專利名稱：四氧化三鐵納米顆粒催化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡萄糖含量的檢測(cè)方法，具體地涉及一種四氧化三鐵納米顆粒催 化的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)葡萄糖含量的方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖是人體細(xì)胞的主要能源，其水平的異常變化能夠直接反映機(jī)體代謝紊亂的 情況，臨床檢驗(yàn)上通過測(cè)定人體血液、尿樣、腦脊液中葡萄糖的含量可以診斷糖尿病、細(xì)胞 腫瘤、肺結(jié)核、腦膜炎等各種疾病。此外，各種食品如果汁、蜂蜜和葡萄酒等中葡萄糖含量的 檢測(cè)，是衡量各種食品是否達(dá)標(biāo)的一個(gè)重要指標(biāo)。因此葡萄糖的快速定量檢測(cè)在生物化學(xué)、 臨床化學(xué)和食品工業(yè)領(lǐng)域具有重要意義。目前，葡萄糖的檢測(cè)方法主要包括分光光度法、電化學(xué)法、表面增強(qiáng)拉曼散射光譜 法禾口化學(xué)發(fā)光法等[Wu ZSiZhou GZ, Jiang JH，et al. Gold colloid-bienzyme conjugates for glucose detection utilizing surface-enhanced Raman scattering. Talanta， 2006，70, 533-539.]。然而，分光光度法準(zhǔn)確度低，選擇性差，而電化學(xué)法和表面增強(qiáng)拉曼光 譜法條件苛刻，儀器復(fù)雜?；瘜W(xué)發(fā)光法由于具有儀器簡(jiǎn)單、檢出限低、線性范圍寬、靈敏度 高和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床醫(yī)學(xué)以及食品工業(yè)葡萄糖檢測(cè)的主要分析手段。化學(xué)發(fā) 光法檢測(cè)葡萄糖是利用葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化 氫在催化劑存在下能夠氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度直接與過氧化氫的濃度成正 比，由于目前化學(xué)發(fā)光法中Luminol-H2A體系的發(fā)光強(qiáng)度比較弱，因此普遍采用具有光放 大作用的化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。因此用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度可間接定量樣品中葡 萄糖的含量。迄今為止，為了提高化學(xué)發(fā)光法的檢出限，化學(xué)發(fā)光法通常與酶促反應(yīng)和流動(dòng) 注射技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行生物樣品的檢測(cè)(酶促反應(yīng)和流動(dòng)注射技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 技術(shù))。目前，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)通常采用金屬絡(luò)合物和過氧化物酶作催化劑來 催化 Luminol-H2A 體系實(shí)現(xiàn)葡萄糖的檢測(cè)[Kricka LJ, Voyta JC, Bronstein I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods Enzymol，2000，305，370-390.]，然而由于金屬絡(luò)合物容易對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生干 擾，而過氧化物酶價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性較差且不能回收[黃玉文，封滿良，章竹君。反相流動(dòng)注 射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定葡萄糖。分析化學(xué)1997，25，34-36]，因此需要尋找新的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)體 系，實(shí)現(xiàn)葡萄糖簡(jiǎn)單、方便和高靈敏度檢測(cè)。目前常用的檢測(cè)方法有1)金屬絡(luò)合物作催化劑為了提高葡萄糖氧化酶的活性和酶的穩(wěn)定性，研究人員采用固定化酶技術(shù)，即將 葡萄糖氧化酶吸附在一定的基質(zhì)上，以提高酶的壽命和活性。楊敏麗等將葡萄糖氧化酶固 定在多孔的玻璃微珠上制成長(zhǎng)壽命和高活性的固相酶，通過固相酶催化的葡萄糖氧化反應(yīng) 與流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系(Iumin0I-H2O2-Kfe(CN)4)結(jié)合檢測(cè)葡萄糖，通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、 魯米諾的濃度和葡萄糖溶液的流速，該方法的線性范圍可達(dá)0. 4 100 μ g/mL,檢出限達(dá)0. 08yg/mL[楊敏麗，熊楚明。固定化酶流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定葡萄糖。寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)自 然科學(xué)版，1995，16，28-31]。2)過氧化物酶作催化劑Lin等在玻璃微珠(經(jīng)硅烷預(yù)處理)上固定金納米顆粒和殼聚糖作為葡萄糖氧 化酶的固定基質(zhì)，將葡萄糖液相酶制成固相酶。結(jié)合辣根過氧化物酶催化的魯米諾發(fā)光 體系(Iumin0I-H2O2-HRP)，通過優(yōu)化反應(yīng)的pH值、反應(yīng)時(shí)間和魯米諾的濃度，在流動(dòng)注 射-化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，此方法的線性范圍可達(dá)到0. 01 6. Ommol/L，檢出 限為 5. 0 μ mol/L[Lin JH, Zhang H, Zhang SS. New bienzymatic strategy for glucose determination by immobilized—gold nanoparticle-enhanced chemiluminescence. Sci China Ser B-Chem，2009，52，196-202]。Lan等用金納米顆粒吸附葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶，通過溶膠-凝膠法 將吸附酶的金納米顆粒固定在化學(xué)發(fā)光池的內(nèi)表面，通過該方法可同時(shí)增強(qiáng)葡萄糖氧化 酶和辣根過氧化物酶的活性，從而增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的信號(hào)，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)分析葡 萄糖，該方法的線性范圍可達(dá)1. 0X 10_5mo 1 /L 1. 0X 10_3mo 1/L，檢出限達(dá)5X10_6mo 1 / L[Lan D, Li BX, Zhang ZJ. Chemiluminescence flow biosensor for glucose based on gold nanoparticle-enhanced activities of glucose oxidase and horseradish peroxidase. Biosensors and Bioelectronics,2008,24,934-938]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種四氧化三鐵納米顆粒催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)葡萄糖含 量的方法，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低、線性范圍寬、檢出限低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在化學(xué)發(fā)光體系中引進(jìn)了磁性四氧化三鐵納米顆粒，用 磁性四氧化三鐵納米顆粒作催化劑，替代了通常使用的過氧化物酶、金屬離子或者金屬絡(luò) 合物。詳細(xì)地說，本發(fā)明提供的方法，是于10-601，將葡萄糖溶液加入至？!1為4.0-9.0 的四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系中，用SpectraMaXM2酶標(biāo)儀檢測(cè)葡萄糖濃 度；其中，四氧化三鐵納米顆粒的濃度為大于或者等于IOppm(優(yōu)選10-30ppm)，魯米諾濃度 為l-2mmol/L。四氧化三鐵納米顆粒的平均粒徑為25nm。本發(fā)明利用了磁性四氧化三鐵納米顆粒的高吸附性、生物相容性、類酶的催化特 性及可重復(fù)利用的特點(diǎn)，建立了操作簡(jiǎn)單、成本低、線性范圍寬、檢出限低的葡萄糖化學(xué)發(fā) 光檢測(cè)法，以實(shí)現(xiàn)臨床和食品領(lǐng)域葡萄糖含量簡(jiǎn)單、方便和高靈敏度的檢測(cè)。本發(fā)明與現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法的不同之處(1)本發(fā)明在化學(xué)發(fā)光體系中加入了具有強(qiáng)催化活性的磁性四氧化三鐵納米顆 粒，取代了現(xiàn)有的金屬離子、金屬絡(luò)合物和過氧化物酶等催化劑。(2)該方法采用了更簡(jiǎn)單的廣泛使用的酶標(biāo)儀(帶有附加化學(xué)發(fā)光測(cè)試功能)，無 需專門的化學(xué)發(fā)光分析儀，為葡萄糖的檢測(cè)提供了方便性。


圖1顯示了本發(fā)明四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾-H2O2溶液體系于不同pH值時(shí)的發(fā)光曲線。圖2顯示了本發(fā)明四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系于不同溫度時(shí)的 發(fā)光曲線。圖3顯示了本發(fā)明四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系中，不同濃度的四 氧化三鐵納米顆粒發(fā)光曲線。圖4為本發(fā)明四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系檢測(cè)葡萄糖含量的線 性范圍。
具體實(shí)施例方式四氧化三鐵納米顆粒由于具有變價(jià)的特性，已被證明具有類過氧化物酶的生物 活性，并且顆粒尺寸越小，該類過氧化物酶的生物活性越高[Gao L, Zhuang J, Nie L, et al.Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles. Nature Nanotech,2007，2，577-58]。本發(fā)明結(jié)合葡萄糖的酶促反應(yīng)，利用磁性四氧化三鐵納米顆粒的這種性質(zhì)催化 Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，采用帶有化學(xué)發(fā)光測(cè)試功能的SpectraMaxM2酶標(biāo)儀(美國(guó)分 子儀器公司)測(cè)量葡萄糖的濃度。并且，本發(fā)明對(duì)用四氧化三鐵納米顆粒作催化劑的化學(xué) 發(fā)光反應(yīng)的條件(PH值、溫度和四氧化三鐵納米顆粒濃度)進(jìn)行了優(yōu)化。參照文獻(xiàn)5中研 究了魯米諾濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，考慮到隨魯米諾濃度的增加雖然發(fā)光信號(hào)增大， 本底值也隨之增加，本發(fā)明選用的魯米諾濃度為2mmol/L。本發(fā)明采用的四氧化三鐵納米顆 粒的平均粒徑為25nm。實(shí)施例1)ρΗ 值優(yōu)化配制四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系，在恒定四氧化三鐵納米顆粒、 魯米諾和H2A濃度以及反應(yīng)溫度(四氧化三鐵納米顆粒的濃度為IOppm ；魯米諾濃度為 2mmol/L ；H2O2濃度為50μπιΟ1/1 ；反應(yīng)溫度為25V )的條件下，通過向溶液中添加HCl和 NaOH的方法調(diào)節(jié)體系的ρΗ值(ρΗ值范圍為4 10)，用ρΗ計(jì)測(cè)量ρΗ值后，用SpectraMaxM2 酶標(biāo)儀測(cè)量各體系的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯鲈赑H值范圍為4 9時(shí)，發(fā)光 強(qiáng)度較大，并且在pH = 7. 0時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大。2)溫度優(yōu)化配制四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系，在恒定四氧化三鐵納米顆粒、 魯米諾和H2A濃度以及ρΗ值(四氧化三鐵納米顆粒的濃度為IOppm ；魯米諾濃度為2mmol/ L ；H2O2濃度為50 μ mol/L ；ρΗ值為7. 0)的條件下，用恒溫振蕩培養(yǎng)箱對(duì)體系進(jìn)行不同溫度 控制，溫度控制范圍為4 70°C，并用SpectraMaXM2酶標(biāo)儀測(cè)量各體系的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如 圖2所示?？梢钥闯鲈诜磻?yīng)溫度為10 60°C時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度較大，并且在反應(yīng)溫度為40°C 時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大。3)四氧化三鐵納米顆粒濃度優(yōu)化配制四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾- 溶液體系，在恒定魯米諾和H2A濃度以及 PH值和溫度(四氧化三鐵納米顆粒的濃度范圍為3 60ppm ；魯米諾濃度為2mmol/L ；H2O2 濃度為50 μ mol/L ；ρΗ值為7. 0 ；反應(yīng)溫度為40°C )的條件下。用SpectraMaxM2酶標(biāo)儀測(cè)量各體系的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯霎?dāng)四氧化三鐵納米顆粒的濃度為3 IOppm時(shí)，隨著四氧化三鐵納米顆粒濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，當(dāng)四氧化三鐵納米顆 粒的濃度大于IOppm時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度較大，并且隨著四氧化三鐵納米顆粒濃度的增加也逐漸 增強(qiáng)；而當(dāng)四氧化三鐵納米顆粒的濃度大于25ppm時(shí)，隨著四氧化三鐵納米顆粒濃度的增 加，發(fā)光強(qiáng)度基本保持不變，因此四氧化三鐵納米顆粒的優(yōu)化濃度為25ppm。因此，本發(fā)明最優(yōu)的化學(xué)發(fā)光條件為pH = 7，反應(yīng)溫度為40°C，四氧化三鐵納米 顆粒的濃度為25ppm。4)優(yōu)化條件下葡萄糖含量的測(cè)量將不同濃度的葡萄糖溶液分別與葡萄糖氧化酶作用，在優(yōu)化的發(fā)光條件下用 SpectraMaxM2酶標(biāo)儀對(duì)其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試，作出化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨萄糖葡濃度變化的 標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4所示?？梢钥闯鲈谠搩?yōu)化發(fā)光條件下，萄糖葡濃度檢測(cè)的線性范圍可達(dá) 2Xl(T6mol/L 1 X l(T3mol/L(相當(dāng)于 0. 36mg/L 180mg/L)，相關(guān)系數(shù)為 0. 9990。通過對(duì) 優(yōu)化條件下Ommol/L魯米諾，25ppm !^e3O4, pH = 7和反應(yīng)溫度為40°C )的空白本底進(jìn)行測(cè) 試，以3 ο (空白平行測(cè)定11次的標(biāo)準(zhǔn)偏差)對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限，可得到該方法檢測(cè)葡 萄糖的檢出限為0.4μπιΟ1/1。本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果(1)本發(fā)明優(yōu)化條件下檢測(cè)葡萄糖的線性范圍為2X10_6mol/L lX10_3mol/ L(相當(dāng)于0. 36mg/L 180mg/L)，檢出限達(dá)到0.4μπιΟ1/1。與現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)的對(duì)比如下表 1所示?？梢钥闯霰景l(fā)明不僅具有檢測(cè)葡萄糖的線性范圍寬的特點(diǎn)，而且檢出限較現(xiàn)有技 術(shù)降低了 5倍，能夠?qū)崿F(xiàn)更低濃度的葡萄糖含量檢測(cè)。(2)需要說明的是，本發(fā)明使用的檢測(cè)儀器為SpeCtraMaXM2酶標(biāo)儀。同化學(xué)發(fā)光 法專門使用的檢測(cè)儀器-化學(xué)發(fā)光分析儀相比，SpectraMaxM2酶標(biāo)儀不具備光放大功能， 因此，如果使用化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)量本發(fā)明涉及的四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾-H2O2-葡 萄糖溶液體系中的葡萄糖含量，其檢出限將更低。同時(shí)，由于本發(fā)明無需專門的化學(xué)發(fā)光分 析儀，只需更簡(jiǎn)單的廣泛使用的酶標(biāo)儀(帶有附加化學(xué)發(fā)光測(cè)試功能)，因此為葡萄糖含量 的檢測(cè)提供了便利。(3)由于四氧化三鐵納米顆粒具有磁性，因此利用磁場(chǎng)作用，如磁鐵等，即可實(shí)現(xiàn) 四氧化三鐵納米顆粒的分離，從而實(shí)現(xiàn)可重復(fù)利用，克服了用過氧化物酶、金屬離子和金屬 絡(luò)合物作催化劑的難以重復(fù)利用的缺點(diǎn)，更有利于降低檢測(cè)成本。表 權(quán)利要求
1.一種化學(xué)發(fā)光檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，采用四氧化三鐵納米顆粒催化魯米 諾- 化學(xué)發(fā)光體系；于10-60°c，將葡萄糖溶液加入至pH為4. 0-9. 0的四氧化三鐵納米 顆粒-魯米諾- 溶液體系中檢測(cè)葡萄糖濃度；其中，四氧化三鐵納米顆粒的濃度為大于或者等于lOppm。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，四氧化三鐵納米顆粒的平均粒徑為25rm。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，檢測(cè)是采用SpectraMaxM〗酶標(biāo)儀。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，魯米諾濃度為l-2mmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，四氧化三鐵納米顆粒的濃度為10-30ppm。
全文摘要
一種四氧化三鐵納米顆粒催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)葡萄糖的方法，于10-60℃，將葡萄糖溶液加入至pH為4.0-9.0的四氧化三鐵納米顆粒-魯米諾-H2O2溶液體系中，用SpectraMaxM2酶標(biāo)儀檢測(cè)葡萄糖濃度；其中，四氧化三鐵納米顆粒的濃度為大于或者等于10ppm。四氧化三鐵納米顆粒的平均粒徑為25nm。本發(fā)明利用了磁性四氧化三鐵納米顆粒的高吸附性、生物相容性、類酶的催化特性及可重復(fù)利用的特點(diǎn)，建立了操作簡(jiǎn)單、成本低、線性范圍寬、檢出限低的葡萄糖化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，以實(shí)現(xiàn)臨床和食品領(lǐng)域葡萄糖含量簡(jiǎn)單、方便和高靈敏度的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102053085SQ20091023671
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月28日
發(fā)明者豐偉悅, 杜偉, 杜崇磊, 汪冰, 王萌, 趙宇亮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所