專利名稱：sFlt-1:血管生成因子絡(luò)合物的測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析和體外診斷，更具體地講涉及先兆子癇中包括的sFlt-Ι 血 管生成因子絡(luò)合物的測(cè)定。
背景技術(shù)：
先兆子癇是一種高血壓、浮腫和蛋白尿綜合征，在孕婦中的患病率為5至10%，并 會(huì)導(dǎo)致高母兒發(fā)病率和死亡率。先兆子癇每年在全世界造成200，000例孕產(chǎn)婦死亡。先兆 子癇的臨床癥狀通常出現(xiàn)在懷孕20周后，通常在婦女血壓常規(guī)評(píng)估和尿樣中蛋白存在的 檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)。然而，這類臨床評(píng)估對(duì)該綜合征的早期診斷是無效的。當(dāng)臨床評(píng)估不能 提供有效信息時(shí)，如果能夠評(píng)估先兆子癇發(fā)展的可能性，和/或能夠在妊娠早期診斷先兆 子癇，和/或能夠在發(fā)病階段診斷先兆子癇，則可以進(jìn)行早期干預(yù)，并降低孕婦和發(fā)育中的 胎兒出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率。目前對(duì)于先兆子癇還沒有已知的治療方法。先兆子癇的嚴(yán)重程度可以為輕度至危 及生命。妊娠并發(fā)癥包括腎衰竭、HELLP綜合征(溶血、肝酶升高和血小板減少)、肝衰竭、 癲癇合并腦水腫，少數(shù)情況下還會(huì)導(dǎo)致死亡。潛在的胎兒并發(fā)癥包括低出生體重、早產(chǎn)和死 亡。輕度先兆子癇可通過臥床休息和頻繁監(jiān)測(cè)進(jìn)行治療。對(duì)于中度至重癥病例，建議住院 治療，并開具降血壓藥物或抗癲癇藥物以預(yù)防癲癇。如果病情危及母嬰生命，應(yīng)終止妊娠并 提前分娩。最近有人對(duì)與先兆子癇相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了綜述(Mutter andKarumanchi, Microvascular Research 75 1-8，2008 (Mutter 和 Karumanchi，微血管研究，第 75 卷第 1-8 頁，2008年))。如Mutter和Karumanchi所指出，據(jù)信內(nèi)皮功能障礙會(huì)促成先兆子癇的臨 床綜合征(Roberts and Cooper, Lancet 357 :53_56，2001 (Roberts 和 Cooper，柳葉刀，第 357卷第53-56頁，2001年))。該疾病的許多癥狀可能是因內(nèi)皮功能異常(包括動(dòng)脈對(duì)外源 和內(nèi)源刺激的高反應(yīng)性、與腎小球通透性增加相關(guān)的蛋白尿、腦水腫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透 性增加、以及導(dǎo)致HELLP綜合征的血管血栓)引起的(Roberts，Semin Reprod Endocrinol 16 5-15,1998 ；Roberts and Cooper, Lancet 357 :53_56，2001 (Roberts 禾口 Cooper，柳葉 刀，第357卷第53-56頁，2001年))。因此，人們一直在積極探尋引起或促成內(nèi)皮功能障礙 的循環(huán)因子。胎兒和胎盤的正常發(fā)育由若干生長(zhǎng)因子介導(dǎo)。其中一個(gè)生長(zhǎng)因子是血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF)。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原、血管生成誘導(dǎo)因子和血管通透性介 導(dǎo)因子。還已發(fā)現(xiàn)，VEGF對(duì)腎小球毛細(xì)血管的修復(fù)發(fā)揮著重要作用。VEGF作為同源二聚體與兩種同源跨膜酪氨酸激酶受體_fms樣酪氨酸激酶受體(Flt-I)(也稱為血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子受體1或VEGF-R1)和激酶結(jié)構(gòu)域受體(Flk/KDR)(也稱為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2或VEGF-R2)中的一種結(jié)合，這兩種受體在來自許多不同組織的內(nèi)皮細(xì)胞中差異表達(dá)。 Flt-1(但不是Flk/KDR)由有助于胎盤形成的滋養(yǎng)層細(xì)胞高表達(dá)。胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)是 VEGF家族的成員，它也與胎盤發(fā)育有關(guān)。PlGF由細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)，并能 夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和活化。PlGF作為同源二聚體與Flt-I受體(但不是Flk/KDR 受體)結(jié)合。PlGF和VEGF均有助于對(duì)胎盤發(fā)育至關(guān)重要的促有絲分裂活性和血管生成。人們已在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中鑒定出一種可溶形式的Flt-I受體 (sFlt-Ι)，并隨后證實(shí)了在胎盤組織中的體內(nèi)表達(dá)。sFlt-Ι是無跨膜域和胞質(zhì)域的Flt-I 受體的剪接變體(He 等人，Mol Endocrinol 13 :537_545，1999 ；Kendall 和 Thomas，Proc Natl Acad Sci USA 90 10705-10709，1993)。Beth Israel Deaconess Medical Center 禾口 Harvard MedicalSchool ^JffuA 員最近的工作表明，先兆子癇患者的胎盤瘦素產(chǎn)量和母體血清sFlt-Ι水平增加(Ahmad和 Ahmed, Circ Res 95 884-891, 2004 ；Chaiworapongsa ^A, Am J Obstet Gynecol 190 1541-1547，2004 ;Koga 等人，J Clin Endocrinol Metab 88 2348-2351, 2003 ；Maynard 等人，J Clin Invest 111 :649_658，2003 ;Shibata 等人，J ClinEndocrinol Metab 90: 4895-4903, 2005) ο sFlt_l能夠與VEGF和PlGF結(jié)合。當(dāng)在血清中處于游離狀態(tài)時(shí)， sFlt-Ι可能會(huì)減弱這些生長(zhǎng)因子分別與其同源受體Flt-I和Flk/KDR的結(jié)合(Kendall等 人，Biochem BiophysRes Commun 226:324-328,1996)。已經(jīng)知道，除了 VEGF 和 PlGF 之 外，胎盤可以產(chǎn)生多種其他血管生成因子，其中包括血管生成素(Ang-Ι和Ang-2)及其受 體 Tie-2(Dunk 等人，Am J Pathol 156 :2185_2199，2000 ；Geva 等人，J Clin Endocrinol Metab 87 :4213_4224，2002 ;Goldman_Wohl 等人，Mol Hum Reprod 6 :81_87，2000)。據(jù)發(fā) 現(xiàn)，在患有先兆子癇的婦女血清中sFlt-Ι水平增加，VEGF和PlGF水平降低。最近人們關(guān)注到了另一種因子內(nèi)皮糖蛋白(endoglin) (Eng)，這是一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子β 和β 3的輔助受體，是一種在先兆子癇患者胎盤中大量表達(dá)的蛋白。內(nèi)皮糖蛋白 的胞外域可能會(huì)釋放并在血清中發(fā)現(xiàn)，此時(shí)稱其為可溶性內(nèi)皮糖蛋白(sEng)。與sFlt-1 類似，sEng在發(fā)病前2至3個(gè)月在母體血清中增加(Levine等人，N Engl J Med 355 992-1005，2006)。通過識(shí)別先兆子癇發(fā)作前出現(xiàn)的循環(huán)血管生成因子失衡或其臨床表現(xiàn)，可用于設(shè) 計(jì)篩選和/或診斷試驗(yàn)，從而識(shí)別存在先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的患者。這樣的試驗(yàn)可以幫助臨床 醫(yī)生在病程早期進(jìn)行密切的隨訪和治療干預(yù)，因而具有寶貴的意義。使用采自先兆子癇 患者的血清進(jìn)行的多項(xiàng)回顧性研究表明，血清中的sFlt-Ι濃度在發(fā)現(xiàn)任何臨床表現(xiàn)之前 5 至 6 周一樣高(Chaiworapongsa 等人，J Matern Fetal Neomatal Med 17 :3_18，2005 ； Hertig 等人，Clin Chem 50 :1702_1703，2004 ;Levine 等人，NEngl J Med 350:672-683， 2004 ;McKeeman 等人，Am J Obstet Gynecoll91 1240-1246，2004)。此外，游離的 VEGF 和 PlGF 較低(Hertig 等人，Clin Chem 50 :1702_1703，2004 ;Levine 等人，N Engl J Med350 672-683,2004)。最近有關(guān)血清中sFlt_l的增加或PlGF的減少是否可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)先兆子 癇發(fā)作的系統(tǒng)性綜述文獻(xiàn)得出結(jié)論，妊娠末三個(gè)月的sFlt-Ι增加和PlGF減少與先兆子癇 相關(guān)，但現(xiàn)有數(shù)據(jù)還不足以建議以此作為篩選試驗(yàn)的內(nèi)容(Widmer等人，Obstet Gynecol109 168-180,2007)。仍然需要更高效和/或更有效的方法來預(yù)測(cè)婦女發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)或確定其 是否已患有先兆子癇。在妊娠早期和/或在臨床評(píng)估可能無法提供有效信息的疾病階段， 預(yù)測(cè)和/或檢測(cè)先兆子癇將是尤其有利的。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種測(cè)定sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的存在或量的方法。該方 法包括a)利用結(jié)合于PlGF的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于sFlt_l和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物；或b)利用結(jié)合于sFlt-Ι的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于PlGF和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物；或c)利用結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑能夠同時(shí)結(jié)合于該絡(luò) 合物；或d)利用結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用與PlGF和 sFlt-Ι中的一者或兩者結(jié)合的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，該方法用于指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)個(gè)體 中的血管、血管相關(guān)、腫瘤、腫瘤相關(guān)、心臟、心臟相關(guān)、先兆子癇或先兆子癇相關(guān)的疾病。該 方法包括a)測(cè)定采自個(gè)體的樣本中sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的存在或量；和b)i)將sFlt_l:PlGF測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或ii)用一個(gè)或多 個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié) 果，并將sFlt-1: PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；從而指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)該疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法還可以包括a)測(cè)定樣本中一種或多種分子實(shí)體的存在或量；和b)i)將分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和sFlt-1: PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值 進(jìn)行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果和 sFlt-l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法還可以包括a)測(cè)定個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將生理屬性測(cè)定值和分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果以及sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果 與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將生理屬性測(cè)定值和分子實(shí)體測(cè) 定結(jié)果以及sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將生理屬性的值 轉(zhuǎn)換結(jié)果和分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果以及sFlt-l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
在一個(gè)附加的實(shí)施例中，該方法可以包括a)測(cè)定個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將生理屬性測(cè)定值和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn) 行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將生理屬性測(cè)定值和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將生理屬性轉(zhuǎn)換結(jié)果和sFlt_l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于測(cè)定sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的存在或量的組合 物。該組合物包含a)結(jié)合于PlGF的捕獲劑和結(jié)合于sFlt-1和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者 的檢測(cè)劑；或b)結(jié)合于sFlt-Ι的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者 的檢測(cè)劑；或c)結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于sFlt_l :P1GF絡(luò)合物的檢測(cè)劑， 其中捕獲劑和檢測(cè)劑能夠同時(shí)結(jié)合于該絡(luò)合物；或d)結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和sFlt-Ι中的一者或兩者 的檢測(cè)劑。另外，本發(fā)明涉及包含純化形式的sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的組合物。


圖1示出了通過PlGF捕獲和sFlt-Ι檢測(cè)的方式測(cè)定sFlt_l :P1GF絡(luò)合物的分析 結(jié)構(gòu)圖；圖2示出了 sFlt-Ι PlGF-I絡(luò)合物分析的劑量反應(yīng)曲線；圖3示出了根據(jù)sFlt-l:PlGF-l絡(luò)合物分析的正常人(0)和先兆子癇患者(1)樣 本結(jié)果的點(diǎn)圖；圖4示出了正常人(0)和先兆子癇患者(1)樣本中的sFlt-1:PlGF絡(luò)合物與游離 PlGF的計(jì)算比率的點(diǎn)圖。
具體實(shí)施例方式如本文所用，sFlt-Ι是指可溶形式的fms樣酪氨酸激酶受體(Flt-I)。Flt-I也 稱為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1 (VEGFR-I)。sFlt-Ι (也稱為sVEGFR-Ι)是無跨膜域和胞質(zhì)域 的Flt-I的剪接變體。含有跨膜域和胞質(zhì)域氨基酸的Flt-I的氨基酸序列由基因庫登錄 號(hào)P17948 (1338個(gè)氨基酸)提供?？扇苄问降腇lt-I缺失了第688-1338位氨基酸，并且第 657-687位氨基酸也有所不同，從而形成687個(gè)氨基酸的sFlt_l的氨基酸序列。sFlt_l異 構(gòu)體在基因庫登錄號(hào)P17948中有所描述。如本文所用，PlGF是指胎盤生長(zhǎng)因子。PlGF具有4種現(xiàn)已識(shí)別的異構(gòu)體，其中包 括PlGF-I、P1GF-2、P1GF_3和P1GF-4，這些異構(gòu)體因選擇性剪接而產(chǎn)生。PlGF氨基酸序列 的一個(gè)例子由基因庫登錄號(hào)P49763 (221個(gè)氨基酸)提供。PlGF-I異構(gòu)體缺失了第132-203
8位氨基酸，從而形成149個(gè)氨基酸的PlGF-I的氨基酸序列。PlGF-I異構(gòu)體在基因庫登錄號(hào) P49763中有所描述。sFlt-Ι結(jié)合于P1GF，本文將所得物稱為sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。考慮到這些術(shù)語，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種測(cè)定sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的存在 或量的方法。該方法包括a)利用結(jié)合于PlGF的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于sFlt_l和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物；或b)利用結(jié)合于sFlt-Ι的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于PlGF和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物；或c)利用結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑能夠同時(shí)結(jié)合于該絡(luò) 合物；或d)利用結(jié)合于sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲該絡(luò)合物，并用結(jié)合于PlGF和 sFlt-Ι中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)該絡(luò)合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，該方法用于指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)個(gè)體 中的血管、血管相關(guān)、腫瘤、腫瘤相關(guān)、心臟、心臟相關(guān)、先兆子癇或先兆子癇相關(guān)的疾病。該 方法包括a)測(cè)定采自個(gè)體的樣本中sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的存在或量；和b)i)將sFlt_l:PlGF測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果 轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將sFlt-l:PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行 比較；從而指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法還可以包括a)測(cè)定樣本中一種或多種分子實(shí)體的存在或量；和b)i)將分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和sFlt-1: PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值 進(jìn)行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果和 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法還可以包括a)測(cè)定個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將生理屬性測(cè)定值和分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果以及sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果 與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將生理屬性測(cè)定值和分子實(shí)體測(cè) 定結(jié)果以及sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將生理屬性的值 轉(zhuǎn)換結(jié)果和分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果以及sFlt-l:PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn) 行比較。在一個(gè)附加的實(shí)施例中，該方法可以包括
a)測(cè)定個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將生理屬性測(cè)定值和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn) 行比較；或ii)利用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將生理屬性測(cè)定值和 sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將生理屬性轉(zhuǎn)換結(jié)果和 sFlt_l:PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。將本發(fā)明的概念延伸到所示優(yōu)選實(shí)施例之外，本發(fā)明可以涉及能夠彼此結(jié)合以形 成分子絡(luò)合物的第一分子實(shí)體和第二分子實(shí)體，其中在優(yōu)選實(shí)施例中，sFlt-1為第一分子 實(shí)體的例子，PlGF為第二分子實(shí)體的例子。sFlt-l:PlGF絡(luò)合物是一例分子絡(luò)合物。下文 將結(jié)合涉及血管生成受體sFlt-Ι及血管生成因子PlGF和VEGF的某些優(yōu)選實(shí)施例詳細(xì)描 述本發(fā)明。這些分子實(shí)體在先兆子癇和先兆子癇相關(guān)疾病方面尤其受關(guān)注。免疫分析_適用于本發(fā)明的一般討論某些分析涉及特異性結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)(測(cè)定其存在或量)的試劑，它們通常被稱 為結(jié)合分析。免疫分析通常被認(rèn)為是使用抗體或抗體片段作為捕獲劑和檢測(cè)劑的結(jié)合分析 法。雖然本發(fā)明是結(jié)合捕獲和檢測(cè)抗體進(jìn)行描述的，但也可以設(shè)想除抗體之外的結(jié)合劑。諸 如捕獲抗體和檢測(cè)抗體之類的結(jié)合劑特異性地結(jié)合于絡(luò)合物形成中涉及的第一分子實(shí)體 或第二分子實(shí)體，或者特異性地結(jié)合于包含第一分子實(shí)體和第二分子實(shí)體的絡(luò)合物。免疫分析可分為競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性(夾心結(jié)構(gòu))免疫分析。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析 中，將標(biāo)記形式的待測(cè)物質(zhì)設(shè)置為與得自樣本的(非標(biāo)記)天然物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)。標(biāo)記形式與天 然物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，以結(jié)合于固定量的捕獲抗體；捕獲抗體能夠結(jié)合于標(biāo)記物質(zhì)和(非標(biāo)記)天然 物質(zhì)，然而不是同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)被結(jié)合于捕獲抗體的標(biāo)記形式的物質(zhì)或游離的(即未被結(jié) 合于捕獲抗體)標(biāo)記形式的物質(zhì)發(fā)出的可測(cè)信號(hào)測(cè)定得自樣本的物質(zhì)的未知濃度。在非競(jìng)爭(zhēng)(夾心結(jié)構(gòu))免疫分析中，讓待測(cè)物質(zhì)接觸捕獲抗體和檢測(cè)抗體，這些抗 體通常在不同的表位結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)，或者在任何情況下能夠同時(shí)結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)?？纱?在結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)的不同表位的多種類型的捕獲抗體和/或結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)的不同表位 的多種類型的檢測(cè)抗體。檢測(cè)抗體被標(biāo)記，而捕獲抗體通常被固定在或能夠固定在固體支 承物上。常規(guī)標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、酶、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、穩(wěn)定的自由基和酶輔因子、抑制劑 以及別構(gòu)劑。免疫分析方法可采用任何適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行。它們可以在溶液中進(jìn)行，在可溶組分 與不可溶組分分離的試驗(yàn)裝置中進(jìn)行，或者在干式分析元件中進(jìn)行。此類免疫分析形式包 括(例如)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、免疫測(cè)定、點(diǎn)印跡(也稱為狹縫印跡)等。免疫分 析可以為異相或均相的。在異相免疫分析中，通常通過一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟將結(jié)合的組分 與游離的非結(jié)合的組分分離。在均相免疫分析中，不需要分離結(jié)合組分與游離組分。與免疫分析和免疫分析方法相關(guān)的出版物為數(shù)眾多(“Practicallmmunoassay”， Butt ed，Marcel Dekker，1984 (實(shí)用免疫分析，Butt 編著，Marcel Dekker，1984 年)； “Immunochemistry of Solid Phase-ImmunoassayButler,CRC Press, 1991 (固相免疫分 析的免疫化學(xué)，Butler，CRC Press，1991 年)；“Immunoassay", Law ed, Taylor &Francis, 1996(免疫分析，Law 編著，Taylor & Francis，1996 年)；"Immunoassay", Eleftherios et al. ,Academic Press，1996 (免疫分析，Eleftherios 等人，Academic Press，1996 年)；
10"Principlesand Practice of Immunoassay", Second Edition, Price and Newmaneds, Macmillan，1997(免疫分析原理與實(shí)踐，第二版，Price和Newman編著，Macmillan, 1997 年)；"Immunoassays in the ClinicalLaboratory，，，Nakamura et al. eds, Alan R Liss, Inc，1979 (臨床實(shí)驗(yàn)室免疫分析，Nakamura 等人編著，Alan R Liss, Inc, 1979 ^ ) ；"Quantitative Enzyme Immunoassay", Engvall et al. eds, Blackwell Scientific Publications, 1978 (定量酶免疫分析，Engvall 等人編著，Blackwell Scientific Publications，1978 年)；Sommer etal.，Clin Chem 32 1770-1774，1986 (Sommer 等人，臨 床化學(xué)，I986 年第 32 期第 I77O-I7M 頁)；"A Primer for Multilayer Immunoassay", Berke, American Chemical Society Conference Proceeding, p303-312, Plenum Press, 1988 (多層免疫分析弓丨物，Berke, AmericanChemical Society Conference Proceeding, 第 303-312 頁，PlenumPress，1988 年)；US 4, 200, 690 ；US 4, 207, 307 ；US 4, 407, 943 ； US4, 550，075 ；US 4，551，426 ；US 4，560，648 ；US 5，312，744 ；US5, 314，830 ；US 5，424，220 ； US 5, 415, 998 ；US 5, 501, 949 ；US5, 518, 887 ；US 5, 663, 054 ；US 5, 789, 261 ；US
5,935, 780 ；US5, 958, 339 ；US 6, 087, 188 ；US 6, 096, 563 ；US 6, 121, 006 ；US6, 143, 575 ；US
6,395, 503 ；US 6, 878, 515 ；US 6, 838, 250 ；US4, 372, 745 ；US 4, 670, 381 ；US 4, 483, 921 ； US 4，517，288 ；US4, 822，747 ；US 4，824，778 ；US 4，829，012 ；US 4，839，299 ；US4, 847，194 ； US 4, 847, 195 ；US 4, 853, 335 ；US 4, 855, 226 ；US4, 857, 453 ；US 4, 857, 454 ；US 4，859，610 ；US 4，863，876 ；US4, 868，106 ；US 4，868，130 ；US 4，879，219 ；US 5，776，933。有關(guān)干式免疫分析元件的詳細(xì)信息可見于下列出版物及其中引用的參考文獻(xiàn)US 3, 867, 258,US 3, 992, 158,US 4, 042, 435,US 4, 050, 898,US 4, 066, 403,US 4, 153, 668,US 4，258，001、US 4，292，272、US4, 430，436。支承物可以為任何不溶的材料或可通過后續(xù)反應(yīng)制成不溶的?？筛鶕?jù)吸引和使捕 獲劑固定的內(nèi)在能力選擇支承物。作為另外一種選擇，可以在支承物上固定能夠吸引和使 捕獲劑固定的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可以(例如)包括與捕獲劑本身或捕獲劑綴合的帶電物質(zhì)電 荷相反的帶電物質(zhì)。通常，交聯(lián)劑可以為被固定到(連接到)支承物上的任何結(jié)合伴侶(優(yōu) 選地為特異性的)，并能夠通過結(jié)合反應(yīng)使捕獲劑固定。交聯(lián)劑能夠使捕獲劑在執(zhí)行分析 前或執(zhí)行分析中間接地結(jié)合于支承物。支承物可以為(例如)塑料、衍生塑料、磁性或非磁 性金屬、玻璃或硅制成的(包括例如)試管、微孔、微量滴定孔、膜、板、珠、微粒、片和本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的其他構(gòu)型。支承物可以為在水性組合物中不溶或基本上不溶的多孔或 無孔材料。支承物能夠以多種不同的形式和構(gòu)型存在容器、管、微量滴定板、球、微粒、桿、 帶、濾紙、色譜紙、膜等。本發(fā)明的方法可適用于采用微粒技術(shù)的系統(tǒng)(包括自動(dòng)和半自動(dòng)系統(tǒng))，其中固 體支承物包括US 5，006，309和US 5，089，424中所述的微粒。在優(yōu)選的形式中，捕獲劑連接到生物素并通過生物素結(jié)合于親和素、鏈霉親和素 或其他生物素結(jié)合劑而被固定到微孔的內(nèi)表面上。有許多專利公布涉及將分子結(jié)合于支承物。例如US 4，624，930、US5, 061, 640、 US 4, 945, 042,US 4, 885, 255,US 5, 362, 624,US5, 277, 589,US 5, 268, 306,US 5，376，557、 US 5，858，803、US5, 126，241、US 5，362，655、US 5，437，981、US 5，792，606、US5, 863，740、 US 5，935, 780、US 6，391, 571。
在異相免疫分析中，可通過以下方法實(shí)現(xiàn)游離組分與結(jié)合組分的分離讓合適的 液體洗滌溶液經(jīng)過支承物；過濾離開支承物的可溶性游離組分；免疫沉淀游離組分，用諸 如聚乙二醇或硫酸銨之類的物質(zhì)進(jìn)行沉淀；磁分離或結(jié)合于不同的支承物；等等。檢測(cè)劑可以為直接可檢測(cè)或間接可檢測(cè)。它可以具有能夠直接或間接發(fā)射信號(hào)的 標(biāo)簽。合適的標(biāo)簽是本領(lǐng)域已知的，并包括(例如)辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光標(biāo) 記、可檢測(cè)的示蹤劑等等。標(biāo)簽可以為能夠直接引發(fā)可檢測(cè)信號(hào)(通常為光學(xué)信號(hào)吸光 度、反射率、發(fā)光和熒光)的化學(xué)實(shí)體。信號(hào)可源于放射性。它可以為伏安測(cè)量或電導(dǎo)測(cè)量 的信號(hào)等。本身能夠產(chǎn)生可測(cè)信號(hào)的可直接檢測(cè)的標(biāo)簽可包括能夠發(fā)出熒光或磷光的有機(jī) 物和無機(jī)物，例如但不限于熒光素及其衍生物、N-(3-fluoranthyl)-馬來酰亞胺、放射性核 素(例如碳14、氚、磷32)；偶氮-氧代(azo-oxo)、偶氮-雙偶氮、吖嗪、噁嗪、噻嗪、喹啉、 吲達(dá)胺、吡喃酮和吡唑啉酮染料。通常，標(biāo)簽可以為化學(xué)元素、化合物或蛋白?？砷g接檢測(cè)的標(biāo)簽通常需要有用來產(chǎn)生可測(cè)信號(hào)的一種或多種附加物質(zhì)存在。此 類標(biāo)記包括需要有底物、輔因子或金屬存在的酶。例如，辣根過氧化物酶是一種需要電子供 體和氧化劑來產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)簽例如，需要魯米諾和過氧化氫來產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，或需要三芳 基咪唑和過氧化氫來產(chǎn)生染料。與一些優(yōu)選實(shí)施例有關(guān)的捕獲劑和/或檢測(cè)劑是能夠特異性結(jié)合于sFlt-1、 VEGF、P1GF或包含sFlt-1和血管生成因子的絡(luò)合物的試劑。一般而言，鑒于第一分子實(shí)體 和第二分子實(shí)體能夠結(jié)合而形成包含這兩種分子實(shí)體的絡(luò)合物，因此除非另外指明，否則 寫明結(jié)合或特異性結(jié)合于第一分子實(shí)體的捕獲劑或檢測(cè)劑能夠結(jié)合于游離的第一分子實(shí) 體并結(jié)合于當(dāng)其被結(jié)合于絡(luò)合物中的第二分子實(shí)體時(shí)的第一分子實(shí)體。類似地，除非另外 指明，否則寫明結(jié)合或特異性結(jié)合于第二分子實(shí)體的捕獲劑或檢測(cè)劑能夠結(jié)合于游離的第 二分子實(shí)體并結(jié)合于當(dāng)其被結(jié)合于絡(luò)合物中的第一分子實(shí)體時(shí)的第二分子實(shí)體。寫明結(jié)合 于絡(luò)合物或特異性結(jié)合于絡(luò)合物的捕獲劑或檢測(cè)劑不結(jié)合或基本上不結(jié)合于游離的第一 分子實(shí)體或游離的第二分子實(shí)體。捕獲劑和檢測(cè)劑包括抗體或其片段、以及包含得自不同生物來源(例如人/小鼠、 小鼠/山羊、人/山羊)的抗體片段的嵌合抗體。它們包括非抗體蛋白和肽，例如血管生成 因子、血管生成受體和非蛋白結(jié)合劑。單克隆抗體或多克隆抗體或單克隆與多克隆抗體的 組合代表了優(yōu)選的捕獲劑和檢測(cè)劑。術(shù)語“樣本”或“生物樣本”包括來自活生物體或早先活的生物體的任何量的物質(zhì)。 此類生物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔、馬和其他動(dòng)物。樣本包括但不限于血液、血 清、尿液、淚液、細(xì)胞、器官、組織、骨骼、骨髓、淋巴、淋巴結(jié)、滑膜組織、軟骨細(xì)胞、滑膜巨噬 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚。分子絡(luò)合物_適用于本發(fā)明的捕獲和檢測(cè)下面將根據(jù)對(duì)包含分子實(shí)體F和分子實(shí)體P的分子絡(luò)合物FP的測(cè)定，象征性地描 述多個(gè)免疫分析實(shí)施例。在一種免疫分析的實(shí)施例中，F(xiàn)P可用對(duì)F具特異性的被固定的或可被固定的捕獲 劑來捕獲。捕獲劑能夠結(jié)合于游離的F和絡(luò)合物FP中的F。“游離的卞是指不結(jié)合于P但 可被結(jié)合于其他分子實(shí)體的F。檢測(cè)用優(yōu)選地由辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)劑進(jìn)行，該檢測(cè) 劑特異性地結(jié)合于P，并能夠結(jié)合于游離的P和絡(luò)合物FP中的P。類似地，“游離的”P是指不被結(jié)合于F但可以結(jié)合于其他分子實(shí)體的P。在另一免疫分析實(shí)施例中，檢測(cè)用優(yōu)選地由 辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)劑進(jìn)行，該檢測(cè)劑特異性地結(jié)合于絡(luò)合物FP，而不結(jié)合或基本 上不結(jié)合于游離的F或游離的P。在一個(gè)類似的免疫分析實(shí)施例中，可使用對(duì)P具特異性的被固定的或可被固定的 捕獲劑來捕獲FP。捕獲劑能夠結(jié)合于游離的P和絡(luò)合物FP中的P。檢測(cè)用對(duì)F具特異性 的檢測(cè)劑進(jìn)行，該檢測(cè)劑能夠結(jié)合于游離的F和絡(luò)合物FP中的F。或者，可以用對(duì)絡(luò)合物 FP具特異性的檢測(cè)劑進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)劑不結(jié)合或基本上不結(jié)合于游離的F或游離的P。在另一免疫分析實(shí)施例中，可采用結(jié)合于絡(luò)合物FP的被固定的或可被固定的捕 獲劑來捕獲絡(luò)合物FP，該捕獲劑不結(jié)合或基本上不結(jié)合于游離的F或游離的P。采用對(duì)絡(luò) 合物FP也具特異性的檢測(cè)劑進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)劑不結(jié)合或基本上不結(jié)合于游離的F或游離 的P。在該實(shí)施例中，捕獲劑和檢測(cè)劑結(jié)合于絡(luò)合物FP的不同位點(diǎn)，或者在任何情況下能夠 同時(shí)結(jié)合于絡(luò)合物FP。作為另外一種選擇，可以采用對(duì)F具特異性的檢測(cè)劑進(jìn)行檢測(cè)，該檢 測(cè)劑能夠結(jié)合于游離的F或絡(luò)合物FP中的F。或者，可以用對(duì)P具特異性的檢測(cè)劑進(jìn)行檢 測(cè)，該檢測(cè)劑能夠結(jié)合于游離的P或絡(luò)合物FP中的P?；蛘?，可以用對(duì)F具特異性的檢測(cè)劑 (能夠結(jié)合于游離的F或絡(luò)合物FP中的F)和對(duì)P具特異性的檢測(cè)劑(能夠結(jié)合于游離的 P或絡(luò)合物FP中的P)進(jìn)行檢測(cè)。在上述免疫分析實(shí)施例中，當(dāng)期望或需要分離時(shí)，可以對(duì)非結(jié)合組分和結(jié)合組分 進(jìn)行分離。例如，當(dāng)用對(duì)F具特異性的且能夠結(jié)合于游離的F和絡(luò)合物FP (從而捕獲并使 游離的F和絡(luò)合物FP固定)的被固定的捕獲劑來捕獲FP，并且在捕獲后用對(duì)P具特異性的 且能夠結(jié)合于游離的P和絡(luò)合物FP的檢測(cè)劑來檢測(cè)FP時(shí)，將進(jìn)行非結(jié)合組分與結(jié)合組分 的分離(通常通過洗滌過程)。因此，結(jié)合的游離F和結(jié)合的FP被從非結(jié)合的游離F、非結(jié) 合的FP和游離的P (P未被捕獲，因而未結(jié)合)分離。然后引入檢測(cè)劑，以便在無游離P (已 在洗滌過程中除去)干擾的情況下結(jié)合于被捕獲和被固定的絡(luò)合物FP?？捎糜诓东@和檢測(cè)sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的抗體的例子包括但不限于小鼠單克 隆抗 sFlt-Ι 抗體 RD-1-49560(R&D Systems)、3661_M16(R&DSystems)和 4449_M24(R&D Systems)；小鼠單克隆抗sFlt-1抗體RD-7-49566 (R&D Systems)、小鼠單克隆抗sFlt-1抗 體 M14 (Ortho-ClinicalDiagnostics)、小鼠單克隆抗 PlGF 抗體 37203 (R&D Systems)、大鼠 單克隆抗PlGF抗體358932 (R&D Systems)、大鼠單克隆抗PlGF抗體 358905 (R&D Systems)、 單克隆抗體 358932 (R&D Systems)和 261 (OrthoClinical Diagnostics)。根據(jù)本發(fā)明，還提供了用于免疫分析實(shí)施例(即用于測(cè)定sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的 存在或量)的組合物。該組合物包含a)結(jié)合于PlGF的捕獲劑和結(jié)合于SFlt-I和sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者 的檢測(cè)劑；或b)結(jié)合于SFlt-I的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和SFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者 的檢測(cè)劑；或c)結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于sFlt_l :P1GF絡(luò)合物的檢測(cè)劑， 其中捕獲劑和檢測(cè)劑能同時(shí)結(jié)合于該絡(luò)合物；或d)結(jié)合于sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和sFlt-Ι中的一者或兩者 的檢測(cè)劑。
13
如本發(fā)明的方法中那樣，捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者可以為多克隆抗體，或 者捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者可以為單克隆抗體，或者捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩 者可以為單克隆抗體和多克隆抗體的組合。適用于本發(fā)明的分析校ιΗ和件能驗(yàn)證免疫分析需要校正和/或驗(yàn)證是否以規(guī)定的精度與準(zhǔn)度檢測(cè)到目標(biāo)被分析物。就 測(cè)定絡(luò)合物FP的免疫分析而言，可使用包含純化形式的分子絡(luò)合物FP的組合物進(jìn)行這種 校正和驗(yàn)證。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“純化”是指絡(luò)合物FP已與游離的F和游離的P 分離。絡(luò)合物FP與游離的F和游離的P的分離可使用一種或多種熟知的方法進(jìn)行，例如 依靠各組分對(duì)特異性結(jié)合伴侶的親和力(例如，F(xiàn)結(jié)合于(優(yōu)選地固定的)P、P結(jié)合于(優(yōu) 選地固定的)F)或各組分與其他結(jié)合伴侶的結(jié)合(例如，F(xiàn)結(jié)合于(優(yōu)選地固定的)抗F 抗體、P結(jié)合于(優(yōu)選地固定的)抗P抗體、或FP結(jié)合于(優(yōu)選地固定的)抗FP抗體)或 各組分與其他類型的特異性結(jié)合伴侶的結(jié)合的方法(親和色譜法)；或者，通過離子交換色 譜法、金屬離子交換色譜法、配體交換色譜法或疏水色譜法；或者，依靠絡(luò)合物及其分子實(shí) 體組分之間的質(zhì)量和/或大小差異和/或凈電荷差異的方法。這類方法包括尺寸排阻色譜 法、離心法、分子篩分法(例如膜過濾)和電泳法等等。如果絡(luò)合物在分離和隨后引入儲(chǔ)存組合物(通常為液體制劑)的過程中穩(wěn)定(其 中穩(wěn)定意味著在這些過程中不易分離而形成大量游離的F和游離的P)，則將包含該絡(luò)合物 的組合物置于適當(dāng)?shù)臈l件下以更長(zhǎng)時(shí)間地保持穩(wěn)定性。例如，當(dāng)組合物為液態(tài)時(shí)，可以將其 儲(chǔ)存在小于或等于約4°C的低溫下；或者將液體組合物在低于0°C的溫度下冷凍并保持固 態(tài)；或者可以將其凍干并在適當(dāng)?shù)臏囟?甚至可以大于約20°C )下保持凍干狀態(tài)。從貯存 庫取出后(必要時(shí)在解凍或復(fù)水之后)，組合物應(yīng)當(dāng)在用于分析校正或驗(yàn)證的條件下在可 接受的時(shí)間段內(nèi)穩(wěn)定?？梢灾苽浣j(luò)合物的改性形式，其中F和P彼此共價(jià)結(jié)合(例如，sFlt-Ι共價(jià)結(jié)合 于P1GF)。在解離而形成游離的F和游離的P方面，此共價(jià)改性形式的FP將是穩(wěn)定的。優(yōu) 選地，改性的共價(jià)絡(luò)合物FP和非共價(jià)絡(luò)合物FP相對(duì)于捕獲劑和檢測(cè)劑具有基本上相同或 相似的結(jié)合特性。如果改性的、共價(jià)形式的FP和未改性的、非共價(jià)形式或天然形式的絡(luò)合 物FP相對(duì)于捕獲劑和檢測(cè)劑不具有基本上相同或足夠相似的結(jié)合特性，則可以如分析技 術(shù)中所公知的，應(yīng)用合適的數(shù)學(xué)校正來補(bǔ)償結(jié)合特性的差異。在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)當(dāng)理 解FP的“形式”這一術(shù)語應(yīng)涵蓋完整的、非共價(jià)的、從合適來源(例如人血清、胎盤組織或 體液等)純化/分離的天然FP、由天然F和天然P或天然F和重組P或重組F和重組P制 備的非共價(jià)FP以及由天然F和天然P或天然F和重組P或重組F和重組P制備的改性的、 共價(jià)結(jié)合的FP (F和P彼此共價(jià)結(jié)合)。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，還提供了包含純化形式的sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的 組合物。sFlt-Ι PlGF絡(luò)合物的sFlt-Ι和PlGF中的一者或兩者可以為天然的，或者 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的sFlt-Ι和PlGF中的一者或兩者可以為重組的。預(yù)測(cè)、檢測(cè)/診斷、監(jiān)測(cè)適用于本發(fā)明的疾病常規(guī)的做法是通過測(cè)定采自個(gè)體的生物樣本中單種物質(zhì)(標(biāo)記物/生物標(biāo)記 物)的存在或量，確定個(gè)體是否患有特定疾病(檢測(cè)/診斷)，是否可能患病(預(yù)測(cè))，以及 確定疾病的進(jìn)展(監(jiān)測(cè))或個(gè)體是否對(duì)治療做出響應(yīng)(監(jiān)測(cè))。
例如，為了確診是否患有糖尿病或監(jiān)測(cè)對(duì)診斷為患有糖尿病的個(gè)體的療效，常常 測(cè)定個(gè)體尿液或血清樣本中葡萄糖(定性分析)的存在或葡萄糖的量(定量分析)。在定 性和定量分析中將形成與樣本中的葡萄糖量成比例的光學(xué)信號(hào)，通常為比色信號(hào)。在一類 比色測(cè)定中，可通過定性的方式在視覺上確定形成的染料的量或色強(qiáng)度(染料密度)。作為 另外一種選擇，利用合適的儀器測(cè)量染料密度并為其賦值可以更準(zhǔn)確和精確地測(cè)定染料的 量和色強(qiáng)度。通常將視覺測(cè)定的由個(gè)體生物樣本產(chǎn)生的染料密度與參考染料密度標(biāo)度或染 料密度范圍進(jìn)行比較，其中參考染料密度標(biāo)度或染料密度范圍包含與非糖尿病和糖尿病患 者相關(guān)的染料密度標(biāo)度或范圍。通常將定量的染料密度與具有類似關(guān)聯(lián)性的參考數(shù)值或參 考數(shù)值范圍進(jìn)行比較。相對(duì)于特定疾病的基準(zhǔn)值或參考范圍通常從診斷為未患該特定疾病的人群(正 常人群)和診斷為患有該特定疾病的人群中獲得?；鶞?zhǔn)值或參考范圍可以包括與疾病的不 同階段相關(guān)的數(shù)值或測(cè)量值?？梢詫⒌米詷颖镜慕Y(jié)果與這些基準(zhǔn)值或參考范圍進(jìn)行比較， 從而檢測(cè)/診斷或監(jiān)測(cè)疾病。就單獨(dú)或結(jié)合生理屬性(下文討論)的多個(gè)生物標(biāo)記物而 言，基準(zhǔn)值和基準(zhǔn)值范圍也可以與不同形式、起源、原因等的疾病(其形式、起源、原因等響 應(yīng)不同的治療)相關(guān)聯(lián)?？梢詫⒌米詷颖镜慕Y(jié)果與這些基準(zhǔn)值或參考范圍進(jìn)行比較，從而 可被告知或指導(dǎo)對(duì)個(gè)體的治療方法。除非另外指明，否則術(shù)語“基準(zhǔn)值”、“基準(zhǔn)值范圍”等旨在涵蓋定量或數(shù)值基準(zhǔn)群 體測(cè)量和定性或視覺基準(zhǔn)群體測(cè)量，例如染料密度標(biāo)度、色彩或色調(diào)標(biāo)度等。使用單個(gè)生物標(biāo)記物檢測(cè)和監(jiān)測(cè)疾病的常規(guī)做法已經(jīng)并將繼續(xù)作為臨床醫(yī)生及 其服務(wù)的患者的有用工具。通常，已知不止一種的生物標(biāo)記物與某一疾病相關(guān)。例如，糖基 化血紅蛋白也與糖尿病相關(guān)。在采自診斷患有糖尿病的個(gè)體的樣本中，測(cè)定葡萄糖和糖基 化血紅蛋白的量可以提供關(guān)于個(gè)體疾病狀態(tài)或除測(cè)定之外的療效的更多信息。通過測(cè)定多 個(gè)生物標(biāo)記物不僅可以改善對(duì)疾病的診斷和監(jiān)測(cè)，而且還可以讓臨床醫(yī)生確定個(gè)體患病的 可能性或概率或是否處于臨床評(píng)估不能提供信息的疾病階段。對(duì)多個(gè)生物標(biāo)記物的測(cè)定 還可用于指導(dǎo)治療，讓臨床醫(yī)生能夠辨別不同形式或階段的疾病，從而可以采用適當(dāng)?shù)闹?療措施對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療。對(duì)多個(gè)生物標(biāo)記物的測(cè)定可與個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性結(jié)合使 用，以進(jìn)一步改善預(yù)測(cè)效果、診斷效果并有助于選擇適當(dāng)?shù)寞煼ā４祟惛郊拥亩鄠€(gè)生物標(biāo)記物在本文中稱為是一個(gè)或多個(gè)分子實(shí)體。就 sFlt_l:PlGF絡(luò)合物檢測(cè)而言，此類分子實(shí)體包括但不限于內(nèi)皮糖蛋白、可溶性內(nèi)皮糖蛋 白、肌酸酐、C-反應(yīng)蛋白、尿蛋白、胎盤蛋白13、人絨毛膜促性腺激素或α-胎蛋白和肝酶， 例如天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶。如本文 所用，VEGF 可以包括 VEGFm、VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF167, VEGF183、VEGF186, VEGF189 或 VEGF2060在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)sFlt_l:PlGF絡(luò)合物，疾病為先兆子癇或先兆子 癇相關(guān)疾病，指導(dǎo)治療、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)均在妊娠期的前15周或妊娠期的前20周或妊娠 期的前30周或更多周進(jìn)行?？墒褂脭?shù)學(xué)運(yùn)算和算法將兩個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記物的量轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換 結(jié)果。此類數(shù)學(xué)運(yùn)算可以包括計(jì)算分子實(shí)體測(cè)定值與sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定值的比率 或sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定值與分子實(shí)體測(cè)定值的比率。轉(zhuǎn)換結(jié)果可以比直接的基于濃度的結(jié)果提供更多的信息。將與個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性結(jié)合的一種或多種生物標(biāo)記物的 測(cè)定值轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果的數(shù)學(xué)運(yùn)算或算法也可用于改善對(duì)治療的指導(dǎo)、對(duì)疾病 的預(yù)測(cè)、檢測(cè)/診斷和監(jiān)測(cè)。生理屬性包括但不限于胎齡、種族、性別、年齡、血壓和身體質(zhì) 量指數(shù)。它們可以單獨(dú)地或以任何組合與一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記物一起使用。介紹數(shù)學(xué)運(yùn)算和算法及其在臨床診斷中的應(yīng)用的專利和非專利出版物有很多。 例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 2006/381104、美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 2003/700672、美國(guó)專 利申請(qǐng)公開No 2003/410572、美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 2003/634145、美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 2005/323460、PCT 國(guó)際專利公開 No WO 2007/044860、美國(guó)專利申請(qǐng)公開 No 2002/330696、 美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 2002/331127、美國(guó)專利申請(qǐng)公開No 1997/912133、美國(guó)專利 No6, 306，087、美國(guó)專利 No 6，248，063 和美國(guó)專利 No 5,769,074。實(shí)例IsFlt-1 :P1GF絡(luò)合物的檢測(cè)分析在本實(shí)例中，描述了用于測(cè)定樣本中sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的量的免疫測(cè)定法，并 示出了 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物作為先兆子癇的診斷指標(biāo)的效用。利用圖1所示的免疫分析形式捕獲和檢測(cè)sFlt_l:PlGF絡(luò)合物。利用生物素化大 鼠的抗PlGF抗體捕獲樣本中的sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。通過將生物素結(jié)合于包被在反應(yīng)器 表面上的鏈霉親和素，以固定抗PlGF抗體捕獲的sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。游離的sFlt_l和 sFlt-1 VEGF絡(luò)合物未被生物素化抗PlGF捕獲劑來捕獲，將在洗滌過程中與其他未結(jié)合的 物質(zhì)一起除去。通過使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗sFlt-Ι抗體通過發(fā)光來檢測(cè)絡(luò) 合物。由結(jié)合的HRP標(biāo)記的抗sFlt-Ι抗體產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)與樣本中存在的sFlt-l:PlGF 的濃度成正比。由生物素化抗PlGF捕獲劑來捕獲的任何游離的PlGF都不與HRP標(biāo)記的抗 sFlt-Ι抗體形成夾心結(jié)構(gòu)，并且也不被測(cè)量。免疫分析中使用的材料包括1.生物素試劑pH緩沖含水組合物中濃度為2. 25 μ g/mL的生物素化抗PlGF抗 體。能夠結(jié)合于sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的生物素化抗PlGF抗體包括但不限于Ortho-Clinical Diagnostic 的小鼠單克隆抗體 0CD-261 和得自 R&D Systems (Minneapolis,Minnesota)的 大鼠單克隆抗體358905及358932。2.酶聯(lián)物pH緩沖含水組合物中濃度為1. 125 μ g/mL的HRP標(biāo)記的抗sFlt_l抗 體。不影響將VEGF或PlGF結(jié)合于sFlt-Ι的HRP標(biāo)記的抗sFlt_l抗體包括但不限于 Ortho-Clinical Diagnostic的克隆號(hào)為3661-M16和4449-M24的小鼠單克隆抗體以及R&D Systems的單克隆抗體49560。3.通過將純化的sFlt_l:PlGF絡(luò)合物加到馬血清中制備校準(zhǔn)液(其中，如上所 述，“純化的sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物”表示該絡(luò)合物已與游離的sFlt-Ι和游離的PlGF分 離)。將得自R&D Systems (目錄號(hào)264_PG)的10倍摩爾過量的重組人PlGF在20°C下溫 育 20min，然后在 2-8°C下用得自 Scios (Scios Inc.，Mountain View, California)的全長(zhǎng) sFlt-l(687個(gè)氨基酸)在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中過夜溫育。采用尺寸排阻色譜 法將sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物在通過含0. 25M乙醇胺的磷酸鹽緩沖液(pH8. 5)平衡的Superdex 200柱上與游離的PlGF分離。將包含絡(luò)合物的鎦分合并，并使用離心濃縮裝置濃縮。然后 將濃縮的合并絡(luò)合物透析到PH7. 4的PBS中。
16
在馬血清(GIBC0，目錄號(hào)26050)中稀釋純化的sFlt_l PlGF絡(luò)合物得到不同的濃 度，以提供校準(zhǔn)液CRl至CR10，這一系列校準(zhǔn)液的sFlt-l:PlGF絡(luò)合物濃度范圍在0. 0和 25，000pg/mL 之間。4.反應(yīng)器為鏈霉親和素包被的微孔(SAC孔)。免疫分析方案免疫分析方案如下將樣本(80 μ L)與80 μ L生物素試劑在SAC孔中結(jié)合，并將混合物在37°C下溫 育21分鐘。溫育之后使用VITROS ECi通用洗滌試劑進(jìn)行洗滌。洗滌步驟之后，將酶聯(lián)物 (160 μ L)加入SAC孔，并在37°C下溫育21分鐘。溫育之后使用VITROS ECi通用洗滌試劑 進(jìn)行二次洗滌。然后加入包含發(fā)光試劑的VITROS ECi信號(hào)試劑并溫育5分鐘。溫育之后 采集發(fā)光信號(hào)。評(píng)估sFlt_l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定的分析和臨床效果。結(jié)果如表1_6和圖2_4所示。 在表1中示出了使用校準(zhǔn)液(包含sFlt-l:PlGF絡(luò)合物)獲得的信號(hào)響應(yīng)，以分析儀光單位 (ALU)表示。表1的數(shù)據(jù)以劑量反應(yīng)曲線在圖2中示出。使用包含不同濃度的游離sFlt-1 或游離PlGF (而非sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物)的樣本來代替檢測(cè)分析中包含sFlt_l :P1GF絡(luò)合 物的樣本，進(jìn)行交叉反應(yīng)性研究，從而提供證明檢測(cè)分析中只檢測(cè)到sFlt-l:PlGF絡(luò)合物 (而非游離sFlt-Ι或游離P1GF)的證據(jù)。研究結(jié)果在表2和表3中給出，從表中數(shù)據(jù)可以 看出，游離的sFlt-Ι和游離的PlGF并未表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)。使用上述檢測(cè)分析法，對(duì)得自診斷為患有先兆子癇或未患先兆子癇(正常)的妊 娠期中三個(gè)月或末三個(gè)月孕婦的血清樣本進(jìn)行sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的分析。結(jié)果匯總于表 4中。圖3示出了結(jié)果的點(diǎn)圖，從圖中可以看出，存在于正常群體血清樣本中的sFlt-l:PlGF 絡(luò)合物濃度通常低于并明顯有別于來自診斷為患有先兆子癇的群體的血清樣本中的濃 度。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行接受者操作特性(ROC)分析。ROC曲線下面積(表5)為0.783，這證明 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物是檢測(cè)/診斷先兆子癇的可用生物標(biāo)記物。對(duì)于每個(gè)樣本，計(jì)算了樣本中sFlt_l:PlGF絡(luò)合物的含量與樣本中游離PlGF的含 量的比率，并與使用游離PlGF分析測(cè)定的游離PlGF的量進(jìn)行比較。結(jié)果在表4中給出。 每個(gè)樣本的比率(sFlt-l:PlGF絡(luò)合物/游離P1GF)與臨床診斷的關(guān)系點(diǎn)圖在圖4中示出。 正常群體樣本的計(jì)算比率通常低于并明顯有別于先兆子癇群體樣本的計(jì)算比率。ROC曲線 下面積(表6)為0. 889，這證明sFlt-l:PlGF絡(luò)合物/游離PlGF的比率也是先兆子癇的可 用標(biāo)記物。實(shí)例II使用抗sFlt-Ι捕獲劑進(jìn)行的sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物ELISA檢測(cè)本實(shí)例中描述了 ELISA方法在測(cè)定sFlt_l:PlGF絡(luò)合物時(shí)的用途。在該檢測(cè)分析 法中，使用抗sFlt-Ι抗體捕獲游離的sFlt-Ι和sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物，并使用標(biāo)記的抗PlGF 抗體檢測(cè)sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物。板包被將Costar 96孔微量滴定高結(jié)合力板用含1 μ g/mL抗sFlt_l抗體49560 (R&D Systems)的IOmM磷酸鹽與2mM EDTA的溶液(pH7. 0)包被，每孔100 μ L，然后在25°C下溫 育18小時(shí)。用含0. 05% TWEEN-20的PBS將孔洗滌一次，然后加入290 μ L/孔的封閉緩沖液(1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液溶液，PH 7.0)，接著在25°C下溫育1小時(shí)。吸出孔內(nèi) 的液體并在低濕度恒溫箱中干燥4小時(shí)，然后密封在氣密袋中待用。ELISA 方法將一系列包含恒定量的重組sFlt-Ι (純化的重組sFlt-1，Scios ；在昆蟲細(xì)胞中 表達(dá)；對(duì)應(yīng)于687個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)可溶fms樣酪氨酸激酶1)和變化量的重組P1GF(149 個(gè)氨基酸；PlGF-I ；在大腸桿菌中表達(dá)；R&DSystems，目錄號(hào)264_PG/CF)的樣本一起在樣 本稀釋液(含0. 05% TWEEN-20的酪蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液，Pierce)中溫育，以形成 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。將100 μ L的各預(yù)溫育樣本加入微量滴定孔。將100 μ L的樣本稀釋 液加入至少一個(gè)孔中，以作為對(duì)照。將孔在37°C下振蕩溫育15分鐘。用洗滌緩沖液(含 0. 05% TWEEN-20的PBS)將板洗滌6次，除去未結(jié)合的物質(zhì)。如表7所示，加入100 μ L/孔 的特異性HRP標(biāo)記的抗體(含0. 05% TWEEN-20的1 μ g/mL酪蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液)， 分別測(cè)量抗sFlt-Ι抗體包被板中的總sFlt-Ι、游離sFlt-Ι和sFlt_l :P1GF絡(luò)合物。加入 各檢測(cè)抗體后，將板在37°C下振蕩溫育15分鐘。將板用洗滌緩沖液洗滌6次。向每個(gè)孔 內(nèi)加入IOOyL的鄰苯二胺(OPD)底物試劑，并在25°C下于黑暗中溫育30分鐘。向每個(gè) 孔內(nèi)加入25 μ L終止液，獲取492nm波長(zhǎng)上的吸光度。(HRP底物、OPD試劑和終止液得自 Ortho-ClinicalDiagnostics, Inc. (Raritan, New Jersey, USA))。ELISA 結(jié)果 二 總 sFlt-1表8給出了每個(gè)樣本在492nm下獲得的吸光度。HRP標(biāo)記的抗sFlt_l抗體 M14 (Ortho-Clinical Diagnostics)既與游離的 sFlt-Ι 結(jié)合也與 sFlt-Ι PlGF 絡(luò)合物 結(jié)合，因而檢測(cè)到游離的sFlt-Ι和sFlt-l:PlGF絡(luò)合物中的sFlt_l。如表8所示，總 sFlt-l(游離的sFlt-Ι和sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的觀察到的信號(hào)總和)的信號(hào)響應(yīng)為恒定 的，與PlGF濃度無關(guān)。ELISA 結(jié)果-游離的 sFlt-1服？標(biāo)記的抗8 1丨_1抗體49566(1 &0 Systems)結(jié)合于游離的sFlt_l，但不結(jié)合于 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物，因而只檢測(cè)到游離的SFlt-I0當(dāng)PlGF濃度從0增至2000pg/mL時(shí)， 觀察到的信號(hào)響應(yīng)降低(表8)。這是意料之中的因?yàn)楫?dāng)PlGF濃度增加時(shí)，將形成更多的 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物，而游離的sFlt-Ι的濃度則降低。ELISA 結(jié)果 _sFlt_l PlGF 絡(luò)合物HRP標(biāo)記的抗PlGF抗體358905 (R&D Systems)結(jié)合于P1GF，因而只檢測(cè)到在 sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物中結(jié)合的sFlt-Ι。表8示出了當(dāng)PlGF濃度從0增至2000pg/mL時(shí)信 號(hào)響應(yīng)增加。表8提供的這些結(jié)果表明，通過利用抗sFlt-Ι抗體捕獲包含sFlt-Ι的分子種類 的ELISA形式，可以測(cè)量總sFlt-Ι、游離的sFlt-Ι和sFlt_l :P1GF絡(luò)合物。通過上述方法捕獲sFlt-Ι和檢測(cè)P1GF，可以測(cè)定樣本中sFlt_l :P1GF絡(luò)合物的存 在或量，并且可以利用如此獲得的測(cè)量結(jié)果(單獨(dú)地或結(jié)合附加的化學(xué)和/或物理生物標(biāo) 記物)作為先兆子癇的診斷指標(biāo)。使用抗PlGF捕獲劑進(jìn)行sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物的ELISA檢測(cè)在另一 ELISA方法中，用抗PlGF抗體捕獲游離的PlGF和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物。用 標(biāo)記的抗sFlt-Ι抗體檢測(cè)sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。
板的包被將Costar 96孔微量滴定高結(jié)合力板用含0. 8 μ g/mL抗PlGF抗體358932 (R&D Systems)的IOmM磷酸鹽與2mM EDTA的溶液(ρΗ7. 0)包被，每孔100 μ L，然后在25°C下溫 育18小時(shí)。用含0. 05% TWEEN-20的PBS將孔洗滌一次，然后加入290 μ L/孔的封閉緩沖 液(1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液溶液，pH 7.0)，接著在25°C下溫育1小時(shí)。吸出孔內(nèi) 的液體并在低濕度恒溫箱中干燥4小時(shí)，然后密封在氣密袋中待用。ELISA 方法將表9中所示的一系列包含恒定量的重組PlGF (序列標(biāo)識(shí)號(hào)2 ；在大腸桿菌中表 達(dá)；R&D Systems,目錄號(hào)264_PG/CF)和變化量的重組sFlt_l (687個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)可溶 fms樣酪氨酸激酶；在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)；Sci0s，lnc.)的樣本一起在樣本稀釋液(含0.05% TWEEN-20的酪蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液，Pierce)中溫育，以形成sFlt_l:PlGF絡(luò)合物；將 混合物加入包被孔中，并將板在37°C下振蕩溫育15分鐘。用溫和的含去垢劑緩沖液洗滌 滴定板，以除去未結(jié)合的物質(zhì)。按表7所示，加入100 μ L/孔的特異性HRP標(biāo)記抗體(含 0. 05% TWEEN-20的1 μ g/mL酪蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液，Pierce)，分別測(cè)量抗PlGF抗體 包被板中的總P1GF、游離PlGF和sFlt-l:PlGF絡(luò)合物。加入每種檢測(cè)抗體后，將板在37°C 下振蕩溫育15分鐘。將板用洗滌緩沖液洗滌6次。加入100 μ L/孔的OPD HRP底物試劑并 在25°C下于黑暗中溫育30分鐘之后，進(jìn)行比色反應(yīng)。加入25 μ L/孔的終止液并獲取492nm 波長(zhǎng)上的吸光度。(HRP底物、鄰苯二胺試劑和終止液得自O(shè)rtho-Clinical Diagnostics, Inc. (Raritan, New Jersey, USA))。ELISA 結(jié)果-總 PlGF表9列出了各特異性反應(yīng)后每個(gè)樣本在492nm波長(zhǎng)上的吸光度。HRP標(biāo)記的抗 PlGF抗體358905 (R&D Systems)既結(jié)合于游離的PlGF也結(jié)合于sFlt_l PlGF絡(luò)合物，因而 檢測(cè)到游離PlGF和sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物中的PlGF。表9中的總PlGF響應(yīng)列示出了 PlGF 濃度為2000pg/mL的樣本的響應(yīng)保持恒定，而不論sFlt-Ι濃度為多少。ELISA 結(jié)果-游離的 PlGFHRP標(biāo)記的抗PlGF抗體37203 (R&D Systems)結(jié)合于游離的P1GF，但不結(jié)合于 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物，因而只檢測(cè)到游離的P1GF。表9顯示，當(dāng)sFlt-Ι濃度從0增至2000pg/ mL時(shí)，信號(hào)響應(yīng)降低。當(dāng)游離的PlGF結(jié)合于sFlt-Ι時(shí)，游離PlGF分子的濃度應(yīng)降低，而 sFlt-Ι PlGF絡(luò)合物的濃度應(yīng)增加。ELISA 結(jié)果-sFlt-1: PlGF 絡(luò)合物HRP 標(biāo)記的抗 sFlt-Ι 抗體 M14 (Ortho-Clinical Diagnostics)結(jié)合于 sFlt-1 并 結(jié)合于sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物，因而只有作為sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物捕獲的PlGF被檢測(cè)到。表 9顯示當(dāng)sFlt-Ι濃度從0增至2000pg/mL時(shí)信號(hào)響應(yīng)增加。表9中所列的結(jié)果表明，通過用抗PlGF抗體捕獲所有PlGF種類并獨(dú)立地檢測(cè)每 項(xiàng)指標(biāo)的ELISA形式，可以測(cè)量總P1GF、游離PlGF和sFlt_l:PlGF絡(luò)合物。當(dāng)將濃度漸增 的sFlt-Ι加入濃度恒定的PlGF中時(shí)，游離PlGF的響應(yīng)降低，而sFlt_l :P1GF絡(luò)合物的響 應(yīng)增加，這可以通過492nm波長(zhǎng)上的吸光度變化來反映。通過上述方法捕獲PlGF和檢測(cè)sFlt-Ι，可以測(cè)定樣本中是否存在sFlt_l PlGF絡(luò) 合物及其量，并且可以利用如此獲得的測(cè)量結(jié)果(單獨(dú)地或結(jié)合附加的化學(xué)和/或物理生物標(biāo)記物)作為先兆子癇的診斷指標(biāo)。實(shí)例IIIsFlt_l:PlGF 絡(luò)合物、總 sFlt-Ι、游離 PlGF胎齡第27-37周總sFlt-Ι和游離PlGF的檢測(cè)分析總sFlt-Ι和游離PlGF的檢測(cè)分析使用目錄號(hào)分別為DVR100B和DPGOO的R&D Systems Quantikine 試劑盒進(jìn)行。按照這些產(chǎn)品的R&DSystems包裝說明書中介紹的方案 進(jìn)行檢測(cè)分析。sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物檢測(cè)分析如實(shí)例I中那樣，利用圖1所示的免疫分析形式捕獲和檢測(cè)sFlt_l:PlGF絡(luò)合物。免疫分析中使用的材料包括1.生物素試劑pH緩沖含水組合物中濃度為6. Oug/mL的生物素化抗PlGF抗體 (Ortho Clinical Diagnostics 小鼠單克隆抗體 0CD-261)。能夠結(jié)合于 sFlt-1 :P1GF 絡(luò)合 物的其他生物素化抗PlGF抗體得自R&DSystems (Minneapolis, Minnesota)。2.酶聯(lián)物pH緩沖含水組合物中濃度為4. 5μ g/mL的HRP標(biāo)記的抗sFlt_l抗 體。不影響將VEGF或PlGF結(jié)合于sFlt-Ι的HRP標(biāo)記的抗sFlt_l抗體包括但不限于 Ortho-Clinical Diagnostic的克隆號(hào)為3661-M16和4449-M24的小鼠單克隆抗體以及R&D Systems的單克隆抗體49560。3.將純化的sFlt_l:PlGF絡(luò)合物加入到馬血清中制備校準(zhǔn)液(其中，如上所述， “純化的sFlt-Ι PlGF絡(luò)合物”表示該絡(luò)合物已與游離的sFlt-Ι和游離的PlGF分離)。將得 自R&D systems的10倍摩爾過量的重組人P1GF(目錄號(hào)264_PG)在20°C下溫育20min，然 后在 2-8°C下用全長(zhǎng) sFlt-l(687 個(gè)氨基酸)(Scios Inc. ,Mountain View, CaliforniaUSA) 在pH 7. 4的PBS緩沖液中過夜溫育。采用尺寸排阻色譜法將sFlt-1:PlGF絡(luò)合物在通過 含0. 25M乙醇胺的磷酸鹽緩沖液(pH8. 5)平衡的Superdex 200柱上與游離的PlGF分離。 將包含絡(luò)合物的鎦分合并，并使用離心濃縮裝置濃縮。然后將濃縮的合并絡(luò)合物透析到PH 7. 4 的 PBS 中。在馬血清(GIBC0，目錄號(hào)26050)中以不同的濃度稀釋純化的sFlt_l :P1GF絡(luò)合 物，以提供校準(zhǔn)液CRl至CR10，這一系列校準(zhǔn)液的sFlt-l:PlGF絡(luò)合物濃度范圍在0. 0和 25，000pg/mL 之間。4.反應(yīng)器為用鏈霉親和素包被的微孔(SAC孔)。免疫分析方案免疫分析方案如下將樣本(80 μ L)與35 μ L生物素試劑和35 μ L酶聯(lián)物在SAC孔中結(jié)合，并將混合 物在37°C下溫育21分鐘。溫育后使用VITROS ECi通用洗滌試劑進(jìn)行洗滌。在洗滌步驟后 加入VITROS ECi信號(hào)試劑并溫育5分鐘。溫育后采集發(fā)光信號(hào)。按照R&D Systems的ELISA檢測(cè)分析方案雙份地分析每個(gè)患者樣本的P1GF-1 和sFlt-Ι。使用如上所述的sFlt-l:PlGF-l絡(luò)合物分析程序?qū)γ總€(gè)患者樣本進(jìn)行 sFlt-1:PlGF-I絡(luò)合物的單個(gè)分析。每個(gè)患者樣本的R&DSystems雙份分析結(jié)果的平均值 和sFlt-l:PlGF-l絡(luò)合物分析結(jié)果在表10的上部給出。采集樣本時(shí)的胎齡在表10的第2列給出。按照美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)(ACOG)指南在接近采集樣本時(shí)確定的診斷結(jié)果見第3列。 ROC曲線下面積測(cè)定結(jié)果在表10的底部給出，具體為=PlGF-I分析(0. 8796)、sFLt-Ι分析 (0. 7994)、sFlt-l: PlGF 絡(luò)合物分析(0. 7654)、sFlt_l/PlGF 比率(0. 8519)和 sFlt_l:PlGF 絡(luò)合物/PlGF比率(0.8642)。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于27至37. 4周的胎齡，sFlt_l PlGF絡(luò)合 物分析單獨(dú)地或作為與游離PlGF分析的比率，在其臨床效果方面與測(cè)量總sFlt-Ι的分析 的效果相當(dāng)。實(shí)例IVsFlt_l:PlGF 絡(luò)合物、sFlt_l、PlGF胎齡第13-21周如本實(shí)例所證明的那樣，相比妊娠早期總sFlt-Ι或總sFlt-Ι與游離PlGF的比 率，對(duì)sFlt-Ι 血管生成因子絡(luò)合物的存在或其量的評(píng)估對(duì)于先兆子癇的診斷和預(yù)測(cè)顯示 出優(yōu)越的臨床效用。類似地，與游離P1GF、總sFlt-Ι或總sFlt-Ι與游離PlGF的比率相比， sFlt-l:PlGF絡(luò)合物與游離PlGF的比率對(duì)于先兆子癇的診斷和預(yù)測(cè)具有更優(yōu)越的臨床效用。像實(shí)例III中一樣，按照R&D Systems ELISA檢測(cè)分析方案對(duì)每個(gè)患者樣本雙 份地進(jìn)行游離PlGF和總sFlt-Ι的測(cè)定，并使用絡(luò)合物分析程序?qū)γ總€(gè)患者樣本進(jìn)行 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的單個(gè)分析。結(jié)果在表11中示出。采集樣本時(shí)的胎齡在表11的第2 列給出。按照ACOG指南進(jìn)行診斷，并在ICD-9編碼標(biāo)號(hào)的基礎(chǔ)上給出輕度和重度先兆子癇 的賦值。這些數(shù)據(jù)在表11的第3和4列中列出。采集之后，將血樣存檔以備日后分析；在 第21周與產(chǎn)后之間進(jìn)行診斷。測(cè)定ROC曲線下面積，結(jié)果在表12中給出。最上面的數(shù)據(jù)圖(輕度或重度PE)中 給出的結(jié)果基于妊娠期第13-21周采集的94個(gè)患者樣本。輕度和重度先兆子癇的診斷結(jié) 果在ROC分析中組合為先兆子癇陽性。ROC曲線下面積的計(jì)算結(jié)果如下游離PlGF分析 (0. 5745)、總 sFlt-Ι 分析(0. 5029)、sFlt_l:PlGF 絡(luò)合物分析(0. 6331)、總 sFlt-Ι/ 游離 PlGF比率(0.5396)和sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物/游離PlGF比率(0.6392)。這些結(jié)果表明，總 sFlt-Ι、游離PlGF和總sFlt-Ι/游離PlGF比率不適用于在妊娠早期預(yù)測(cè)或檢測(cè)先兆子癇。 然而，sFlt-l:PlGF絡(luò)合物和sFlt-1:PlGF絡(luò)合物/游離PlGF的比率結(jié)果表明，它們能夠 在臨床上辨別隨后發(fā)展到輕度或重度先兆子癇的受試者與未發(fā)展下去的受試者。中間數(shù)據(jù)圖(重度PE，輕度PE=正常)給出的結(jié)果基于相同的94個(gè)患者樣本； 然而，在ROC分析過程中，輕度先兆子癇的診斷結(jié)果重新劃分為正常。ROC曲線下面積如下 游離 PlGF 分析(0. 7142)、總 sFlt-Ι 分析(0. 5622)、sFlt_l PlGF 絡(luò)合物分析(0. 6942)、總 sFlt-Ι/ 游離 PlGF 比率(0. 6771)和 sFlt_l:PlGF 絡(luò)合物 / 游離 PlGF 比率(0. 7445)。這 些結(jié)果表明，與總sFlt-Ι相比，在預(yù)測(cè)先兆子癇發(fā)作方面sFlt-l:PlGF絡(luò)合物單獨(dú)地或與 游離PlGF結(jié)合作為比率形式具有更優(yōu)越的臨床能力。最下面的數(shù)據(jù)圖中提供的ROC分析結(jié)果僅基于妊娠期第16-21周采集的那些患 者樣本，這些患者被診斷為正常(分析中將輕度先兆子癇劃為正常)，或者被診斷為患有重 度先兆子癇。ROC曲線下面積如下游離PlGF分析(0. 7394)、總sFlt-Ι分析(0. 5455)、 sFlt-l:PlGF 絡(luò)合物分析(0. 7636)、總 sFlt-Ι/游離 PlGF 比率(0.6848)和 sFlt_l:PlGF 絡(luò)合物/游離PlGF比率(0.8707)。結(jié)果表明，與總sFlt_l相比，在預(yù)測(cè)先兆子癇發(fā)作方面
21sFlt-1 :P1GF絡(luò)合物單獨(dú)地或作為比率具有更優(yōu)越的效果。雖然已經(jīng)示出了本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是本發(fā)明并不局限于此，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的 技術(shù)人員可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行修改，尤其是按照上述教導(dǎo)進(jìn)行修改。在不脫離本發(fā)明精 神的情況下，可以在本發(fā)明的上述公開范圍內(nèi)進(jìn)行合理的變型和修改。本發(fā)明引用的所有文檔(包括已公布的專利申請(qǐng)、授權(quán)專利和非專利出版物)的 主題和這些文檔中引用的所有參考文獻(xiàn)的主題均以引用方式并入本文中。^t 1劑量_反應(yīng)結(jié)果 彪游離sFlt-Ι的交叉反應(yīng)件
游離PlGF的交叉反應(yīng)件 患者結(jié)果sFlt-l:PlGF絡(luò)合物、游離PlGF和sFlt-Ι PlGF絡(luò)合物/游離PlGF比 ^ 5ROC 分析ff =曲線下面積，SE =標(biāo)準(zhǔn)誤差，ρ =概率 戲ROC 分析ff =曲線下面積，SE =標(biāo)準(zhǔn)誤差，ρ =概率

表7 魁
表9 表 10sFlt_l:PlGF 絡(luò)合物、sFlt-Ι、游離 PlGF 和比率胎齡第27-37周 sFlt-1:PlGF-I 絡(luò)合物、sFlt-Ι、游離 PlGF 和比率胎齡第13-21周(接下三頁) 表 12RQC 分析 輕度或重度PE與無PE (采集時(shí)的胎齡13-21周)
權(quán)利要求
一種測(cè)定sFlt 1:PlGF絡(luò)合物的存在或量的方法，所述方法包括a)用結(jié)合于PlGF的捕獲劑來捕獲所述絡(luò)合物，并用結(jié)合于sFlt 1和sFlt 1:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)所述絡(luò)合物；或b)用結(jié)合于sFlt 1的捕獲劑來捕獲所述絡(luò)合物，并用結(jié)合于PlGF和sFlt 1:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)所述絡(luò)合物；或c)用結(jié)合于sFlt 1:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲所述絡(luò)合物，并用結(jié)合于sFlt 1:PlGF絡(luò)合物的檢測(cè)劑來檢測(cè)所述絡(luò)合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑能夠同時(shí)結(jié)合于所述絡(luò)合物；或d)用結(jié)合于sFlt 1:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑來捕獲所述絡(luò)合物，并用結(jié)合于PlGF和sFlt 1中的一者或兩者的檢測(cè)劑來檢測(cè)所述絡(luò)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PlGF為PlGF-I、P1GF_2或P1GF-3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲劑被固定在支承物上或能夠被固定在支 承物上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述支承物為試管的表面、微孔、微量滴定孔、膜、 板、珠、微?；蚱?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中捕獲劑連接于生物素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中連接于生物素的捕獲劑通過結(jié)合于親和素、鏈霉 親和素或其他生物素結(jié)合劑而被固定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為單克隆和多克 隆抗體的組合。
10.用于指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)個(gè)體中的血管、血管相關(guān)、腫瘤、腫瘤相關(guān)、心臟、 心臟相關(guān)、先兆子癇或先兆子癇相關(guān)疾病的方法，所述方法包括a)測(cè)定采自個(gè)體的樣本中sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的存在或量；和b)i)將所述sFlt-1:PlGF測(cè)定結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或 )用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn) 化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物轉(zhuǎn)換結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn) 行比較；從而指導(dǎo)治療或預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)所述疾病。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，還包括a)測(cè)定所述樣品中一種或多種分子實(shí)體的存在或量；和b)i)將所述分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和所述sFlt-1:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與所述一個(gè)或多 個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或 )用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將所述分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果和所述 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將所述分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果和 所述sFlt-l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與所述一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，還包括a)測(cè)定所述個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將所述生理屬性測(cè)定值和所述分子實(shí)體測(cè)定結(jié)果以及所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物2測(cè)定結(jié)果與所述一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或 )用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將所述生理屬性測(cè)定值和所述分子實(shí)體 測(cè)定結(jié)果以及所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將所述生 理屬性的值轉(zhuǎn)換結(jié)果和所述分子實(shí)體轉(zhuǎn)換結(jié)果以及所述sFlt-l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與所述一 個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，還包括a)測(cè)定所述個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)生理屬性的值；和b)i)將所述生理屬性測(cè)定值和所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果與所述一個(gè)或多個(gè) 基準(zhǔn)值進(jìn)行比較；或 )用一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算或一個(gè)或多個(gè)算法將所述生理屬性測(cè)定值和所述 sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)換結(jié)果，并將所述生理屬性轉(zhuǎn)換結(jié)果和 所述sFlt-l:PlGF轉(zhuǎn)換結(jié)果與所述一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)值進(jìn)行比較。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中PlGF為P1GF-1、P1GF-2或P1GF-3。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述疾病為先兆子癇或先兆子癇相關(guān)疾病，并 且指導(dǎo)治療、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)在妊娠期前15周內(nèi)或妊娠期前20周內(nèi)或妊娠期前30周或 更多周內(nèi)進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)分子實(shí)體選自游離P1GF、游離 sFlt-Ι、游離VEGF、sFlt-1:VEGF絡(luò)合物、內(nèi)皮糖蛋白、可溶性內(nèi)皮糖蛋白、肌酸酐、c_反應(yīng) 蛋白、肝酶、尿蛋白、胎盤蛋白13、人絨毛膜促性腺激素、α-胎蛋白和血管緊張素II-I型受 體的自身抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16 所述的方法，其中 VEGF 為 VEGF121、VEGF145, VEGF165, VEGF165b、 VEGF167, VEGF183、VEGF186, VEGF189 或 VEGF2060
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)數(shù)學(xué)運(yùn)算包括計(jì)算所述分子實(shí) 體測(cè)定值與所述sFlt-1: PlGF絡(luò)合物測(cè)定值的比率或所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物測(cè)定值與所 述分子實(shí)體測(cè)定值的比率。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)生理屬性選自胎齡、種族、年 齡、性別、血壓和身體質(zhì)量指數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)生理屬性選自胎齡、種族、年 齡、性別、血壓和身體質(zhì)量指數(shù)。
21.用于測(cè)定sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的存在或量的組合物，包含a)結(jié)合于PlGF的捕獲劑和結(jié)合于sFlt-1和sFlt_lPlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢 測(cè)劑；或b)結(jié)合于sFlt-Ι的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和sFlt-1:PlGF絡(luò)合物中的一者或兩者的檢 測(cè)劑；或c)結(jié)合于sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的檢測(cè)劑，其中 捕獲劑和檢測(cè)劑能夠同時(shí)結(jié)合于所述絡(luò)合物；或d)結(jié)合于sFlt-1:PlGF絡(luò)合物的捕獲劑和結(jié)合于PlGF和sFlt_l中的一者或兩者的檢 測(cè)劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中PlGF為P1GF-1、P1GF-2或P1GF-3。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為多克隆抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為單克隆抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中捕獲劑和檢測(cè)劑中的一者或兩者為單克隆和 多克隆抗體的組合。
26.包含純化形式的sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中PlGF為P1GF-1、P1GF-2或P1GF-3。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的sFlt_l和PlGF 中的一者或兩者為天然的。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述sFlt-l:PlGF絡(luò)合物的sFlt_l和PlGF 中的一者或兩者為重組的。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述純化形式的sFlt-1:P1GF絡(luò)合物利用下 列方法獲得尺寸排阻色譜法、疏水色譜法、離子交換色譜法、離心法、分子篩分法、金屬離 子交換色譜法、親和色譜法、電泳法或配體交換色譜法。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中sFlt-Ι和PlGF彼此共價(jià)結(jié)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，所述組合物用于校準(zhǔn)或驗(yàn)證測(cè)定sFlt-1:P1GF絡(luò) 合物的存在或量的檢測(cè)分析法的性能。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于測(cè)定包含第一分子實(shí)體和第二分子實(shí)體的絡(luò)合物的存在或量的方法，所述絡(luò)合物優(yōu)選地為sFlt-1:PlGF絡(luò)合物。對(duì)所述絡(luò)合物的存在或量的測(cè)定結(jié)果可用于預(yù)測(cè)、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)或指導(dǎo)治療例如下列疾病的方法中血管疾病、血管相關(guān)疾病、心臟疾病、心臟相關(guān)疾病、腫瘤、腫瘤相關(guān)疾病、先兆子癇和先兆子癇相關(guān)疾病。測(cè)定sFlt-1血管生成因子絡(luò)合物對(duì)于在妊娠早期以及臨床評(píng)估可能無法提供有效信息的疾病階段預(yù)測(cè)和檢測(cè)先兆子癇尤為有用。
文檔編號(hào)G01N33/00GK101918839SQ200980101754
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日
發(fā)明者B·?？ㄌm, D·拜爾恩, E·斯卡利斯, G·巴什里安斯, H·萊恩-布朗, J·鄭, K·楊, S·杰克遜, S·格魯爾瓦 申請(qǐng)人:奧索臨床診斷有限公司