專利名稱：口腔護(hù)理方法和系統(tǒng)的制作方法
口腔護(hù)理方法和系統(tǒng)
本申請要求2008年2月9日提交的美國專利申請61/027，437的權(quán)益，也要求2008 年2月9日提交的美國專利申請61/027，442和均在2008年2月8日提交的美國專利申請 61/027，432,61/027, 431,61/027, 420和61/027，435的權(quán)益，這些申請的內(nèi)容均通過引用結(jié)合到本文中。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及測定口腔中致齲菌和精氨酸分解菌(arginolyticbacterium)相對量 的方法，例如使用含游離或鹽形式的堿性氨基酸的組合物作為牙護(hù)理方案的部分。
發(fā)明背景
精氨酸和其他堿性氨基酸已被提出用于口腔護(hù)理，并相信其對抗蛀洞形成和牙過 敏有顯著的益處。市售的精氨酸基牙膏為含CaviStat 的DenClude 和ProClude ，兩者包含精氨酸和碳酸氫鈣。
口腔中生物群落的類型一般在蛀洞發(fā)展和口腔健康中起重要作用。例如，已假設(shè) 精氨酸有益效果的重要因素是，精氨酸和其他堿性氨基酸可由某些類型的細(xì)菌代謝，例如 不致齲并且與致齲菌(例如變異鏈球菌(S.mutans))競爭牙齒上和口腔中位置的血鏈球菌 (S. sanguis)。精氨酸分解菌可利用精氨酸和其他堿性氨基酸產(chǎn)生氨，從而提高它們的環(huán) 境的PH，而致齲菌使糖代謝成乳酸，乳酸傾向于降低菌斑PH，并使牙齒脫礦質(zhì)，最終導(dǎo)致蛀 洞。
因此，具有監(jiān)測口腔中生物群落(bioflora)類型，例如以決定最佳治療和監(jiān)測治 療患者有效性的有效方式是有用的。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供評價(jià)口腔中生物群落的快速簡單的方法。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明測定菌斑產(chǎn)氨量，以確定精氨酸分解菌的相對群體 量(relative population)0
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明測定菌斑乳酸量，以確定致齲菌的相對群體量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(例如定量實(shí)時(shí)PCR)表征 口腔中的生物群落，例如菌斑或唾液中的生物群落。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明用反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)表征口腔中的生物群落， 例如菌斑或唾液中的生物群落。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用抗體探針(例如，熒光抗體探針)表征口腔中的生物群 落，例如菌斑或唾液中的生物群落。
例如，本發(fā)明對至少一種致齲菌(例如變異鏈球菌)和至少一種精氨酸分解菌 (例如血鏈球菌)的量進(jìn)行定量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用前述方法之一評價(jià)患者，并由此確定治療方案。
本發(fā)明的方法特別可用于檢測菌斑生態(tài)學(xué)的潛在損傷變化，并允許在有可測量或 顯著的牙齒脫礦質(zhì)或損傷之前校正性治療。
因此，本發(fā)明提供促進(jìn)口腔健康的方法，例如，以
a.減輕或抑制齲齒的形成，
b.減輕或抑制牙齒脫礦質(zhì)和促進(jìn)牙齒再礦化，
c.治療、減輕或抑制早期牙釉質(zhì)損傷的形成，
d.減輕牙齒過敏性，
e.減輕或抑制牙齦炎，
f.促進(jìn)口腔中潰瘍或傷口的痊愈，
g.減少產(chǎn)酸細(xì)菌的量，
h.增加精氨酸分解菌的相對量，
i.抑制口腔中形成微生物生物膜，
j.在糖攻擊后將菌斑pH提高和/或保持在至少pH5. 5的水平，
k.減少菌斑積累，
1.治療、緩和或減輕口干，
m.使牙齒增白，
η.促進(jìn)全身健康，包括心血管健康，例如，通過減小經(jīng)由口腔組織全身感染的可能 性，
ο.使牙齒對致齲菌及其作用具有免疫力，
p.清潔牙齒和口腔，并且/或者
q.減輕牙齒腐蝕，
所述方法包括例如用任何前述方法測定口腔的生物群落，并且如果指示，則給予 包含有效量堿性氨基酸或其鹽(例如精氨酸)的口腔護(hù)理制品。
本發(fā)明進(jìn)一步提供游離或鹽形式的堿性氨基酸用于制備藥物的用途，所述藥物用 于促進(jìn)受試者的口腔健康，所述受試者的口腔生物群落包含根據(jù)本發(fā)明的方法測定的提高 量的致齲菌和/或提高量的乳酸根和/或低量的精氨酸分解菌和/或低量的菌斑產(chǎn)氨量。
本發(fā)明進(jìn)一步提供促進(jìn)口腔美容的方法(其中此促進(jìn)美容可包括例如使牙齒更 白和/或減輕口臭)，所述方法包括用本發(fā)明的方法測定口腔的生物群落，并且如果指示存 在提高量的致齲菌和/或提高量的乳酸根和/或存在低量的精氨酸分解菌和/或低量的菌 斑產(chǎn)氨量，則給予包含游離或鹽形式的堿性氨基酸的口腔護(hù)理制品。
發(fā)明詳述
菌斑代謝-產(chǎn)氨
牙菌斑使精氨酸轉(zhuǎn)化成氨的能力是精氨酸分解活性的標(biāo)志。某些細(xì)菌具有使精氨 酸轉(zhuǎn)化成氨的能力，正如某些細(xì)菌能夠使糖轉(zhuǎn)化成酸一樣。有益的是，提高精氨酸分解物種 的相對濃度，因?yàn)檫@些細(xì)菌產(chǎn)生不利于致齲菌增殖的條件，致齲菌偏愛酸性條件，并增加齲 齒風(fēng)險(xiǎn)。期需日常使用精氨酸使菌斑生態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移以常見的糖消耗產(chǎn)生有利于產(chǎn) 酸細(xì)菌的條件的類似方式有利于精氨酸分解菌。氨是一種能夠中和酸并幫助維持中性菌斑 PH的堿。中性pH條件更有利于非病原菌。產(chǎn)氨量測定法測定了能夠使精氨酸轉(zhuǎn)化成氨的 所有細(xì)菌的作用。這與實(shí)時(shí)PCR方法(以下進(jìn)一步描述)形成對比，后一種方法測定選擇 性精氨酸分解菌的濃度，并且不在代謝活性(活)細(xì)菌與非活性(死)細(xì)菌作出區(qū)分。
氨檢測試劑盒為市售的，例如購自Diagnostic Chemicals Limited (Oxford, CT),以測定產(chǎn)氨量。定量和測定的原理是，已知氨與α -酮戊二酸根和還原型煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸(NADPH)反應(yīng)生成L-谷氨酸根和NADP。此反應(yīng)由谷氨酸脫氫酶(GLDH)催化。 由于NADPH氧化而導(dǎo)致的在340nm處吸光度減小與氨濃度成比例。在預(yù)定的治療方案后收 集菌斑樣品。在一些應(yīng)用中，從釉質(zhì)或安裝在保持器(retainer)上的HAP樣品收獲菌斑。 在其他應(yīng)用中，直接從牙齒收獲菌斑。
由乳酸量檢測菌斑牛杰學(xué)
正如氨量測定法作為測定精氨酸分解菌量的代表一樣，乳酸作為測定致齲菌量的 代表。受試者在不經(jīng)早晨口腔清潔和不經(jīng)夜晚前飲食的情況下取得菌斑。將它們用10%蔗 糖溶液清洗2分鐘。8分鐘后，通過刮擦牙齒表面收集菌斑。將菌斑樣品收集在預(yù)稱重管中 于冰上，并測定菌斑重量。分析包括，將冰冷水加到已知量的菌斑樣品中，然后將樣品加熱 到80°C持續(xù)5分鐘，以殺死細(xì)菌并且釋放所有的酸，隨后使樣品在冰水中冷卻另外5分鐘。 然后將樣品離心，并過濾上清液。乳酸根濃度用毛細(xì)管電泳測定。
由定量實(shí)時(shí)PCR檢測菌斑牛杰學(xué)
定量實(shí)時(shí)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為DNA定量的高靈敏方法。從牙菌斑分離的細(xì) 菌DNA用于對細(xì)菌總量定量，因?yàn)镈NA的量與存在的細(xì)菌量有直接關(guān)系。實(shí)時(shí)PCR被政府 機(jī)構(gòu)如疾病控制中心(Center forDisease Control)和FDA承認(rèn)為一種強(qiáng)有力的靈敏技 術(shù)。利用很多口腔細(xì)菌的已知基因組序列，可設(shè)計(jì)探針檢測口腔細(xì)菌或特定細(xì)菌如變異鏈 球菌或血鏈球菌的總量。從菌斑或唾液樣品分離的DNA由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。DNA的量 隨PCR反應(yīng)各循環(huán)成指數(shù)增加。此技術(shù)被稱為“實(shí)時(shí)”，因?yàn)橥ㄟ^使用熒光報(bào)告分子實(shí)時(shí)跟 蹤反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用STOR Green作為報(bào)告分子。此分子在與雙鏈DNA 配位(coordination)時(shí)強(qiáng)烈發(fā)出熒光。通過設(shè)定熒光閾并用不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品測定 達(dá)到閾所需的循環(huán)數(shù)，可實(shí)現(xiàn)定量。存在的DNA越多，達(dá)到閾所需的DNA循環(huán)數(shù)越少。市售 實(shí)時(shí)PCR儀器可購自很多制造商，如Roche Diagnostics。
菌斑樣品從釉質(zhì)或羥基磷灰石樣品以已知的恒定表面積收獲。菌斑收集標(biāo)準(zhǔn)化很 關(guān)鍵，因?yàn)榇嬖诘腄NA的量與收集多少菌斑有直接關(guān)系。不適當(dāng)?shù)氖?，用菌斑質(zhì)量作為由 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)時(shí)PCR測定的總細(xì)菌的手段，因?yàn)閮蓚€(gè)量顯著相關(guān)。結(jié)果報(bào)告為ygDNA/ml?？?對DNA濃度Ln (DNA濃度)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對于總細(xì)菌，用受試者和治療作為因子完成雙因子 AN0VA。如果檢測差異為95%置信水平，則認(rèn)為差異顯著。對于特定細(xì)菌，如變異鏈球菌或 血鏈球菌，用總細(xì)菌作為協(xié)變量進(jìn)行雙因子ANC0VA。由于與總細(xì)菌群體量相關(guān)，特定細(xì)菌的 總量是菌斑生態(tài)學(xué)健康的更相關(guān)標(biāo)志。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將變異鏈球菌作為致齲性的標(biāo)志測定，選擇變異鏈 球菌是因?yàn)樗驱x齒開始中相關(guān)的公認(rèn)的風(fēng)險(xiǎn)因子。雖然在齲過程中涉及其他產(chǎn)酸細(xì)菌， 但已知變異鏈球菌特別在致齲過程的開始和早期階段起重要作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案中，將血鏈球菌選擇為轉(zhuǎn)變成較健康的菌斑生態(tài)學(xué)的標(biāo)志，因?yàn)檠溓蚓且阎@示高 水平精氨酸分解活性(使精氨酸轉(zhuǎn)化成氨的能力)的細(xì)菌。
由RT-PCR檢測菌斑生態(tài)學(xué)
反轉(zhuǎn)錄PCR測定樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄物。分離RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶使轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)化成 cDNA, cDNA用PCR擴(kuò)增。RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)是用于測定口腔細(xì)菌的基于DNA的方法不能測定那 些物種的生存力。由于口腔細(xì)菌最常發(fā)現(xiàn)于生物膜群落，在殺死后死亡細(xì)菌的DNA可長時(shí)間保持于生物膜結(jié)構(gòu)內(nèi)。其他方法，如基于熒光的生存力測定(LiveDead試劑盒，Molecular Probes)可檢測生物體是否具有受損的膜，但不直接檢測特定物種。
因此，反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR是對復(fù)雜群落內(nèi)存在的口腔細(xì)菌的特定物種的活生物體定 量的方法。mRNA具有相對較短的半衰期，因此指示最近活性的細(xì)菌。我們已對延伸因子tuf 研究出物種特異性引物。此基因不顯著受生長期、培養(yǎng)基或環(huán)境條件調(diào)節(jié)，因此使對細(xì)菌檢 測數(shù)的假影響(spurious effect)減到最低限度。利用伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)作為試驗(yàn)生物體，可在少到20%存在的生物體存活時(shí)檢測活細(xì) 菌和KOH殺死的細(xì)菌混合群體的生存力差異。另外，該方法允許在包含多達(dá)六個(gè)不同細(xì)菌 物種的混合物種群體中可靠地鑒定伴放線放線桿菌的存在。計(jì)算的細(xì)菌濃度與基于對相同 培養(yǎng)物的0D610的估計(jì)值密切相關(guān)(r = 0. 96，< 差異)。此測定代表研究口腔復(fù)雜環(huán) 境內(nèi)特定生物體的生態(tài)學(xué)的手段。由于更多的基因序列數(shù)據(jù)變得可用，因而可對多種口腔 細(xì)菌開發(fā)引物。
由熒光抗體探針檢測細(xì)菌量
通過使用單克隆抗體，用齲診斷試劑盒檢測唾液中致齲型細(xì)菌(例如變異鏈球 菌)和/或非致齲型細(xì)菌(例如血鏈球菌)的量。所用特定抗體對細(xì)菌物種是特異的，并 且具有連接到抗體的熒光染料。通過測定發(fā)射的熒光量，可檢測細(xì)菌量。實(shí)施例 實(shí)施例1實(shí)時(shí)PCR測定總菌斑細(xì)菌量使用不同的牙膏制劑，用上述步驟測定受試者的總菌斑細(xì)菌量(微克細(xì)菌DNA/總細(xì)菌DNA 6. 091變異鏈球菌DNA 0.09622血鏈球菌DNA 1. 126250ppm氟化物制 劑(對照)1450ppm氟化物制6.018 劑具有2%精氨酸碳3.781 酸氫鹽和1450ppm 氟化物的制劑精氨酸-氟化物制劑有效減小總菌斑負(fù)載量和變異鏈球菌(致齲)菌斑負(fù)載量，0.099030.059981. 1071. 291同時(shí)提高血鏈球菌(精氨酸分解)負(fù)載量。
實(shí)施例2-產(chǎn)氨量
使用不同的牙膏制劑，用上述方法測定受試者的產(chǎn)氨量
氨量(ppm)
250ppm 氟化物制劑 1.97
(對照)
1450ppm 氟化物制劑 1.79
具有2%精氨酸碳酸2.77
氫鹽和1450ppm氟化
物的制劑
利用含精氨酸的制劑，受試者的菌斑產(chǎn)氨量顯著更高。
實(shí)施例3-乳酸量
如上所述使用毛細(xì)管電泳，測定受試者的菌斑乳酸量，顯示在蔗糖存在下乳酸根 顯著增加。
權(quán)利要求
1.一種評價(jià)口腔的生物群落的方法，所述方法包括測定精氨酸分解菌量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中還測定致齲菌活性。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中通過測定菌斑產(chǎn)氨量評價(jià)精氨酸分解菌活性。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中通過測定乳酸根產(chǎn)量評價(jià)致齲菌活性。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括用定量實(shí)時(shí)PCR(定量RT-PCR)和/或 熒光抗體探針定量測定至少一種致齲菌和/或至少一種精氨酸分解菌的量。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中精氨酸分解菌包括血鏈球菌。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中也測定致齲菌活性，并且致齲菌包括變異鏈球菌。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法檢測在有可測量或顯著的牙齒脫礦質(zhì) 或損傷之前的菌斑生態(tài)學(xué)的潛在損傷變化。
9.一種促進(jìn)口腔健康的方法，例如，以a.減輕或抑制齲齒的形成，b.減輕或抑制牙齒脫礦質(zhì)和促進(jìn)牙齒再礦化，c.治療、減輕或抑制早期牙釉質(zhì)損傷的形成，d.減輕牙齒過敏性，e.減輕或抑制牙齦炎，f.促進(jìn)口腔中潰瘍或傷口的痊愈，g.減少產(chǎn)酸細(xì)菌的量，h.增加精氨酸分解菌的相對量，i.抑制口腔中形成微生物生物膜，j.在糖攻擊后將菌斑PH提高和/或保持在至少pH5. 5的水平， k.減少菌斑積累， 1.治療、緩和或減輕口干， m.使牙齒增白，η.促進(jìn)全身健康，包括心血管健康， ο.使牙齒對致齲菌具有免疫力或保護(hù)不受致齲菌傷害， P.清潔牙齒和口腔，并且/或者 q.減輕牙齒腐蝕，所述方法包括用前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法測定口腔的生物群落，并且如果指示 存在提高量的致齲菌和/或提高量的乳酸根，和/或 存在低量的精氨酸分解菌和/或低量的菌斑產(chǎn)氨量， 則給予包含有效量的堿性氨基酸或其鹽的口腔護(hù)理制品。
10.權(quán)利要求9的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸或其鹽。
11.游離或鹽形式的堿性氨基酸用于制備藥物的用途，所述藥物用于促進(jìn)受試者的口 腔健康，所述受試者的口腔生物群落包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法測定的提高量 的致齲菌和/或提高量的乳酸根和/或低量的精氨酸分解菌和/或低量的菌斑產(chǎn)氨量。
12.一種促進(jìn)口腔美容的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法測定 口腔的生物群落，并且如果指示存在提高量的致齲菌和/或提高量的乳酸根和/或存在低量的精氨酸分解菌和/或低量的菌斑產(chǎn)氨量，則給予包含游離或鹽形式的堿性氨基酸的口 腔護(hù)理制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及評價(jià)口腔的生物群落和根據(jù)評價(jià)利用堿性氨基酸提供適合治療的方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102037360SQ200980104889
公開日2011年4月27日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月8日
發(fā)明者L·謝菲爾-科爾比洛, L·迪蒂姆, P·桑塔皮亞, R·薩利文, S·拉文德, Y·胡, Z·呂 申請人:高露潔-棕欖公司