專利名稱：G-quadruplex檢測(cè)方法、形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)方法以及端粒酶活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法以及利用該方法的診斷方法。
背景技術(shù)：
端粒是位于真核生物的染色體的兩末端部分的由DNA和各種各樣的蛋白質(zhì)形成 的結(jié)構(gòu)。根據(jù)迄今為止的研究，已知該端粒結(jié)構(gòu)保護(hù)染色體不受某種DNA分解酶和不適當(dāng) 的DNA修復(fù)等。另外，由于該端粒部分在每次細(xì)胞分裂后變短，所以認(rèn)為其在稱之為細(xì)胞老 化和永生化的現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用。另一方面，如果從結(jié)構(gòu)方面看，已知端粒具有幾個(gè)特征。即，在大部分染色體DNA 中，在互補(bǔ)的雙鏈DNA鏈之間，腺嘌呤(以下稱為A)堿基和胸腺嘧啶(以下稱為T)堿基、 鳥嘌呤(以下稱為G)堿基和胞嘧啶(以下稱為C)堿基分別形成特異的氫鍵從而形成 Watson-Crick型堿基對(duì)，并且通過(guò)在該堿基對(duì)之間產(chǎn)生的π - ji疊加相互作用而構(gòu)建雙螺 旋結(jié)構(gòu)(圖1)。但是，在端粒DNA中，雖然其大部分也由互補(bǔ)的雙鏈DNA形成，但是，其最末端部分 DNA的3'末端突出(overhang 懸端)而形成單鏈狀態(tài)。該懸端部分的長(zhǎng)度和端粒的全長(zhǎng) 根據(jù)物種而不同，人類的懸端部分為50 100個(gè)堿基左右，全長(zhǎng)在初期階段約為10000個(gè) 堿基對(duì)左右。而且，端粒序列的另一個(gè)結(jié)構(gòu)特征為，懸端一側(cè)的鏈由富含G的重復(fù)序列構(gòu) 成，因此，作為其互補(bǔ)鏈的另一側(cè)的鏈?zhǔn)歉缓珻的重復(fù)序列。具體而言，人類的懸端一側(cè)的鏈為5' -TTAGGG-3'(序列序號(hào)1)的重復(fù)序列 (富G序列)，另一側(cè)為5' -CCCTAA-3'(序列序號(hào)1的反義鏈)的重復(fù)序列(富C序 列)。近年來(lái)，端粒部位中的富G序列得到特別熱衷的研究。這是由于日益明確該序列 能夠形成稱為G-quadruplex的四鏈DNA結(jié)構(gòu)。G-quadruplex (鳥嘌呤四鏈結(jié)構(gòu))中，已知 有四條DNA鏈全部為5'到3'方向的走向相同的平行型，或者兩條走向相同而其余的兩條 走向相反的反平行型等多種樣式，但是每種樣式都具有如圖2所示的特征。S卩，四個(gè)G堿基 通過(guò)Hoogsteen型氫鍵形成稱為G四聯(lián)體(G-Quartet)的結(jié)構(gòu)，并且該G四聯(lián)體面之間通 過(guò)JI-JI疊加相互作用而保持該結(jié)構(gòu)。另外，在形成G-quadruplex的結(jié)構(gòu)時(shí)，在G四聯(lián)體面和G四聯(lián)體面之間需要金屬 離子的配位，已知K離子和Na離子等進(jìn)行配位。目前，這樣的G-quadruplex在端粒內(nèi)在什 么樣的條件下形成，以及行使什么樣的機(jī)能的詳細(xì)內(nèi)容仍不清楚。但是，認(rèn)為其可能是與上 述的染色體保護(hù)和細(xì)胞老化等相關(guān)聯(lián)的重要結(jié)構(gòu)。另外，還日益明確如上所述的富G序列不僅存在于端粒中。例如，作為原癌基因的 c-myc中也存在形成G-quadruplex的富G序列。另外，除此以外，在c_kit、bcl_2、VEGF、 H-ras、N-ras基因的啟動(dòng)子區(qū)域中也發(fā)現(xiàn)有形成G-quadruplex的富G序列。這些都是與 細(xì)胞的癌化等相關(guān)聯(lián)的基因，由此暗示G-quadruplex行使對(duì)人體重要的機(jī)能。因此，目前預(yù)測(cè)還存在超過(guò)30萬(wàn)個(gè)能夠形成G-quadruplex的富G序列(以下，將這樣的序列稱為 Quadruplex預(yù)測(cè)序列)，它們?cè)趯?shí)際中是否形成G-quadruplex，若能形成，則這樣的結(jié)構(gòu)行 使什么樣的機(jī)能備受矚目。在這樣的技術(shù)背景中，最重要的技術(shù)之一是特異性檢測(cè)G-quadruplex的方法。 即，需要一種研究試樣中的DNA是否含有G-quadruplex、或者試樣中的由Quadruplex預(yù)測(cè) 序列構(gòu)成的DNA在實(shí)際中能否形成G-quadruplex的技術(shù)。例如，如果對(duì)前者使用現(xiàn)有技 術(shù)進(jìn)行研究，則如下所示。即，準(zhǔn)備含有目的DNA的試樣溶液，測(cè)定該溶液的CD (Circular Dichroism 圓二色性)譜。接著，根據(jù)所得到的⑶譜分析是否存在G-quadruplex特有的 譜。但是，測(cè)定CD譜的裝置非常昂貴并且大型。而且，分析時(shí)間也需要長(zhǎng)達(dá)30分鐘左右的 時(shí)間，并且一次能夠分析的試樣數(shù)量也通常為一種，因此在高通量性的方面很差。另外，使 用CD還存在無(wú)法根據(jù)四鏈的形狀而從DNA的其它形狀中識(shí)別的問(wèn)題。作為解決該問(wèn)題的方法，如圖3所示，可以列舉在上述溶液中混合探針材料、檢測(cè) 該溶液中的信號(hào)的方法，該探針材料根據(jù)G-quadruplex的有無(wú)而發(fā)出能夠以廉價(jià)的裝置 分析的信號(hào)(吸光度、熒光強(qiáng)度等)。此時(shí)，重要的一點(diǎn)為該探針對(duì)G-quadruplex的特異 性。即，由于在基因組DNA中存在占大部分的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)和以上述的端粒部位的懸端部 分為代表的單鏈DNA結(jié)構(gòu)，因此，與這些結(jié)構(gòu)比較時(shí)對(duì)G-quadruplex的特異性是很重要的。 因此，盡管希望單獨(dú)研究G-quadruplex的有無(wú)，但探針對(duì)G-quadruplex的特異性低，結(jié)果 探針也與單鏈DNA或雙鏈DNA相互作用而產(chǎn)生信號(hào)，則正確檢測(cè)溶液中的G-quadruplex變 得困難。另外，當(dāng)使用現(xiàn)有技術(shù)研究試樣中的Quadruplex預(yù)測(cè)序列DNA在實(shí)際中能否形成 G-quadruplex時(shí)，如圖4所示。即，首先在溶液中準(zhǔn)備具有Quadruplex預(yù)測(cè)序列的DNA。 之后，將該溶液置于形成G-quadruplex的反應(yīng)條件下，使G-quadruplex形成反應(yīng)進(jìn)行。接 著，可以通過(guò)進(jìn)行CD譜測(cè)定對(duì)反應(yīng)后的溶液中是否存在G-quadruplex進(jìn)行分析。但是，此 時(shí)也產(chǎn)生如上所述的裝置昂貴、大型的問(wèn)題以及高通量方面的問(wèn)題。因此，此時(shí)如果也有如 圖3所示的G-quadruplex檢測(cè)用探針則非常有用。具體而言，如圖5所示，將該探針混合在上述G-quadruplex形成反應(yīng)后的溶液中， 測(cè)定由此發(fā)出的信號(hào)即可。此時(shí)，G-quadruplex形成反應(yīng)前的Quadruplex預(yù)測(cè)序列DNA， 如上所述，由于也存在單鏈或雙鏈DNA的可能性，因此探針對(duì)G-quadruplex的特異性極為 重要。即，如果在上述G-quadruplex形成反應(yīng)后，Quadruplex預(yù)測(cè)序列DNA沒有全部形 成G-quadruplex時(shí)，或只有一部分形成時(shí)，上述探針也與Quadruplex預(yù)測(cè)序列DNA原本 的結(jié)構(gòu)(單鏈或雙鏈DNA)相互作用從而產(chǎn)生信號(hào)，則正確檢測(cè)所形成的G-quadruplex變 得困難。反之，當(dāng)探針對(duì)G-quadruplex的特異性極高時(shí)，在圖5所示的方法中，就可以從 G-quadruplex形成反應(yīng)前事先在溶液中混合探針，也能夠防止操作的繁瑣性。如上所述，形成G-quadruplex的富G序列發(fā)現(xiàn)存在于染色體中與癌化和老化等 相關(guān)的部位，因而預(yù)測(cè)將來(lái)能夠通過(guò)研究患者的染色體中的G-quadruplex而進(jìn)行疾病診 斷。因此，可以說(shuō)開發(fā)一種能夠特異性檢測(cè)G-quadruplex的方法是非常重要的課題。另外， 作為上述探針的特性，如果其不僅能夠特異性檢測(cè)G-quadruplex和Quadruplex預(yù)測(cè)序列 DNA,而且能夠根據(jù)它們的存在量而產(chǎn)生信號(hào)增大或者減小的變化，則不僅能夠僅僅進(jìn)行檢 測(cè)，而且還能夠定量進(jìn)行分析，從而當(dāng)然會(huì)更有用。
另外，已知有稱為端粒酶的酶。該酶是由RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶等形成的復(fù)合體，能夠復(fù) 制由于細(xì)胞分裂而變短的端粒部位的富G側(cè)的重復(fù)序列而延長(zhǎng)(S卩，在人類的情況下，端粒 酶添加5' -TTAGGG-3'序列(序列序號(hào)1)，以下，將該添加反應(yīng)稱為端粒酶反應(yīng))。已知 該酶在人類通常的體細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)，但是在生殖細(xì)胞和大部分癌細(xì)胞中大量表達(dá)，因此 能夠?qū)⒍肆Ｃ富钚宰鳛橹笜?biāo)而研究被檢測(cè)者的細(xì)胞是否癌化。作為現(xiàn)有的方法，已知有稱為TRAP分析的方法。使用圖6對(duì)TRAP分析進(jìn)行說(shuō)明。 在TRAP分析中，首先配制含有作為端粒酶的模板的合成單鏈DNA的溶液。該單鏈DNA通常 為由5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘(序列序號(hào)2)的序列形成的DNA，稱為TS引物(因 此，端粒酶在該TS引物的3'末端添加5' -TTAGGG-3'序列(序列序號(hào)1)。參照非專利 文獻(xiàn)3)。但是，不需要將TS引物限定于該序列，只要是成為端粒酶的模板的單鏈DNA即可。接著，在該溶液中添加由疑似癌化的細(xì)胞試樣或組織試樣的提取物并混合，置于 進(jìn)行端粒酶反應(yīng)的條件下。此時(shí)，如果這些試樣發(fā)生癌化，則具有端粒酶活性，因此能夠以 TS引物為起點(diǎn)引起端粒酶反應(yīng)。另一方面，如果沒有發(fā)生癌化，則不能引起端粒酶反應(yīng)。所 以，最后通過(guò)PCR將利用端粒酶反應(yīng)延長(zhǎng)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)電泳法檢測(cè)該經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的 DNA片段。由于利用端粒酶反應(yīng)得到的DNA的長(zhǎng)度各種各樣，因此得到的電泳圖如圖7所示。 即，當(dāng)使用的試樣的端粒酶活性強(qiáng)時(shí)，所得到的DNA片段的長(zhǎng)度呈現(xiàn)從短到長(zhǎng)的廣范圍的 梯子(ladder)狀的條帶，并且條帶的濃度較濃。另一方面，由活性弱的端粒酶無(wú)法得到長(zhǎng) 的DNA片段，所以在短的范圍里出現(xiàn)梯子狀的條帶，并且條帶的濃度較淡。因此，為了判斷 試樣的癌化，可以對(duì)由TRAP分析的結(jié)果得到的電泳圖中的DNA片段的長(zhǎng)度范圍和條帶的濃 度進(jìn)行分析，但是，由于難以將其進(jìn)行定量分析，所以只能是定性地判斷。關(guān)于這點(diǎn)，當(dāng)圖3和圖5中說(shuō)明的G-quadruplex特異性檢測(cè)用探針不僅僅對(duì) G-quadruplex具有特異性，而且還根據(jù)G-quadruplex的存在量而改變其信號(hào)量時(shí)，則在以 端粒酶的活性作為指標(biāo)的癌診斷中也是有用的。其流程圖如圖8所示。在該方法中，也首先制備含有TS引物的溶液，接著，在該溶液中添加細(xì)胞試樣或 組織試樣的提取物并混合，這樣，在該溶液中使端粒酶反應(yīng)進(jìn)行之后，通過(guò)PCR法使由端粒 酶反應(yīng)而延長(zhǎng)的DNA擴(kuò)增，以上為止的操作與圖6相同。但是，在圖8所示的方法中，對(duì)該 PCR之后的溶液不進(jìn)行電泳，而進(jìn)行與圖5的情況相同的G-quadruplex形成反應(yīng)。使用 G-quadruplex檢測(cè)用探針檢測(cè)所形成的G-quadruplex。這里，由于所形成的G-quadruplex 的量反映端粒酶活性的強(qiáng)度，所以如果上述探針的信號(hào)量根據(jù)G-quadruplex的量而改變， 則能夠通過(guò)該方法進(jìn)行定量的端粒酶活性分析及癌化的判斷。不言而喻，此時(shí)，探針對(duì)G-quadruplex的特異性極為重要。即，當(dāng)細(xì)胞試樣沒有癌 化時(shí)，端粒酶反應(yīng)不進(jìn)行，其結(jié)果是作為單鏈DNA的TS引物原樣殘留在反應(yīng)液中。而且，之 后的PCR反應(yīng)也也不進(jìn)行，因此，PCR反應(yīng)用的引物也以單鏈DNA的狀態(tài)殘留。因此，當(dāng)細(xì) 胞試樣沒有癌化時(shí)，最終的反應(yīng)溶液中存在大量的單鏈DNA，若上述探針與這些單鏈DNA反 應(yīng)而發(fā)出信號(hào)，則難以進(jìn)行定量的端粒酶活性分析和癌診斷。以上，在如所說(shuō)明的那樣在溶液中存在單鏈、雙鏈DNA的任一種的狀況下，能夠特 異性檢測(cè)G-quadruplex的方法是非常有用的。而且，如果進(jìn)一步具備定量性的話，則不僅 可以定量檢測(cè)G-quadruplex，還能夠解決現(xiàn)有的TRAP分析的問(wèn)題。因此，力求開發(fā)一種使用探針的G-quadruplex檢測(cè)方法，該探針與G-quadruplex特異性地相互作用，并且根據(jù) G-quadruplex的量而使信號(hào)變化。例如，專利文獻(xiàn)1中提出了一種G-quadruplex特異性的新型化合物。但是，盡管 相比于單鏈、雙鏈DNA，該探針確實(shí)與對(duì)G-quadruplex的結(jié)合選擇性高，但是能確認(rèn)也與單 鏈、雙鏈DNA結(jié)合。另外，非專利文獻(xiàn)1中報(bào)告了由下述(化學(xué)式1)的結(jié)構(gòu)形成的陽(yáng)離子性卟啉對(duì) G-quadruplex的特異性。該文獻(xiàn)中利用SPR(surfaceplasmon resonance 表面等離子共 振)現(xiàn)象分析金基板上的上述卟啉與雙鏈結(jié)構(gòu)DNA或G-quadruplex的結(jié)合，其結(jié)果，盡管 G-quadruplex確實(shí)比雙鏈DNA的信號(hào)變化大，但是在雙鏈DNA的情況下也觀察到信號(hào)的變 化，不能確認(rèn)充分的特異性。(化學(xué)式1) 另外，非專利文獻(xiàn)2中報(bào)告了由下述(化學(xué)式2)和(化學(xué)式3)的結(jié)構(gòu)形成的陽(yáng) 離子性卟啉等對(duì)G-quadruplex的特異性。該文獻(xiàn)中，同樣通過(guò)分析SI3R現(xiàn)象和紫外可見吸 收光譜，研究這些卟啉對(duì)G-quadruplex的特異性結(jié)合，但是，記載了在DNA濃度為5 μ M以 上的條件下，出現(xiàn)雙鏈DNA與這些卟啉的非特異性結(jié)合。(化學(xué)式2) (化學(xué)式3) 如上所述，目前為止以檢測(cè)G-quadruplex為目的而開發(fā)出來(lái)的探針都是陽(yáng)離子性的物質(zhì)。這是由于G-quadruplex是陰離子性的，從使其能與G-quadruplex結(jié)合的觀點(diǎn) 考慮時(shí)，認(rèn)為陽(yáng)離子性非常有利(即，認(rèn)為若為陰離子性則引起靜電排斥，不利于結(jié)合)。由 于全部DNA鏈都是陰離子性的，而不僅僅限于G-quadruplex，所以將它們作為目標(biāo)而開發(fā) 探針時(shí)，使其為陽(yáng)離子性為最重要的設(shè)計(jì)指南，而不考慮陰離子性。專利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開第2004/072027號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1 :J. Am. Chem. Soc.，129，1502-1503非專利文獻(xiàn)2 =Chem. Commun. 4685-4687非專利文獻(xiàn)3 =Nucleic Acids Res.，25，2595-259
發(fā)明內(nèi)容
如上所述，當(dāng)在溶液中存在單鏈、雙鏈DNA的任一種的狀況下，能夠特異性檢 測(cè)G-quadruplex的方法是非常有用的。而且，如果進(jìn)一步具備定量性的話，則不僅可以 定量檢測(cè)G-quadruplex，還能夠解決現(xiàn)有的TRAP分析的問(wèn)題。因此，力求開發(fā)一種使用 探針的G-quadruplex檢測(cè)方法，該探針與G-quadruplex特異性地相互作用，并且根據(jù) G-quadruplex的量而使信號(hào)變化，但是，目前為止提出的方法不能在任意情況下特異性地 檢測(cè)G-quadruplex。因此，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰離子性的平面 型酞菁雖然是陰離子性的，但是具有與G-quadruplex的極高的特異性而相互作用，并且吸 光度根據(jù)G-quadruplex的濃度而變化，從而完成了本發(fā)明。解決上述問(wèn)題的本發(fā)明提供一種G-quadruplex檢測(cè)方法，檢測(cè)試樣溶液中的 G-quadruplex，其中，該試樣溶液含有形成單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)和G-quadruplex中的至少 任一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA，其特征在于，上述方法依次包括以下工序(a)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)將含有上述陰離子性平面型酞菁的溶液與上述試樣溶液混合的工序；(c)測(cè)定上述(b)工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；和(d)如果在上述640 740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定上述試樣溶液中含有形成 G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。另外，本發(fā)明還提供一種形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)方法，通過(guò)研究試 樣溶液中含有的形成單鏈結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)中的至少一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA是否形成 G-quadruplex，檢測(cè)形成G-quadruplex的DNA，其特征在于，上述方法依次包括以下工序
CN 101889210 A
說(shuō)明 書5/22頁(yè)
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(a)將上述試樣溶液置于G-quadruplex形成反應(yīng)條件下的工序；(b)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(c)在上述(a)工序之前或之后，將含有上述陰離子性平面型酞菁的溶液與上述 試樣溶液混合的工序；(d)測(cè)定上述(a) (c)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的 工序；和(e)如果在上述640 740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定上述試樣溶液中含有形成 G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。另外，本發(fā)明提供一種端粒酶活性測(cè)定方法，測(cè)定試樣溶液中的端粒酶活性，其特 征在于，上述方法依次包括以下工序(a)制備上述試樣溶液的工序；(b)制備底物溶液的工序，該底物溶液含有作為端粒酶底物的DNA ；(c)混合上述試樣溶液和上述底物溶液，制備端粒酶反應(yīng)溶液的工序；(d)將上述端粒酶反應(yīng)溶液置于由端粒酶進(jìn)行的DNA添加反應(yīng)的條件下；(e)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(f)將含有上述陰離子性平面型酞菁的溶液與上述(d)工序后得到的溶液混合的
工序；(g)測(cè)定上述(a) (f)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的 工序；和(h)如果在上述640 740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定上述試樣溶液中含有形成 G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。本發(fā)明中，上述陰離子性平面型酞菁，優(yōu)選選自作為配位金屬與銅絡(luò)合形成的物 質(zhì)、與鋅絡(luò)合形成的物質(zhì)、與鈷絡(luò)合形成的物質(zhì)和具有鎳的陰離子性平面型酞菁，或者與沒 有配位金屬的陰離子性平面型酞菁絡(luò)合形成的物質(zhì)、沒有形成絡(luò)合的物質(zhì)中的任一種。另外，本發(fā)明中，優(yōu)選上述陰離子性平面型酞菁具有選自羧基、羧基的金屬鹽、磺 基以及磺基的金屬鹽中的至少一種官能團(tuán)。本發(fā)明的上述目的、其它目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)，參照附圖，根據(jù)以下優(yōu)選的實(shí)施方 式的詳細(xì)說(shuō)明即可明確。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供特異性且定量檢測(cè)G-quadruplex的方法、特異性且定量檢 測(cè)能夠形成G-quadruplex的DNA的方法、以及端粒酶活性測(cè)定方法。


圖1是用于說(shuō)明雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)的圖。圖2是用于說(shuō)明G-quadruplex的結(jié)構(gòu)的圖。圖3是用于說(shuō)明使用對(duì)形成G-quadruplex的DNA具有特異性的探針特異性檢測(cè) 形成G-quadruplex的DNA的方法的圖。圖4是用于說(shuō)明使用⑶分析裝置檢測(cè)Quadruplex預(yù)測(cè)序列的方法的圖。圖5是用于說(shuō)明使用對(duì)形成G-quadrup 1 ex的DNA具有特異性的探針檢測(cè)Quadruplex預(yù)測(cè)序列的方法的圖。圖6是用于說(shuō)明現(xiàn)有的端粒酶活性測(cè)定方法的圖。圖7是表示由現(xiàn)有的端粒酶活性測(cè)定方法得到的電泳圖像的一個(gè)例子的圖。圖8是用于說(shuō)明使用對(duì)形成G-quadruplex的DNA具有特異性的探針檢測(cè)端粒酶 活性的方法的圖。圖9是用于說(shuō)明使用陰離子性酞菁特異性檢測(cè)形成G-quadruplex的DNA的方法 的圖。圖10是用于說(shuō)明使用陰離子性酞菁檢測(cè)Quadruplex預(yù)測(cè)序列的方法的圖。圖11是用于說(shuō)明使用陰離子性酞菁測(cè)定端粒酶活性的方法的圖。圖12是表示實(shí)施例2中的⑶檢測(cè)結(jié)果的圖。圖13是表示實(shí)施例2中使用陰離子性酞菁銅時(shí)的結(jié)果的圖。圖14是表示實(shí)施例2中使用陰離子性酞菁鎳時(shí)的結(jié)果的圖。圖15是表示實(shí)施例2中使用不具有配位金屬的陰離子性酞菁時(shí)的結(jié)果的圖。圖16是表示實(shí)施例2中使用陰離子性酞菁鐵時(shí)的結(jié)果的圖。圖17是表示實(shí)施例1中的⑶檢測(cè)結(jié)果的圖。圖18是表示實(shí)施例1中使用陰離子性酞菁銅時(shí)的結(jié)果的圖。圖19是表示實(shí)施例1中使用陰離子性酞菁鎳時(shí)的結(jié)果的圖。圖20是表示實(shí)施例1中使用不具有配位金屬的陰離子性酞菁時(shí)的結(jié)果的圖。圖21是表示實(shí)施例1中使用陰離子性酞菁鐵時(shí)的結(jié)果的圖。圖22是表示實(shí)施例3中使用陰離子性酞菁銅時(shí)的結(jié)果的圖。圖23是表示實(shí)施例3中使用陰離子性酞菁鎳時(shí)的結(jié)果的圖。圖24是表示實(shí)施例3中使用不具有配位金屬的陰離子性酞菁時(shí)的結(jié)果的圖。圖25是表示實(shí)施例4中使用陰離子性酞菁銅時(shí)的結(jié)果的圖。圖26是表示實(shí)施例4中使用陰離子性酞菁鎳時(shí)的結(jié)果的圖。圖27是表示實(shí)施例4中使用不具有配位金屬的陰離子性酞菁時(shí)的結(jié)果的圖。圖28是表示實(shí)施例4中使用陰離子性酞菁鐵時(shí)的結(jié)果的圖。圖29是總結(jié)本實(shí)施例1 4的結(jié)果的圖。圖30是表示酞菁會(huì)聚狀態(tài)時(shí)和分散狀態(tài)時(shí)的典型吸光譜的圖。圖31是表示本發(fā)明的機(jī)制的圖。圖32是表示平面型酞菁和羽毛球型酞菁的圖。圖33是表示實(shí)施例1中使用陰離子性酞菁鈷時(shí)的結(jié)果的圖。圖34是表示實(shí)施例2中使用陰離子性酞菁鈷時(shí)的結(jié)果的圖。圖35是表示實(shí)施例3中使用陰離子性酞菁鈷時(shí)的結(jié)果的圖。圖36是表示實(shí)施例4中使用陰離子性酞菁鈷時(shí)的結(jié)果的圖。符號(hào)說(shuō)明1具有互補(bǔ)關(guān)系的二條DNA鏈2T-A 堿基對(duì)3C-G 堿基對(duì)4G-quadruplex
5G四聯(lián)體面
6金屬離子
7G四聯(lián)體面的化學(xué)結(jié)構(gòu)
8容器
9G-quadruplex 以外的 DNA 鏈
10與G-quadruplex結(jié)合的探針
11游離的探針
12Quadruplex預(yù)測(cè)序列
13TS引物
14延長(zhǎng)的TS引物
15PCR用引物
16試樣溶液
17含有陰離子性酞菁的溶液
18含有作為端粒酶底物的單鏈DNA的溶液，整理序號(hào)2040300046日本特愿
2008-137574 (Proof)申請(qǐng)日平成 20 年 5 月 27 日 27/E19會(huì)聚的陰離子性酞菁20單體狀態(tài)的酞菁21嵌入G-quadruplex的陰離子性酞菁22平面型酞菁23羽毛球型酞菁
具體實(shí)施例方式以下，使用圖9 圖11說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。(實(shí)施方式1)使用圖9說(shuō)明本實(shí)施方式1中檢測(cè)試樣溶液中的G-quadruplex的方法，其中，該 試樣溶液含有形成單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)和G-quadruplex中的至少一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA。本實(shí)施方式1中，首先混合試樣溶液與含有陰離子性平面型酞菁的溶液。接著測(cè) 定該混合溶液在640 740nm的范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度。此時(shí)，如果上述試料溶液中存 在形成G-quadruplex的DNA，則在640 740nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)依賴于該形成G-quadruplex 的DNA的吸收峰，而另一方面，即使存在單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA，在上述波長(zhǎng)范圍內(nèi)也不 出現(xiàn)依賴于該單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA的峰。因此，通過(guò)分析該峰的有無(wú)，能夠得知上述 試樣溶液中是否存在形成G-quadruplex的DNA。在分析峰的有無(wú)時(shí)，例如，配制已知至少不含形成G-quadruplex的DNA的參照溶 液，與含有上述陰離子性平面型酞菁的溶液混合，對(duì)其也測(cè)定混合時(shí)在上述特定波長(zhǎng)的吸 光度，求出其與使用試樣溶液時(shí)得到的吸光度值的差即可。另外，該上述吸收峰的吸光度值隨著形成G-quadruplex的DNA濃度增高而增大。 因此，通過(guò)分析吸光度，能夠分析形成G-quadruplex的DNA濃度。實(shí)施方式1中所使用的陰離子性平面型酞菁選自具有銅、鋅、鈷或鎳作為配位金 屬的陰離子性平面型酞菁、或者沒有配位金屬的陰離子性平面型酞菁。
另外，實(shí)施方式1中所使用的陰離子性平面型酞菁具有選自羧基、羧基的金屬鹽、 磺基以及磺基的金屬鹽中的至少一種官能團(tuán)。另外，上述特定的波長(zhǎng)只要在640 740nm的范圍內(nèi)，則可以是任意波長(zhǎng)，但是呈 現(xiàn)峰的極大值的波長(zhǎng)附近的波長(zhǎng)能夠進(jìn)行高敏感度的測(cè)定，故而更加優(yōu)選。(實(shí)施方式2)使用圖10說(shuō)明本實(shí)施方式2中研究試樣溶液中含有的形成單鏈結(jié)構(gòu)或雙鏈結(jié)構(gòu) 中的至少任一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA是否形成G-quadruplex的方法。本實(shí)施方式2中，首先混合上述試樣溶液與含有陰離子性平面型酞菁的溶液，將 其置于形成G-quadruplex的條件下從而使G-quadruplex形成反應(yīng)進(jìn)行之后，測(cè)定該混合 溶液在640 740nm的范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度(圖10 (A))，或者將上述試樣溶液置于 形成G-quadruplex的條件下從而使G-quadruplex形成反應(yīng)進(jìn)行之后，與含有陰離子性平 面型酞菁的溶液混合，測(cè)定該混合溶液在640 740nm的范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度(圖 10 (B))。此時(shí)，和上述實(shí)施方式1同樣，如果該混合溶液中存在形成G-quadruplex的DNA， 則在640 740nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)依賴于該形成G-quadruplex的DNA的吸收峰，并且該吸收 峰的吸光度值隨著形成G-quadruplex的DNA濃度增高而增大。而另一方面，即使存在單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA，在上述波長(zhǎng)范圍內(nèi)也不出現(xiàn)依 賴于該單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA的峰。因此，通過(guò)分析該峰的有無(wú)，能夠得知上述試樣溶 液中的DNA是否形成了 G-quadruplex。作為分析峰的有無(wú)的方法，例如，制備不含DNA、或 者即使含有DNA，也只含有不形成G-quadruplex的DNA的參照溶液，對(duì)該參照溶液也經(jīng)過(guò)與 上述試樣溶液的情況完全相同的工序測(cè)定吸光度值，分析與上述試樣溶液的吸光度值的差 即可。另外，上述吸收峰的吸光度值隨著形成G-quadruplex的DNA的濃度增高而增大。 因此，通過(guò)分析吸光度，能夠?qū)ι鲜鲈嚇又行纬蒅-quadruplex的DNA濃度進(jìn)行定量分析。本實(shí)施方式2中所使用的陰離子性平面型酞菁，與實(shí)施方式1同樣，是選自具有 銅、鋅、鈷或鎳作為配位金屬的陰離子性平面型酞菁、或者沒有配位金屬的陰離子性平面型酞菁。另外，本實(shí)施方式2中使用的陰離子性平面型酞菁，與實(shí)施方式1同樣，具有選自 羧基、羧基的金屬鹽、磺基以及磺基的金屬鹽中的至少一種官能團(tuán)。另外，上述特定的波長(zhǎng)只要在640 740nm范圍內(nèi)，則可以是任意波長(zhǎng)，但是呈現(xiàn) 峰的極大值的波長(zhǎng)附近的波長(zhǎng)能夠進(jìn)行高敏感度的測(cè)定，故而更加優(yōu)選。(實(shí)施方式3)使用圖11說(shuō)明本實(shí)施方式3中定量分析試樣中含有的端粒酶活性的方法。本實(shí)施方式3中，首先混合上述試樣和含有作為端粒酶底物的單鏈DNA的溶液， 將該混合溶液置于進(jìn)行端粒酶反應(yīng)的條件下。此時(shí)，如果上述試樣中含有具有活性的端粒 酶，則置于該條件下進(jìn)行端粒酶反應(yīng)，其結(jié)果，從上述底物單鏈DNA添加由5' -TTAGGG-3' 形成的DNA，而另一方面，如果上述試樣溶液中不存在具有活性的端粒酶，則不進(jìn)行這樣的 DNA添加。接著，將上述端粒酶反應(yīng)后的混合溶液置于形成G-quadruplex的條件下。此時(shí)， 如果假設(shè)上述試樣中含有具有活性的端粒酶，由此進(jìn)行端粒酶反應(yīng)，則形成G-quadruplex，其量依賴于上述試樣中的端粒酶活性(活性越大則形成的G-quadruplex量越多)。反之， 例如，如果上述試樣中不含有具有活性的端粒酶，則其結(jié)果為上述端粒酶反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，從 而此時(shí)不形成G-quadruplex。最后，混合該G-quadruplex形成反應(yīng)后的混合溶液和含有陰離子性平面型酞菁 的溶液，測(cè)定該混合溶液在640 740nm的范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度。此時(shí)，與上述實(shí)施 方式1和2同樣，如果該混合溶液中存在形成G-quadruplex的DNA，則在640 740nm的 范圍內(nèi)出現(xiàn)依賴于該形成G-quadruplex的DNA的吸收峰，并且該吸收峰的吸光度值隨著形 成G-quadruplex的DNA濃度增高而增大。而另一方面，即使該混合溶液中存在單鏈結(jié)構(gòu)、 雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA，在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)也不出現(xiàn)依賴于該單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA的峰。因此， 通過(guò)測(cè)定該峰的吸光度值，能夠定量地分析上述試樣中的端粒酶活性。這里，在圖11中，將上述陰離子性平面型酞菁溶液向G-quadruplex形成反應(yīng)后的 混合溶液中添加，但是添加上述陰離子性平面型酞菁的時(shí)機(jī)不受此限制。即，也可以在端粒 酶反應(yīng)后并且直至吸光度測(cè)定前的任何時(shí)機(jī)向含有上述試料溶液的混合溶液中添加。本實(shí)施方式3中所使用的陰離子性平面型酞菁，與實(shí)施方式1和實(shí)施方式2同樣， 是選自具有銅、鋅、鈷或鎳作為配位金屬的陰離子性平面型酞菁、或者沒有配位金屬的陰離 子性平面型酞菁。另外，實(shí)施方式3中所使用的陰離子性平面型酞菁，與實(shí)施方式1和實(shí)施方式2同 樣，具有選自羧基、羧基的金屬鹽、磺基以及磺基的金屬鹽中的至少一種官能團(tuán)。另外，上述特定的波長(zhǎng)只要在640 740nm范圍內(nèi)，則可以是任意波長(zhǎng)，但是呈現(xiàn) 峰的極大值的波長(zhǎng)附近的波長(zhǎng)能夠進(jìn)行高敏感度的測(cè)定，故而更加優(yōu)選。[實(shí)施例]以下記載的實(shí)施例中所用的DNA全部是北海道System Science株式會(huì)社的 合成品。另外，本實(shí)施例中所使用的酞菁中，Copper( II )phthalOCyanine-3，4'，4"， 4' “ -tetrasulfonic acid tetrasodium salt (酞菁銅(II )-3，4'，4〃，4'“-四磺 StH^ik ) > Nickel ( II ) phthalocyanine tetrasulfonicacid tetrasodium salt (酞菁 鎳(II )四磺酸四鈉鹽)和 Iron(III)phthalocyanine-4，4'，4〃，4' “ -tetrasulfonic acid, compound with oxygenmonosodium salt hydrate (駄 善 鐵(III ) -4,4 ‘， 4 “ ,4'“-四磺酸，與氧單鈉鹽水合物的混合物)，由Sigma Aldrich公司購(gòu)入。 Phthalocyanine tetrasulfonicacid (四石黃 St Fft 胃)禾口 Zinc ( II )phthalocyanine tetrasulfonic acid(四磺酸酞菁鋅(II ))由 FUNAK0SHI 購(gòu)入。Cobalt ( II ) phthalocyaninetetracarboxylic acid(四羧酸酞菁鈷(II ))為合成的。合成方法如下所 述。將偏苯三酸6. 4g、尿素20g、氯化鈷六水合物4. 75g和鉬酸銨四水合物0. 82g在 IOOrnl硝基苯中在170 180°C的油浴中加熱4. 5小時(shí)，放冷后，以傾析法除去硝基苯層。將 殘留物以甲醇和水洗凈之后進(jìn)行真空干燥，得到8. 66g固態(tài)物。將該固態(tài)物1. Og在50% 氫氧化鉀水溶液30g中，在70 75°C下攪拌2小時(shí)后，添加90ml的水，攪拌，并將其過(guò)濾。 將此時(shí)得到的濾液以35 37%鹽酸調(diào)為強(qiáng)酸性從而析出沉淀物，將其過(guò)濾取出。將該沉淀 物在100ml的IN的氫氧化鈉水溶液中溶解，再次過(guò)濾。將此時(shí)得到的濾液再次以鹽酸調(diào)為 強(qiáng)酸性，過(guò)濾取出析出的沉淀物。將其用大量水洗凈之后進(jìn)行真空干燥，由此以0. Ig的粉末得到四羧酸酞菁鈷(II )。以下實(shí)施例中所使用的四羧酸酞菁鈷(II )全部是通過(guò)該合 成得到的。(實(shí)施例1)本實(shí)施例中，嘗試使用陰離子性平面型酞菁檢測(cè)出在溶液中存在的形成反平行型 G-quadruplex的DNA。為此，首先以下述順序制備含有形成反平行型G-quadruplex的DNA 的溶液。<含有形成反平行型G-quadruplex的DNA的溶液的制備>首先制備含有由5' -gggttagggttagggttaggg-3'的序列(序列號(hào)3)形成的單 鏈DNA的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量100 μ 1)。該序列與人類的端粒部分 的序列相同，因此下文將該DNA稱為人類端粒DNA。這里，分別準(zhǔn)備該溶液中所含的人類端 粒DNA的濃度為0. 5、2、5、10、25、50、100 μ M的溶液。作為陰性對(duì)照，還制備了不含DNA的 50mM HEPESUOOmM NaCl.pH 7 的溶液。接著，將這些溶液在90°C孵育5分鐘之后，以2°C /分鐘的降溫速度冷卻至0°C，最 后在0°C孵育2小時(shí)(以下，在沒有特別指明時(shí)，出現(xiàn)“退火”或者“退火處理”的表現(xiàn)時(shí)，都 是指這一系列的溫度控制)。接著，為了確認(rèn)上述結(jié)果得到的各溶液中的人類端粒DNA形成反平行型 G-quadruplex，對(duì)各溶液進(jìn)行CD分析。其結(jié)果，如圖17所示，除了陰性對(duì)照溶液，每種情況 都在295nm附近確認(rèn)正峰，在265nm附近確認(rèn)負(fù)峰。這顯示形成有反平行型G-quadruplex。另外，人類端粒DNA濃度為100 μ M的溶液中的上述正峰和負(fù)峰的絕對(duì)值最大，其 它的按照50、25、10、5、2、0. 5 μ M的順序變小。這顯示，若最初含有的人類端粒DNA濃度高， 則所得到的形成反平行型G-quadruplex DNA濃度也高。下面，分別對(duì)人類端粒DNA濃度為100、50、25、10、5、2、0. 5 μ M的溶液進(jìn)行上述一 系列的退火處理，將結(jié)果得到的溶液分別稱為Anti-G-quadruplex溶液A、B、C、D、Ε、F、G。 另一方面，對(duì)作為陰性對(duì)照制備的不含DNA的溶液進(jìn)行上述一系列退火處理，將結(jié)果得到 的溶液稱為NC溶液。接著，使用由以上工序得到的Anti-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F、G和NC溶 液，由陰離子性平面型酞菁進(jìn)行反平行型G-quadruplex檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法如下所述。<利用陰離子性酞菁銅的檢測(cè)>首先制備含有15μΜ的酞菁銅(II )-3，4' Λ" Λ' “ _四磺酸四鈉鹽(具有銅 作為配位金屬、且具有磺酸基的鈉鹽作為官能團(tuán)的陰離子性平面型酞菁)的50mM HEPES、 IOOmM NaCl、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-G-quadruplex 溶液C、D、E、F和NC溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖18(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外，可知該峰以Anti-G-quadruplex溶液C > D > E > F的順序 增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁銅(II )_3，4'，4〃，4' “ _四磺酸四鈉鹽，能夠 檢測(cè)出溶液中形成反平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖18(A)中得到的各圖譜在691. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖18(B)所示。因此可知通過(guò)使用酞菁銅(II )_3，4'，4〃，4'“-四磺酸 四鈉鹽，能夠定量檢測(cè)出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。
另外，圖18(B)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié) 構(gòu)變化為反平行型G-quadruplex之后，添加酞菁銅(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸四鈉 鹽而得到的結(jié)果，但是，在進(jìn)行退火處理之前添加酞菁銅(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸 四鈉鹽時(shí)(即按照?qǐng)D10(A)所示的順序時(shí))，也與圖18(B)的情況同樣，所得到的在691. 5nm 的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。<利用陰離子性酞菁鎳的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽(具有鎳作為配位金屬、且具 有磺酸基的鈉鹽作為官能團(tuán)的陰離子性平面型酞菁)的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶 液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-G-quadruplex溶液D、E、F、G和NC 溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖19(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外，可知該峰以Anti-G-quadruplex溶液D > E > F > G的順序 增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠檢測(cè)出溶液中形成反 平行型 G-quadruplex 的 DNA。另外，圖19(A)中得到的各圖譜在691. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖19(B)所示。因此可知通過(guò)使用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠定量檢 測(cè)出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖19(B)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié) 構(gòu)變化為反平行型G-quadruplex之后，添加酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽而得到的結(jié)果，但 是，在進(jìn)行退火處理之前添加酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽時(shí)(即按照?qǐng)D10(A)所示的順序 時(shí))，也與圖19(B)的情況同樣，所得到的在691. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。<利用不具有配位金屬的陰離子性酞菁的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四磺酸酞菁(不具有配位金屬、且具有磺酸基作為官能團(tuán) 的陰離子性平面型酞菁)的50mM HEPES、IOOmMNaCl、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-G-quadruplex溶液D、E、F、G和NC溶液 混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 SOOnm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖20 (A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除 了不含DNA的NC溶液外，大致在660 740nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)峰，另外，可知該峰以 Anti-G-quadruplex溶液D > E > F > G的順序增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四磺酸 酞菁，能夠檢測(cè)出溶液中形成反平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖20(A)中得到的各圖譜在677. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖20(B)所示，在710. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度的關(guān)系 如圖20(C)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用四磺酸酞菁，能 夠定量檢測(cè)出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖20(B)和圖20(C)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò) 退火而使結(jié)構(gòu)變化為反平行型G-quadruplex之后，添加四磺酸酞菁而得到的結(jié)果，但是， 在進(jìn)行退火處理之前添加四磺酸酞菁時(shí)(即按照?qǐng)D10(A)所示的順序時(shí))，也與圖20(B)和 圖20(C)的情況同樣，所得到的在677. 5nm和在710. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒 DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。
<利用陰離子性酞菁鈷的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四羧酸酞菁鈷(II )(具有鈷作為配位金屬、且具有羧酸基 作為官能團(tuán)的陰離子性平面型酞菁)的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量20 μ 1)。 接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-G-quadruplex溶液B、C、D、G和NC溶液混合，對(duì)該混 合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖33(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外，可知該峰以Anti-G-quadruplex溶液B > C > D > G的順序 增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四羧酸酞菁鈷(II )，能夠檢測(cè)出溶液中形成反平行型 G-quadruplex 的 DNA0另外，圖33(A)中得到的各圖譜在684. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖33(B)所示。因此，通過(guò)使用四羧酸酞菁鈷(II )，能夠定量檢測(cè)出溶液中 的形成反平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖33 (B)是如上所述將在試樣溶 液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié)構(gòu)變化為反平行型G-quadruplex之后，添加四羧 酸酞菁鈷(II )而得到的結(jié)果，但是，在進(jìn)行退火處理之前添加四羧酸酞菁鈷(II )時(shí)(即 按照?qǐng)D10㈧所示的順序時(shí))，也與圖33(B)的情況同樣，所得到的在684. 5nm的吸光度值 與該樣品的人類端粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。但是，使用四羧酸酞菁鈷(II )時(shí)在640 720nm的范圍所見的峰上升，比使用酞 菁銅(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四鈉鹽、酞菁鎳(II)四磺酸四鈉鹽和四磺酸酞菁時(shí) 的結(jié)果小。認(rèn)為這是由于合成的四羧酸酞菁鈷(II )沒有充分精制的緣故。<利用陰離子性酞菁鐵的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的酞菁鐵(III) _4，4'，4"，4' “ _四磺酸(與氧單鈉鹽水 合物的混合物)(具有鐵作為配位金屬、且具有磺酸基作為官能團(tuán)的陰離子性平面型酞菁) 的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述 Anti-G-quadruplex溶液B和NC溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖21所示。由此，使用Anti-G-quadruplex溶液B時(shí)得結(jié)果也與使 用不含DNA的NC溶液時(shí)的結(jié)果大致相同。根據(jù)以上結(jié)果可知，使用酞菁鐵(III)-4，4'， 4"，4' “ _四磺酸(與氧單鈉鹽水合物的混合物)不能夠檢測(cè)出溶液中的形成反平行型 G-quadruplex 的 DNA0除了以上的酞菁以外，還對(duì)四磺酸酞菁鋅(II )(=具有鋅作為配位金屬、 且具有磺酸基作為官能團(tuán)的陰離子性平面型酞菁)進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，僅在與 Anti-G-quadruplex溶液混合時(shí)在640 740nm的范圍內(nèi)觀察到峰。因此，根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果可知，除了使用陰離子性酞菁鐵以外，使用任一種陰離 子性平面型酞菁都能夠檢測(cè)出反平行型G-quadruplex。另外，使用四磺酸酞菁鋅(II )時(shí)， 在上述峰范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度值與樣品中的人類端粒DNA濃度之間也能夠確認(rèn)很 高的相關(guān)關(guān)系。因此，根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果可知，除了使用陰離子性酞菁鐵以外，使用任一種陰離 子性平面型酞菁都能夠定量檢測(cè)出在試樣溶液中存在的形成反平行型G-quadruplex的單 鏈DNA的濃度。(實(shí)施例2)
本實(shí)施例中，嘗試使用陰離子性平面型酞菁檢測(cè)出在溶液中混合存在的形成反平 行型G-quadruplex和平行型G-quadruplex的DNA。為此，首先以下述順序制備混合存在有 形成反平行型G-quadruplex的DNA和形成平行型G-quadruplex的DNA的溶液。<混合存在有形成反平行型G-quadruplex的DNA和形成平行型G-quadruplex的 DNA的溶液的制備>首先制備含有人類端粒DNA的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7的溶液(總量100 μ 1)。 這里，分別準(zhǔn)備該溶液中所含的人類端粒DNA的濃度為1、2、10、25、50、100μΜ的溶液。作 為陰性對(duì)照，還制備了不含DNA的50mM HEPESUOOmM KCUpH 7的溶液。接著，將這些溶液 進(jìn)行退火處理。接著，為了確認(rèn)上述結(jié)果得到的各溶液中的人類端粒DNA是否形成平行型 G-quadruplex，對(duì)各溶液進(jìn)行CD分析。其結(jié)果如圖12所示。這里，如實(shí)施例1中的說(shuō)明，已知反平行型G-quadruplex時(shí)，該⑶測(cè)定的結(jié)果為 在295nm附近顯示正峰，在265nm附近顯示負(fù)峰。另一方面，已知平行型G-quadruplex時(shí)， 在260nm附近顯示正峰，在240nm附近顯示負(fù)峰。根據(jù)這些認(rèn)知，在圖12所示的⑶結(jié)果中， 除了陰性對(duì)照的溶液以外，在240nm附近存在負(fù)峰，在295nm附近存在正峰，由此可以認(rèn)為 平行型G-quadruplex和反平行型G-quadruplex混合存在。另外，無(wú)論是295nm附近的正峰還是240nm附近的負(fù)峰，其絕對(duì)值均隨著人類端粒 DNA濃度的增高而增大。這顯示，若最初含有的人類端粒DNA濃度高，則上述退火處理后得 到的溶液中的形成平行型G-quadruplex DNA和形成反平行型G-quadruplex DNA的濃度也均高。下面，分別對(duì)人類端粒DNA濃度為100、50、25、10、2、1μΜ的溶液進(jìn)行上述一系列 的退火處理，將結(jié)果得到溶液分別稱為Anti-Para-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F。另 一方面，對(duì)作為陰性對(duì)照制備的不含DNA的溶液進(jìn)行上述一系列退火處理，將結(jié)果得到的 溶液稱為NC-2溶液。接著，使用由以上工序得到的Anti-Para-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F和NC-2 溶液，由陰離子性平面型酞菁進(jìn)行平行型G-quadruplex檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法如下所述。<利用陰離子性酞菁銅的檢測(cè)>首先制備含有15μΜ的酞菁銅(II )_3，4' Λ" Λ'“-四磺酸四鈉鹽的 50mM HEPESUOOmM KC1、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述 Anti-Para-G-quadrup 1 ex溶液B、C、D、F和NC-2溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm 的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖13(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外,可知該峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > F 的順序增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁銅(II )_3，4'，4〃，4'‘‘-四磺酸四鈉鹽，能 夠檢測(cè)出溶液中混合存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖13(A)中得到的各圖譜在689. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖13(B)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用 酞菁銅(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四鈉鹽，能夠定量檢測(cè)出形成反平行型和平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖13(B)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié) 構(gòu)變化為反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加酞菁銅(II )_3，4'，4"，4'“-四 磺酸四鈉鹽而得到的結(jié)果，但是，在進(jìn)行退火處理之前添加酞菁銅(II )_3，4'，4"， 4'“-四磺酸四鈉鹽時(shí)(即按照?qǐng)D10㈧所示的順序時(shí))，也與圖13⑶的情況同樣，所得 到的在689. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。<利用陰離子性酞菁鎳的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7 的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-Para-G-quadruplex溶液A、 B、C、E和NC-2溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖14(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外,可知該峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液A > B > C > E 的順序增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠檢測(cè)出溶液中 混和存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖14(A)中得到的各圖譜在677. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖14⑶所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用酞菁 鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠定量檢測(cè)出形成反平行型和平行型G-quadruplex的單鏈DNA 的濃度。另外，圖14(B)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié) 構(gòu)變化為反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽而得到的 結(jié)果，但是，在進(jìn)行退火處理之前添加酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽時(shí)(即按照?qǐng)D10(A)所示 的順序時(shí))，也與圖14⑶的情況同樣，所得到的在677. 5nm的吸光度值與該樣品的人類端 粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。<利用不具有配位金屬的陰離子性酞菁的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四磺酸酞菁的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7的溶液(總量 20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B、C、D、F和NC-2 溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖15(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC-2溶液外，在660 740nm 的范圍內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)峰，另外，可知該峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > F的 順序增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四磺酸酞菁，能夠檢測(cè)出溶液中混合存在的形成反 平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖15(A)中得到的各圖譜在708. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖15(B)所示，在675. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度的關(guān)系 如圖15(C)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用四磺酸酞菁，能 夠定量檢測(cè)出形成反平行型和平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖15(B)和圖15(C)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò) 退火而使結(jié)構(gòu)變化為反平行型G-quadruplex和平行型G-quadruplex之后，添加四磺酸酞 菁而得到的結(jié)果，但是，在進(jìn)行退火處理之前添加四磺酸酞菁時(shí)，也與圖15(B)和圖15(C) 的情況同樣，所得到的在708. Onm和在675. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。<利用陰離子性酞菁鈷的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四羧酸酞菁鈷(II )的50mM HEPES、IOOmMKCl、pH7的溶 液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B、C、D、 E和NC-2溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖34(A)所示。由此發(fā)現(xiàn)除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。另外,可知該峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > E 的順序增大。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四羧酸酞菁鈷(II )，能夠檢測(cè)出溶液中混合存在的 形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，圖34㈧中得到的各圖譜在679. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA 濃度的關(guān)系如圖34(B)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用四 羧酸酞菁鈷(II )，能夠定量檢測(cè)出形成反平行型和平行型G-quadruplex的單鏈DNA的濃度。另外，圖34(B)是如上所述將在試樣溶液中含有的人類端粒DNA通過(guò)退火而使結(jié) 構(gòu)變化為反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加四羧酸酞菁鈷(II )而得到的結(jié)果， 但是，在進(jìn)行退火處理之前添加四羧酸酞菁鈷(II )時(shí)，也與圖34(B)的情況同樣，所得到 的在679. Onm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度之間可獲得很高的相關(guān)關(guān)系。但是，使用四羧酸酞菁鈷(II )時(shí)在640 720nm的范圍所見的峰上升，比使用酞 菁銅(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四鈉鹽、酞菁鎳(II)四磺酸四鈉鹽和四磺酸酞菁時(shí) 小。認(rèn)為這是由于合成的四羧酸酞菁鈷(II )沒有充分精制的緣故。<利用陰離子性酞菁鐵的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的酞菁鐵(III) _4，4'，4"，4' “ _四磺酸(與氧單鈉鹽水 合物的混合物)的50mM HEPESUOOmM KC1、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶 液分別與上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B和NC-2溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如圖16所示。由此可知，使用Anti-Para-G-quadruplex溶液B和使 用NC-2溶液這兩種情況所得到的結(jié)果大致相同。因此，根據(jù)以上結(jié)果可知，使用酞菁鐵 (ΙΙΙ)-4,4' Λ" ,4' “ _四磺酸(與氧單鈉鹽水合物的混合物)不能檢測(cè)出溶液中混合 存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。除了以上的酞菁以外，也對(duì)四磺酸酞菁鋅(II )(=具有磺酸基作為官能 團(tuán)、且具有鋅作為配位金屬的陰離子性平面型酞菁)進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，僅在與 Anti-Para-G-quadruplex溶液混合時(shí)在640 740nm的范圍內(nèi)觀察到峰。因此，根據(jù)以上 結(jié)果可知，除了使用陰離子性酞菁鐵以外，使用任一種陰離子性平面型酞菁都能夠檢測(cè)出 反平行型、平行型G-quadruplex。另外，使用四磺酸酞菁鋅(II )時(shí)，在上述峰范圍內(nèi)的特定波長(zhǎng)的吸光度值與樣品 中的人類端粒DNA濃度之間也能夠確認(rèn)很高的相關(guān)關(guān)系。因此，使用四磺酸酞菁鋅(II ) 時(shí)，也能夠定量檢測(cè)出在溶液中存在的形成反平行型和平行型G-quadruplex的單鏈DNA的 濃度。
(實(shí)施例3)根據(jù)上述實(shí)施例1和實(shí)施例2的結(jié)果可知，除了使用陰離子性酞菁鐵以外，使用 任一種陰離子性平面型酞菁都能夠檢測(cè)出在溶液中存在的無(wú)論形成反平行型還是平行型 G-quadruplex0本實(shí)施例3中，為了確認(rèn)這些陰離子性酞菁對(duì)G-quadruplex的特異性，使 用陰離子性酞菁進(jìn)行了單鏈DNA和雙鏈DNA的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。為此，首先按照以下順序制備含 有單鏈DNA的溶液、含有雙鏈DNA的溶液。<含有單鏈DNA的溶液的制備>制備以50μΜ的濃度含有由5' -ttttttttttttttttttttt-3‘的序列(序列號(hào) 4)形成單鏈DNA的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量100 μ 1)，將這些溶液在90°C 孵育5分鐘之后，以2V /分鐘的降溫速度冷卻至0°C，最后在0°C孵育2小時(shí)。該結(jié)果得到 的溶液中的DNA在孵育后也為單鏈DNA (以下，將該溶液稱為單鏈DNA溶液)。<含有雙鏈DNA的溶液的制備>制備分別以50 μ M的濃度含有由5 ‘ -AGAAGAGAAAGA-3 ‘的序列(序列號(hào)5)形 成單鏈DNA和由5 ‘ -TCTTTCTCTTCT-3 ‘的序列(序列號(hào)5的反義鏈)形成單鏈DNA的 50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量100 μ 1)，將這些溶液在90°C孵育5分鐘之后， 以2V /分鐘的降溫速度冷卻至0°C，最后在0°C孵育2小時(shí)。由于上述兩種DNA具有互補(bǔ) 的關(guān)系，該孵育的結(jié)果使溶液中的兩種DNA形成了雙鏈DNA(以下，將該溶液稱為雙鏈DNA 溶液)。使用以上工序得到的單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液，利用陰離子性酞菁進(jìn)行單鏈 DNA和雙鏈DNA的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法如下所述。<利用陰離子性酞菁銅的檢測(cè)>首先制備含有15μΜ的酞菁銅(II )_3，4' A" A'“-四磺酸四鈉鹽的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述單鏈DNA溶 液和雙鏈DNA溶液混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。單鏈DNA溶液和雙鏈DNA 溶液各自的測(cè)定結(jié)果如圖22㈧和圖22⑶所示。在各自的圖中，將使用實(shí)施例1中的NC溶液作為陰性對(duì)照得到的結(jié)果也一并表 示。由此可知，單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液盡管含有50 μ M的高濃度的DNA，也都得到與 NC溶液中基本相同的結(jié)果。因此，根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果可知，使用酞 菁銅(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四鈉鹽對(duì)形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)具有極高 的特異性。<利用陰離子性酞菁鎳的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽的50mM HEPESUOOmM NaCl, PH7的溶液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液 混合，對(duì)該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液各自的測(cè)定 結(jié)果如圖23(A)和圖23(B)所示。在各自的圖中，將使用實(shí)施例1中的NC溶液作為陰性對(duì) 照得到的結(jié)果也一并表示。由此可知，單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液盡管含有50 μ M的高濃度的DNA，也都得 到與NC溶液基本相同的結(jié)果。因此，根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果可知，使 用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽對(duì)形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)具有極高的特異性。
<利用不具有配位金屬的陰離子性酞菁的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四磺酸酞菁的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(總量 20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液混合，對(duì)該混合液測(cè) 定480 800nm的吸光度。單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液各自的測(cè)定結(jié)果如圖24 (A)和圖 24(B)所示。在各自的圖中，將使用實(shí)施例1中的NC溶液作為陰性對(duì)照得到的結(jié)果也一并表 示。由此可知，單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液盡管含有50 μ M的高濃度的DNA，也都得到與 NC溶液基本相同的結(jié)果。因此，根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果可知，使用四磺 酸酞菁對(duì)形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)具有極高的特異性。<利用陰離子性酞菁鈷的檢測(cè)>首先制備含有15 μ M的四羧酸酞菁鈷(II )的50mM HEPES、IOOmMNaCl、pH7的溶 液(總量20 μ 1)。接著，將該酞菁溶液分別與上述單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液混合，對(duì) 該混合液測(cè)定480 800nm的吸光度。單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液各自的測(cè)定結(jié)果如圖 35(A)和圖35⑶所示。在各自的圖中，將使用實(shí)施例1中的NC溶液作為陰性對(duì)照得到的
結(jié)果也一并表示。由此可知，單鏈DNA溶液和雙鏈DNA溶液盡管含有50 μ M的高濃度的DNA，也都得 到與NC溶液基本相同的結(jié)果。因此，根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果可知，使 用四羧酸酞菁鈷(II )對(duì)形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)具有極高的特異性。除了以上的酞菁以外，也對(duì)四磺酸酞菁鋅(II )(=具有磺酸基作為官能團(tuán)、且具 有鋅作為配位金屬的陰離子性平面型酞菁)進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，單鏈DNA溶液和雙鏈DNA 溶液盡管含有50 μ M的高濃度的DNA，也都得到與NC溶液基本相同的結(jié)果。(實(shí)施例4)上述實(shí)施例1和實(shí)施例2中顯示了，使用由與人類的端粒部分的序列相同的序列 形成單鏈DNA制備平行型、反平行型G-quadruplex的DNA，能夠利用除了配位金屬是鐵以 外的陰離子性酞菁將它們檢測(cè)出來(lái)，或者基于該檢測(cè)的結(jié)果能夠定量檢測(cè)出上述單鏈DNA。 本實(shí)施例4中，對(duì)上述實(shí)施例1和實(shí)施例2的結(jié)果是否限于由人類端粒部分的序列形成的 G-quadruplex、還是對(duì)由人類端粒部分的序列以外形成的G-quadruplex也能夠得到同樣 的結(jié)果進(jìn)行研究?！蠢藐庪x子性酞菁銅對(duì)由5'-ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的檢測(cè) >首先制備由序列5' -ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的單鏈DNA(以下稱為 64丁4640離)、2.5“] 的酞菁銅(11)-3，4'，4〃，4'“-四磺酸四鈉鹽和50mM HEPES、IOOmM KC1、pH7的溶液(總量100 μ 1)。G4T4G4DNA序列與人類端粒部分的序列不同，但是已知在K+的存在下通過(guò)退火處 理可形成平行型G-quadruplex。分別準(zhǔn)備上述溶液中的G4T4G4DNA濃度為0、1、2、3、4、5、 10 μ M的溶液。接著，將這些溶液進(jìn)行退火處理，對(duì)它們測(cè)定480 SOOnm的吸光度。測(cè)定結(jié)果如 圖25 (A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA為ΟμΜ時(shí)以外，大致在640 720nm的范 圍內(nèi)出現(xiàn)峰。
根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁銅(II )_3，4'，4〃，4'“-四磺酸四鈉鹽，能 夠檢測(cè)出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，圖25 (A)中得到的各圖譜在687nm的吸光度值與該樣品的G4T4G4DNA濃度 的關(guān)系如圖25(B)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，根據(jù)該結(jié)果可知， 通過(guò)使用酞菁銅(11)-3，4'，4"，4'“-四磺酸四鈉鹽，能夠定量檢測(cè)出G4T4G4DNA的濃度?！蠢藐庪x子性酞菁鎳對(duì)由5'-ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的檢測(cè) >采用與上述 < 利用陰離子性酞菁銅對(duì)由5' -ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的檢測(cè) > 的實(shí)驗(yàn)相同的方法，使用酞菁鎳(II )四磺 酸四鈉鹽代替酞菁銅(II )_3，4'，4〃，4'丨‘-四磺酸四鈉鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，G4T4G4DNA 濃度為0、1、2、3、4、5、10、25μΜ。結(jié)果如圖26(A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA為 0μ M時(shí)以外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠檢測(cè)出由 G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，圖26 (A)中得到的各圖譜在677. 5nm的吸光度值與該樣品的G4T4G4DNA濃 度的關(guān)系如圖26(B)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，根據(jù)該結(jié)果可 知，通過(guò)使用酞菁鎳(II )四磺酸四鈉鹽，能夠定量檢測(cè)出G4T4G4DNA的濃度?！蠢貌痪哂信湮唤饘俚年庪x子性酞菁對(duì)由5'-ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6) 形成的形成平行型G-quadruplex的DNA的檢測(cè)>采用與上述 < 利用陰離子性酞菁銅對(duì)由5' -ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的檢測(cè) > 的實(shí)驗(yàn)相同的方法，使用四磺酸酞菁代替酞 菁銅(11)-3，4'，4"，4'“-四磺酸四鈉鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，G4T4G4DNA濃度為0、1、2、 10、25μΜ。結(jié)果如圖27(A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA為0 μ M時(shí)以外，大致在 660 740nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四磺酸酞菁，能夠檢測(cè)出由G4T4G4DNA形成的形成 平行型 G-quadruplex 的 DNA。另夕卜，圖27 (A)中得到的各圖譜在705. Onm的吸光度值與該樣品的G4T4G4DNA濃 度的關(guān)系如圖27(B)所示，在6740nm的吸光度值與該樣品的人類端粒DNA濃度的關(guān)系如圖 27(C)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，根據(jù)該結(jié)果可知，通過(guò)使用四 磺酸酞菁，能夠定量檢測(cè)出G4T4G4DNA的濃度?！蠢藐庪x子性酞菁鈷對(duì)由5'-ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的檢測(cè) >采用與上述 < 陰離子性酞菁銅對(duì)由5' -ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的 形成平行型G-quadruplex的DNA的檢測(cè)〉的實(shí)驗(yàn)相同的方法，使用四羧酸酞菁鈷(II )代 替酞菁銅(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸四鈉鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是，四羧酸酞菁鈷(II )的 濃度為30μΜ。另外，G4T4G4DNA濃度為0、5、10、25、50μΜ。結(jié)果如圖36(A)所示。由此可 知，除了上述G4T4G4DNA為0 μ M時(shí)以外，大致在640 720nm的范圍內(nèi)出現(xiàn)峰。根據(jù)以上結(jié)果可知，通過(guò)使用四羧酸酞菁鈷(II )，能夠檢測(cè)出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，圖36 (A)中得到的各圖譜在680nm的吸光度值與該樣品的G4T4G4DNA濃度 的關(guān)系如圖36(B)所示。由此可知兩者之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)使用四羧酸 酞菁鈷(II )，能夠定量檢測(cè)出G4T4G4DNA的濃度。但是，使用四羧酸酞菁鈷(II )時(shí)在640 720nm的范圍所見的峰上升，比使用酞 菁銅(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四鈉鹽、酞菁鎳(II)四磺酸四鈉鹽和四磺酸酞菁時(shí) 小。認(rèn)為這是由于合成的四羧酸酞菁鈷(II )沒有充分精制的緣故?！蠢藐庪x子性酞菁鐵對(duì)由5'-ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的檢測(cè) >采用與上述 < 利用陰離子性酞菁銅對(duì)由5' -ggggttttgggg-3'(序列號(hào)6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的檢測(cè) > 的實(shí)驗(yàn)相同的方法，使用酞菁鐵(III )_4， 4'，4〃，4'丨‘-四磺酸(與氧單鈉鹽水合物的混合物)代替酞菁銅(II )_3，4'，4〃， 4'‘‘-四磺酸四鈉鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另外，6奵4640嫩濃度為0、1、2、3、4、5、10、25口1。結(jié)果如圖28所示。由此可知，所有濃度時(shí)的結(jié)果都與0μ M的結(jié)果一樣。因此可 知通過(guò)酞菁鐵(III)-4，4'，4〃，4'“-四磺酸(與氧單鈉鹽水合物的混合物)不能檢測(cè) 出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。除了以上的酞菁以外，也對(duì)四磺酸酞菁鋅(II )(=具有磺酸基作為官能團(tuán)、且具 有鋅作為配位金屬的陰離子性平面型酞菁)進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，除了上述G4T4G4DNA為 0 μ M時(shí)以外，大致在640 740nm的范圍內(nèi)觀察到峰。因此，根據(jù)上述結(jié)果可知，除了使用 陰離子性酞菁鐵以外，使用任一種陰離子性酞菁都能夠檢測(cè)出由G4T4G4DNA形成的形成平 行型 G-quadruplex 的 DNA。另外，使用四磺酸酞菁鋅(II )時(shí)，也能夠確認(rèn)上述峰范圍內(nèi)的特定的波長(zhǎng)的吸光 度值與G4T4G4NDA濃度之間存在很高的相關(guān)關(guān)系。因此，使用四磺酸酞菁鋅(II )也能夠 定量檢測(cè)出G4T4G4DNA的濃度。將實(shí)施例1 實(shí)施例4的結(jié)果與表示各酞菁的結(jié)構(gòu)的圖一同總結(jié)于圖29中。圖 29中的〇表示在各實(shí)施例的DNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，依賴于目的DNA的存在而在640 740nm的 波長(zhǎng)范圍內(nèi)能夠得到吸光度峰。另一方面，X表示不能得到這樣的峰。另外“_”表示沒 有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由此可知，除了陰離子性酞菁鐵以外，無(wú)論陰離子性官能團(tuán)的種類(磺酸基 或者羧基)如何還是配位金屬的種類如何，使用任一種陰離子性酞菁都能特異性檢測(cè)出 G-quadruplex。另外可知，對(duì)于G-quadruplex的種類而言，也不依賴于平行型或者反平行 型，并且對(duì)于序列而言也不限于人類端粒DNA序列，只要是用圖2說(shuō)明的G-quadruplex，都 能夠檢測(cè)出來(lái)。需要說(shuō)明的是，關(guān)于酞菁和G-quadruplex，已知下述的兩個(gè)重要事項(xiàng)。首先，第一 個(gè)重要事項(xiàng)是關(guān)于酞菁所表現(xiàn)出的吸光度。當(dāng)酞菁類溶解于通常的溶液中時(shí)，由于其寬大 的η平面而產(chǎn)生相互間的疊加相互作用，從而引起分子間會(huì)聚。此時(shí)的典型的UV吸收譜 如圖30(A)所示。另一方面，如果向該狀態(tài)的酞菁溶液中添加表面活性劑，則在640 740 附近出現(xiàn)峰(圖30(B))。已知這時(shí)表示通過(guò)表面活性劑的添加而使酞菁以會(huì)聚被解除的狀 態(tài)(換而言之即為單體的狀態(tài))存在的峰。即，本實(shí)施例1 4的結(jié)果中，除了陰離子性酞 菁鐵以外，其他的陰離子性酞菁在與G-quadruplex混合的狀態(tài)中，至少一部分作為單體存
23在，它們表現(xiàn)為640 730nm附近的峰。第二個(gè)重要事項(xiàng)是關(guān)于G-quadruplex與其它有機(jī)分子的相互作用。如圖2中的 說(shuō)明，G-quadruplex具有稱為G-qartet(G四聯(lián)體)面的寬大的π平面疊加而成的結(jié)構(gòu)。 這樣的結(jié)構(gòu)容易使其它具有η平面的分子嵌入該G-qartet面與G-qartet面之間。因此， 例如此前的陽(yáng)離子性蒽醌類和陽(yáng)離子性卟啉等的分子，顯示通過(guò)其靜電相互作用和疊加相 互作用的效果而嵌入G-quadruplex中。因此，加上對(duì)這些知識(shí)的考慮，本實(shí)施例1 本實(shí)施例4的結(jié)果表示，除了陰離子 性酞菁鐵以外的其它陰離子性酞菁以圖31所示的機(jī)制特異性檢測(cè)G-quadruplex。S卩，不存 在G-quadruplex時(shí)，這些陰離子性酞菁會(huì)聚，其UV吸收譜如圖30(A)所示。但是，如果其 中混合G-quadrup 1 ex，則這些陰離子性酞菁的至少一部分嵌入G-quadrup 1 ex中。嵌入的陰 離子性酞菁與單體狀態(tài)相同，因此顯示640 730nm的吸光度峰。這里，出乎意料的一點(diǎn)在于，盡管所使用的酞菁不同于上述的陽(yáng)離子性蒽醌類和 陽(yáng)離子性卟啉類，而為陰離子性的，但是也能得到該效果。另一方面，單鏈DNA和雙鏈DNA 中不存在G-quadruplex這樣的寬大的π平面，而且陰離子性之間的靜電排斥也發(fā)揮作用， 其結(jié)果，即使混合也不引起反應(yīng)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與原來(lái)認(rèn)為的陽(yáng)離子性作為 DNA檢測(cè)的探針有利的常識(shí)相反，通過(guò)使用陰離子性的酞菁，能夠得到對(duì)G-quadruplex很 高的特異性，從而完成了本發(fā)明。另外，著眼于圖29所示的酞菁的配位金屬可知，只有在配位金屬為鐵時(shí)，無(wú)論是 人類端粒DNA還是G4T4G4DNA，都不能檢測(cè)出G-quadruplex。該理由如下所述。即，作為酞 菁的代表性的結(jié)構(gòu)，存在稱為平面型的和稱為羽毛球型的。平面型則如其名，分子整體形成 平面(圖32(A))，與其相對(duì)，羽毛球型則形成為金屬和其配體從酞菁平面僅向一個(gè)方向突 出的結(jié)構(gòu)(圖32(B))。作為本發(fā)明中使用的作為陰離子性酞菁鐵的酞菁鐵(III )_4，4'，4"，4'“-四 磺酸(與氧單鈉鹽水合物的混合物)，是配位金屬鐵具有氧的物質(zhì)，其是羽毛球型的酞菁。 另一方面，本實(shí)施例中使用的其它酞菁全部是平面型。如上所述，羽毛球型酞菁形成從中 央部分突出的結(jié)構(gòu)從而缺乏平面型。因此，平面型的酞菁如圖31所示的機(jī)制，能夠嵌入 G-quadruplex中，與此相對(duì)，本實(shí)施例中使用的陰離子性酞菁鐵所代表的羽毛球型酞菁由 于不是平面型，所以不能嵌入G-quadruplex中，作為結(jié)果，不能觀察到采用其它陰離子性 酞菁類時(shí)所觀察到的640 730nm的吸光度峰。這種關(guān)于平面型酞菁和羽毛球型酞菁對(duì) G-quadruplex的相互作用的知識(shí)，是本發(fā)明的發(fā)明人在世界上首次發(fā)現(xiàn)的。對(duì)以上進(jìn)行總結(jié)，本發(fā)明的發(fā)明人與現(xiàn)有的常識(shí)相反地使用陰離子性的酞菁，并 且在世界上首先發(fā)現(xiàn)平面型酞菁和羽毛球型酞菁對(duì)G-quadruplex的相互作用的不同，由 此完成了本發(fā)明的使用陰離子性平面型酞菁的特異性極高的G-quadruplex檢測(cè)方法。根據(jù)上述說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的大量改良和其它實(shí)施方式。因 此，上述說(shuō)明僅僅是作為示例進(jìn)行解釋的，是出于將實(shí)施本發(fā)明的最佳方式向本領(lǐng)域技術(shù) 人員進(jìn)行說(shuō)明的目的而提供的。能夠不超出本發(fā)明的精神而將其結(jié)構(gòu)和/或機(jī)能的詳細(xì)內(nèi) 容進(jìn)行實(shí)質(zhì)上的變更。產(chǎn)業(yè)上的可利用性。根據(jù)本發(fā)明，形成G-quadruplex的DNA的特異性檢測(cè)方法作為生物技術(shù)領(lǐng)域中的分析方法是有用的。
權(quán)利要求
一種G-quadruplex檢測(cè)方法，檢測(cè)試樣溶液中的G-quadruplex，其中，該試樣溶液含有形成單鏈結(jié)構(gòu)、雙鏈結(jié)構(gòu)和G-quadruplex中的至少任一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)將含有所述陰離子性平面型酞菁的溶液與所述試樣溶液混合的工序；(c)測(cè)定所述(b)工序之后的混合液在640～740nm的吸光度的工序；和(d)如果在所述640～740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定所述試樣溶液中含有形成G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的G-quadruplex檢測(cè)方法，其特征在于所述陰離子性平面型酞菁，是具有銅、鋅、鈷或者鎳作為配位金屬的陰離子性平面型酞 菁、或者不具有配位金屬的陰離子性平面型酞菁。
3.如權(quán)利要求1所述的G-quadruplex檢測(cè)方法，其特征在于所述陰離子性平面型酞菁具有選自羧基、羧基的金屬鹽、磺基以及磺基的金屬鹽中的 至少一種官能團(tuán)。
4.一種形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)方法，通過(guò)研究試樣溶液中含有的形成單 鏈結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)中的至少一種以上的結(jié)構(gòu)的DNA是否形成G-quadrup 1 ex，檢測(cè)形成 G-quadruplex的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)將所述試樣溶液置于G-quadruplex形成反應(yīng)條件下的工序；(b)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(c)在所述(a)工序之前或之后，將含有所述陰離子性平面型酞菁的溶液與所述試樣 溶液混合的工序；(d)測(cè)定所述(a) (c)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；禾口(e)如果在所述640 740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定所述試樣溶液中含有形成 G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。
5.如權(quán)利要求4所述的形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)方法，其特征在于 所述陰離子性平面型酞菁是配位有選自銅、鋅、鈷和鎳中的至少一種金屬的陰離子性平面型酞菁、或者沒有配位金屬的陰離子性平面型酞菁中的任一種。
6.如權(quán)利要求4所述的形成G-quadruplex的DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述陰離子性平面型酞菁具有選自羧基、羧基的金屬鹽、磺基以及磺基的金屬鹽中的 至少一種官能團(tuán)。
7.—種端粒酶活性測(cè)定方法，測(cè)定試樣溶液中的端粒酶活性，其特征在于，所述方法依 次包括以下工序(a)制備所述試樣溶液的工序；(b)制備底物溶液的工序，該底物溶液含有作為端粒酶底物的DNA；(c)混合所述試樣溶液和所述底物溶液，制備端粒酶反應(yīng)溶液的工序；(d)將所述端粒酶反應(yīng)溶液置于由端粒酶進(jìn)行的DNA添加反應(yīng)的條件下；(e)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(f)將含有所述陰離子性平面型酞菁的溶液與所述(d)工序后得到的溶液混合的工序； (g)測(cè)定所述(a) (f)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；禾口(h)如果在所述640 740nm出現(xiàn)最大吸收峰，則判定所述試樣溶液中含有形成 G-quadruplex結(jié)構(gòu)的DNA的工序。
8.如權(quán)利要求7所述的端粒酶活性測(cè)定方法，其特征在于所述陰離子性平面型酞菁是配位有選自銅、鋅、鈷和鎳中的至少一種金屬的陰離子性 平面型酞菁、或者沒有配位金屬的陰離子性平面型酞菁中的任一種。
9.如權(quán)利要求7所述的端粒酶活性測(cè)定方法，其特征在于所述陰離子性平面型酞菁具有選自羧基、羧基的金屬鹽、磺基及磺基的金屬鹽中的至 少一種官能團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種特異性檢測(cè)G-quadruplex的方法。本發(fā)明的G-quadruplex檢測(cè)方法的特征在于，包括以下工序(a)準(zhǔn)備含有陰離子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)將含有上述陰離子性平面型酞菁的溶液與試樣溶液混合的工序；和(c)測(cè)定上述(b)工序后的混合液在640～740nm的吸光度的工序。
文檔編號(hào)G01N33/58GK101889210SQ20098010127
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
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