專利名稱：一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的新型探針。本發(fā)明還涉及 到雙環(huán)探針技術(shù)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前已經(jīng)有多種核酸擴(kuò)增技術(shù)被發(fā)明，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可以在 1.5-3小時(shí)內(nèi)特異地?cái)U(kuò)增靶核酸序列至幾百萬倍。近年來，由于實(shí)時(shí)PCR儀的出現(xiàn)使普通PCR 不再需要凝膠電泳分析，從而不必PCR后操作，杜絕了PCR污染。因此實(shí)時(shí)PCR技術(shù)在臨床上 應(yīng)用越來越廣泛。
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)最早使用熒光染料，例如SYBR GREEN， EVE GREEN，以指示PCR反 應(yīng)。染料法盡管簡(jiǎn)單，然而其無法識(shí)別非特異擴(kuò)增，尤其是由于引物二聚體引起的非特?cái)U(kuò)增 ，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。隨后，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)中開始應(yīng)用標(biāo)記熒光的核 酸探針，例如5'-核酸外切酶技術(shù)中使用的T叫man探針、分子信標(biāo)、熒光能量轉(zhuǎn)移探針(相 鄰探針)、蝎子引物、點(diǎn)亮探針等。實(shí)時(shí)PCR中加入探針對(duì)PC財(cái)廣增產(chǎn)物具有第二識(shí)別步驟， 從而避免了非特異擴(kuò)增，結(jié)果更加可靠。不過，如前所述的探針普遍存在設(shè)計(jì)復(fù)雜，熒光本 底高，對(duì)單堿基突變識(shí)別能力有限的缺點(diǎn)。
本發(fā)明涉及使用一種對(duì)核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的新式探針。該探針在設(shè)計(jì)思路上與前述的當(dāng)前探 針根本不同。此探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、易于合成、熒光本底低。本發(fā)明的雙環(huán)探針檢測(cè)技術(shù)是基于 對(duì)耙核酸的直接雜交，該探針由于5'端和3'端都具有與探針內(nèi)部互補(bǔ)的序列，可以形成2 個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，5'端和3'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)和淬滅劑能夠充分靠近、淬滅熒光，所以在PCR 退火時(shí)熒光本底低，而2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)也很易于打開，因此對(duì)靶序列的雜交效率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
該探針為一條寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分別存在3-6個(gè)堿基，在一定條件下可以 和探針內(nèi)部序列結(jié)合為雙鏈，使探針形成2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，寡核苷酸的5'端還標(biāo)記有熒光基團(tuán) 或熒光供體，3'端標(biāo)記有淬滅劑或者熒光受體。在一定條件下，探針部分是雙鏈，形成2個(gè) 環(huán)形結(jié)構(gòu)，當(dāng)探針與耙序列雜交時(shí)，部分雙鏈結(jié)構(gòu)被打開，環(huán)形結(jié)構(gòu)消失，探針被耙序列打開，熒光強(qiáng)度隨之發(fā)生改變。合適條件下，該探針可以與它完全互補(bǔ)的靶序列結(jié)合；而只要 耙序列里含有一個(gè)堿基的突變，該探針仍然能夠保持部分雙鏈和環(huán)形結(jié)構(gòu)；或一定設(shè)計(jì)的探 針可以跨越靶序列多變區(qū)，而對(duì)多種可能的變異靶序列仍然保持較高較一致的雜交效率。根 據(jù)此，本發(fā)明的探針可以被用于實(shí)時(shí)PCR中耙核酸的檢測(cè)。
本發(fā)明的探針?biāo)褂玫暮塑账峥梢允荄NA， RNA， LNA (鎖核酸)，或PNA (肽核酸)，或 任何非自然核苷組成。
雙環(huán)探針的設(shè)計(jì)方法
探針內(nèi)部雙鏈結(jié)合區(qū)域Tm值在大多數(shù)情況下，探針的互補(bǔ)堿基為6-20bp，其Tm值與擴(kuò) 增引物Tm值相當(dāng)或高于退火溫度2-5'C。根據(jù)本發(fā)明的一部分具體實(shí)施方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如 用于單堿基突變區(qū)分檢測(cè)的實(shí)時(shí)PCR的雙環(huán)探針互補(bǔ)區(qū)Tm值可以高于退火溫度3-8'C 。對(duì)于作 為擁有多變區(qū)靶序列的共用探針，雙鏈結(jié)合部分的Tm值，可以高于退火溫度5-12'C。
探針的長(zhǎng)度 一般情況，探針總長(zhǎng)度為12-80bp，靶序列結(jié)合區(qū)8-40bp，探針內(nèi)部互補(bǔ) 區(qū)即雙鏈結(jié)合區(qū)6-20bp， 5'端成環(huán)結(jié)合域長(zhǎng)度3-10bp， 3端成環(huán)結(jié)合域長(zhǎng)度也為3-10bp。
熒光標(biāo)記位置熒光基團(tuán)和淬滅劑都可以標(biāo)記在探針的5'端或3'端，但是一端只能標(biāo) 記熒光基團(tuán)和淬滅劑的一種。
非自然核苷酸的使用任何非自然核苷酸，如LNA，均可以在探針的任何位置使用。
雙環(huán)探針的最適檢測(cè)結(jié)構(gòu)雙環(huán)探針可以用于實(shí)時(shí)PCR中特異耙序列的擴(kuò)增檢測(cè)。熒光 基團(tuán)的信號(hào)在退火階段被檢測(cè)。目前雙環(huán)探針適用的實(shí)時(shí)PCR儀器包括Applied Biosystems (ABI)公司的7300、 7500、 7700， Bio-Rad公司的IQ Cycler, Roche公司的 LightCycler2. 0、 LightCycler480， Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000、 6000， Strategene公司的MX3000P和MX3005P等等。
雙環(huán)探針的積極效果
設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單雙環(huán)探針設(shè)計(jì)時(shí)沒有太多要求，探針序列為擴(kuò)增耙序列的一部分，只要探針 的雙鏈結(jié)合區(qū)的Tm值與相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系中的引物或使用的退火溫度保持一致或高出。任 何設(shè)計(jì)過PCR引物的人員都可以設(shè)計(jì)。
熒光本底低熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)非常靠近，淬滅效果佳。
適用范圍廣對(duì)于目前現(xiàn)存的熒光探針而言，其對(duì)于AT富集區(qū)和GC富集區(qū)的困難模板， 有著很好的應(yīng)用性。
易于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針設(shè)計(jì)時(shí)在保證有效的特異性的情況下，可對(duì)存在著小區(qū)域的多變堿
基的多型別模板能很好的指示，現(xiàn)有的多種探針大多數(shù)是能過增加與相應(yīng)的模板匹配探針條數(shù)來解決問題，而雙環(huán)探針則能很好的通過設(shè)計(jì)解決該問題。見圖2b。
合成簡(jiǎn)單無需任何特別的儀器，只需普通的DNA合成儀即可完成合成。
特異性高由于本探針存在一個(gè)自身的反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，只有但耙序列與探針結(jié)合區(qū)
的結(jié)合力大與反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)合的能量，探針才可以與靶序列發(fā)生雜交，放出熒光信號(hào)。如 果與靶序列中存在突變，如單堿基的改變，該探針可以保持自身環(huán)形結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。另外，由 于自身存在一個(gè)反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)時(shí)可以調(diào)節(jié)互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)短，來調(diào)整探針的特異性


圖l、雙環(huán)探針及其反應(yīng)原理的示意圖2a、雙環(huán)探針在PCR循環(huán)檢測(cè)時(shí)的反應(yīng)原理示意說明；
圖2b、雙環(huán)探針在PCR循環(huán)檢測(cè)時(shí)與不匹配耙序列雜交反應(yīng)機(jī)制
圖3、雙環(huán)探針用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)；模板連續(xù)10倍稀釋；
圖4、雙環(huán)探針SNP區(qū)分雜交能力；
圖5、 2條雙環(huán)探針在實(shí)時(shí)PCR中用于檢測(cè)單堿基突變； 圖6 、雙環(huán)探針在實(shí)時(shí)PCR中用于多變耙序列的檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
雙環(huán)探針構(gòu)成
本發(fā)明的雙環(huán)探針為一條寡核苷酸，寡核苷酸的5'端和3'端都存在可以與探針內(nèi)部互 補(bǔ)、結(jié)合的3-10個(gè)堿基，在一定條件下此2個(gè)區(qū)域的序列可以與探針內(nèi)部結(jié)合為雙鏈，使探 針形成2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，寡核苷酸的5'端還標(biāo)記有熒光基團(tuán)或熒光受體，3'端標(biāo)記有淬滅劑 或者熒光受體；探針內(nèi)部形成雙鏈區(qū)的堿基同樣可以標(biāo)記上熒光基團(tuán)或熒光受體，也可以是 淬滅劑或者熒光受體。雙環(huán)探針在不同的條件下可以有不同的形態(tài)，熒光值也隨之變化。當(dāng) 探針自身雜交為部分雙鏈，形成2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)和部分雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅劑，或者 熒光供體和受體，十分靠近，熒光基團(tuán)或熒光供體被淬滅劑或熒光受體淬滅，在熒光基團(tuán)或 熒光供體反射波長(zhǎng)范圍內(nèi)探針沒有熒光。當(dāng)在變性條件下，比如酸性、堿性或高溫條件下， 探針的雙鏈部分被打開，環(huán)形結(jié)構(gòu)消失，熒光基團(tuán)或熒光供體與淬滅劑或熒光受體遠(yuǎn)離，熒 光基團(tuán)或熒光供體放出熒光。在一定的雜交條件下，比如PCR的退火階段，探針可以和反應(yīng) 液中的靶序列結(jié)合，探針的雙鏈部分被打開，環(huán)形結(jié)構(gòu)消失，熒光基團(tuán)或熒光供體與淬滅劑或熒光受體遠(yuǎn)離，熒光基團(tuán)或熒光供體放出熒光。 雙環(huán)探針與耙序列反應(yīng)
雙環(huán)探針可以與溶液中單鏈寡核苷酸發(fā)生反應(yīng)。雙環(huán)探針的環(huán)狀部分以及探針內(nèi)部雙鏈 結(jié)合區(qū)可以和耙序列結(jié)合形成一種熱力學(xué)更穩(wěn)定的復(fù)式結(jié)構(gòu)。雙環(huán)探針環(huán)形結(jié)構(gòu)的消失引起 熒光的產(chǎn)生。雙環(huán)探針可以在該反應(yīng)中，將完全匹配的耙序列檢測(cè)出來，見圖l。
根據(jù)圖l，雙環(huán)探針由三段不同長(zhǎng)度的寡核苷酸l、 2、 3組成。5'端的3-10個(gè)寡核苷酸組 成的區(qū)域l，與探針內(nèi)部堿基互補(bǔ)，可與探針內(nèi)部結(jié)合成雙鏈，在本例中稱為5'端成環(huán)結(jié)合 域，5'端用熒光劑4標(biāo)記；3'末端最后3-10個(gè)寡核苷酸組成的區(qū)域3，與探針內(nèi)部堿基互補(bǔ)， 可與探針內(nèi)部結(jié)合成雙鏈，在本例中稱為3'端成環(huán)結(jié)合域，3'端用淬滅劑5標(biāo)記；探針還包 括中間較長(zhǎng)的區(qū)域2，此區(qū)域堿基與靶序列互補(bǔ)，在本例中稱為靶序列結(jié)合部位。區(qū)域3的中 間部分6-20個(gè)堿基可以探針的區(qū)域l和區(qū)域2結(jié)合形成雙鏈，從而使探針5'端和3'端形成環(huán)形 結(jié)構(gòu)。當(dāng)5'端和3'端同時(shí)成環(huán)時(shí)，該探針不發(fā)熒光因?yàn)闊晒鈩┡c淬滅劑緊密靠近。變性后成 環(huán)結(jié)構(gòu)打開，在靶DNA 6存在時(shí)，靶序列結(jié)合部位與靶DNA結(jié)合，使熒光劑與淬滅劑遠(yuǎn)離開。 從而發(fā)出熒光。
雙環(huán)探針用于核酸擴(kuò)增體系
如前所述，本發(fā)明的雙環(huán)探針可以與單鏈靶序列發(fā)生雜交反應(yīng)。從實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步 發(fā)現(xiàn)雙環(huán)探針也可以用于檢測(cè)在PCR體系中不斷指數(shù)擴(kuò)增放大的靶序列。在PCR反應(yīng)每個(gè)循環(huán) 周期中包括高溫變性、低溫退火和延伸三個(gè)階段。雙環(huán)探針在變性階段由于高溫變性使雙 鏈不能形成而產(chǎn)生熒光；在退火階段，假若沒有靶序列存在，探針反向互補(bǔ)區(qū)域?qū)⒔Y(jié)合成雙 鏈，探針形成一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅劑靠近，而不產(chǎn)生熒光；但是當(dāng)有耙序列存在 時(shí)，探針將與耙序列雜交，探針自身形成的部分雙鏈打開，環(huán)形結(jié)構(gòu)隨即消失，從而產(chǎn)生熒 光。在延伸階段，探針會(huì)從靶序列上解離。通過對(duì)PCR每個(gè)循環(huán)的退火階段的熒光信號(hào)的檢 測(cè)，在實(shí)時(shí)狀態(tài)中擴(kuò)增產(chǎn)物就可以被檢測(cè)到了。見圖2。
根據(jù)圖2所示一種雙環(huán)探針11和雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物21，在媒介PCR周期中二者都存在于PC財(cái)廣 增反應(yīng)中。探針11包括5'端成環(huán)結(jié)合域鏈12、耙序列結(jié)合部位鏈13和3'端成環(huán)結(jié)合域鏈14， 5'端由熒光劑15標(biāo)記，3'端由淬滅劑16標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物21包括互補(bǔ)的鏈22、 23。在高溫變性 時(shí)，成啞鈴狀的探針5'端環(huán)和3'端環(huán)打開，擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈22、 23分離。當(dāng)溫度低于退火溫度 時(shí)(為PCR引物退火)，探針11的靶序列結(jié)合部位鏈13和其互補(bǔ)的擴(kuò)增產(chǎn)物的靶鏈雜交。熒 光劑15不被淬滅劑淬滅，而發(fā)出熒光。
只要調(diào)節(jié)探針自身雙鏈結(jié)合部分互補(bǔ)堿基的數(shù)量以及環(huán)形區(qū)域堿基數(shù)量，就可以調(diào)節(jié)探針對(duì)突變堿基或不匹配堿基的區(qū)分檢測(cè)能力。對(duì)單堿基突變區(qū)分，雙鏈結(jié)合部分要有一定的 Tm值和堿基數(shù)量，探針區(qū)域2 Tm值約比雙鏈結(jié)合部分Tm值高2-5'C。對(duì)于作為擁有多變區(qū)耙 序列的共用探針，雙鏈結(jié)合部分的Tm值不需太高，低于探針區(qū)域2 Tm值5-1(TC。
實(shí)施例l:乙肝病毒雙環(huán)探針實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)
為考察雙環(huán)探針應(yīng)用在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的有效性，PCR模板為一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品。 反應(yīng)體系總體積為50y 1，包括5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每種dNTP 400線上下游引物 0.4 yM，探針O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，5yl模板DNA。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)在RotorGene 3000實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為96。C預(yù)變性2min，隨后96。C變性15 s， 68°C-59°C ( 每循環(huán)一次溫度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO個(gè)循環(huán)；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (檢測(cè)FAM、熒光信號(hào))，72°C 15 s，共35個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)DNA連續(xù)IO倍梯度稀釋， H20作為陰性對(duì)照。雙環(huán)探針包括一段與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核酸序列。上下游引物擴(kuò)增乙肝病 毒的S區(qū)基因(NC-003977)，擴(kuò)增174bp。其上游引物為5'-caacatcaggattcctaggacc-3' ，下游引物為5'-ggtgagtgattggaggttg-3'，探針的靶序列靠近上游引物，序列為
FM-5' - AGTCTAG CAGACT :TAGAC TCGTCGT 3GAC TTCACC ACG_ 3' -B恥
^-^_ 。探針上帶有方框標(biāo)示的堿基為
探針內(nèi)自身雙鏈結(jié)合區(qū)，5端和3端帶有下劃線標(biāo)示的堿基為參與形成探針內(nèi)雙鏈結(jié)合區(qū)的堿基。
在PC財(cái)廣增時(shí)熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)測(cè)量了35個(gè)循環(huán)，其結(jié)果如圖4所示。初始的靶濃度在稀釋物 最濃時(shí)的線41，線42、 43、 44分別表示當(dāng)模板被連續(xù)10倍稀釋3個(gè)梯度后的熒光曲線。線45 說明無靶(水)的對(duì)比。
與引物相同濃度或?yàn)橐餄舛鹊?/2 1/4，雙環(huán)探針可以很快與耙序列雜交結(jié)合，顯出 熒光信號(hào)。沒有耙序列存在時(shí)，探針自身互補(bǔ)的堿基分子內(nèi)雜交，形成穩(wěn)定的雙環(huán)結(jié)構(gòu)和一 段雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠近，自身熒光被淬滅。因此，雙環(huán)探針可以用于實(shí)時(shí)核 酸擴(kuò)增檢測(cè)，可以用于檢測(cè)乙肝病毒的PCR檢測(cè)技術(shù)中。
實(shí)施例2:雙環(huán)探針用于區(qū)分單堿基突變耙序列
選擇人類血小板同種異型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-l基因?yàn)檠?究對(duì)象。HPA-l由于單堿基的突變即T〉C突變導(dǎo)致HPA-la和HPA-lb兩個(gè)抗原。雙環(huán)探針設(shè)計(jì)為 針X寸HPA—la抗原其因序歹[J為. 5'—昍X—J1100 G^JAGGTCAGCCC^GAGGC:AGGtrGCCTC卜Dabcyl-3"
帶有下劃線的堿基為突變發(fā)生堿基，帶有外框的堿基為成環(huán)結(jié)合區(qū)堿基。合成的雜交序列比探針在兩端各多出2個(gè)堿基。HPA-la耙序列為5'-GCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCG-3'，帶有下劃 線的堿基為突變發(fā)生堿基；HPA-lb靶序列為5'-GCCCTGCCTCGGGGCTCACCTCG-3'，帶有下劃 線的堿基為突變發(fā)生堿基；采用25 yl反應(yīng)體系，內(nèi)含1X buffer (67 mM Tris-HC1， 16.6 mM (NH4)2S04， 85 y g/mL BSA， pH 8.0) ， 2. 0 mM MgCl2， 0.4 yM探針和1.6 y M雜交序列 。反應(yīng)程序?yàn)?4。C 1 min; 94。C 10 s， 56。C 15 s， 40個(gè)循環(huán)。使用Rotor-Gene 3000實(shí) 時(shí)PCR儀在每次雜交時(shí)(即56"C時(shí))采集HEX熒光數(shù)據(jù)。
圖4表示對(duì)完全互補(bǔ)的靶序列(線31)和突變的靶序列(線32)的實(shí)時(shí)熒光信號(hào) (Fluoresoenoe)觀測(cè)?？梢园l(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度上升了30倍以上。如果在耙序列中有一個(gè)單核苷酸 或一個(gè)以上的核苷酸突變，將不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。
實(shí)施例3:實(shí)時(shí)PCR中用雙環(huán)探針檢測(cè)SNP
選擇人類血小板同種異型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-4基因，由 于該基因內(nèi)存在一個(gè)G〉A(chǔ)的突變，而導(dǎo)致產(chǎn)生HPA-4a和HPA-4b兩個(gè)血小板抗原，HPA-4a為野 生型，HPA-4b為突變型。針對(duì)兩個(gè)抗原的基因序列分別設(shè)計(jì)雙環(huán)探針，兩個(gè)探針只相差l個(gè) 堿基，并選擇已知基因型的3個(gè)典型樣品進(jìn)行試驗(yàn)。l個(gè)為純和HPA-4a樣品，l個(gè)為純和 HPA-4b樣品，l個(gè)為雜合樣品，同時(shí)含有HPA-4a和HPA-4b。試驗(yàn)時(shí)同時(shí)做一個(gè)無(陰性)樣 品即H20對(duì)照。野生型(HPA-4a)探針序列為
5" -FM- XAAAGCT 3GTCAGCTn^GCATCTGGGT :CAGATG -BHQ- 3'
5" -HEX-TTGCATCTACCCAGATGC^AMGCTCACCTCAGCTT_B恥-3;
，突變型(HPA-4b)探針序列為 ，帶有下劃線的堿基為突變發(fā)生堿基
，帶有外框的堿基為成環(huán)結(jié)合區(qū)堿基。上游引物為5'-GGACCTGTCTTACTCCATGAAGG-3';下 游引物為5'-GAAGCCAATCCGCAGGTTAC-3'。
反應(yīng)總體系為25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每種dNTP 400 y M，每種引物 0.4 yM，每種探針O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)在 RotorGene 3000實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為96°C預(yù)變性2min，隨后96。C變性15 s， 68°C-59°C (每循環(huán)一次溫度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO個(gè)循環(huán)；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (檢測(cè)FAM和HEX種熒光信號(hào))，72°C 15 s，共35個(gè)循環(huán)。
圖5顯示了實(shí)時(shí)熒光PCR循環(huán)數(shù)據(jù)的結(jié)果。相當(dāng)于野生型靶的探針發(fā)出的熒光被正方實(shí)心 表示，相當(dāng)于突變異種靶的探針發(fā)出的熒光被實(shí)心圓環(huán)表示。
相對(duì)于陰性樣本，野生型探針(曲線51)，及突變型探針(曲線52)，均沒有發(fā)出熒光。結(jié)果顯示僅當(dāng)模板包括在反應(yīng)中相應(yīng)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。當(dāng)兩個(gè)靶均在樣本中時(shí)，野生型探針 (曲線57)，及突變探針(曲線58)，熒光強(qiáng)度顯著增加。但是，對(duì)于野生型靶，熒光強(qiáng)度 顯著增強(qiáng)來自于野生型探針(曲線55)，而不是突變異種型探針(曲線56)。相反，對(duì)于突 變型靶，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)來自于突變型探針(曲線53)，而不是野生型探針(曲線54)。 結(jié)果顯示僅僅是匹配的探針可以產(chǎn)生正確的信號(hào)。野生模板與突變異種模板的100%完全檢測(cè) 。這證明了根據(jù)本發(fā)明的探針通過一個(gè)單核苷區(qū)分了靶。當(dāng)無模板時(shí)無信號(hào)被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有兩 個(gè)模板時(shí)，兩個(gè)信號(hào)均被發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施列4:雙環(huán)探針用作簡(jiǎn)并探針檢測(cè)多變靶序列
在實(shí)時(shí)PCR的臨床應(yīng)用中，尤其是對(duì)傳染病中致病微生物的檢測(cè)，常常碰到致病微生物 型別多，變異快，即便是該致病微生物的保守基因也很能找到每個(gè)型別都相同的序列，用來 引物和探針設(shè)計(jì)，往往需要針對(duì)多個(gè)型別設(shè)計(jì)多個(gè)檢測(cè)探針，不僅增加了成本，也增加了實(shí) 驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度。
本例使用雙環(huán)探針進(jìn)行解脲支原體(UU)的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。解脲支原體可以分為14個(gè)標(biāo)
準(zhǔn)血清型。選用解脲支原體較保守的區(qū)域解脲酶基因區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和探針。上游引物為
:5'-GATCACATTTCCACTTATTTGAAACA-3';下游引物為5'-AAACGACGTCCATAAGCAACTTTA-3'。 FAM-5， - ICAGGTGC |aCCACAAGCACCTC CTACGATmiGTTC|AAATCGTAG|~3" -B恥
探針為
^帶有下劃線的堿
基為多變區(qū)堿基，帶有外框的堿基為成環(huán)結(jié)合區(qū)堿基。
反應(yīng)總體系為25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每種dNTP 400 y M，每種引物 0.4 yM，每種探針O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)在 RotorGene 3000實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為96°C預(yù)變性2min，隨后96。C變性15 s， 68°C-59°C (每循環(huán)一次溫度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO個(gè)循環(huán)；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (檢測(cè)FAM熒光信號(hào))，72°C 15 s，共35個(gè)循環(huán)。
圖6顯示了實(shí)時(shí)熒光PCR循環(huán)數(shù)據(jù)的結(jié)果。A、 B、 C、 D、 E、 F代表不同解脲支原體血清型 樣品的檢測(cè)結(jié)果，無論哪種血清型，探針都很好地給予檢出。
權(quán)利要求
1.一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，包括與靶序列互補(bǔ)的單鏈靶序列結(jié)合部位；位于所述的單鏈靶序列結(jié)合部位5’端的5’端成環(huán)結(jié)合域；和位于所述的單鏈靶序列結(jié)合部位3’端的3’端成環(huán)結(jié)合域；其中5’端成環(huán)結(jié)合域及3’端成環(huán)結(jié)合域分別與所述的靶序列結(jié)合部位中的一段序列互補(bǔ)，使探針成為2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)；所述探針的5’端或3’端中的一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)或熒光供體，另一端標(biāo)記有淬滅劑或者熒光受體。
2.如權(quán)利要求l所述的一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于 所述的5'端成環(huán)結(jié)合域的長(zhǎng)度為3-10個(gè)堿基。
3.如權(quán)利要求l所述的一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于 所述的3'端成環(huán)結(jié)合域的長(zhǎng)度為3-10個(gè)堿基。
4.如權(quán)利要求l所述的一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于 所述的探針總長(zhǎng)度為12-80bp，其中靶序列結(jié)合區(qū)8-40bp。
5.如權(quán)利要求l所述的一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于 所述的探針中的核苷酸為DNA或RNA。
6.如權(quán)利要求l所述的一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于 所述的靶序列結(jié)合部位、5'端成環(huán)結(jié)合域及3'端成環(huán)結(jié)合域中，至少有一個(gè)包括至少一個(gè) 非自然的核苷。
7.一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其中靶擴(kuò)增產(chǎn)物采用熒光 標(biāo)記探針檢測(cè)，包括使用一種單鏈核酸探針對(duì)所述的靶序列進(jìn)行雜交檢測(cè)，其包括 與耙序列互補(bǔ)的單鏈耙序列結(jié)合部位； 位于所述的單鏈耙序列結(jié)合部位5'端的5'端成環(huán)結(jié)合域；和位于所述的單鏈靶序列結(jié)合部位3'端的3'端成環(huán)結(jié)合域；其中5'端成環(huán)結(jié)合域及3'端成環(huán)結(jié)合域分別與所述的靶序列結(jié)合部位中的一段序列互補(bǔ)，使探針成為2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)；所述探針的5'端或3'端中的一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)或熒光供體，另一端標(biāo)記有淬滅劑 或者熒光受體。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其特征 在于所述的5'端成環(huán)結(jié)合域的長(zhǎng)度為3-10個(gè)堿基。
9. 如權(quán)利要求7所述的一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其特征 在于所述的3'端成環(huán)結(jié)合域的長(zhǎng)度為3-10個(gè)堿基。
10. 如權(quán)利要求7所述的一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其特 征在于所述的探針總長(zhǎng)度為12-80bp，耙序列結(jié)合區(qū)8-40bp。
11. 如權(quán)利要求7所述的一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其特 征在于所述的探針中的核苷酸為DNA或RNA。
12. 如權(quán)利要求7所述的一種實(shí)時(shí)核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)方法，其特 征在于所述的耙序列結(jié)合部位、5'端成環(huán)結(jié)合域及3'端成環(huán)結(jié)合域中，至少有一個(gè)包括 至少一個(gè)非自然的核苷。
13. 一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，其特征在于該探針為一條寡核 苷酸，寡核苷酸的5端和3端分別存在3-6個(gè)堿基，在合適條件下可以和探針內(nèi)部序列結(jié)合為 雙鏈，使探針形成2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，寡核苷酸的5'端或3'端中的一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)或熒光 供體，5'端或3'端的另一端標(biāo)記有淬滅劑或者熒光受體；當(dāng)探針與靶序列雜交時(shí)，部分雙 鏈結(jié)構(gòu)被打開，環(huán)形結(jié)構(gòu)消失，探針被靶序列打開，熒光強(qiáng)度隨之發(fā)生改變。
14. 一種檢測(cè)核酸靶序列的方法，包括，在懷疑帶有靶序列中的樣品 中加入如權(quán)利要求1一6或13中任一項(xiàng)所述的探針，并測(cè)量指示與所述的靶序列雜交的熒光標(biāo) 記的熒光的增加情況。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針，屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域。該探針包括與靶序列互補(bǔ)的單鏈靶序列結(jié)合部位；5’端成環(huán)結(jié)合域和3’端成環(huán)結(jié)合域；其中5’端成環(huán)結(jié)合域及3’端成環(huán)結(jié)合域分別與所述的靶序列結(jié)合部位中的一段序列互補(bǔ)，使探針成為2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于本探針存在一個(gè)自身的反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)。因此本發(fā)明的探針特異性強(qiáng)，另外，由于自身存在一個(gè)反向互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)時(shí)可以調(diào)節(jié)互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)短，來調(diào)整探針的特異性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101671744SQ200910300518
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者何東華, 鄭立謀, 力 阮 申請(qǐng)人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司