專利名稱：大觀霉素elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測大觀霉素殘留量的試劑盒，特別是檢測肌 肉、肝臟中大觀霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。 ( 二 )背景技術(shù)大觀霉素是氨基糖苷類抗生素，主要通過作用于細(xì)菌核糖體30S 亞基來抑制其蛋白質(zhì)的合成，對革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、沙門菌、布魯菌、變形菌、銅綠 假單胞菌、巴氏桿菌等)有較強(qiáng)作用，對革蘭陽性菌和支原體亦有一定作用。我國獸藥典獸 藥使用指南(化學(xué)藥品巻，2005版)及美國FDA均規(guī)定本品在牛、羊、豬、雞等食用組織中最 高允許殘留量分別為肌肉500/zg/kg ;脂肪、肝2000/zg/kg和腎5000/zg/kg。 目前主要有高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、微生物學(xué)方法等，但是，這些
方法即缺乏必要的靈敏度，亦有繁雜的衍化過程，缺乏特異性等，難以推廣應(yīng)用。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的大觀霉 素殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技 術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品中大觀霉素殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要 的時間。 本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種檢測動物源性食品中大觀霉素殘留量的酶聯(lián)免疫 試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶 位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯試劑板作為 固相載體，酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個可拆 裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，在試劑盒酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被大觀霉素偶聯(lián)抗原制成 檢測板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將放入真空鋁箔袋中，將 6瓶lml梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、lml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、7ml酶標(biāo)二抗、10ml大觀霉素抗體 工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶液試 劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板 膜、自封袋、說明書、質(zhì)控報告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個試劑盒中的 試劑足夠進(jìn)行96次測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將 板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果 的準(zhǔn)確性。檢測時，樣本中的大觀霉素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的大觀霉素偶聯(lián)抗原競 爭抗大觀霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含大觀霉 素的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中大觀霉 素殘留量，其操作簡便易行。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度肌肉、肝臟樣本的最低檢測限均為 10ii g/kg ;肌肉、肝臟樣本的回收率為85% ±15% ;相對于其他大觀霉素檢測方法，本試劑 盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、振蕩器、均質(zhì)器和微量加樣器，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備， 所需成本較低。 本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于大觀霉素殘留量的檢

圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm); 圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm); 圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖； 圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖； 圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖； 圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖； 圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。 參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被大觀霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外 框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫 箱內(nèi)反應(yīng)時封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2);透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮 洗滌液；藍(lán)色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色塑 料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml 顯色液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試 劑瓶(8)用于封裝7ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝10ml大觀霉素抗 體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝lml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及l(fā)ml高濃度標(biāo) 準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)， 50ml濃縮復(fù)溶液(11) ， 7ml顯色液A液瓶位(14) ， 7ml顯色液B液瓶位(13) ， 7ml終止液瓶 位(12) ， 10ml大觀霉素抗體工作液瓶位(16) ，7ml酶標(biāo)二抗瓶位(15) ，6種lml/瓶各種濃 度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及1瓶lml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式本實(shí)用新型的實(shí)施例 —、樣本的前處理 1.配液 配液1 :1%三氯乙酸-0.0謹(jǐn)磷酸鹽緩沖液 稱取10. 0g三氯乙酸、4. 0g氯化鈉、0. lg氯化鉀、0. lg磷酸二氫鉀、2. 68g十二水
合磷酸氫二鈉加去離子水溶解定容至1L。 配液2:復(fù)溶工作液 用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 : 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1
份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4t:環(huán)境可保存一個月。 配液3 :洗滌工作液 用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 : 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4t:環(huán)境可保存一個月。 2.以大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加的肌肉、肝臟樣本處理步驟 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入 10ml lX三氯乙酸-0.01M磷酸緩沖液，用振蕩器振蕩5min ;3000g以上，室溫(20-25。C )離 心5min ;移取200 y 1上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入200 y 1復(fù)溶工作液充分混勻 (pH值在5 7);取20 iil用于分析。[0027] 二、使用試劑盒的操作步驟 1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫(20_25°C )平衡30min以上，注意每種液 體試劑使用前均須搖勻。 2、取出板架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗滌液在使用前也需要回溫。 4、編號將樣本溶液和標(biāo)準(zhǔn)品工作液對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品 工作液做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。 5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液20 ii 1到各自的微孔 中，隨即加入酶標(biāo)二抗50ia，然后加抗體工作液80ia/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板， 37。C環(huán)境中反應(yīng)30min。 6、取出微孔板，甩出孔內(nèi)液體，用洗滌液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭剌破)。 7、顯色每孔先加入底物液A液50 iU，再加B液50 y 1，輕輕振蕩混勻，37。C環(huán)境 中避光顯色15min。 8、測定每孔加入終止液50 ii 1，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用 雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD (若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用 目測法可進(jìn)行判定)。 三、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第l種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與大觀霉素殘留量成負(fù)相關(guān)。 1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(P g/L)。 假設(shè)樣本1的吸光度值為0. 113，樣本2的吸光度值為0. 554，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是 0 y g/L為1. 519 ; 1 ii g/L為1. 200 ;2 ii g/L為0. 850 ;4 ii g/L為0. 436 ;8 ii g/L為0. 186 ; 16 y g/L為0. 079。則樣本1的濃度范圍是8 ii g/L-16 y g/L乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)；樣本 2的濃度范圍是2 ii g/L-4 ii g/L乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 2、定量分析 (1)百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) = - x 100%
BO B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(P g/L)的半對數(shù)為橫坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng) 的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中大觀霉素實(shí)際殘留量。 四、測定前的注意事項(xiàng) 1、室溫低于2(TC或試劑及樣本沒有回到室溫(20_25°C )會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。 2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性
不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3、每加一種試劑前需要將其搖勻。 4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。 5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試 劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中 的試劑。 6、儲存條件 保存試劑盒于2-8 °C ，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 7、試劑變質(zhì)的跡象 發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)時，表示試劑可能變質(zhì)。 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長 反應(yīng)時間，但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。
權(quán)利要求一種檢測動物源性食品中大觀霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被大觀霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo) 板，放于真空鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料 瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液 用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔 預(yù)包被大觀霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，lml/ 瓶，濃度分別為0 ii g/L， 1 ii g/L， 2 ii g/L， 4 ii g/L， 8 y g/L， 16 y g/L ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶， lml ;酶標(biāo)二抗1瓶，7ml ;抗體工作液1瓶，10ml ;顯色液A液1瓶，7ml ;顯色液B液1瓶， 7ml ;終止液1瓶，7ml ;濃縮洗滌液1瓶，40ml ;濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測動物源性食品中大觀霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、大觀霉素抗體工作液、大觀霉素6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被大觀霉素偶聯(lián)抗原，樣本中含有的大觀霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗大觀霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中大觀霉素的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在肌肉、肝臟中大觀霉素的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK201535774SQ200920246850
公開日2010年7月28日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者萬宇平, 何勇, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 馮靜, 劉福林, 湯慶彩, 汪善良, 王立志, 趙正苗, 郝士元 申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司