專利名稱：利用全細(xì)胞捕獲和atp分析進(jìn)行樣品細(xì)菌分析的方法
利用全細(xì)胞捕獲和ATP分析進(jìn)行樣品細(xì)菌分析的方法相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2008年2月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/066，336的權(quán)利，將 其以引用的方式并于本文。
背景技術(shù)：
對(duì)常用抗生素具有耐藥性的細(xì)菌的出現(xiàn)是一個(gè)日益成為的問題，嚴(yán)重影響對(duì)被感 染個(gè)體的治療。因此，在早期并以相對(duì)快速的方式確定這些細(xì)菌的存在以更好地控制這些 細(xì)菌變得越來越重要。這也適用于多種其他微生物。一種這類非常受關(guān)注的微生物為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus， “S. aureus”)。這是一種引起廣譜感染的病原體，所述感染包括淺表?yè)p傷，例如小的皮膚 膿腫和傷口感染；全身性且致命的病癥，例如心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血病；以及中毒癥，例如 食物中毒和中毒性休克綜合征。一些菌株(例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)對(duì)除少數(shù) 精選的抗生素之外的所有抗生素具有耐藥性。目前檢測(cè)微生物尤其是對(duì)抗生素具有耐藥性的細(xì)菌的技術(shù)一般比較費(fèi)時(shí)且通常 涉及以純種形式培養(yǎng)細(xì)菌。一種此類用于鑒定與急性感染相關(guān)的病原葡萄球菌(即人類 和動(dòng)物中的金黃色葡萄球菌以及動(dòng)物中的中間葡萄球菌(S. intermedius)和豬葡萄球菌 (S. hyicus))的技術(shù)是基于微生物凝結(jié)血漿的能力。已描述了至少兩種不同的凝固酶試驗(yàn) 游離凝固酶的試管試驗(yàn)和“細(xì)胞結(jié)合的凝固酶”或聚集因子的玻片試驗(yàn)。試管凝固酶試驗(yàn) 通常涉及將腦心浸出液肉湯中的過夜培養(yǎng)物與重構(gòu)的血漿混合，將該混合物溫育4小時(shí)并 通過緩慢傾斜試管來觀察血塊形成。對(duì)于金黃色葡萄球菌建議將受試物溫育過夜，因?yàn)樯?量的菌株可能需要4小時(shí)以上才能形成血塊。玻片凝固酶試驗(yàn)通常更快并且更經(jīng)濟(jì)；然而， 10%至15%的金黃色葡萄球菌菌株可能會(huì)產(chǎn)生陰性結(jié)果，這需要通過試管試驗(yàn)重新檢驗(yàn)分 離物。盡管本領(lǐng)域已描述了檢測(cè)金黃色葡萄球菌以及其他微生物的方法，但改進(jìn)的檢測(cè) 方法中將存在優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供捕獲細(xì)菌全細(xì)胞然后直接或間接進(jìn)行腺苷三磷酸 (ATP)分析的方法。這些方法涉及使用對(duì)特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有 抗原特異性的一種或多種抗體(優(yōu)選對(duì)特定細(xì)菌特征性的兩種或更多種獨(dú)特被分析物具 有抗原特異性的兩種或更多種抗體)。如果使用不止一種抗體，那么這兩種或更多種抗體優(yōu) 選在它們的結(jié)合特性上協(xié)同。也就是說，它們能夠同時(shí)結(jié)合靶標(biāo)被分析物的各獨(dú)特區(qū)域或 最好為互補(bǔ)結(jié)合，通過所述互補(bǔ)結(jié)合，對(duì)某獨(dú)特被分析物的結(jié)合可被另一種抗體的結(jié)合增 強(qiáng)。在一個(gè)這樣的實(shí)施例中，本發(fā)明提供分析特定細(xì)菌的方法，其中該方法包括提供 疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物；提供對(duì)該特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中 所述抗體選自MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12_9、它 們的片段以及它們的組合；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料；使該樣品、該固體支撐 物材料和該一種或多種抗體之間在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物 的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下接觸；從該樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì) 胞；裂解該靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；以及通過直接或間接分析裂解物的ATP來分析該特 定細(xì)菌是否存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該一種或多種(優(yōu)選兩種或更多種)抗體與該固體支撐 物材料連接形成被分析物結(jié)合性材料，從而該方法包括在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的 一種或多種被分析物的全細(xì)胞的話有效捕獲所述全細(xì)胞的條件下，提供該樣品和該被分析 物結(jié)合性材料之間的接觸。提供該樣品和該被分析物結(jié)合性材料之間的接觸可包括該樣品 和該一種或多種抗體之間的同時(shí)和/或依次接觸，優(yōu)選同時(shí)接觸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，提供該樣品、該固體支撐物材料和該一種或多種抗體 之間的接觸包括提供該一種或多種抗體和該樣品之間的接觸以形成結(jié)合抗體的全細(xì)胞，隨 后提供該抗體結(jié)合的全細(xì)胞和該固體支撐物材料之間的接觸。在某些實(shí)施例中，該特定細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是金黃色葡萄球菌。在某些實(shí)施例中，每個(gè)粒子具有設(shè)置在其上的結(jié)合不同被分析物的至少兩種抗 體。在某些實(shí)施例中，先將靶標(biāo)全細(xì)胞從磁性粒子移除再進(jìn)行裂解。在某些實(shí)施例中，通過直接或間接分析ATP來分析該特定細(xì)菌是否存在包括使 所述裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通過任何存在的腺苷酸激酶有效產(chǎn)生ATP的 條件下接觸；以及檢測(cè)是否存在所產(chǎn)生的ATP。在某些實(shí)施例中，檢測(cè)是否存在所產(chǎn)生的 ATP包括測(cè)量所產(chǎn)生ATP的量并將其與特定細(xì)菌或特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/ 或量關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施例中，檢測(cè)是否存在所產(chǎn)生的ATP包括使含有裂解物和ADP的混合 物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與所產(chǎn)生的ATP的量成比例的光，并用光度計(jì)檢測(cè) 所述光。在某些實(shí)施例中，通過直接或間接分析ATP來分析是否存在特定細(xì)菌包括使裂 解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光；并用光度計(jì)檢測(cè)所 述光。在某些實(shí)施例中，分析特定細(xì)菌是否存在還包括測(cè)量ATP的存在量并將其與特定細(xì) 菌或特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在量關(guān)聯(lián)。本發(fā)明也提供分析樣品中的細(xì)菌的方法，該方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞 的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物；提供包含磁性粒子的固體 支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗 原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親 和純化的GxClf40、MAb 12-9、它們的片段以及它們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征 性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述 樣品、所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒子之間的接觸；從該樣品分離捕獲的靶標(biāo) 全細(xì)胞；裂解該靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物并且如果存在腺苷三磷酸(ATP)的話釋放出ATP ； 使裂解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光；用光度計(jì)檢測(cè)所述光；和測(cè)量ATP的存在量并將其與特定細(xì)菌或特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在量關(guān) 聯(lián)。本發(fā)明還提供分析樣品中的細(xì)菌的方法，該方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞 的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物；提供包含磁性粒子的固體 支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗 原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親 和純化的GxClf40、MAb 12-9、它們的片段以及它們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征 性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述 樣品、所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒子之間的接觸；從該樣品分離捕獲的靶標(biāo) 全細(xì)胞；裂解該靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；使裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通 過任何存在的腺苷酸激酶有效產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)的條件下接觸；和測(cè)量所產(chǎn)生的腺苷 三磷酸的量并將其與所述特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的量關(guān)聯(lián)。 定義“全細(xì)胞”意指在與其他生物材料分離的過程中保持其結(jié)構(gòu)、但不一定需要能夠繁 殖的生物活性細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“被分析物”和“抗原”可互換使用，指所關(guān)注的微生物特征性的各種分子(例 如，A蛋白)或分子表位(例如，A蛋白的不同結(jié)合位點(diǎn))，或微生物全細(xì)胞。這些包括細(xì)胞 壁組分(例如，細(xì)胞壁蛋白如A蛋白，以及聚集因子，其為存在于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁 相關(guān)纖維蛋白原受體)、外部細(xì)胞組分(例如莢膜多糖和細(xì)胞壁碳水化合物)等等?！按判粤Ｗ印敝赣设F磁性、順磁性或超順磁性粒子構(gòu)成的粒子或粒子聚集物，包括 所述粒子在聚合物小珠中的分散體。詞語(yǔ)“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下可提供某些有益效果的本發(fā)明的實(shí) 施例。然而，在相同的或其他情況下，其他實(shí)施例也可以是優(yōu)選的。此外，述及一個(gè)或多個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施例并非暗示其他實(shí)施例不可用，也并非旨在將其他實(shí)施例排除在本發(fā)明的范圍 之外。術(shù)語(yǔ)“包含”和其變型形式在說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)時(shí)不具有限制性意義。如本文所用，“一種”、“至少一種”和“一種或多種”可互換使用。因此，例如，包含 “一種”抗體的被分析物結(jié)合性材料可解釋為意指該被分析物結(jié)合性材料包括結(jié)合不同被 分析物的“一種或多種”抗體。術(shù)語(yǔ)“和/或”是指所列要素的一個(gè)或全部，或所列要素的任何兩個(gè)或更多個(gè)的組合。另外，在本文中，由端點(diǎn)界定的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所含的所有數(shù)值(如，1至5 包括 1、1· 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容并非意圖描述本發(fā)明的每個(gè)公開的實(shí)施例或每種實(shí)施方 式。以下“具體實(shí)施方式
”更為具體地舉例說明示例性實(shí)施例。在本專利申請(qǐng)中的幾個(gè)地 方，通過實(shí)例的列表給出指導(dǎo)，這些實(shí)例可以各種組合來應(yīng)用。在每個(gè)情況中，所述及的列 表只是用作代表性的群組，不應(yīng)該被解釋為是排他性的列表。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及基于利用所關(guān)注細(xì)菌特有的一種或多種被分析物從樣品中捕獲所關(guān)注細(xì)菌的全細(xì)胞的各種方法。具體而言，本發(fā)明的捕獲方法包括使用對(duì)該特定細(xì)菌特征性 的一種或多種獨(dú)特被分析物(優(yōu)選兩種或更多種)具有抗原特異性的一種或多種抗體(優(yōu) 選兩種或更多種)。如果使用兩種或更多種抗體，優(yōu)選它們?cè)诮Y(jié)合特性上協(xié)同。也就是說， 它們能夠同時(shí)結(jié)合靶標(biāo)被分析物的各獨(dú)特區(qū)域或最好為互補(bǔ)結(jié)合，通過所述互補(bǔ)結(jié)合，對(duì) 某獨(dú)特被分析物的結(jié)合可被另一種抗體的結(jié)合增強(qiáng)靶標(biāo)全細(xì)胞一旦連接至磁性粒子，可將它們?cè)谶M(jìn)一步分析之前先從樣品中移除。 在分析之前選擇性結(jié)合靶標(biāo)全細(xì)胞并將它們與樣品其余部分分離的優(yōu)點(diǎn)在于，這可選擇性 濃縮細(xì)胞并可提供更好的靈敏度和特異性。這也可除去可能存在于復(fù)雜樣品中的抑制劑。本發(fā)明方法中分析細(xì)菌的技術(shù)涉及直接或間接分析腺苷三磷酸(ATP)。在這種分 析之前，可將被捕獲的(靶標(biāo))全細(xì)胞在其不從磁性粒子釋放的情況下或在從磁性粒子釋 放后進(jìn)行裂解。在許多其中全細(xì)胞捕獲為檢測(cè)或進(jìn)一步分析之前的樣品制備步驟的一部分的情 況中，本發(fā)明是有利的。已知對(duì)于給定的細(xì)菌菌株，靶標(biāo)蛋白的表達(dá)可變化很大。在某些情 況下，可利用對(duì)以單一抗體技術(shù)即可很好地進(jìn)行捕獲的菌株的捕獲。在其他情況下，針對(duì)靶 標(biāo)細(xì)菌的單一抗原的單一抗體可導(dǎo)致某些細(xì)菌菌株顯示出較差的捕獲效率或根本不能被 捕獲。對(duì)于這些菌株，樣品制備步驟將導(dǎo)致可供檢測(cè)的細(xì)菌大大減少。結(jié)果，這將增加該檢 測(cè)技術(shù)的假陰性數(shù)量，并且這也對(duì)該測(cè)定法的檢測(cè)限具有不利影響。通過將包被有不同抗 體的粒子混合或?qū)⒉煌贵w包被于同一粒子上，有可能增加對(duì)用單一抗體時(shí)顯示較差捕獲 或不能被捕獲的細(xì)菌菌株的捕獲效率。因此，通過使用本發(fā)明優(yōu)選的方法，采用對(duì)特定細(xì)菌 特征性的兩種或更多種不同被分析物具有抗原特異性的兩種或更多種抗體，可改善使用全 細(xì)胞捕獲的測(cè)定法的測(cè)定靈敏度以及檢測(cè)限。優(yōu)選地，可使用相對(duì)較小體積的試驗(yàn)樣品。盡管可使用顯著大于2毫升(mL)的試 驗(yàn)樣品體積，但是500微升(μ 左右的試驗(yàn)樣品通常足夠用于本發(fā)明方法，不過更小的樣 品量也是可以的。優(yōu)選地，使用本發(fā)明方法，捕獲時(shí)間可相對(duì)較短。例如，捕獲時(shí)間可少于30分鐘、 少于15分鐘、少于5分鐘、少于60秒，并且甚至短至30秒。特別關(guān)注的細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。尤其相關(guān)的生物體包 括以下各科屬的成員腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)或 葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 腸球菌屬(Enterococcus)、沙門氏菌(Salmonella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、志賀桿 菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希桿菌屬 (Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、弧菌屬(Vibrio)、棒桿 菌屬(Corynebacteria)以及皰疹病毒、曲霉菌屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium) 以及假絲酵母屬(Candida)。毒力特別強(qiáng)的生物體包括金黃色葡萄球菌(包括耐藥菌株 例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)、無乳鏈球菌(S. agalactiae)、產(chǎn)月農(nóng)鏈球菌(S. pyogenes)、獎(jiǎng) 腸球菌(Enterococcus faecal i s)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌 (VRSA)、萬古霉素中度耐藥金黃色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(A. fumigatus)、棒曲霉(A. clavatus)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum)、厚孢鐮刀菌(F. chlamydosporum)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、依氏李其j 特菌(Listeriaivanovii)、霍舌L弧菌(Vibrio cholera)、畐Ij溶血 性弧菌(V. parahemolyticus)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerasuis)、傷寒沙門氏菌 (S. typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑假絲 酵母(C. glabrata)、克魯斯假絲酵母(C. krusei)、坂崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)、 大腸桿菌0157以及多重耐藥性革蘭氏陰性桿菌(MDR)。特別值得關(guān)注的是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如金黃色葡萄球菌。通常，可通過檢測(cè)這些 細(xì)菌特征性的細(xì)胞壁組分(例如細(xì)胞壁蛋白)的存在來檢測(cè)它們。而且，特別關(guān)注的是包 括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR在內(nèi)的抗生素耐藥性微生物。通常，可通過另外檢測(cè)造成 抗生素耐藥性的內(nèi)部細(xì)胞組分(例如膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶等)的存在來檢測(cè)這些微生物。本發(fā)明優(yōu)選的方法可用于利用分別的分子(例如，像用于分析金黃色葡萄球菌的 A蛋白和聚集因子的分子)或同一分子(例如蛋白質(zhì))的兩個(gè)不同表位從樣品捕獲細(xì)菌全 細(xì)胞。這些被分析物包括(例如)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，例如A蛋白和微生物表面組分識(shí)別性粘 附基質(zhì)分子(MSCRAMMs)如纖維蛋白原結(jié)合蛋白(如聚集因子)、纖連蛋白結(jié)合蛋白、膠原結(jié) 合蛋白、肝素相關(guān)多糖結(jié)合蛋白等等。A蛋白和聚集因子，例如纖維蛋白原結(jié)合因子和聚集 因子A、B和Efb也尤其可用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的存在的方法中。其他關(guān)注的細(xì)胞壁組 分包括莢膜多糖和細(xì)胞壁碳水化合物(如，磷壁酸和脂磷壁酸)?？稍诳稍醋远喾N來源的試驗(yàn)樣品中分析的所關(guān)注的菌種，所述來源例如生理流體 (如血液、唾液、眼睛晶狀體液、滑膜液、腦脊液、膿汁、汗液、滲出物、尿液、粘液)、粘膜組織 (例如口腔、牙齦、鼻部、眼睛、氣管、支氣管、胃腸、直腸、尿道、輸尿管、陰道、子宮頸和子宮 粘膜)、哺乳期乳汁、糞便等。另外，試驗(yàn)樣品可源自身體部位，例如傷口、皮膚、前鼻孔、鼻咽 腔、鼻腔、鼻前庭、頭皮、指甲、外耳、中耳、口、直腸、陰道、腋窩、會(huì)陰、肛門、直腸或其他相似 的部位。除了生理流體外，其他試驗(yàn)樣品可包括其他液體以及溶于液體介質(zhì)的固體。關(guān)注 的樣品可包括工藝液流、水、土壤、植物或其他植被、空氣、表面(例如被污染表面)等等。本領(lǐng)域描述了用于檢測(cè)細(xì)菌例如金黃色葡萄球菌的多種患者取樣技術(shù)。這些取樣 技術(shù)也適用于本發(fā)明方法。例如，通常通過用無菌拭子或取樣裝置拭抹，從患者的鼻孔例如 患者的前鼻孔擦拭獲得樣品。例如，一個(gè)拭子用于對(duì)一名受試者取樣，即一個(gè)拭子用于兩個(gè) 鼻孔。這種取樣例如通過以下方式進(jìn)行將干燥的或用適當(dāng)?shù)娜芤侯A(yù)潤(rùn)濕的拭子插入受試 者鼻孔的前端并沿著鼻孔粘膜表面將拭子旋轉(zhuǎn)整整兩周。有多種拭子或其他樣品采集裝置可例如以商品名PURE-WRAPS購(gòu)自Puritan Medical Products Co. LLC (Guilford, ME),或以商品名 microRheologics nylon flocked swab 禾口 ESwab Collection and TransportSystem 購(gòu) 自 Copan Diagnostics, Inc. (Murrietta,CA)。如果需要也可使用例如美國(guó)專利No. 5，879，635 (Nason)中公開的樣品采 集裝置。拭子可為包括棉花、人造絲、藻酸鈣、滌綸、聚酯、尼龍、聚氨酯等在內(nèi)的各種材料。然后可將樣品采集裝置(例如拭子)直接培養(yǎng)、直接分析或用適當(dāng)?shù)娜芤禾崛?(例如，通過洗滌，經(jīng)渦旋洗脫)。這些提取(即洗脫)溶液通常包括水并可任選包括緩沖 液和至少一種表面活性劑。洗脫緩沖液的例子包括(例如)磷酸鹽緩沖液(PBS)，其可與例如TWEEN 20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯，可購(gòu)自Sigma-Aldrich Corp.)或PLUR0NIC L64(聚(氧乙烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物，可購(gòu)自BASFCorp.)組合使用。其他的提取溶 液可起到在從樣品收集位置傳送到樣品分析位置的過程中保持樣本穩(wěn)定性的作用。這些類 型的提取溶液的例子包括Amies和Stuart傳送介質(zhì)?？稍谶M(jìn)一步分析之前對(duì)試驗(yàn)樣品(例如液體)進(jìn)行處理。這包括濃縮、沉淀、過濾、 離心、蒸餾、透析、稀釋、天然組分的失活、添加試劑、化學(xué)處理等。使樣品與合適的可連接至磁性粒狀材料的抗體接觸?？蓪⒔Y(jié)合的細(xì)胞從載體洗脫 以獲得純化的靶標(biāo)被分析物，或?qū)⑵湓谂c固體支撐物材料連接的情況下進(jìn)行處理。將一種或多種(優(yōu)選兩種或更多種)抗體(例如金黃色葡萄球菌抗體)用作金 黃色葡萄球菌反應(yīng)物?！敖瘘S色葡萄球菌抗體”指具有特異結(jié)合給定抗原的能力的免疫球 蛋白，包括其抗原結(jié)合片段。金黃色葡萄球菌抗體可商購(gòu)自Sigma-Aldrich和Accurate Chemical。此外，其他金黃色葡萄球菌抗體(例如單克隆抗體Mab 12_9)在美國(guó)專利 No. 6，979，446中有描述。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體選自本文描述的那些(例如，選自 MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12-9)、它們的片段以及 它們的組合。這些抗體也在下列專利公布中公開美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 2008-0118937-A1 和 PCT 專利公布 No. WO 2008/140570 中，二 者的標(biāo)題均為"ANTIBODY WITHPROTEIN A SELECTIVITY(具有A蛋白選擇性的抗體)”，以及2006年11月22日提交的美國(guó)專利申請(qǐng) 系列號(hào) 11/562，747 和 PCT 專利公布 No. WO 2008/143697，二者的標(biāo)題均為“ANTIBODY WITH PROTEIN ASELECTIVITY(具有A蛋白選擇性的抗體)”，以及2006年11月22日提交的美國(guó) 專利申請(qǐng)系列號(hào)60/867，089和2007年11月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/943，168， 二者的標(biāo)題均為 “SPECIFICANTIBODY SELECTION BY SELECTIVE ELUTI ON CONDITIONS (通 過選擇性洗脫條件進(jìn)行的特異抗體選擇)”。優(yōu)選的抗體為單克隆抗體。尤其優(yōu)選的是結(jié)合金黃色葡萄球菌(本文中也稱作 “S. aureus”或“Staph Α”)的A蛋白的單克隆抗體。尤其優(yōu)選的抗體為MAb_76、MAb_107、 它們的片段以及它們的組合。更具體地講，在一個(gè)實(shí)施例中，合適的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段為顯示雜 交瘤細(xì)胞系358A76. 1所產(chǎn)生的單克隆抗體76的免疫學(xué)結(jié)合特性的那些。鼠單克隆抗 體76為從用A蛋白免疫的小鼠分離的鼠IgG2A κ抗體。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)，可產(chǎn)生單克隆抗體76的雜交瘤358A76. 1于2006年10月18日保藏于美國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)保藏庫(kù)，10801University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209)并被給予專利保藏號(hào)PTA-7938 (本文中也稱作登錄 號(hào)PTA-7938)。雜交瘤358A76. 1產(chǎn)生在本文中稱作“Mab 76”的抗體。Mab 76在本文中也 稱作“Mab76”、"Mab-76”、"MAb-76”、“單克隆 76”、“單克隆抗體 76”、“76”、"M76，，或“M76”， 并且均可在本文中互換使用，是指于2006年10月18日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)并分配登錄號(hào)No. PTA-7938的雜交瘤細(xì)胞系358A76. 1所產(chǎn)生的免疫球蛋白。在另一實(shí)施例中，合適的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段為顯示雜交瘤細(xì)胞系 358A107. 2所產(chǎn)生的單克隆抗體107特征性的免疫學(xué)結(jié)合特性的那些。鼠單克隆抗體107 為從用A蛋白免疫的小鼠分離的鼠IgG2A κ抗體。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，可產(chǎn)生單克隆抗體 107的雜交瘤358A107. 2于2006年10月18日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection(ATCC)保藏庫(kù)，10801 UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110-2209)并被給予專利保藏號(hào)PTA-7937(本文中也稱作登錄號(hào)PTA-7937)。雜交瘤 358A107. 2產(chǎn)生在本文中稱作"Mab 107”的抗體。Mab 107在本文中也稱作“Mabl07”、 “Mab-107”、“MAb-107”、“單克隆 107”、“單克隆抗體 107”、“107”、“M107” 或 “M 107”，并且 均可在本文中互換使用，是指于2006年10月18日保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 并分配登錄號(hào)PTA-7937的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的免疫球蛋白。合適的單克隆抗體還有可抑制單克隆抗體MAb-76與金黃色葡萄球菌的A蛋白結(jié) 合的那些。本發(fā)明可利用結(jié)合金黃色葡萄球菌A蛋白的被單克隆抗體MAb-76所識(shí)別的相 同表位的單克隆抗體。測(cè)定單克隆抗體是否能抑制單克隆抗體MAb-76與金黃色葡萄球菌 A蛋白的結(jié)合以及測(cè)定單克隆抗體是否結(jié)合金黃色葡萄球菌A蛋白的被單克隆抗體MAb-76 所識(shí)別的同一表位的方法，是免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合適的單克隆抗體還有能抑制單克隆抗體MAb-107與金黃色葡萄球菌A蛋白的 結(jié)合的那些。本發(fā)明可利用結(jié)合金黃色葡萄球菌A蛋白的被單克隆抗體MAb-107所識(shí)別 的同一表位的單克隆抗體。測(cè)定單克隆抗體是否能抑制單克隆抗體MAb-107與金黃色葡 萄球菌A蛋白的結(jié)合以及測(cè)定單克隆抗體是否結(jié)合金黃色葡萄球菌A蛋白的被單克隆抗體 MAb-107所識(shí)別的同一表位的方法，是免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合適的單克隆抗體為由這個(gè)雜交瘤的子代或衍生物所產(chǎn)生的那些單克隆抗體以 及等價(jià)的或相似的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明還包括各種抗體片段，也稱作抗原結(jié)合片段，它們僅包括完整抗體的一部 分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)并因而保留了結(jié)合抗原的能力。抗體片段的例子包 括(例如)通過蛋白酶解消化和/或還原二硫鍵所產(chǎn)生的Fab、Fab'、Fd、Fd'、Fv、dAB和 F(ab' )2片段以及從Fab表達(dá)文庫(kù)中產(chǎn)生的片段。這些抗體片段可通過本領(lǐng)域熟知的技 術(shù)生成。可用于本發(fā)明的單克隆抗體包括但不限于人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、單鏈 FvS(SCFv)、二硫鍵連接的 FvS(SdFv)、Fab 片段、F(ab')片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、雙 抗體、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的線性抗體片段、包括VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗 體(即胞內(nèi)抗體)，以及它們的抗原結(jié)合抗體片段?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可具有許多種同種型?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可 為(例如)鼠IgM、IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE0可用于本發(fā)明的單克隆抗 體可為(例如)人 IgM、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE。在一些實(shí)施例中， 單克隆抗體可為鼠IgG2a、IgGl或IgG3。就本發(fā)明而言，給定的重鏈可與κ或λ形式的 輕鏈配對(duì)?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可由動(dòng)物(包括但是不限于人、小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠、 山羊、馬、雞或火雞)產(chǎn)生、化學(xué)法合成或重組表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可通過多 種本領(lǐng)域已知用于純化免疫球蛋白分子的方法來純化，例如通過色譜法(如離子交換色 譜、親和色譜以及排阻柱色譜法)、離心、差異溶解度法，或通過多種其他用于純化蛋白質(zhì)的 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化。合適的抗體還包括可以優(yōu)選至少1皮克每毫升(pg/mL)、更優(yōu)選最多100pg/mL的 濃度檢測(cè)金黃色葡萄球菌的重組聚集因子(rClf40)蛋白的高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗體制品。合適的抗體還包括與金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白抗血清相 比顯示出檢測(cè)靈敏度至少增加4倍的高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗 體制品。在某些實(shí)施例中，可使用高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗體制 品，其中所述高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗體制品的制備方法包括從 用金黃色葡萄球菌的重組聚集因子(rClf40)蛋白免疫的動(dòng)物獲得抗血清；使該抗血清結(jié) 合金黃色葡萄球菌聚集因子(rClf40)蛋白親和柱；用含有0. 5M鹽且pH為4的洗滌緩沖液 洗滌該柱；并用PH為2的洗脫緩沖液從柱子洗脫高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白 多克隆抗體制品。在本文中，來自兔和山羊的高親合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多 克隆抗體制品分別稱作親和純化的RxClf40和親和純化的GxClf40。在一些實(shí)施例中，高親 合力抗金黃色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗體制品可通過這樣的方法來獲得，該方法在 使抗血清結(jié)合金黃色葡萄球菌聚集因子(Clf40)蛋白親和柱之前還包括富集該抗血清的 IgG型抗體。該富集可從制品中除去非免疫球蛋白蛋白質(zhì)和/或富集樣品當(dāng)中的IgG型抗 體。本文所用的抗血清指來自經(jīng)免疫的宿主動(dòng)物并已從中去除了凝血蛋白和紅血細(xì) 胞(RBC)的血液。靶標(biāo)抗原的抗血清可通過免疫多種宿主動(dòng)物來獲得?？墒褂枚喾N免疫方案。抗體親合力為多克隆抗體制品的功能親和力的量度。親合力為多種抗體/抗原相 互作用的復(fù)合親和力。也就是說，親合力為抗原/抗體結(jié)合的表觀親和力而不是真正的親 和力。盡管在大多數(shù)的抗血清中親和力不均一，但可通過定義平均親和力(Ktl)來表征這些 群體。被分析物結(jié)合性材料包括磁性粒狀材料，例如鐵磁性、順磁性和超順磁性材 料。優(yōu)選地，這些磁性粒子(例如小珠)的平均粒徑(即單個(gè)粒子的最長(zhǎng)維度，例如直 徑)小于2微米，并且優(yōu)選在0.05至1微米的范圍內(nèi)。例如，用各種基團(tuán)例如羧基、胺和 甲苯磺?；倌芑拇判粤Ｗ涌缮藤?gòu)自多個(gè)商業(yè)來源，例如Invitrogen (Carlsbad，美國(guó) 加州)和Ademtech (Pessac，法國(guó))。鏈霉抗生物素蛋白包被的粒子也可得自若干來源， 例如 Invitrogen (Carlsbad,美國(guó)力口州)、Ademtech (Pessac,法國(guó))禾口 Miltenyi Biotec GmbH(Bergisch Gladbach，德國(guó))。被分析物結(jié)合性材料優(yōu)選包括磁性粒狀材料，其中粒狀材料的每個(gè)粒子上設(shè)置有 至少兩種結(jié)合不同被分析物的抗體。例如，在某些實(shí)施例中，被分析物結(jié)合性材料包括其上 設(shè)置有抗體MAb-107和親和純化的GxClf40(優(yōu)選以1 1的比率)的磁性粒狀材料?？贵w可通過共價(jià)連接或非共價(jià)連接方式連接至磁性粒狀載體材料?？贵w與磁性粒狀載體材料的非共價(jià)連接包括通過例如離子相互作用或氫鍵的連 接。包括于本發(fā)明中的非共價(jià)連接的一個(gè)例子為熟知的生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)?；?于生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)的技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。抗生物 素蛋白和生物素之間的親和常數(shù)非常高(解離常數(shù)Kd為大約10_15M，參見Biochem. J.，89， 599(1963))并且當(dāng)生物素與多種生物分子偶聯(lián)時(shí)也不會(huì)顯著減小。已確定了許多化學(xué)方 法，來將生物分子與生物素偶聯(lián)，同時(shí)該生物分子的活性或其他所需特性只有極少或可忽 略的損失。生物素-抗生物素蛋白技術(shù)的綜述可見于Applications of Avidin-BiotinTechnology toAffinity-Based Separation, Bayer ^Α J- of Chromatography, 3-11 頁(yè)(1990)。鏈霉抗生物素蛋白及其功能同系物抗生物素蛋白為四聚體蛋白質(zhì)，具有四個(gè)相同 的亞基。鏈霉抗生物素蛋白由放線細(xì)菌阿維丁鏈霉菌(Sti^ptomyces avidinii)分泌。鏈 霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的單體含有一個(gè)對(duì)水溶性維生素生物素的高親和力結(jié)合 位點(diǎn)，從而鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白四聚體結(jié)合四個(gè)生物素分子。生物素(也稱作維生素H或順式-六氫-2-氧代-IH-噻吩并-[3-4]-咪唑-4-戊 酸)是包括細(xì)菌和酵母在內(nèi)的大多數(shù)生物體所必需的基本生物素。生物素的分子量為244 道爾頓，遠(yuǎn)低于其結(jié)合伴侶抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。生物素也是丙酮酸羧化酶、 轉(zhuǎn)羧酶、乙酰輔酶A羧化酶和甲基巴豆酰輔酶A羧化酶(它們共同羧化多種底物)的 酶輔因子。鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白二者均顯示與生物素非常緊密和高度特異性 的結(jié)合，這是已知最強(qiáng)的蛋白質(zhì)與配體間非共價(jià)相互作用之一，摩爾解離常數(shù)為10_15摩 爾濃度(M) (Green, Advances in ProteinChemistry,第 29 卷，第 85-133 頁(yè)(1975))，且 配體解離的 tl/2 為 89 天(Green, N. Μ.，Advances in Protein Chemistry,第 29 卷，第 85-133頁(yè)(1975))?？股锼氐鞍?生物素結(jié)合在血清和血液循環(huán)中是穩(wěn)定的(Wei等人， Experientia，第27卷，第366-368頁(yè)(1971))?？股锼氐鞍?生物素復(fù)合物一旦形成，不 受最極端的PH、有機(jī)溶劑和變性條件的影響。從生物素分離鏈霉抗生物素蛋白需要例如8M 胍、pH 1. 5或121°C高壓烹煮10分鐘(min)的條件?？墒褂枚喾N已知方法將抗體進(jìn)行生物素?；＠?，可使用活化的生物素類似物 如N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHS-生物素)通過化學(xué)法將抗體進(jìn)行生物素酰化，NHS-生 物素例如可購(gòu)自Pierce ChemicalCompany (Rockford，IL)的)，其需要抗體上存在游離的
伯氨基。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，可用鏈霉抗生物素蛋白包被磁性粒子并使其與生物素酰 化的抗體接觸。然后可將這些粒子用于細(xì)菌捕獲。對(duì)于兩種或更多種抗體，可發(fā)生同時(shí)或 依次捕獲。另一選擇為可將生物素?；目贵w與樣品混合以捕獲細(xì)菌，然后可將抗體-細(xì) 菌復(fù)合物捕獲于小珠(Dynal T IMyOne Streptavidin Package insert)上。對(duì)于某些實(shí)施例，可優(yōu)化生物素分子數(shù)量與抗體數(shù)量的比率以對(duì)某些粒子避免聚 集。例如，對(duì)于Ademtech 200-nm鏈霉抗生物素蛋白包被的粒子，優(yōu)選約2 1的比率。更 高的比率，尤其是大于7 1的比率對(duì)這些粒子已顯示出聚集問題。將抗體共價(jià)連接至粒狀載體材料的代表性方法包括利用由活化化合物(例如戊 二醛、碳二亞胺、溴化氰)活化的載體材料中的官能基團(tuán)(例如羧基、胺、羥基、馬來酰亞胺、 酰胼)來與抗體中的另一反應(yīng)性基團(tuán)(例如羥基、氨基、酰胺基或巰基)反應(yīng)。這個(gè)鍵合可 為(例如)二硫鍵、硫酯鍵、酰胺鍵、硫醚鍵等等?？贵w也可直接連接至用可與抗體上的官 能團(tuán)(例如胺)直接反應(yīng)的基團(tuán)(甲苯磺?；?、氯甲基)官能化的載體材料。抗體可通過多種本領(lǐng)域已知的方法共價(jià)鍵合至磁性粒狀載體材料。例如，用羧基 衍生化的小珠可商購(gòu)獲得?？扇缓笸ㄟ^由碳二亞胺活化所介導(dǎo)的抗體上的伯胺和小珠表面 上的羧基之間酰胺鍵的形成將抗體偶聯(lián)至這些小珠。通常，針對(duì)所關(guān)注的系統(tǒng)優(yōu)化粒子濃度和抗體與粒子的比率以實(shí)現(xiàn)快速捕獲。一
13般來講，這取決于粒子。例如，對(duì)于Dynal 1_ μ m粒子，粒子濃度優(yōu)選大于0. 04mg/mL，更優(yōu) 選大于0. lmg/mL，且甚至更優(yōu)選大于0. 16mg/mL。對(duì)于上述的粒子，抗體與粒子的比率優(yōu)選 大于1 μ g/mg粒子，更優(yōu)選大于10 μ g/mL,且甚至更優(yōu)選大于40 μ g/mg粒子。例如，對(duì)于Ademtech 200_nm粒子，粒子濃度優(yōu)選大于0. 04mg/mL，更優(yōu)選大于 0. lmg/mL，且甚至更優(yōu)選大于0. 16mg/mL。對(duì)于上述的粒子，抗體與粒子的比率優(yōu)選至少為 0. 01 μ g/mg粒子，更優(yōu)選大于0. 1 μ g/mL,且甚至更優(yōu)選大于1 μ g/mg粒子。對(duì)于上述的粒 子，抗體與粒子的比率優(yōu)選小于10μ g/mg粒子。合適的粒子可進(jìn)行或不進(jìn)行封閉以防止非特異性結(jié)合。這些封閉可在進(jìn)行抗體連 接之前或之后完成。例如，某些磁性小珠(例如DynalTlMyOne鏈霉抗生物素蛋白小珠)在 購(gòu)買時(shí)為用牛血清白蛋白(BSA)封閉的?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的其他合適的針對(duì)非特異結(jié)合 的封閉劑。含有靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品和含有抗體的固體支撐物材料之間的接觸時(shí)間(例如，混 合時(shí)間)可不超過15分鐘，然而可使用低至30秒和高至30分鐘。這些組合物還可包括緩 沖液，例如任選含有PLUR0NICL-64表面活性劑、乙二胺四乙酸(EDTA) ,BSA或它們的組合的 PBS0盡管對(duì)于大的粒子和小的粒子兩者均可使用物理攪拌(或混合)，但小的粒子可在不 進(jìn)行混合的情況下使用?？赏ㄟ^沉降、離心或過濾而從樣品分離粒子。優(yōu)選地，使用磁性粒子并通過使用磁 場(chǎng)將它們分離?？捎枚喾N緩沖液(包括(例如)含PLURONIC L-64或TWEEN 20、含有或不 含BSA等的PBS)洗滌這些分離的粒子(其上有全細(xì)胞)。值得注意的是，使用本發(fā)明的全細(xì)胞捕獲方法時(shí)，優(yōu)選至少樣品中20%靶標(biāo)全細(xì) 胞被捕獲，更優(yōu)選至少50%靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲，且甚至更優(yōu)選至少80%靶標(biāo)全細(xì)胞被捕
-M-犾。本發(fā)明方法包括裂解試驗(yàn)樣品中的靶標(biāo)全細(xì)胞。可在裂解前將靶標(biāo)全細(xì)胞從磁性粒子移除。既有化學(xué)方法也有物理方法可用于從 磁性粒子移除細(xì)胞。最簡(jiǎn)單的方法依靠改變緩沖液PH或離子強(qiáng)度(或二者)來釋放被捕 獲細(xì)胞。溫度也可用作釋放被捕獲細(xì)胞的觸發(fā)因素。另一種方法則依靠在固體支撐物表面 和被捕獲的抗體之間提供不穩(wěn)定的連接基團(tuán)。取決于該連接基團(tuán)的構(gòu)造，可使用若干種方 式來觸發(fā)不穩(wěn)定的組分。光和熱暴露是觸發(fā)不穩(wěn)定的連接基團(tuán)以釋放被捕獲抗體的可能手 段。也有可能通過使用對(duì)被捕獲抗體具有更高親和力的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑置換被捕獲細(xì)胞來釋 放它們。作為另一種選擇，可將靶標(biāo)全細(xì)胞在它們與磁性粒子連接情況下進(jìn)行裂解。為了有效測(cè)量細(xì)胞中的ATP，期望能有效率地將它提取而又不造成其降解。文獻(xiàn) 描述了許多不同的提取處理法。參見，例如，Karl D.M. ；Microbiology Review，44，739， 1980 ；Stanley, P. Ε. Methods inEnzymology，133，14，1986。最常用的提取劑之一為三氯乙 酸(TCA)。TCA可用于從細(xì)胞釋放ATP以及使存在于樣品基質(zhì)中的可導(dǎo)致ATP降解的酶失 活。通常的TCA濃度在0.5%至2. 5% (以體積計(jì))的范圍內(nèi)，但因?yàn)門CA可抑制熒光素 /熒光素酶反應(yīng)，通常采用最低所需濃度的TCA，該濃度仍能有效率地提取給定細(xì)胞靶標(biāo)的 ATP含量。提取后，通常通過加入適當(dāng)?shù)木彌_液(例如，Tris-醋酸鹽)來中和樣品，以獲得 大約7. 7的溶液pH。通過細(xì)胞裂解提取ATP也可以其他方式來完成。例如，裂解可在常規(guī)條件下例如5°C至42°C (可能高至50°C)的溫度，優(yōu)選在15°C至25°C的溫度下進(jìn)行。值得注意到是， 可使用未培養(yǎng)的細(xì)胞即直接的試驗(yàn)樣品進(jìn)行裂解，但也可使用經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。裂解可在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行物理裂解時(shí)發(fā)生。物理裂解可在將試驗(yàn)樣品與玻璃小珠一起 渦旋、對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行超聲處理、加熱和煮沸，或使試驗(yàn)樣品經(jīng)歷高壓時(shí)發(fā)生，例如在使用 弗氏細(xì)胞壓碎器時(shí)發(fā)生。也可使用裂解劑進(jìn)行裂解。合適的裂解劑包括例如酶(如，蛋白酶、糖苷酶、核酸 酶)。示例性的酶包括溶葡球菌酶、胃蛋白酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、溶菌酶、無色肽酶、 內(nèi)肽酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、內(nèi)- β -N-乙酰氨基葡糖苷酶、ALE-U DNA酶和 RNA酶。如果需要，可使用酶的各種組合。溶葡球菌酶尤其可用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的存 在的方法中。其他的裂解劑包括鹽(如離液鹽)、增溶劑(如，去污劑)、還原劑(如，β-巰基乙 醇(BME)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP ；Pierce Chemical Company，Rockford，IL)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)、酸(如，HCl)以及堿(如， NaOH)。這些裂解劑可能更適用于某些生物體，例如，相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌而言它們可更 適用于革蘭氏陰性菌。如果需要，可使用裂解劑和/或方法的各種組合。裂解方法在美國(guó)專利申請(qǐng)公布 No. 2005/0153370A1 中有進(jìn)一步論述。此外，如果需要，并且樣品為含粘液的樣品，可在裂解之前或之后用至少一種可包 括溶粘液劑的試劑對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步處理。用溶粘液劑處理含粘液的樣品可減少分析過程中 因粘液的存在引起的干擾。溶粘液劑的例子包括酶(如，胃蛋白酶、DNA酶、RNA酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、 糖苷酶)、鹽(如，離液鹽)、增溶劑(如，表面活性劑、去污劑)、還原劑(如，巰基乙醇 (BME)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、半胱氨酸、TCEP, N-乙酰半胱氨酸)和酸 (如，HCl)。如果需要，可使用這些溶粘液劑的各種組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解裂解劑和 溶粘液劑之間可以有重疊；不過不是所有裂解劑都例如是溶粘液的。在某些實(shí)施例中，如果樣品為含粘液的樣品，且溶粘液劑為還原劑，則可酸化該還 原劑(如，具有小于3的ρΗ)?？墒褂枚喾N酸例如無機(jī)酸(如HCl)或有機(jī)酸(如乳酸、檸檬 酸)將還原劑酸化。作為另一種選擇，如果以足夠高的濃度使用，則不需要用酸調(diào)節(jié)還原劑 的ρΗ。通常，但任選地，在加入還原劑后，樣品制備涉及使組合物中的還原劑失活。這可 (例如)通過提供競(jìng)爭(zhēng)性底物(例如，對(duì)N-乙酰半胱氨酸用牛血清白蛋白)來完成。使還 原劑失活的試劑的其他例子包括包含中和緩沖液的稀釋劑。中和緩沖液的代表性成分可包 括(例如)緩沖劑(如，磷酸鹽)、鹽(如，NaCl)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(如，BSA、酪蛋白、血清) 聚合物、糖和/或去污劑或表面活性劑(如，一種或多種以下的列有商品名和通常來源的 試劑ΝΙΝΑΤΕ 411 (燒基苯磺酸銨，購(gòu)自 St印an Co. , Northfield, IL)、ZONYL FSN 100 (具 有聚乙二醇的調(diào)聚物 B 單醚，購(gòu)自 Ε· I. DuPont de Nemours Co.), Aerosol OT 100% (琥 珀酸二辛酯磺酸鈉，購(gòu)自American Cyanamide Co.)、GER0P0NT-77 (N-油?；?N-甲基 ?；撬徕c，購(gòu)自 Rhodia Novacare)、BI0-TERGEAS-40 (烯烴(C14-C16)磺酸鈉，購(gòu)自 Stepan Co.)、STANDAPOL ES-I (十二烷基聚氧乙烯(1)硫酸鈉，購(gòu)自 Cognis Corp.，Ambler, PA)、TETR0NIC 1307 (乙二胺烷氧基化物嵌段共聚物，購(gòu)自BASF Corp.)、SURFYN0L 465、485和 104PG-50(均購(gòu)自 Air Products and Chemicals, Inc.)、IGEPAL CA210 (辛基酚乙氧基化 物，購(gòu)自Stepan Co.)、TRIT0NX-45、X-100和X-305 (辛基苯氧基聚乙氧基乙醇類，均購(gòu)自 The DowChemical Co.) ,SILffET L-7600 (聚二甲基硅氧烷甲基乙氧基化物，購(gòu)自Momentive Performance Materials, Inc.，Wilton, CT)、RH0DASURF0N-870 (聚乙氧基化(2)油醇， 購(gòu)自 Rhodia Novacare)、CREM0PH0REL(聚氧乙氧基化蓖麻油，購(gòu)自 BASF Corp.)、TffEEN 20和TWEEN80(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯和單油酸酯，二者均購(gòu)自Sigma-Aldrich Corp.)、BRIJ 35 (聚氧乙烯(23)十二 燒基醚，購(gòu)自 Sigma-Aldrich Corp.)、CHEMAL LA-9 (聚氧乙烯(9)月桂醇，購(gòu)自 PCCChemax，Piedmont, SC)、PLURONIC L64 (聚(氧乙 烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物，購(gòu)自BASF Corp.)、SURFACTANT IOG (對(duì)-壬基苯氧基聚(縮 水甘油)，購(gòu)自Arch Chemicals Inc.，Norwalk, CT)、SPAN 60 (單硬脂酸脫水山梨醇酯，購(gòu) 自 Sigma-Aldrich Corp.) ,CREM0PH0R EL(—種聚氧乙烯基化蓖麻油，購(gòu)自 Sigma-Aldrich Corp.))。如需要，也可用中和緩沖液調(diào)節(jié)樣品的pH。除還原劑外，或作為還原劑的替代，含粘液的樣品的樣品制備可包括使用一種或 多種表面活性劑或去污劑(例如在將樣品和酶裂解劑與溶粘液劑混合之后或同時(shí)使用)。 合適的表面活性劑可為非離子型的、陰離子型的、陽(yáng)離子型的或兩性離子型的。合適的例子 包括十二烷基硫酸鈉(SDS)和月桂基硫酸鈉(SLS)。如果需要，可使用表面活性劑的各種組
I=I O任選地，樣品制備方法可包括隨后使表面活性劑失活。這可通過(例如)提供競(jìng) 爭(zhēng)性底物來完成。使表面活性劑失活的其他例子包括使用試劑中和緩沖液，例如足以將溶 粘液試驗(yàn)樣品和表面活性劑的PH調(diào)節(jié)至至少為5的pH的緩沖液。優(yōu)選地，該緩沖液足以 將PH調(diào)節(jié)至不大于8。而且，如果一種或多種樣品制備試劑為酸性的，則優(yōu)選將隨后的包括所關(guān)注的被 分析物的組合物中和至7至7. 5或接近7. 2的pH。這可(例如)通過提供緩沖液和/或稀 釋劑來完成。本發(fā)明提供多種基于分析腺苷三磷酸(ATP)來分析樣品中所關(guān)注的細(xì)菌的方法。 這可直接或間接完成。ATP檢測(cè)可用作細(xì)菌負(fù)荷的指標(biāo)。在直接ATP測(cè)定法中，將具有結(jié)合的細(xì)菌細(xì)胞 的固體支撐物與樣品的其余部分(其可含有干擾性組分例如胞外ATP)分離之后，將細(xì)胞 裂解(可在存在磁性粒子的情況下完成)并與螢光素和螢光素酶接觸。然后可例如用光 度計(jì)檢測(cè)并且優(yōu)選測(cè)量所產(chǎn)生的生物發(fā)光，該生物發(fā)光的強(qiáng)度與被捕獲的細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量 成比例。該方法描述于(例如)McElroy，W. D.和 Deluca，Μ. A. ；Firefly and bacterial luminescence :Basic science and applications ；Journalof Applied Biochemistry, 第 5 卷，197, (1983),以及 Lundin, Α.禾口 Thore, Α. ；Analytical information obtainable by evaluation of the time course offirefIy bioluminescence in the assay of ATP ；Analytical Biochemistry，第66卷，47，(1975)。螢光素/螢光素酶制劑以及它們 在直接ATP測(cè)定法中的使用方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并可商購(gòu)獲得(例如，可購(gòu)自 Promega Corporation (Madison WI)的 ENLI TEN rLuc if erase/Luc iferinReagent,或可購(gòu) g Biotrace International (Bridgend UK)白勺 Clean—Triice gAqua—Trace) 。HM白勺SSA^"
16有(例如)0. 1毫克/升(mg/L)至10mg/L熒光素酶、15毫摩爾/升(mmol/L)至1000 (mmol/ L)，優(yōu)選 15mmol/L 至 100mmol/L(如，36mmol/L)D-螢光素以及諸如 MgCl2 (2. 5_25mmol) EDTA、BSA和pH 7緩沖液(更通常為ρΗ7· 8緩沖液)之類的物質(zhì)。
ATP的量與細(xì)菌和/或其特征性的胞內(nèi)內(nèi)容物的量的關(guān)系可通過使用校準(zhǔn)曲線容 易地進(jìn)行，所述校準(zhǔn)曲線通過使用已知量的靶標(biāo)細(xì)菌或其特征性的胞內(nèi)內(nèi)容物進(jìn)行該測(cè)定 法來產(chǎn)生并通過與其比較來估算未知量。對(duì)于優(yōu)選的方法，將產(chǎn)生每一定數(shù)量的細(xì)菌發(fā)出 的光的校準(zhǔn)曲線，并從其獲得每單位時(shí)間來自樣品中未知量的物質(zhì)的光輸出的讀數(shù)。螢光素酶反應(yīng)的速率決定發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度和衰減速率。因此，任何影響熒光素酶 反應(yīng)速率的環(huán)境變量也將影響發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度和時(shí)間上的穩(wěn)定性。例如，溫度將影響該系 統(tǒng)的酶反應(yīng)速率和發(fā)光輸出。在進(jìn)行該測(cè)定法時(shí)，期望保持溫度控制以獲得一致的結(jié)果。反應(yīng)的光輸出也將隨時(shí)間變化，所以期望了解該檢測(cè)體系的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以便確保 發(fā)光信號(hào)在其峰強(qiáng)度時(shí)得到測(cè)量。大多數(shù)的市售試劑被配制成可在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生更恒定 的光輸出以使這些動(dòng)力學(xué)效應(yīng)減至最低。螢光素酶反應(yīng)的化學(xué)環(huán)境也將影響所產(chǎn)生的發(fā)光。例如，在來源處的或由于ATP 檢測(cè)之前的樣品加工造成的污染樣品的表面活性劑和溶劑會(huì)改變預(yù)期的光輸出。因此，優(yōu) 選采取適當(dāng)?shù)目刂撇⒘私饪赡艽嬖谟诰唧w樣品類型中的對(duì)熒光素酶反應(yīng)的潛在干擾源。同 時(shí)，識(shí)別被分析樣品是否含有污染性ATP (即，非細(xì)菌ATP)也是重要的。盡管本文描述的樣 品制備將減少污染性ATP的量，但是也可采用對(duì)樣品的酶處理。例如，可在細(xì)胞捕獲前用腺 苷三磷酸雙磷酸酶降解不包含在細(xì)胞中的ΑΤΡ，以盡可能地使來自污染性ATP的背景信號(hào) 最小化?；旌鲜茿TP檢測(cè)中的另一變量。將試劑與所提取的ATP完全混合可得到最佳性能。而且，從靶標(biāo)細(xì)胞提取ATP需要的時(shí)間不僅取決于所使用的提取劑而且還取決于 靶標(biāo)細(xì)胞的類型。從某些細(xì)菌提取ATP可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間。大多數(shù)的ATP試劑會(huì)固有地 呈現(xiàn)ATP背景，不管它們的制備方法或純度如何。這一背景信號(hào)可影響可達(dá)到的靈敏度，因 此期望使用幾乎沒有背景ATP的試劑。熒光素酶/熒光素試劑系統(tǒng)也應(yīng)該包括熱穩(wěn)定劑以使它們的儲(chǔ)存壽命最大化。大 多數(shù)的市售熒光素酶/熒光素試劑被配制成熱穩(wěn)定的。在間接ATP測(cè)定法中，在將具有結(jié)合的細(xì)菌細(xì)胞的固體支撐物與樣品其余部分 (其可能含有干擾性組分例如胞外ATP)分離之后，將細(xì)胞裂解(可在存在磁性粒子的情況 下完成)并使裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通過任何存在的腺苷酸激酶有效產(chǎn) 生腺苷三磷酸(ATP)的條件下接觸。該方法在(例如)美國(guó)專利No. 5，798，214中有描述。 腺苷酸激酶的使用也可用于富集含ATP的樣品。與樣品混合的ADP的量?jī)?yōu)選足以提供在混合物中超過0.005mM，更優(yōu)選超過 0. OlmM,并且最優(yōu)選超過0. OSmM的ADP濃度。轉(zhuǎn)化步驟混合物中尤其優(yōu)選的ADP量為約 0. ImM。這可取決于ADP的純度高水平的ATP污染限制更高濃度的使用。實(shí)際可用的ADP 范圍為IOmM至0. ImM。有效產(chǎn)生ATP的條件包括存在摩爾濃度足以使得ADP向ATP的轉(zhuǎn)化率最大的鎂離 子。對(duì)于上面列出的優(yōu)選ADP濃度，在ADP向ATP轉(zhuǎn)化過程中懸浮液或溶液中優(yōu)選的鎂離 子濃度為ImM或更高，更優(yōu)選5mM或更高，并且最優(yōu)選IOmM或更高?？梢匀魏捂V鹽，但優(yōu)選乙酸鹽的形式提供鎂離子。實(shí)際可用的Mg2_的范圍為約0. ImM至約25mM。Mg2_的存在量可取決于ADP濃度等因素。由于鎂離子可引起ADP的不穩(wěn)定(就使得污染性腺苷酸激酶過早地將其轉(zhuǎn)化成 ATP而言)，優(yōu)選在使用前不將它們?cè)谌芤褐斜３衷谝黄穑瑑?yōu)選在即將使用前或在ADP轉(zhuǎn)化 步驟中將它們放在一起。由于腺苷酸激酶的活性需要鎂離子，在加入ADP前將這些鎂離子 和樣品混合在一起可能是優(yōu)選的。在要將這些試劑保持在一起的情況中，優(yōu)選將它們以凍 干形式保存以避免任何不穩(wěn)定作用。有效產(chǎn)生ATP的條件包括將裂解物與ADP和鎂離子溫育能有效將ADP轉(zhuǎn)化為ATP 的一段時(shí)間。上文對(duì)直接ATP測(cè)定法討論的條件和考慮因素可類似地應(yīng)用于間接ATP測(cè)定法?？蓹z測(cè)所產(chǎn)生的ATP，并優(yōu)選的是，可測(cè)量所產(chǎn)生ATP的量，并將與細(xì)菌或其特征 性胞內(nèi)內(nèi)容物的存在和/或量關(guān)聯(lián)。這可如下進(jìn)行使用熒光素酶/熒光素試劑產(chǎn)生與所 產(chǎn)生ATP的量成比例的光，并用光度計(jì)以與直接ATP測(cè)定法中相同的方式檢測(cè)光。熒光素/ 熒光素酶制劑及它們的使用方法在上文對(duì)直接ATP測(cè)定法作了描述。優(yōu)選的實(shí)施例涉及在 溫育開始時(shí)向樣品添加熒光素/熒光素酶發(fā)光測(cè)定試劑，優(yōu)選作為與ADP和鎂離子源一起 的單一試劑添加。這一實(shí)施例通常使用高純度的熒光素酶試劑。在其中所有的試劑在ADP 向ATP轉(zhuǎn)化開始時(shí)以該方式加入，和/或其中光度計(jì)計(jì)數(shù)在加入熒光素/熒光素酶(這為單 獨(dú)的步驟)之后持續(xù)進(jìn)行的本發(fā)明實(shí)施例中，可通過熒光素/熒光素酶試劑提供鎂。然而， 由于熒光素酶和EDTA對(duì)鎂離子的結(jié)合，通常通過預(yù)先試驗(yàn)或計(jì)算肯定地保證鎂離子的量。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，要加至給定ADP樣品和熒光素/熒光素酶混合物的最佳鎂鹽量， 可通過使用含有可籍以獲得最大信號(hào)的已知細(xì)菌量的樣品進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)而輕易測(cè)定。在示例性實(shí)施例中，可使用一種并且有利的是兩種抗體捕獲和分離細(xì)菌，并進(jìn)行 分析。所分離的細(xì)菌可在選擇性富集肉湯中富集并洗滌以移除未結(jié)合的物質(zhì)。將含有裂解 試劑(如溶葡球菌酶)和腺苷二磷酸的試劑加到洗滌過的樣品中。裂解的細(xì)胞釋放出可催 化ADP向ATP的反應(yīng)的腺苷酸激酶。然后，將熒光素和熒光素酶添加至樣品，在存在ATP的 情況下發(fā)光。本發(fā)明還提供用于實(shí)施本發(fā)明各種方法的試劑盒或系統(tǒng)。在一個(gè)具體的實(shí)施例 中，試劑盒將包括例如(1)樣品采集裝置(例如美國(guó)專利No. 5,879, 635中描述的裝置)； (2)磁性小珠；(3)將該小珠從樣品分離的磁體；(4)樣品制備溶液(例如，用于除去非特異 吸附的細(xì)胞和其他干擾性物質(zhì)的洗滌溶液，用于提取ATP的裂解劑/提取劑)，在例如用于 將它們進(jìn)行遞送的適當(dāng)移液管或試劑瓶中；(5)熒光素酶/熒光素試劑，在例如用于將它們 進(jìn)行遞送的適當(dāng)移液管或試劑瓶中；以及(6)讀取光輸出的光度計(jì)。本發(fā)明提供以下示例性實(shí)施例1. 一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，所述方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被 分析物；提供對(duì)所述特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一 種或多種抗體，其中所述抗體選自MAb-76、MAb-10 7、親和純化的RxC 1 f40、親和純化的 GxClf40,MAb 12-9、它們的片段以及它們的組合；
提供包含磁性粒子的固體支撐物材料；使所述樣品、所述固體支撐物材料和所述一種或多種抗體之間在如果存在具有特 定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話能有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條 件下接觸；
從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；以及通過直接或間接分析所述裂解物的ATP來分析所述特定細(xì)菌是否存在。2.實(shí)施例1的方法，其中所述一種或多種抗體連接至所述固體支撐物材料而形成 被分析物結(jié)合性材料，并且所述方法包括使所述樣品和所述被分析物結(jié)合性材料之間在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的 一種或多種被分析物的全細(xì)胞的話能有效捕獲所述全細(xì)胞的條件下接觸。3.實(shí)施例2的方法，其中提供所述樣品和所述被分析物結(jié)合性材料之間的接觸包 括所述樣品與所述一種或多種抗體之間的同時(shí)接觸。4.實(shí)施例1的方法，其中提供所述樣品、所述固體支撐物材料和所述一種或多種 抗體之間的接觸包括提供所述一種或多種抗體和所述樣品之間的接觸以形成結(jié)合抗體的 全細(xì)胞，并隨后提供所述抗體結(jié)合的全細(xì)胞和所述固體支撐物材料之間的接觸。5.實(shí)施例1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述特定細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。6.實(shí)施例5的方法，其中所述特定細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌。7.實(shí)施例1至6中任一項(xiàng)的方法，其中至少20%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲。8.實(shí)施例7的方法，其中至少50%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲。9.實(shí)施例8的方法，其中至少80%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲。10.實(shí)施例1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支撐物材料包含濃度大于 0. 04mg/mL 的粒子。11.實(shí)施例1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支撐物材料包含粒子并且所述 抗體與所述粒子的比率大于ι μ g/mg粒子。12.實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支撐物材料包含粒子并且所述 抗體與所述粒子的比率為至少0. 01 μ g/mg粒子。13.實(shí)施例12的方法，其中所述抗體與所述粒子的比率小于10 μ g/mg粒子。14.實(shí)施例1至13中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)粒子具有設(shè)置在其上的結(jié)合不同被 分析物的至少兩種抗體。15.實(shí)施例1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶標(biāo)全細(xì)胞在裂解前從所述磁性粒 子移除。16.實(shí)施例1至15中任一項(xiàng)的方法，其中通過直接或間接分析ATP來分析是否存 在所述特定細(xì)菌包括使所述裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在能有效通過任何存在的腺苷酸 激酶產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)的條件下接觸；以及檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在。17.實(shí)施例16的方法，其中檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在包括測(cè)量所產(chǎn)生的腺苷三 磷酸(ATP)的量并將其與特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/或量關(guān)聯(lián)。18.實(shí)施例16或?qū)嵤├?7的方法，其中檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在包括使含有所 述裂解物和ADP的混合物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與所產(chǎn)生的ATP的量成比例 的光，以及用光度計(jì)檢測(cè)所述光。19.實(shí)施例16至18中任一項(xiàng)的方法，其中所述有效產(chǎn)生ATP的條件包括存在足以 使得ADP向ATP的轉(zhuǎn)化率最大的摩爾濃度的鎂離子。20.實(shí)施例19的方法，所述有效產(chǎn)生ATP的條件包括將所述裂解物與所述ADP和 所述鎂離子溫育將ADP有效轉(zhuǎn)化成ATP的一段時(shí)間。21.實(shí)施例1至15中任一項(xiàng)的方法，其中通過直接或間接分析ATP來分析所述特 定細(xì)菌是否存在包括使所述裂解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光； 以及用光度計(jì)檢測(cè)所述光。22.實(shí)施例21的方法，其中分析所述特定細(xì)菌是否存在還包括測(cè)量ATP的存在量 并將其與細(xì)菌或胞內(nèi)物質(zhì)的存在量關(guān)聯(lián)。23. 一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，該方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被 分析物；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)所述特定細(xì)菌特 征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自 MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12_9、它們的片段以及它 們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效 捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述樣品、所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒 子之間的接觸；從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物并且如果 存在腺苷三磷酸(ATP)的話釋放出ATP ；使所述裂解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光；用光度計(jì)檢測(cè)所述光；以及測(cè)量ATP的存在量并將其與所述特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的
存在量關(guān)聯(lián)。24. 一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，所述方法包括 提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被 分析物；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)所述特定細(xì)菌特 征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自 MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12_9、它們的片段以及它 們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述樣品、所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒 子之間的接觸；從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；
裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；使所述裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通過任何存在的腺苷酸激酶有 效產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)的條件下接觸；以及測(cè)量所產(chǎn)生的腺苷三磷酸的量并將其與所述 特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的量關(guān)聯(lián)。25.實(shí)施例1至24中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支撐物材料包括連接有兩種或 更多種抗體的磁性粒子，所述抗體對(duì)所述特定細(xì)菌特征性的兩種或更多種獨(dú)特被分析物具 有抗原特異性。SM現(xiàn)已結(jié)合發(fā)明人所預(yù)見的、給出了操作性描述(enabling description)的若干具 體實(shí)施例描述了本發(fā)明。本發(fā)明的非實(shí)質(zhì)修改形式，包括非當(dāng)前所預(yù)見的修改形式，仍可構(gòu) 成其等同物。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)受本文所述的細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)的限制，而是僅受以下權(quán)利 要求書和其等同物的限制。除非另外指明，否則實(shí)例以及說明書其余部分中的所有份數(shù)、百分?jǐn)?shù)、比率等均以 摩爾計(jì)。所有未指明供應(yīng)商的溶劑和試劑均購(gòu)自Aldrich Chemical (Milwaukee, WI) ο水是 用電阻系數(shù)為 18. 2Mohms/cm 的 U-V Milli-Q 純水器(Millipore，Bedford ΜΑ)進(jìn)行純化?？s寫表
縮寫或商品名 __說明_
ATCC _美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心_
ATP_腺苷三磷酸_
PBS緩沖液 將商購(gòu)自EMD Biosciences (San Diego, CA)的IOx PBS濃縮液稀
__釋十倍所制備的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液_
PBSL64緩沖液 取PBS緩沖溶液并加入0.2%(w/v)的PLURONICL64制備而成 PLURONIC L64 | 購(gòu)自 BASF Corporation (Mount Olive，NJ)的表面活性劑的商品名制備實(shí)例1-抗體官能化磁件小珠的制備鼠抗A蛋白單克隆抗體MAb-107在于2006年11月22日提交的美國(guó)專利申請(qǐng) 系列號(hào) 11/562，747 和 PCT 專利公布 No. WO 2008/143697 ( 二者標(biāo)題均為 “ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY”(具有A蛋白選擇性的抗體))中有描述。將鼠抗A蛋白單克隆抗 體MAb-107用得自Pierce的EZ-Link NHS-PE04-生物素(產(chǎn)品編號(hào)21330)按照生產(chǎn)商的說 明書進(jìn)行生物素?；ｆ溍箍股锼氐鞍装坏拇判粤Ｗ?lym Dynal Tl)從Invitrogen， Inc. (Carlsbad,CA)獲得。除非另外指明，否則所有反應(yīng)和洗滌均在PBS L-64緩沖液(含 0.2%w/v PLUR0NICL64的磷酸緩沖鹽水)中進(jìn)行。洗滌步驟包括三次連續(xù)的洗滌，除非另 外指明。洗滌過程包括將磁體靠近管子放置，以將粒子吸到管子靠近磁體的一側(cè)，將液體從有磁體靠近的管子中移除，然后加入等體積的新鮮緩沖液代替被移除的液體。移除磁體，讓 粒子重懸和混合。將濃度為2. 5毫克/毫升(mg/mL)的鏈霉抗生物素蛋白包被磁性粒子與生物素酰 化的抗體制品在500微升(yL)PBS L-64緩沖液中混合?？贵w與用于綴合的粒子的質(zhì)量比 為40 μ g抗體/mg粒子。將所得的混合物在37°C下溫育1小時(shí)。隨后，將粒子在PBSL-64 緩沖液中洗滌，以除去未結(jié)合的抗體。最后一次洗滌后，將粒子重懸成2. 5mg/mL的粒子濃度。
制各實(shí)例2-含PLURONIC L64 _沖劑的磷酸_沖鹽水(PBS-L64 _沖液)的制各通過將IOx PBS濃縮液(商購(gòu)自EMD Biosciences (San Diego CA))稀釋十倍制 備磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液。這得到具有以下鹽組成的PBS緩沖溶液10mM磷酸鈉、137mM 氯化鈉、2. 7mM氯化鉀。該P(yáng)BS緩沖液25°C時(shí)pH為7. 5。為了制備含PLURONIC L64溶液 的磷酸緩沖鹽水(PBS-L64緩沖液)，將0. 2% (w/v) PLURONIC L64表面活性劑(購(gòu)自BASF Corporation, (Mount Olive, NJ))加入 PBS 緩沖液中。該 PBS-L64 緩沖液 25°C 時(shí) pH 為 7. 5。狐糊3- ■細(xì)賄膽_丨1金黃色葡萄球菌可以商品名ATCC 25923從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (Rockville,MD)獲得。使細(xì)菌生長(zhǎng)于通過用細(xì)菌接種5_10毫升制備的無菌胰酶大豆肉湯 (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA)而制備的過夜(37°C下 17-22 小時(shí))肉湯培養(yǎng)物 中。培養(yǎng)物通過在 Eppendorf 型號(hào) 5804R 離心機(jī)(Brinkman Instruments, ffestbury, NY) 中離心(8，000-10，OOOrpm) 15分鐘進(jìn)行洗滌，然后重懸于PBS L64緩沖液中并通過用這個(gè) 溶液另外離心3個(gè)循環(huán)進(jìn)行洗滌。艦糊4-表·■輔膽_丨1表皮葡萄球菌可以商品名ATCC 12228從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville， MD)獲得。使細(xì)菌生長(zhǎng)于通過用細(xì)菌接種5-10毫升制備的無菌胰酶大豆肉湯(Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA)而制備的過夜(37°C下17-22小時(shí))肉湯培養(yǎng)物中。培養(yǎng) 物通過在 Eppendorf 型號(hào) 5804R 離心機(jī)(Brinkman Instruments, ffestbury, NY)中離心 (8，000-10，OOOrpm) 15分鐘進(jìn)行洗滌，然后重懸于PBS L64緩沖液中并通過用這個(gè)溶液另 外離心3個(gè)循環(huán)進(jìn)行洗滌。制備實(shí)例5-裂解溶液的制備通過在攪拌下將IOOmg的溶葡球菌酶(目錄號(hào)L-4402，Sigma-Aldrich)溶解于 IOmL PBS L64緩沖液得到含10 μ g/mL濃度的溶葡球菌酶的裂解溶液，來制備裂解緩沖液。實(shí)例1-6-響應(yīng)金黃餼葡萄球菌檢測(cè)的樣品檢測(cè)金黃色葡萄球菌的測(cè)定法如下進(jìn)行(1)將十六(16) μ L的用MAb 107抗體官能化的磁性小珠懸液(如制備實(shí)例1中 制備)加入聚丙烯微量離心管(購(gòu)自VWR Scientific,West Chester PA)。向所述微量離 心管加入484 μ L的給定濃度(報(bào)告于表1)的于PBS-L64緩沖液(如制備實(shí)例2和3中制 備)中的金黃色葡萄球菌懸液。所得混合物用Barnstead LabQuake搖動(dòng)器(購(gòu)自Barnstead International, Dubuque ΙΑ)在搖動(dòng)攪動(dòng)下于室溫下溫育15分鐘。(2)然后通過將該微量離心管放在Dynal磁性固定裝置(獲自Invitrogen，Inc.Carlsbad, CA)中至少5分鐘，對(duì)小珠進(jìn)行分離和集中。在不破壞聚集的小珠的情況下用微 量移液器吸取上清液并棄去。(3)然后通過向管中加入0. 5mL PBS-L64緩沖液并以搖動(dòng)運(yùn)動(dòng)攪動(dòng)5分鐘，將小珠 進(jìn)行洗滌。然后將微量離心管放在Dynal磁性固定裝置中至少5分鐘，對(duì)小珠再次進(jìn)行分 離和集中。在不破壞聚集的小珠的情況下用微量移液器吸取洗滌溶液并棄去。再一次重復(fù) 這個(gè)洗滌步驟。(4)將一百(100) μ L的溶葡球菌酶溶液(如制備實(shí)例5中制備)加至洗滌過的磁 性小珠。然后將該微量離心管旋渦混合10秒，讓其靜置5分鐘。(5)然后將微量離心管放在Dynal磁性固定裝置中至少5分鐘，對(duì)小珠再次進(jìn)行 分離和集中。然后，在移出拭子和移除BiotraceAqua-Trace測(cè)試裝置的裝有粒狀裂解劑的 底室的密封箔之后，用微量移液器將所有的上清液(IOOyL)吸取至該底室中。Biotrace 裝置的底室裝有通過螢光素酶生物發(fā)光測(cè)定ATP的存在所需的所有干燥試劑(熒光素酶/ 熒光素和穩(wěn)定劑)。將樣品旋渦混合10秒并在向Biotrace裝置加入步驟(4)的上清液后 三十秒內(nèi)置于Biotrace光度計(jì)(UniLiteNG)中。每個(gè)樣品的生物發(fā)光響應(yīng)以相對(duì)發(fā)光單 位(RLU)在表1中報(bào)道。三次重復(fù)試驗(yàn)的平均RLU在表1中報(bào)道。表1還示出了所報(bào)道的 RLU值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。該表示出了使用相同的官能化磁性小珠的兩種不同制品的兩次試 驗(yàn)的結(jié)果。在實(shí)例1-3中，使用在4°C下保存了五個(gè)月的小珠制品，而實(shí)例4-6顯示了使用 新鮮制備的小珠溶液得到的結(jié)果。兩個(gè)試驗(yàn)僅在最高的受試金黃色葡萄球菌濃度下具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)上顯著的差異。這表明，新鮮制備的小珠溶液比已保存五個(gè)月的小珠溶液更有效地捕 獲細(xì)菌。通過捕獲后對(duì)小珠進(jìn)行接種和培養(yǎng)獨(dú)立地驗(yàn)證該兩個(gè)批次的小珠溶液的捕獲效 率，顯示新鮮制備溶液的捕獲效率為總細(xì)菌濃度(106CfU/ml)的大約80%，而保存過的溶液 具有大約60%的捕獲效率。這些實(shí)例證明了能夠檢測(cè)一定范圍濃度的靶標(biāo)生物體，檢測(cè)限 低至 10000cfu/mL。表 1.
權(quán)利要求
一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，所述方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述靶標(biāo)全細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物；提供對(duì)所述特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自MAb 76、MAb 107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12 9、它們的片段以及它們的組合；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料；使所述樣品、所述固體支撐物材料和所述一種或多種抗體之間在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下接觸；從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；以及通過直接或間接分析所述裂解物的ATP來分析所述特定細(xì)菌是否存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種抗體連接至所述固體支撐物材料 形成被分析物結(jié)合性材料，并且所述方法包括在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的全細(xì)胞的話有效捕獲所述 全細(xì)胞的條件下，提供所述樣品和所述被分析物結(jié)合性材料之間的接觸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中提供所述樣品和所述被分析物結(jié)合性材料之間的 接觸包括所述樣品與所述一種或多種抗體之間的同時(shí)接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中提供所述樣品、所述固體支撐物材料和所述一種 或多種抗體之間的接觸包括提供所述一種或多種抗體和所述樣品之間的接觸以形成結(jié)合 抗體的全細(xì)胞，并隨后提供所述結(jié)合抗體的全細(xì)胞和所述固體支撐物材料之間的接觸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述特定細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述特定細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)0
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少20%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕-M-犾。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中至少50%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中至少80%的所述靶標(biāo)全細(xì)胞被捕獲。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固體支撐物材料包含濃度大于 0. 04mg/mL 的粒子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固體支撐物材料包含粒子并 且所述抗體與粒子的比率大于ι μ g/mg粒子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固體支撐物材料包含粒子并 且所述抗體與粒子的比率為至少0. 01g/mg粒子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述抗體與粒子的比率小于10μ g/mg粒子。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中每個(gè)粒子具有設(shè)置在其上的結(jié)合 不同被分析物的至少兩種抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶標(biāo)全細(xì)胞在裂解前從所述磁性粒子移除。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過直接或間接分析ATP來分析 所述特定細(xì)菌是否存在包括使所述裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通過任何存在的腺苷酸激酶有效產(chǎn) 生ATP的條件下接觸；以及檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在包括測(cè)量所產(chǎn)生的 腺苷三磷酸(ATP)的量并將其與特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/或量關(guān)聯(lián)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中檢測(cè)所產(chǎn)生的ATP是否存在包括使含有所 述裂解物和ADP的混合物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與所產(chǎn)生的ATP的量成比例 的光，以及用光度計(jì)檢測(cè)所述光。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效產(chǎn)生ATP的條件包括存 在足以使得ADP向ATP的轉(zhuǎn)化率最大的摩爾濃度的鎂離子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，所述有效產(chǎn)生ATP的條件包括將所述裂解物與所述 ADP和所述鎂離子溫育將ADP有效轉(zhuǎn)化成ATP的一段時(shí)間。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過直接或間接分析ATP來分析 所述特定細(xì)菌是否存在包括使所述裂解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光；以及 用光度計(jì)檢測(cè)所述光。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中分析所述特定細(xì)菌是否存在還包括測(cè)量ATP的 存在量并將其與所述特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在量關(guān)聯(lián)。
23.一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，所述方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述靶標(biāo)全細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種 被分析物；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)所述特定細(xì)菌特 征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自 MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12_9、它們的片段以及它 們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲 所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述樣品、所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒子之 間的接觸；從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物，并且如果存在腺苷三磷酸(ATP)的話釋放ATP; 使所述裂解物與熒光素酶/熒光素試劑接觸以產(chǎn)生與ATP的存在量成比例的光； 用光度計(jì)檢測(cè)所述光；以及測(cè)量ATP的存在量并將其與所述特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi)物質(zhì)的存在量關(guān)聯(lián)。
24.一種分析樣品中的細(xì)菌的方法，所述方法包括提供疑似包括靶標(biāo)全細(xì)胞的樣品，所述靶標(biāo)全細(xì)胞包含特定細(xì)菌特征性的一種或多種 被分析物；提供包含磁性粒子的固體支撐物材料，所述磁性粒子上連接有對(duì)所述特定細(xì)菌特 征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，其中所述抗體選自 MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb 12_9、它們的片段以及它 們的組合；在如果存在具有特定細(xì)菌特征性的一種或多種被分析物的靶標(biāo)全細(xì)胞的話有效捕獲 所述靶標(biāo)全細(xì)胞的條件下，提供所述樣品和所述連接有所述一種或多種抗體的磁性粒子之 間的接觸；從所述樣品分離捕獲的靶標(biāo)全細(xì)胞；裂解所述靶標(biāo)全細(xì)胞以形成裂解物；使所述裂解物與含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通過任何存在的腺苷酸激酶有效產(chǎn) 生腺苷三磷酸(ATP)的條件下接觸；以及測(cè)量所產(chǎn)生的腺苷三磷酸的量并將其與所述特定細(xì)菌或所述特定細(xì)菌特征性的胞內(nèi) 物質(zhì)的量關(guān)聯(lián)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固體支撐物材料包含連接有 兩種或更多種抗體的磁性粒子，所述抗體對(duì)所述特定細(xì)菌特征性的兩種或更多種獨(dú)特被分 析物具有抗原特異性。 全文摘要
本發(fā)明涉及捕獲細(xì)菌全細(xì)胞的方法，所述方法包括使用對(duì)特定細(xì)菌特征性的一種或多種獨(dú)特被分析物具有抗原特異性的一種或多種抗體，然后用直接或間接ATP測(cè)定法分析靶標(biāo)全細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101952729SQ200980105955
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者G·馬爾科·博馬里托, 希瑟·M·韋伯, 帕特里克·A·馬赫, 斯里達(dá)爾·V·達(dá)薩拉塔, 瑪拉·S·賴夫-溫納, 約瑟夫·J·斯托費(fèi)爾, 賈森·W·比約克, 郭春梅 申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司