專利名稱：一種檢測(cè)磺胺藥物的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)磺胺藥物的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
磺胺類藥(Sulfonamides)，是通過人工合成的氨苯磺胺衍生物，主要用于預(yù)防和 治療細(xì)菌感染性疾病。代表藥物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺間甲 氧嘧啶、磺胺喹惡啉等?；前奉愃幬锬芤种聘锾m氏陽性菌及一些陰性菌，可以治療多種細(xì)菌 感染，在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療由敏感細(xì)菌感染的各種畜禽疾病。由于磺胺類藥物在體內(nèi)的作用和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，通過任何途徑攝入的磺胺都有可 能在人體內(nèi)蓄積。蓄積濃度超過一定值時(shí)，就會(huì)對(duì)人體造成損害。短時(shí)間大劑量或長(zhǎng)時(shí)間 小劑量的刺激可分別引起急性或慢性中毒，影響機(jī)體的泌尿、免疫系統(tǒng)，破壞肌肉、腎臟和 甲狀腺等組織，如誘發(fā)人的甲狀腺癌等。另外，人體內(nèi)長(zhǎng)期存在磺胺會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)磺胺 類藥物產(chǎn)生抗藥性。因此，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)和許多國(guó)家規(guī)定，食品中磺胺類總量 的最大殘留限量(MRL)為0. lmg/kg。檢測(cè)磺胺類藥物的化學(xué)方法有高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，由于復(fù) 雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種磺胺藥物單克隆抗體。本發(fā)明所提供的磺胺藥物單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 3393的磺胺類 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株SAs分泌產(chǎn)生的。保藏編號(hào)為CGMCC No. 3393的磺胺類單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株SAs也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍?；前匪幬锱c載體蛋白的偶聯(lián)物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；其中，所述載體蛋白為 牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋 白。上述任一所述磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物是指磺胺藥物與載體蛋白通過重氮 法得到的磺胺藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，偶聯(lián)比率為1-30之間。上述磺胺藥物單克隆抗體和/或上述任一所述偶聯(lián)物在制備檢測(cè)磺胺藥物的酶 聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)磺胺藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)磺胺藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，為下述1) ,2)、3)或4)中任一 所述酶聯(lián)免疫試劑盒1)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括上述任一所述偶聯(lián)物、上述磺胺藥物單克隆抗體和酶標(biāo) 記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括磺胺藥物的酶標(biāo)記物、上述磺胺藥物單克隆抗體和抗抗體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括磺胺藥物的酶標(biāo)記物、上述磺胺藥物單克隆抗體；其 中，所述磺胺藥物單克隆抗體作為包被原；4)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括上述任一所述偶聯(lián)物、上述磺胺藥物單克隆抗體的酶標(biāo) 記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。本發(fā)明試劑盒中還可包括磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、洗滌液和/或樣品稀釋 液。本發(fā)明試劑盒中，所述磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品為0 μ g/L、0. 5 μ g/L、l. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、 13. 5 μ g/L和40. 5 μ g/L的磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述底物顯色液由A液和B液組成，A液為含有1. 5% -2. 5%過氧化脲的水溶液， B液為含有0. 5% -1. 5%四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；所述洗滌液為含有0. 8 % 1. 2 %吐溫20和0. 3 % -0. 7 %疊氮化鈉的 0. 005M-0. 015M磷酸鹽緩沖液；所述樣品稀釋液為20X (0. 03mol/L-0. 05mol/L)的磷酸鹽緩沖液；所述樣品濃縮液為(0. 03mol/L-0. 05mol/L)的磷酸鹽緩沖液，樣品濃縮液需要進(jìn) 行稀釋，成為樣品稀釋液后使用。其中，所述樣品濃縮液優(yōu)選為0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選稀釋倍數(shù)為20倍。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理如下當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被磺胺類藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入樣本 溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入磺胺藥物單克隆抗體溶液，樣本中殘留的磺胺類藥物或磺胺 藥物標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的磺胺類藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)磺胺藥物單克 隆抗體，加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中磺胺類藥物的 含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板 上顏色的深淺，與系列濃度磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中磺胺類藥 物含量的濃度范圍。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被二抗時(shí)，加入磺胺藥物單克隆抗體孵育后，加入樣本 溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)記磺胺類藥物半抗原溶液，樣本中的磺胺類藥物或磺胺類 藥物標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記磺胺類藥物半抗原競(jìng)爭(zhēng)磺胺類藥物特異性抗體，用顯色液顯色，樣本 吸光度值與樣本中磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥 物的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的 比較可粗略判斷樣品中磺胺類藥物含量的濃度范圍。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被磺胺類藥物單克隆抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶 液后，再加入酶標(biāo)記磺胺類藥物半抗原溶液，樣本中殘留的磺胺類藥物或磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn) 品與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的磺胺類藥物單克隆抗體，用顯色液顯色，樣本吸光 值與磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的含量。同 時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略 判斷樣品中磺胺類藥物含量的濃度范圍。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被磺胺類藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入樣本 溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記磺胺類藥物單克隆抗體溶液，樣本中的磺胺類藥物或磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的磺胺類藥物抗原競(jìng)爭(zhēng)磺胺類藥物單克隆抗體，用顯色 液顯色，樣本吸光值與樣本中磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本 中磺胺類藥物的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品 溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中磺胺類藥物含量的濃度范圍。所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法，包括如下步驟1)將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣本溶液；2)用上述任一所述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣本溶液進(jìn)行檢測(cè)；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測(cè)樣品為牛奶；將所述牛奶與上述樣品稀釋液按照1 (3-5)的體積比 混勻，得到的混合溶液即為待測(cè)樣本溶液；將所訴奶粉溶于樣品稀釋液中混合均勻，得到的 混合溶液即為待測(cè)樣本溶液；b)所述待測(cè)樣品為豬肉、蛋、魚或蝦；將所述待測(cè)樣品用提取劑進(jìn)行提取，得到提 取溶液，再將所述提取溶液進(jìn)行脫脂，取水相即為待測(cè)樣本溶液；所述提取劑為甲醇；所述 脫脂中使用的溶劑是正己烷或正庚烷；其中，所述提取的方法可包括如下步驟將每0. 8g-l. 2g所述待測(cè)樣品加入l_3mL 甲醇中，渦動(dòng)20-50s，20-25°C、4000-5000r/min離心9-llmin，取上清液，即為所述提取液；c)所述待測(cè)樣品為雞肉；將所述待測(cè)樣品依次用提取劑I和提取劑II進(jìn)行提取， 得到提取溶液，再將所述提取溶液進(jìn)行脫脂，取水相即為待測(cè)樣本溶液；所述提取劑I為乙 腈和水的混合溶液；所述提取劑II為氯化鈉的水溶液和乙酸乙酯的混合物；所述脫脂中使 用的溶劑是正己烷或正庚烷。其中，所述提取的方法包括如下步驟將每l_3g所述待測(cè)樣品的勻漿組織加 Λ 5-7ml所述提取劑I中，混勻，14-16 °C、3000-4000r/min離心9-llmin，取上清液I， 再將每3-5mL所述上清液I加入8-IOml所述提取劑II中，混勻，14-16°C、3000_4000r/ min離心9-llmin，取上清液II，即為所述提取液；所述提取劑I中乙腈和水的體積比為 (80-85) (20-15)；所述提取劑II中氯化鈉與乙酸乙酯的比例為3mm0l-5mm0l氯化鈉 6mL-8mL乙酸乙酯；上述b)或c)中所述的前處理方法中，脫脂的方法具體可為向每0.4-0. 6ml所 述提取溶液中加入0. 8-1. 2mL正己烷或正庚烷，渦動(dòng)8-12s，20-25°C、4000_5000r/min離心 9-llmin，取水相。上述b)或C)中所述的前處理方法中，在所述提取后，所述脫脂前，還可包括對(duì)所 述提取溶液進(jìn)行干燥復(fù)溶的步驟；所述復(fù)溶中使用的是所述試劑盒中的樣品稀釋液；d)所述待測(cè)樣品為蜂蜜；用乙腈對(duì)所述蜂蜜樣本進(jìn)行提取，取有機(jī)相即為待測(cè)樣 本溶液；稱取1.0士0.05g蜂蜜樣本溶于ImL IM鹽酸溶液中，37°C孵育30min，得到溶液I ； 向所述溶液I中加入0. 5mL 2M氫氧化鈉和0. 5mL 0. 2M PB緩沖溶液，混勻，再加入8mL乙 腈，震蕩lOmin，在20°C _25°C的溫度下離心5min，取上層有機(jī)相，吹干，再用所述樣品稀釋 液溶解，得到的混合溶液即為待測(cè)樣本溶液；
所述樣品稀釋液為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明檢測(cè)方法提供的檢測(cè)結(jié)果分析過程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0 標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％) = (B/B0) X 100%以磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(yg/L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為 Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的 濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中磺胺類藥物的含量。也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣 品溶液濃度。還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過程 只需較短時(shí)間，1.5h內(nèi)即可以完成。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種制備磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明所提供的制備磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物的方法，包括如下步驟1)將磺胺藥物溶于硫酸水溶液中，得到溶液I ；2)將載體蛋白溶于Na2CO3溶液中，得到溶液II ；3)將NaNO2溶于水中，得到溶液III;4)將溶液III加入到溶液I中，在此過程中，溶液I置于碎冰中，得到溶液IV ；5)將溶液IV緩慢加入到溶液II中，攪拌，pH值保持在9-10之間，得到溶液V;將 所述溶液V進(jìn)行生理鹽水透析，得到磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明所提供的制備磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物的方法，具體如下1)將l(Mmg磺胺藥物溶于8mL 0. 25mol L—1的硫酸水溶液中，得到溶液I ；2)將200mg的載體蛋白溶于SmL的Na2CO3溶液中，得到溶液II ；3)將38mg NaNO2溶于2mL水中，得到溶液III ；4)將溶液III加入到溶液I中，在此過程中，溶液I置于碎冰中，得到溶液IV ；5)將溶液IV緩慢加入到溶液II中，攪拌，pH值保持在9-10之間，得到溶液V;將 所述溶液V進(jìn)行生理鹽水透析，得到磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物。上述任一所述產(chǎn)品(單克隆抗體、偶聯(lián)物或試劑盒)和任一所述方法(偶聯(lián)物制 備方法、檢測(cè)磺胺藥物的方法)中，所述磺胺藥物為磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲 嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對(duì) 甲氧嘧啶。上述任一所述產(chǎn)品(單克隆抗體、偶聯(lián)物或試劑盒)和任一所述方法(偶聯(lián)物制 備方法、檢測(cè)磺胺藥物的方法)中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清 蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。所述酶標(biāo)記中的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化 物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與二抗進(jìn) 行偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與二抗進(jìn)行偶聯(lián)，如戊 二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長(zhǎng)期的勞動(dòng)創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時(shí)、 降低辣根過氧化物酶(HRP)與二抗的濃度比率，節(jié)省了原材料。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物或 人食用的產(chǎn)品(特別是牛奶、豬肉、雞肉、蛋、蜂蜜、魚和蝦等)中磺胺類藥物的含量。本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批 量樣品；采用高特異性的磺胺類藥物單克隆抗體，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏 度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。且本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格 便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選。并且本發(fā)明試劑 盒可以同時(shí)檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲 氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶多種藥物，本發(fā)明的試劑盒 將在磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。


圖1為磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。磺胺二甲基嘧啶(SM2)購自Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為46802 ；實(shí)施例1、磺胺二甲基嘧啶抗原、磺胺二甲基嘧啶抗體及其制備一、磺胺二甲基嘧啶抗原的合成1、磺胺二甲基嘧啶免疫原以磺胺二甲基嘧啶(SM2)作為磺胺二甲基嘧啶半抗原。1)取l(Mmg磺胺二甲基嘧啶(SM2)，加入SiiL 0. 25mol L—1的硫酸水溶液中，置于 4°C冰箱，形成溶液1(含SM2)；2) 200mg的人血清白蛋白(HSA)溶于8mL的Na2CO3溶液中(pH = 10)，置于4°C冰 箱，形成溶液11(含HSA)；3) 38mg NaNO2,加入 2mL 純水，得到溶液 III (含 NaNO2)；4)將溶液III (含NaNO2)緩慢加入到溶液I (含觀)中，在此過程中，溶液I (含 SM2)置于碎冰中，大概15min，得到溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)；5)將溶液IV(含SM2-NaNO2混合物)緩慢加入到溶液II (含HSA)中，并搖動(dòng)燒 杯，此時(shí)有紅色生成；6min后，將燒杯置于磁力攪拌器上，室溫慢速攪拌，繼續(xù)加溶液IV (含 SM2-NaNO2混合物)；在攪拌過程中，檢測(cè)pH值，使之保持在9_10之間，最終溶液變成暗紅色 液體；室溫繼續(xù)攪拌4h ；裝入透析袋，生理鹽水透析。得到磺胺二甲基嘧啶與人血清白蛋白 的偶聯(lián)物，即為磺胺二甲基嘧啶免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式I所示。
權(quán)利要求
1.一種磺胺藥物單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 3393的磺胺類單克隆抗體雜 交瘤細(xì)胞株SAs分泌產(chǎn)生的。
2.保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3393的磺胺類單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株SAs。
3.磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠 血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
4.權(quán)利要求1中所述磺胺藥物單克隆抗體和/或權(quán)利要求3中所述偶聯(lián)物在制備檢測(cè) 磺胺藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)磺胺藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，為下述1)、2)、；3)或4)中任一所述酶聯(lián)免疫 試劑盒1)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括權(quán)利要求3中所述偶聯(lián)物、權(quán)利要求1中所述磺胺藥物單克 隆抗體和酶標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括磺胺二甲基嘧啶的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1中所述磺胺藥物單 克隆抗體和抗抗體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括磺胺二甲基嘧啶的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1中所述磺胺藥物單 克隆抗體；其中，所述磺胺藥物單克隆抗體作為包被原；4)酶聯(lián)免疫試劑盒中包括權(quán)利要求3中所述偶聯(lián)物、權(quán)利要求1中所述磺胺藥物單克 隆抗體的酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的單克隆抗體、偶聯(lián)物或試劑盒，其特征在于 所述磺胺藥物為磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對(duì)甲氧嘧啶；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、 血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
7.—種檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法，包括如下步驟1)將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣本溶液；2)用權(quán)利要求5所述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣本溶液進(jìn)行檢測(cè)； 所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測(cè)樣品為牛奶、奶粉；將所述牛奶與樣品稀釋液按照1 (3-5)的體積比混 勻，得到的混合溶液即為待測(cè)樣本溶液；將所述奶粉溶于樣品稀釋液中，混合均勻，得到的 混合溶液即為待測(cè)樣本溶液；b)所述待測(cè)樣品為豬肉、蛋、魚或蝦；將所述待測(cè)樣品用提取劑進(jìn)行提取，得到提取溶 液，再將所述提取溶液進(jìn)行脫脂，取水相即為待測(cè)樣本溶液；所述提取劑為甲醇；所述脫脂 中使用的溶劑是正己烷或正庚烷；c)所述待測(cè)樣品為雞肉；將所述待測(cè)樣品依次用提取劑I和提取劑II進(jìn)行提取，得到 提取溶液，再將所述提取溶液進(jìn)行脫脂，取水相即為待測(cè)樣本溶液；所述提取劑I為乙腈和 水的混合溶液；所述提取劑II為氯化鈉的水溶液和乙酸乙酯的混合物；所述脫脂中使用的 溶劑是正己烷或正庚烷；d)所述待測(cè)樣品為蜂蜜；用乙腈對(duì)所述蜂蜜樣本進(jìn)行提取，取有機(jī)相即為待測(cè)樣本溶液；所述樣品稀釋液為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
8.一種制備權(quán)利要求3中所述偶聯(lián)物的方法，包括如下步驟1)將磺胺藥物溶于硫酸水溶液中，得到溶液I；2)將載體蛋白溶于Na2CO3溶液中，得到溶液II；3)將NaNO2溶于水中，得到溶液III；4)將溶液III加入到溶液I中，在此過程中，溶液I置于碎冰中，得到溶液IV；5)將溶液IV緩慢加入到溶液II中，攪拌，pH值保持在9-10之間，得到溶液V;將所述 溶液V進(jìn)行生理鹽水透析，得到磺胺藥物與載體蛋白的偶聯(lián)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的方法，其特征在于所述磺胺藥物為磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺 間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對(duì)甲氧嘧啶；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、 血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)磺胺藥物的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該酶聯(lián)免疫試劑盒，包括磺胺藥物單克隆抗體和磺胺藥物。該磺胺藥物單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC No.3393的磺胺類單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株SAs分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物或人食用的產(chǎn)品(特別是牛奶、豬肉、雞肉、蛋、蜂蜜、魚和蝦等)中磺胺類藥物的含量。本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品；采用高特異性的磺胺類藥物單克隆抗體，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/12GK102079788SQ20091024130
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者史為民, 吳小平, 徐飛, 李娜, 江海洋, 王亞輝, 王戰(zhàn)輝, 王照鵬, 王進(jìn), 米鐵軍 申請(qǐng)人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司