專利名稱：保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種組織細胞蛋白裂解液的提取裝置，尤其涉及一種保持蛋白磷
酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液的提取裝置，該裝置在提取活體組織裂解液的過程中同時抑制 磷酸酶，從而保持其中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。
背景技術(shù)：
迅速裂解動物組織是尋找和研究生物標記、抗體、蛋白表達、蛋白相互作用以及 ELISA和免疫沉淀等實驗所必須的步驟。此外，生物體細胞內(nèi)的磷酸化和去磷酸化的蛋白表 達能揭示一系列生物現(xiàn)象，包括與細胞內(nèi)信號傳遞、細胞凋亡、細胞分化和增殖相關(guān)聯(lián)的分 子開關(guān)。 目標蛋白通過蛋白激酶，在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上轉(zhuǎn)移磷酸基團，使得蛋 白處理磷酸化狀態(tài)，其鍵結(jié)合改變了蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及結(jié)合反應(yīng)能力。蛋白的磷酸化檢 測被廣泛應(yīng)用于疾病的的體外診斷。 除具用專業(yè)分子生物實驗的部門外，如在醫(yī)院鏡檢部門的口?；铙w組織檢驗過 程中，都是預(yù)先一周內(nèi)由專業(yè)分子生物實驗室制備磷酸酶抑制劑，放入某種容器或試管內(nèi) 準備好，在使用時容器放置在冰上，預(yù)備在鏡檢的操作室內(nèi)，或把活檢組織直接投入液氮。 其制備過程繁瑣并會對鏡檢部門原有的設(shè)置和條件產(chǎn)生影響，此外，配制的磷酸酶抑制劑 易受空氣中酸性物質(zhì)(如二氧化碳等)的影響而使得其對酶的抑制失效，或者在從液氮中 復(fù)蘇，蛋白磷酸化的狀態(tài)也會有很大變化。由于采集到的活體組織又需要快速裂解，以穩(wěn)定 其中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，而磷酸酶抑制劑不宜長期保存，在檢測過程中組織裂解液當中 的磷酸化蛋白狀態(tài)易發(fā)生改變，都影響了被檢測的蛋白磷酸化水平。 實驗室配制的磷酸酶抑制劑其保存時間通常為兩周左右，當其暴露于空氣中時， 其抑制效果會顯著下降。GENMED公司提供一種磷酸酶抑制劑混合液，包括氟化鈉(Sodium Fluoride)、饑酸納(SodiumOrthovanadate)、焦憐酸納(Sodium Pyrophosphate)禾口甘油憐 酸(Glycerophosphate)等化合物實現(xiàn)對組織提取液中磷酸化酶的抑制，使樣品中的各類 蛋白質(zhì)處理原始的生理狀態(tài)。在4t:溫度下，該抑制劑的穩(wěn)定性能保持12個月。 以醫(yī)院鏡檢部門為例，其對活體組織的檢驗通常采用微陣列檢測(即蛋白或組織 芯片)，這就要求活體組織細胞經(jīng)常規(guī)方法裂解后，還必須要經(jīng)過測定和校正裂解液中的蛋 白質(zhì)濃度后，才能進行相應(yīng)的蛋白磷酸化水平檢測。因此受到多種因素的影響(如裂解液 制備時間過長，磷酸酶抑制也會不穩(wěn)定)，使得磷酸酶抑制劑的抑制效果下降，導(dǎo)致樣品中 蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變，并進而影響檢測結(jié)果。還有檢測方法借助熒光技術(shù)直接作 用于被檢測組織上，但其受細胞膜的阻礙作用，抗體效果會受表達不穩(wěn)定影響。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝 置，盡可能地保護磷酸化狀態(tài)并能使組織細胞盡快裂解的方法，以適應(yīng)于醫(yī)院活檢組織鏡檢的需要，簡化和統(tǒng)一被檢的樣本的制備，從而提高檢測的通量、制備樣本一致性和實時的 準確性，來更好地評價生命現(xiàn)象。本裝置能實現(xiàn)不具備特殊實驗室條件的單位，如醫(yī)院鏡 檢部門對活檢組織的蛋白磷酸化檢測的樣本制備。 鏡檢指通過纖維鏡進行的檢測，纖維鏡是一種可隨意彎曲、細小、柔軟的內(nèi)腔鏡， 由導(dǎo)光性能良好的玻璃纖維制成，其外部有冷光源照明，能按操作要求進入成角度的生理 或病理性小腔道內(nèi)，觀察微小的病變，采取組織或細胞樣本。 在纖維氣管鏡或胃腸道鏡檢過程中，技術(shù)人員通常需要對活體器官進行取樣，以 便于通過進一步的組織檢測分析病情。這些活體組織在離體后，其中某些蛋白質(zhì)的磷酸化 水平會發(fā)生變化，使得其與生理狀態(tài)不相一致，比如在離體狀態(tài)下，JNK蛋白的磷酸化程 度在逐漸增加，而ERK蛋白的磷酸化程度則在減少。因此，在離體的組織或細胞樣本中需要 加入磷酸酶抑制劑，減少活組織離體后某些蛋白磷酸化表達變化，保持活組織離體后蛋白 磷酸化原有狀態(tài)，以確保檢測的結(jié)果與實際的生命狀況相一致，能為生命現(xiàn)象和疾病的診 斷提供依據(jù)。 在鏡檢的整個過程當中，實時的蛋白磷酸化狀態(tài)是極其不穩(wěn)定或易發(fā)生改變，不 僅需要對離體樣本的及時處理，還需要對處理后樣品制備及快速地分析。因此，保持組織細 胞的蛋白磷酸化狀態(tài)的技術(shù)一直是很重要的。 活檢組織源自于活體動物器官的細胞或形態(tài)相似、功能相同的細胞群及其細胞間 質(zhì)?；铙w動物包括人、野生動物和家畜(Livestock)。野生動物為自然狀態(tài)下未經(jīng)人工馴化 的動物。家畜是為了提供食物來源而人工飼養(yǎng)的動物，如狗、鼠、倉鼠、豬、兔、奶牛、水牛、 公牛、綿羊、山羊、鵝和雞等，活體動物器官的具體類型，但不僅限于，如鼻、喉、食管、支氣 管、胃、十二指腸、膽道、結(jié)腸、膀胱或?qū)m腔等。 先預(yù)冷凍裝置盒o至-6t:—個小時，再進行蛋白磷酸酶抑制劑和裂解液制備及分 裝在微型離心管內(nèi)，然后將其微型離心管置于真空容器中，在o-4t:避光條件下的制劑能有 效保存14-16個月，以實現(xiàn)醫(yī)院等鏡檢部門對活檢組織的快速檢測。 —種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括 密閉容器，由頂蓋和容器腔體組成，腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積小于腔體的 容積；12至24個大小相同的微型離心管，置于密閉容器的腔體內(nèi)，各個試管中盛有相同體 積的裂解液及磷酸酶抑制劑。 另一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括 由頂蓋和雙層容器腔體組成的密閉容器，容器腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積
小于腔體的容積；管槽與容器腔體側(cè)面內(nèi)壁固定連接，將腔體分為上下兩層，12至24個大
小相同的微型離心管垂直放置于管槽內(nèi)；各個微型離心管中盛有相同體積的裂解液及磷酸
酶抑制劑。 容器腔體側(cè)面和頂蓋面至少設(shè)有一個與內(nèi)腔向連通的開口。 裂解液為1-2% (w/v)十二烷基磺酸鈉溶液，磷酸酶抑制劑2mmol/L釩酸鈉溶液 (pH10)，裂解液和磷酸酶抑制劑按等體積混合后分裝于微型離心管內(nèi)。 真空裝置通過密閉容器上的開口與容器連接，將內(nèi)腔中的空氣排除，使其真空度 至少小于-lPa，優(yōu)先選擇真空度為-5Pa--10Pa。之后將開口密閉并將裝置置于4。C保存。 使用時，打開容器頂蓋，將相同體積和相同類型的活檢組織樣本置于試管內(nèi)，研磨并離心后得到上清組織裂解液，直接用于蛋白的微陣列檢測。 為了避免溶解于溶液中氣體的影B向，實現(xiàn)對磷酸酶更好的抑制效果，可以通過超
聲的方式將配制后的磷酸酶抑制劑和裂解液中的氣體排除。具體方法如將溶液先超聲
10-30分鐘后，靜置20-60分鐘，再振搖后超聲5-15分鐘后，靜置10-30分鐘。 微型離心管為1.8ml Eppendorf離心管。 冷凍液為試管提供低溫環(huán)境，具體為水。 本實用新型所涉及的術(shù)語與其在本領(lǐng)域的一般概念相同。 所述的"真空度"為相對真空度。 本實用新型技術(shù)方案實現(xiàn)的有益效果 本實用新型通過將微型離心管置于本裝置的管槽中，有效控制其中液體的溫度， 結(jié)合真空度小于_5Pa密閉容器使得磷酸酶抑制劑裂解液能較長時間保存，使得裂解和抑 制磷酸化在o-4t:下同時進行，實現(xiàn)了保持原有的蛋白磷酸化狀態(tài)和組織細胞裂解液的快 速制備。 本裝置能在5-6小時內(nèi)完好保存蛋白的生理狀態(tài)，可集中收集多個活體組織，還 能穩(wěn)妥護送組織樣本到分子生物實驗中心進行磷酸化蛋白微陣列的檢測。置于該裝置的磷
酸酶抑制劑可在o-4t:的冷藏柜里避光保存l年半。適用于醫(yī)院活體組織磷酸化蛋白微陣 列的檢測，減少對醫(yī)院纖維鏡檢部門原有的設(shè)置影響和條件要求。

圖1為提取活體組織裂解液的裝置一實施例的示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明實施例僅用以說明本發(fā)明的技
術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員
應(yīng)當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精
神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。 實施例1 結(jié)合圖l，本發(fā)明的一保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括由頂 蓋11和容器腔體12組成的密閉容器l，腔體內(nèi)盛有冷凍液體13，其體積小于容器腔體容 積。管槽4與容器腔體12側(cè)面內(nèi)壁固定連接，將腔體分為上下兩層，12至24個大小相同的 微型離心管2設(shè)置于管槽內(nèi)，各個離心管中盛有裂解液和磷酸酶抑制劑按相同體積混合的 溶液21。 容器腔體側(cè)面設(shè)有一個與內(nèi)腔向連通的抽氣口 3。 真空裝置通過密閉容器上的開口與容器內(nèi)腔連接，將內(nèi)腔中的空氣排除，使其真 空度小于-lPa，最后用橡膠塞將抽氣口 3封閉。
權(quán)利要求一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特征在于，包括密閉容器，由頂蓋和容器腔體組成，腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積小于腔體的容積；12至24個大小相同的微型離心管，置于密閉容器的腔體內(nèi)，各個試管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
2. —種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特征在于包括 密閉容器，由頂蓋和雙層容器腔體組成，容器腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積小于腔體的容積；管槽，與容器腔體側(cè)面內(nèi)壁固定連接，將腔體分為上下兩層，12至24個大小相同的微 型離心管設(shè)置于管槽內(nèi)；各個微型離心管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特 征在于所述磷酸酶抑制劑為釩酸鈉溶液，所述裂解液為十二烷基磺酸鈉溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特 征在于容器腔體側(cè)面和頂蓋面設(shè)有一個與容器內(nèi)腔相連通的抽氣口 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特 征在于所述密閉容器，腔體內(nèi)的真空度為-5Pa--10Pa。
專利摘要一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括由頂蓋和容器腔體組成的密閉容器，腔體內(nèi)盛有冷凍液體；12至24個大小相同的微型離心管，置于密閉容器的腔體內(nèi)，各個試管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。本裝置磷酸酶抑制劑及裂解液有效期14-16個月。使用本裝置，能使活檢在抑制磷酸酶同時還同步進行組織細胞裂解，蛋白濃度為1-4μg/μl，不測定和校正蛋白濃度，即可直接用于磷酸化蛋白微陣列檢測。該方法和裝置能保持被檢測組織的蛋白磷酸化狀態(tài)，適合醫(yī)院等部門的組織鏡檢需要，簡化樣本制備步驟及縮短時間，能保證檢測組織質(zhì)和量的一致性，從而能提高了檢測速度和數(shù)量。實現(xiàn)了快速制備組織細胞裂解液。
文檔編號G01N1/28GK201464253SQ20092007162
公開日2010年5月12日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者吳建乾, 吳達龍, 周新妹, 宋柱芹, 尹滿香, 張成文, 張高忠, 李斌, 杜開齊, 林雪平, 顧旭東 申請人:嘉興學(xué)院;張成文