專利名稱：：一種基于整體觀評(píng)價(jià)中藥活性和作用機(jī)理的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，具體涉及一種基于中藥整體觀通過敲除和捕獲中藥化學(xué)成分來評(píng)價(jià)其活性及作用機(jī)理的方法，為一種利用液相色譜-質(zhì)譜-閥切換技術(shù)聯(lián)用研究中藥不同成分對(duì)整體活性的影響以及各成分之間相互作用機(jī)制的方法。
背景技術(shù)：
：長期以來，國內(nèi)中藥研究的主流模式主要是借鑒了西方對(duì)天然產(chǎn)物活性成分研究的基本策略在化學(xué)成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定基礎(chǔ)上利用藥理模型(整體動(dòng)物、離體器官、細(xì)胞和分子等模型)對(duì)得到的化合物純品進(jìn)行生物活性測試(參見屠鵬飛，生藥學(xué)的發(fā)展及其研究思路，中國天然藥物，2006，4:411-419)。雖然這樣的研究方法闡明了一些中藥的有效部位和作用機(jī)制，但卻忽視了中藥的整體作用特點(diǎn)。隨著研究的深入，中藥的多成分、多靶點(diǎn)和整體作用模式逐步成為國內(nèi)外學(xué)者的共識(shí)(參見J.Qiu.Acultureinthebalance.Nature,2007，448:126—128;J.Qiu.Chinaplanstomodernizetraditionalmedicine.Nature,2007，446:590-591;T.H.Han，R.Roy.StudyingtraditionalChinesemedicine.Science,2003，300:740_741;周俊，中藥復(fù)方_天然組合化學(xué)庫與多靶作用機(jī)理，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18:67;肖培根等，21世紀(jì)與中藥現(xiàn)代化，中國中藥雜志，2000，25:67-70)。中藥指紋圖譜可以直接控制中藥提取物中盡量多的成分，成為目前中藥質(zhì)量控制的有效方法。傳統(tǒng)的化學(xué)指紋圖譜通過評(píng)價(jià)藥材中各色譜峰的峰面積或峰高比值來確定樣品中化學(xué)成分的相對(duì)含量，并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法通過相似度的比較來評(píng)價(jià)中藥材或制劑質(zhì)量的優(yōu)劣(參見屠鵬飛，高效液相色譜法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討，中成藥，2000，22:516。果德安等，中藥質(zhì)量控制研究的思路與方法，中國天然藥物，2005，4:332-337。蔡少青等，基于擬分布的中藥色譜指紋圖譜的相似性分析，北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，44:695-699)。雖然該方法涉及到了中藥"多成分"的特點(diǎn)，但各成分與其藥效之間的關(guān)聯(lián)性在現(xiàn)階段還沒有得到有效的表達(dá)，不足以說明中藥的整體作用特點(diǎn)。近幾年來，生物技術(shù)迅猛發(fā)展，生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)的交叉形成了一種新的綜合技術(shù)-生物色譜法，這為中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究另辟蹊徑。該法是應(yīng)用最早的生物指紋圖譜技術(shù)，包括分子生物色譜、生物膜色譜和細(xì)胞生物色譜等，其基本原理是以各種具有生物活性的材料作為固定相，將活性生物大分子或者活性細(xì)胞膜固著在色譜擔(dān)體上作為靶標(biāo)。根據(jù)中藥與酶、受體或細(xì)胞膜等靶標(biāo)的相互作用的強(qiáng)弱不同而將不同的成分分離開來，能夠?qū)χ兴幍亩喾N活性成分進(jìn)行快速篩選，彌補(bǔ)了目前化學(xué)指紋圖譜控制中藥質(zhì)量會(huì)與藥效脫鉤的不足，具有一定的藥理學(xué)或生理學(xué)意義。(參見汪海林等，分子生物色譜用于中藥活性成分篩選及質(zhì)量控制方法的研究，色譜，1999，17(2):123-127。毛希琴等，生物膜色譜及其在藥物活性成分分析中的應(yīng)用，分析化學(xué)，2002，30(2):231-236。盛亮洪等，固定化脂質(zhì)體色譜研究中藥方劑的細(xì)胞膜通透性成分及其質(zhì)量控制，分析化學(xué)，2004，32(12):1595-1598。袁秉祥等，細(xì)胞膜生物親和色譜藥物篩選系統(tǒng)，中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，20(3):368。)然而該方法在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多問題，如酶、受體等活性大分子或細(xì)胞膜與硅膠等載體結(jié)合后其生物學(xué)特征會(huì)受到一定的影響等，且這種方法只能說明中藥不同成分之間的活性強(qiáng)弱差異，并不能解釋各個(gè)成分之間以及各成分與藥材整體活性之間的關(guān)聯(lián)作用。發(fā)明人在前期研究中，發(fā)明了一種基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法。其基本原理是將靶蛋白與中藥提取物在緩沖液中共孵育，此時(shí)有活性的化合物與靶蛋白結(jié)合成靶蛋白-活性成分復(fù)合物，孵育得到的混合溶液中包括靶蛋白-活性成分復(fù)合物和沒有與靶蛋白結(jié)合的游離小分子化合物。孵育溶液上樣于分子排阻色譜柱或第一根在線固相提取柱，用緩沖液洗脫柱子，洗脫液流經(jīng)紫外檢測器，在吸收波長280nm下檢測并收集首先出峰的洗脫液；然后將洗脫液與解離液混合進(jìn)行解離，解離溶液中與靶蛋白結(jié)合的活性成分被解離成游離化合物；隨后將解離溶液上樣于第二根在線固相提取柱，耙蛋白和緩沖鹽被高流速的水溶液洗脫，而活性成分則保留在第二根在線固相提取柱上；再把上述步驟得到的被保留的活性成分洗脫進(jìn)入高效液相-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。這樣就可篩選出中藥中的活性化合物，對(duì)篩選到的活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證(見CN200810124611.1)。但此技術(shù)只能篩選出中藥中孤立的化學(xué)活性成分，并不能從整體上分析中藥中不同成分對(duì)整體活性的貢獻(xiàn)度、各成分之間的相互作用以及全部活性成分群的整體活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明建立了一種基于中藥整體觀的通過對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行敲除和捕獲來評(píng)價(jià)中藥活性和整體作用特點(diǎn)的研究方法。本發(fā)明可以敲除和捕獲中藥指紋圖譜中的任意一個(gè)色譜峰，分析色譜峰的變化與中藥活性之間的關(guān)聯(lián)度以得到每個(gè)色譜峰在中藥整體活性中的貢獻(xiàn)度；同時(shí)還可以利用基于靶蛋白親和選擇的活性成分篩選技術(shù)，在快速篩選確定活性成分峰后對(duì)其進(jìn)行敲除和捕獲，以研究中藥提取物里一個(gè)或多個(gè)活性成分與中藥整體活性之間的關(guān)系，且可通過將捕獲的活性成分以不同方式組合來進(jìn)一步探討各個(gè)活性成分之間的協(xié)同或拮抗作用。本發(fā)明基于中藥整體觀的中藥成分作用特點(diǎn)的檢測方法，包括將待測中藥用溶劑提取，得到中藥提取液，然后按如下步驟進(jìn)行a.中藥提取液經(jīng)高效液相色譜法檢測，得到中藥指紋圖譜；b.確定指紋圖譜中的目標(biāo)峰；c.確定目標(biāo)峰后，將高效液相色譜檢測器的流出管路與六通切換閥相連，通過閥切換，把洗脫液按下列方式收集l)單個(gè)目標(biāo)峰、2)任意組合的目標(biāo)峰群和3)指紋圖譜中敲除目標(biāo)峰(群)后的剩余成分群，這三部分中，可以三部分都收集，也可以收集第一和第三部分，或收集第二和第三部分；d.對(duì)c步驟收集得到的樣品進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，得到目標(biāo)峰群的整體活性、單個(gè)目標(biāo)峰的活性排序、單個(gè)目標(biāo)峰在中藥提取物中的貢獻(xiàn)度，和各個(gè)成分之間的相互作用關(guān)系。下面結(jié)合上述方法作進(jìn)一步的闡述上述方法中，待測中藥可以是單味中藥也可以是中藥復(fù)方。提取中藥的溶劑按本領(lǐng)域常用的方法提取，可以是水和/或有機(jī)溶劑。優(yōu)選的溶劑是選自水、C「Cs的醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它們的混合物。所述C「C5的醇優(yōu)選甲醇、乙醇、正丁醇。更為優(yōu)選地，用70-100%乙醇或70-100%甲醇提取制備中藥提取液。提取中藥的溶劑是中性、酸性或堿性均可；可選用無機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)酸或有機(jī)堿中和酸性或堿性的中藥提取液，如酸提堿沉法或堿提酸沉法。由于中藥中含有許多成分，加上高效液相色譜具有很高的分離效能，中藥提取液通過高效液相會(huì)出現(xiàn)許多峰，一般而言，在一種色譜條件下，一個(gè)峰就代表一個(gè)成分或者結(jié)構(gòu)相似的幾個(gè)成分。同時(shí)，如果在某種色譜條件下不能分開的成分，可以換一種色譜條件將之分開。最優(yōu)色譜條件應(yīng)使峰形穩(wěn)定、分離度好。實(shí)際操作過程中，技術(shù)人員可根據(jù)具體待測中藥參閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，目前大部分的中藥都有比較成熟的得到中藥指紋圖譜的方法。指紋圖譜中目標(biāo)峰的確定有以下兩種方法①經(jīng)活性篩選得到將中藥提取液與靶蛋白在緩沖液中共孵育，同時(shí)將不含靶蛋白的中藥提取液作為空白對(duì)照，分別用基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法檢測，確定能與靶蛋白結(jié)合的峰，即活性成分峰，作為目標(biāo)峰。；②未經(jīng)活性篩選得到將指紋圖譜峰按照峰高值或者峰面積值由大到小排序，選取排序靠前的色譜峰作為目標(biāo)峰，即主成分峰，以5-20個(gè)為宜。目前，確定指紋圖譜中活性成分峰的方法有多種，比如本實(shí)驗(yàn)室之前開發(fā)的一些方法(參見李萍，盛亮洪，李睿巖，李松林，齊煉文，一種中藥有效成分的檢測方法，中國發(fā)明專利，ZL200410041024.8;李萍，盛亮洪，李睿巖，李松林，王偉，一種中藥有效成分的檢測方法，中國發(fā)明專利，ZL200410041115.l和李萍，周建良，安婧婧，李會(huì)軍，基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法，CN200810124611.1)。本發(fā)明中，優(yōu)選使用靶蛋白親和選擇的方法，具體為將中藥提取液與靶蛋白在緩沖液中共孵育，同時(shí)將不含靶蛋白的中藥提取液作為空白對(duì)照，分別用多維液_質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測，比較兩者圖譜，峰面積發(fā)生明顯改變的峰，即是目標(biāo)峰。上述活性成分篩選方法中的中藥提取液如果包含有機(jī)溶劑，應(yīng)濃縮去除全部有機(jī)溶劑，用緩沖液溶解或加入低濃度的增溶劑，以免破壞靶蛋白。緩沖液優(yōu)選pH6.08.0的磷酸鹽緩沖液、P朋.08.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、p朋.08.0乙酸銨緩沖液或pH6.08.0碳酸氫銨緩沖液。增溶劑的選擇基于不破壞或基本不破壞靶蛋白的活性。在實(shí)際操作中，靶蛋白可以承受的增溶劑的比例可以通過簡單實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)。例如通過Ellman分光光度分析法證明乙酰膽堿酯酶在含有5%甲醇的緩沖鹽體系中活性幾乎不受影響。所述增溶劑優(yōu)選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一種或幾種的混合溶液。優(yōu)選的增溶劑體積占緩沖液體積的比例為0.1-5%。所有來自人體和動(dòng)物的與疾病密切相關(guān)的活性蛋白均可作為篩選中藥的靶標(biāo)。優(yōu)選的靶蛋白來自于人體或動(dòng)物組織的與老年癡呆、心血管疾病或腫瘤疾病相關(guān)的酶或受體，本發(fā)明中優(yōu)選乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶或組蛋白脫乙?；傅龋壳坝写罅康纳唐坊幕钚缘鞍卓梢再徺I，如乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等，亦可自己進(jìn)行純化制備。具體篩選中藥時(shí)可根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)試驗(yàn)選擇合適的活性蛋白，如文獻(xiàn)顯示石蒜生物堿部位能顯著抑制乙酰膽堿酯酶的活性，那么在篩選石蒜生物堿中活性成分時(shí)可以選擇乙酰膽堿酯酶作為靶蛋白。主成分峰的確定如上所述，操作簡便，不需要運(yùn)用篩選方法，只用將指紋圖譜中各峰按照峰高值或者峰面積值由大到小排序，選取排序靠前的色譜峰作為目標(biāo)峰，即主成分峰，以5-20個(gè)為宜。操作者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇合適的目標(biāo)峰確定方法。確定目標(biāo)峰后，將高效液相色譜檢測器的流出管路與六通切換閥相連，具體裝置5如圖l所示。通過閥切換，可以把洗脫液分成兩部分收集一部分為b步驟確定的目標(biāo)峰(群)，即目標(biāo)峰的捕獲；另一部分為目標(biāo)峰(群)缺失后的剩余成分，即目標(biāo)峰的敲除。收集的樣品在與待測中藥提取液相同條件(濃度、色譜檢測條件等)下進(jìn)行高效液相色譜分析來檢測目標(biāo)峰的敲除是否完全。上述步驟中，目標(biāo)色譜峰出峰時(shí)立即切換六通閥，出峰結(jié)束時(shí)六通閥再切回至原位，從而從洗脫液中捕獲得到目標(biāo)色譜峰，因此檢測器的流出口到六通閥之間的管路優(yōu)選管徑小、管路短的peek管(如Agilent的紅色peek管線，內(nèi)徑O.13mm，色譜峰經(jīng)過此管線僅需0.02秒，延遲時(shí)間幾乎可以忽略)，從而減少色譜峰的延遲體積，降低峰敲除時(shí)的誤差。對(duì)上述收集得到的樣品進(jìn)行生物學(xué)檢測來評(píng)價(jià)捕獲或敲除化學(xué)成份的生物活性。具體生物學(xué)評(píng)價(jià)方法可根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)試驗(yàn)選擇合適的測試方法。以靶蛋白為膽堿酯酶為例，可通過經(jīng)典的Ellman分光光度分析法來計(jì)算捕獲得到的目標(biāo)峰(群)和目標(biāo)峰(群)缺失后剩余的成分群對(duì)膽堿酯酶的抑制率，將其與沒有進(jìn)行任何敲除的中藥洗脫液相比，即可分析得到目標(biāo)峰在中藥提取物中的貢獻(xiàn)度及其活性排序，從而挖掘中藥的多成分作用特點(diǎn)。另外，將捕獲的單目標(biāo)峰以不同方式組合，評(píng)價(jià)得到的目標(biāo)峰群的活性，還可進(jìn)一步探討各個(gè)成分之間的協(xié)同或拮抗作用。抑制率中藥洗脫液一抑制率敲除后剩余物貢獻(xiàn)度(100%)=-^-xioo%fflflj帛中藥洗脫液由于上述洗脫收集得到的樣品含有機(jī)溶劑，最好將其濃縮至干后，用緩沖液溶解或加入低濃度的增溶劑，以免在活性測試時(shí)破壞靶蛋白。緩沖液與增溶劑的選取同前。對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行捕獲時(shí)，可以分別得到不同的單目標(biāo)峰，操作者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將單個(gè)的目標(biāo)峰組合成新的樣品后再評(píng)價(jià)其生物活性，進(jìn)而可對(duì)成分之間的協(xié)同或拮抗作用做出解釋若兩個(gè)樣品組合后檢測的活性超過了它們單獨(dú)檢測時(shí)所應(yīng)有的活性之和，則說明樣品之間可能會(huì)有協(xié)同作用；若兩個(gè)樣品組合后檢測的活性低于它們單獨(dú)檢測時(shí)的活性，則說明樣品之間可能會(huì)有拮抗作用。運(yùn)用本發(fā)明方法，可對(duì)各個(gè)目標(biāo)峰(群)進(jìn)行捕獲和敲除，運(yùn)用生物學(xué)方法測試收集樣品的活性，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算目標(biāo)峰(群)的貢獻(xiàn)度和活性排序。另外還可將收集得到的單個(gè)目標(biāo)峰以任意方式組合后進(jìn)行活性測定，從而可對(duì)中藥各成分之間的協(xié)同、拮抗作用開展進(jìn)一步的研究。這大大拓寬了中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究方向，是一種操作簡單、成本較低的中藥整體作用機(jī)制研究方法，克服了傳統(tǒng)方法只能篩選出中藥活性成分卻不能說明活性成分之間作用方式的不足。運(yùn)用本發(fā)明的研究方法，發(fā)明人已從石蒜生物堿提取液中篩選確定四個(gè)活性成分峰，將其敲除后，再以一定方式把捕獲得到的活性成分峰進(jìn)行組合。對(duì)收集到的樣品進(jìn)行活性測試，發(fā)現(xiàn)四個(gè)活性成分峰缺失會(huì)導(dǎo)致剩余物的活性顯著降低，而各個(gè)活性成分峰之間也存在一定的協(xié)同或拮抗作用。運(yùn)用本方法，發(fā)明人已從石杉生物堿提取液中選取確定了11個(gè)主成分峰，將其敲除及捕獲后，對(duì)收集到的樣品進(jìn)行活性測試。測試結(jié)果表明活性貢獻(xiàn)大以及活性強(qiáng)的指紋峰并不一定是指紋圖譜中峰面積高的峰，而將活性高的峰敲除后，剩余物的活性也并不會(huì)顯著降低，這表明中藥是一個(gè)多成分起作用的整體，各成分之間也存在著復(fù)雜的相互作用。6以上兩種方法充分說明本發(fā)明用于中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體作用特點(diǎn)的可行性。圖l是目標(biāo)峰敲除和捕獲裝置圖。a.C18反相色譜分析柱b.紫外檢測器c.六通切換閥。圖2是靶蛋白親和選擇活性成分在線篩選裝置圖。1.HLB固相提取柱2.線圈3.六通切換閥4.C18反相色譜分析柱5.質(zhì)譜檢測器6.MCX固相提取柱。蠓是靶蛋白-活性成分復(fù)合物，，是靶蛋白，錄是活性成分。圖3中，a為石蒜生物堿提取液的指紋圖譜；b為四個(gè)活性成分峰被敲除后的紫外圖譜；c為捕獲的四個(gè)活性成分峰的紫外圖譜。圖4是石杉生物堿提取液的指紋圖譜。圖5是石杉生物堿主要的主成分峰敲除驗(yàn)證圖譜。A、2號(hào)峰被敲除后的紫外圖譜；B、3號(hào)峰被敲除后的紫外圖譜；C、5號(hào)峰被敲除后的紫外圖譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例1石蒜生物堿活性成分的檢測和評(píng)價(jià)活性成分峰敲除與捕獲篩選石蒜生物堿提取液中可以與乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)有相互作用的峰作為目標(biāo)峰，即活性成分峰，并對(duì)其進(jìn)行敲除和捕獲。石蒜生物堿的制備石蒜粉末5g，10倍體積的70%甲醇超聲提取兩次，每次30min，合并提取液濃縮至干，加入20mL2%HC1調(diào)節(jié)pH至1，過濾。濾液用l麗aOH調(diào)pH至10。2倍體積的氯仿對(duì)其萃取3次，取氯仿層合并濃縮至干。10mL甲醇溶解，離心后進(jìn)樣，高效液相色譜法分析，得其指紋圖譜。AChE的制備乙酰膽堿酯酶凍干粉2000U(Acetylcholinesterasefromelectriceel，Sigma)，用2ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液(20mM，含100mMNaCl，pH7.5)充分溶解，配制成1000U/ml，置-20°〇冰箱中分裝備用。活性成分峰的篩選取200iU石蒜生物堿提取液，氮吹儀將其濃縮至干，再用100ia三羥甲基氨基甲烷緩沖液(含2%甲醇作為增溶劑)溶解作為待測液。取10iU待測液與10iilAChE溶液(1000U/ml)均勻混合，在25。C環(huán)境下靜置lh。20yl孵育溶液上樣于SPE1(WatersOasisHLB)，甲酸銨緩沖液(20mM，pH7.5)3ml/min洗脫30s，洗脫液(3ml/min)與解離液(0.2X甲酸水溶液，lml/min)混合于線圈(2ml)解離30s，同時(shí)解離后樣品上樣于SPE2(WatersOasisMCX)，此時(shí)六通切換閥處于附圖2的上樣(LOAD)位置，用二乙胺水溶液(pH10.0)4ml/min沖洗SPE21min，隨后將六通切換閥切換至附圖2的進(jìn)樣分析(INJECT)位置，富集于SPE2上的活性成分被洗脫入LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。同時(shí)另取10iU待測液與10ia三羥甲基氨基甲烷緩沖液(含2%甲醇作為增溶劑)均勻混合作為空白對(duì)照，用同樣的方法進(jìn)行分析。比較兩者圖譜，峰面積有明顯改變的峰，即是與靶細(xì)胞有相互作用的峰，作為目標(biāo)峰，即活性成分峰。運(yùn)用基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法(參見李萍，周建良，安婧婧，李會(huì)軍，基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法，CN200810124611.1)對(duì)石蒜生物堿提取液進(jìn)行活性篩選，確定了四個(gè)峰可以和乙酰膽堿酯酶結(jié)合，如附圖3中a所示。經(jīng)與加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，峰4為活性成分加蘭他敏?；钚猿煞址宓那贸c捕獲石蒜生物堿提取液進(jìn)樣20iU，此時(shí)六通切換閥處于附圖1的上樣(LOAD)位置。目標(biāo)峰開始出峰時(shí)迅速將六通切換閥切換至附圖1的進(jìn)樣(INJECT)位置對(duì)其收集。出峰結(jié)束時(shí)再次切換六通閥至上樣(LOAD)位置，此時(shí)目標(biāo)峰收集結(jié)束。而六通閥在上樣(LOAD)位置時(shí)的收集物即為目標(biāo)峰缺失后的剩余成分群。將敲除目標(biāo)峰后的剩余成分群與石蒜生物堿提取液在相同條件(濃度、色譜檢測條件等)下進(jìn)樣分析，驗(yàn)證敲除效果，如附圖3中b所示。從圖中可以看出，本發(fā)明可以將目標(biāo)峰敲除。捕獲到的目標(biāo)峰如附圖3中c所示。色譜與質(zhì)譜分析條件C18色譜柱，高效液相色譜-電噴霧四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-ESI/QuadrupoleMS);流動(dòng)相乙腈水(各含0.05%二乙胺)梯度洗脫；紫外檢測波長為280nm;ESI離子源；正離子模式，質(zhì)量范圍1001000m/z;噴霧毛細(xì)管電壓3500V;干燥氣(N2)流速9.0L/min;干燥氣溫度32(TC;霧化壓力16psi;碎片電壓100V。活性測試測試體系要兼顧靶蛋白的高活性和小分子化合物的溶解性。因收集得到的樣品含有較多的有機(jī)溶劑，故將其濃縮至干后用緩沖液溶解，以免在活性測試時(shí)破壞靶蛋白。然而石蒜總堿極性較小，在緩沖鹽體系中不易溶解，需要選擇合適的溶媒使二者共存，如加入低濃度的增溶劑等，本實(shí)驗(yàn)使用含有2%甲醇的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽體系，乙酰膽堿酯酶在體系中活性幾乎不受影響。另外還對(duì)四個(gè)活性成分峰進(jìn)行組合(峰群123、峰群124、峰群134、峰群234)以考察各峰之間的相互作用。樣品的膽堿酯酶抑制活性測試方法為經(jīng)典的Ellman分光光度分析法。取4ylAChE(2U/ml)、80y1DTNB(lmM)、4yl樣品禾口10iil三羥甲基氨基甲烷緩沖液混合均勻，室溫孵育10min，隨后加入2y1ATCh引發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)10min后加入100ii1甲醇終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定412nm下吸光度。同時(shí)另取4y1緩沖液代替樣品再進(jìn)行測定，即為空白對(duì)照溶液吸光度。吸光度空白溶液一吸光度樣品溶液抑制率(100%)=-^-X100%卩^^fiis空白溶液檢測結(jié)果對(duì)平行制備的三批樣品進(jìn)行活性測試，抑制率平均值如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>考慮到提取液在經(jīng)過色譜柱分析后，成分會(huì)有一定的損失，我們將石蒜總堿提取液進(jìn)樣后的全部洗脫液也收集起來作為一份樣品，即為石蒜總堿洗脫液。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們可以得出1、藥材總體活性與活性成分峰群1234活性相當(dāng)，且敲除峰群1234后的剩余成分群與藥材總體活性相比大大降低，說明本發(fā)明方法擬定的活性成分基本可代表藥材的活性。同時(shí)藥材中剩余成分多數(shù)為無活性成分，或活性較差，在與篩選出的高活性成分峰競爭乙酰膽堿酯酶結(jié)合位點(diǎn)時(shí)處于劣勢，所以未被篩出。當(dāng)去除活性高的成分后，這些活性較差的成分對(duì)乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)出較弱的抑制作用。2、四個(gè)活性成分峰抑制作用排序?yàn)榉?>峰2>峰3>峰1;將活性峰三個(gè)為一組進(jìn)行組合后測定抑制率，活性排序結(jié)果為峰群123<峰群134<峰群124<峰群234，即缺4<缺2<缺3<缺l，相應(yīng)的貢獻(xiàn)度排序?yàn)榉?>峰2>峰3>峰l，說明各活性峰的貢獻(xiàn)度是與其活性成正比的。且去除峰4后，峰群123的活性顯著下降，再次說明峰4為活性最好的成分，而峰4加蘭他敏已為上市抗老年癡呆藥物，因而再次證實(shí)了本方法的準(zhǔn)確性和可靠性。3、峰群123的活性較峰1、峰3均高，但卻低于峰2單獨(dú)存在時(shí)的活性，說明峰1、3與峰2競爭靶蛋白中的同一結(jié)合位點(diǎn)。4、峰群124缺失了一個(gè)峰，但與四個(gè)峰全收集相比，其活性卻略微升高，可能就是因?yàn)橄烁吆康牡突钚苑?對(duì)其他峰的競爭作用，因?yàn)榛钚缘偷扛叩幕衔飼?huì)影響高活性成分對(duì)靶蛋白的結(jié)合，即影響其抑制活性。5、雖去除了活性較好的峰2，但峰群134的活性較四個(gè)峰全收集時(shí)只略微下降，可能是因?yàn)榉?的活性很好，在整體活性中一直處于主導(dǎo)地位，所以峰2去除后活性下降并不多。同時(shí)峰群134的活性卻沒有峰4單獨(dú)存在時(shí)高，說明峰1、3與峰4存在競爭作用，因?yàn)榉?、3活性較低，因此最終導(dǎo)致組合時(shí)活性反而下降。6、雖然缺失了一個(gè)活性峰，但峰群234的活性較四個(gè)峰全收集時(shí)反而有所增高，原因同上述第4點(diǎn)。由上述數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，某些成分雖活性不好(如峰1、峰3)，但含量較高，會(huì)占據(jù)一定數(shù)量的結(jié)合位點(diǎn)，因此可能會(huì)影響親和力較強(qiáng)的成分(如峰2、峰4)與蛋白的結(jié)合，使得整體(四個(gè)峰全收集)抑制活性有所下降。由此可見，中藥是一個(gè)多成分起作用的整體，各個(gè)成分對(duì)整體的貢獻(xiàn)并不是簡單的加和，而各個(gè)成分之間亦存在著復(fù)雜的相互作用。實(shí)施例2石杉生物堿主成分的活性檢測和評(píng)價(jià)主成分峰敲除與捕獲確定石杉生物堿提取液中峰高值較大的峰作為目標(biāo)峰，即主成分峰，并對(duì)其進(jìn)行敲除和捕獲。石杉生物堿的制備石杉粉末5g，浸入10倍體積pH值為3的鹽酸，超聲提取兩次，每次30min。合并濾液，氨水調(diào)pH值至9，用10倍體積的氯仿萃取3次。取氯仿層合并濃縮至干。10mL甲醇溶解，離心后進(jìn)樣，高效液相色譜法分析，得其指紋圖譜。主成分峰的確定將得到的石杉指紋色譜峰按照峰高值由大到小排序，選取排序靠前的色譜峰作為目標(biāo)峰，即主成分峰，最終確定了11個(gè)主成分峰，如附圖4所示。經(jīng)與石9杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，5號(hào)峰為石杉?jí)A甲。主成分峰的敲除與捕獲石杉生物堿提取液進(jìn)樣10iU，目標(biāo)峰為主成分峰，敲除與捕獲步驟同實(shí)施例1。將敲除目標(biāo)峰后的剩余成分群在與石杉生物堿提取液相同條件(濃度、色譜檢測條件等)下進(jìn)樣分析，驗(yàn)證敲除效果，如附圖5(A-C)所示。從圖中可以看出，本發(fā)明可以將目標(biāo)峰敲除。色譜與質(zhì)譜分析條件C18色譜柱，高效液相色譜-電噴霧四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-ESI/QuadrupoleMS);流動(dòng)相乙腈水(含50mM甲酸銨)梯度洗脫；紫外檢測波長為230nm;ESI離子源；正離子模式，質(zhì)量范圍1001000m/z;噴霧毛細(xì)管電壓3500V;干燥氣(N2)流速9.OL/min;干燥氣溫度32(TC;霧化壓力16psi;碎片電壓100V。活性測試考察了捕獲得到的11個(gè)主成分峰以及每個(gè)主成分峰被敲除后剩余成分群的活性。樣品處理要求及活性測試方法同實(shí)施例1。檢測結(jié)果對(duì)平行制備的五批樣品進(jìn)行活性測試，抑制率平均值如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們可以得出1、含有活性成分石杉?jí)A甲的5號(hào)峰活性最好，將其敲除后，剩余成分群活性有所下降，但是卻沒有顯著降低。很有可能是因?yàn)楫?dāng)5號(hào)峰存在時(shí)，由于其和靶點(diǎn)的親和性強(qiáng)，其他成分峰雖也有一定的膽堿酯酶抑制作用但很難和靶點(diǎn)結(jié)合，5號(hào)峰則起活性主導(dǎo)作用。當(dāng)5號(hào)峰缺失后，其他峰就可以和靶點(diǎn)結(jié)合，從而發(fā)揮活性，使得整體活性不會(huì)出現(xiàn)顯著下降。2、峰10的活性僅次于峰4，然而將其敲除后，剩余成分群的活性反而升高，甚至比石杉總堿提取液的活性還要高，這說明峰10很可能與提取液中的多個(gè)峰都有拮抗作用，將其去除后，其他峰的活性得以發(fā)揮出來。3、峰面積高即石杉總堿提取液中含量較大的成分不一定活性好，如峰3和峰11;峰面積低即含量較小的成分不一定活性弱，如峰10。由以上數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，活性貢獻(xiàn)大以及活性強(qiáng)的指紋峰并不一定是指紋圖譜中峰面積高的峰，反之，峰面積高的峰并不一定活性就好，因此只靠單純的分析中藥中的某一或幾個(gè)主成分而控制中藥質(zhì)量有失偏頗，忽視了中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體作用的特點(diǎn)。通過本發(fā)明，可考察中藥主成分對(duì)中藥整體的作用。權(quán)利要求一種基于整體觀的中藥成分作用特點(diǎn)的檢測方法，包括將待測中藥用溶劑提取，得到中藥提取液，然后按如下步驟進(jìn)行a.中藥提取液經(jīng)高效液相色譜法檢測，得到中藥指紋圖譜；b.確定指紋圖譜中的目標(biāo)峰；c.確定目標(biāo)峰后，將高效液相色譜檢測器的流出管路與六通切換閥相連，通過閥切換，收集下列洗脫液單個(gè)目標(biāo)峰和/或任意組合的目標(biāo)峰群，還收集指紋圖譜中敲除目標(biāo)峰或目標(biāo)峰群后剩余的成分群；d.對(duì)c步驟收集得到的樣品進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，得到目標(biāo)峰群的整體活性、單個(gè)目標(biāo)峰的活性排序、單個(gè)目標(biāo)峰在中藥提取物中的貢獻(xiàn)度，和各個(gè)成分之間的相互作用關(guān)系。2.權(quán)利要求1的檢測方法，其中確定指紋圖譜中的目標(biāo)峰的方法如下將指紋圖譜峰按照峰高值或者峰面積值由大到小排序，選取排序靠前的色譜峰即主成分峰，以5-20個(gè)為宜，作為目標(biāo)峰。3.權(quán)利要求1的檢測方法，其中確定指紋圖譜中的目標(biāo)峰的方法如下將中藥提取液與靶蛋白在緩沖液中共孵育，孵育溶液上樣于在線固相提取柱，緩沖液洗脫，將洗脫液與解離液混合進(jìn)行解離，解離溶液上樣于第二根在線固相提取柱，耙蛋白和緩沖鹽流出柱子，而活性成分則保留在固相提取柱上，將被保留的活性成分洗脫進(jìn)入液相-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，取不含靶蛋白的中藥提取液作為空白對(duì)照，同樣用上述方法檢測，比較兩者圖譜，峰面積發(fā)生明顯改變的峰即活性成分峰，作為目標(biāo)峰。4.權(quán)利要求3的檢測方法，其中緩沖液選自p朋.08.0的磷酸鹽緩沖液、p朋.08.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、pH6.08.0乙酸銨緩沖液或p朋.08.0碳酸氫銨緩沖液；靶蛋白為來自人體或動(dòng)物的與疾病密切相關(guān)的活性蛋白。5.權(quán)利要求4的檢測方法，其中人體或動(dòng)物的與疾病密切相關(guān)的活性蛋白選自乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶或組蛋白脫乙酰基酶。6.權(quán)利要求l的檢測方法，其中閥切換裝置中從檢測器的流出口到六通閥之間的管路為色譜peek管。7.權(quán)利要求l的檢測方法，其中用于提取中藥的溶劑選自水、C「CJ勺醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚中的一種或幾種的混合溶劑。8.權(quán)利要求1的檢測方法，其中c步驟收集得到的樣品在進(jìn)行d步驟前先將其濃縮，再用緩沖液溶解或加入低濃度的增溶劑。9.權(quán)利要求8的檢測方法，其中緩沖液選自pH6.08.0的磷酸鹽緩沖液、pH6.08.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、pH6.08.0乙酸銨緩沖液或p朋.08.0碳酸氫銨緩沖液；增溶劑選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明涉及中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，具體涉及一種基于整體觀評(píng)價(jià)中藥活性和作用機(jī)理的方法，其特征是將中藥提取液經(jīng)高效液得到中藥指紋圖譜；再確定指紋圖譜中的目標(biāo)峰；將高效液相色譜檢測器的流出管路與六通切換閥相連，通過閥切換，收集單個(gè)目標(biāo)峰、任意組合的目標(biāo)峰群和指紋圖譜中敲除目標(biāo)峰(群)后的剩余成分群；將收集得到的樣品進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，得到目標(biāo)峰群的整體活性、單個(gè)目標(biāo)峰的活性排序、單個(gè)目標(biāo)峰在中藥提取物中的貢獻(xiàn)度，和各個(gè)成分之間的相互作用關(guān)系。本發(fā)明拓寬了中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究方向，是一種操作簡單、成本較低的中藥整體作用機(jī)制研究方法。文檔編號(hào)G01N30/06GK101793883SQ20091026416公開日2010年8月4日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者劉朋,劉穎,周建良,李萍申請人:中國藥科大學(xué)