專利名稱：用于非常規(guī)可傳播因子的體外檢測和/或滴定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于非常規(guī)可傳播因子(NCTA)相關(guān)感染性的體外測定的方法及其應(yīng) 用，特別是用在體外評估和/或監(jiān)測用于獲得或處理生物學(xué)樣品的方法的有效性的方法 中，或用在消除污染步驟的體外評估和/或監(jiān)測方法中，或用在體外評估化合物調(diào)節(jié)NCTA 相關(guān)感染性的能力的方法中。
背景技術(shù)：
可傳播海綿狀腦病(TSE)將許多以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)退化為特征的遺傳性或獲 得性疾病合并為一組。在人類中最常見的形式是克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease) (CJD)，但是TSE也存在于許多哺乳動物中(特別是綿羊中的瘙癢病和牛海綿狀腦病)。這 些疾病的病原因子被分類在“非常規(guī)可傳播因子”(NCTA)類別中。疾病的標(biāo)志是存在被稱 為朊病毒蛋白(PrP)的細(xì)胞外蛋白，該蛋白在疾病過程中被轉(zhuǎn)變成對蛋白酶例如蛋白酶K 具有抗性的不溶形式，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累。這種被稱為PrPsc的病理學(xué)異常形式的 PrP與感染性共純化，并且其積累在時間上先于組織學(xué)病變的出現(xiàn)。它源于PrP朊病毒蛋白 構(gòu)象的改變。已經(jīng)證實編碼PrP的基因表達(dá)沒有改變，其翻譯也沒有任何損傷(Prusiner， Biochemistry 1992 ；31 ；12277-88) 目前可以獲得的數(shù)據(jù)還不能證明在血液衍生物中發(fā)現(xiàn)了感染形式的造成TSE的 可傳播因子(Brown et al. ,2001, Semin Hemato 1. ；38(4Suppl 9) :2_6)。但是，不能做出它不存在的結(jié)論，這種不確定性首先是由于血液中可能非常低的 濃度，其次是由于這些疾病在臨床征兆出現(xiàn)之前特征性的非常長的無臨床癥狀潛伏期。此外，NCTA不尋常的抗性阻止了對常規(guī)使用的失活方法例如吐溫-TNBP溶劑/去 污劑處理的依靠，所述處理方法已被證明能夠有效降低血液衍生物例如低溫沉淀血漿蛋白 (因子VIII，von Willebrand因子等)的病毒載量。因為考慮到治療性應(yīng)用，生物學(xué)樣品 例如血漿凝結(jié)蛋白的獲得或治療應(yīng)該包括病毒消除/失活步驟，因此制造血液衍生藥物的 制藥工業(yè)如今正在設(shè)法評估變體CJD通過血液衍生制品傳播的理論風(fēng)險。目前，常規(guī)使用的用于NCTA相關(guān)感染性的滴定方法通過腦內(nèi)注射各種稀釋度的 載有NCTA的測試產(chǎn)品使用體外滴定方法(例如金色倉鼠用于滴定與263k毒株相關(guān)的感染 性)。根據(jù)對應(yīng)于所執(zhí)行的稀釋的各種不同組中受感染動物的數(shù)量，有可能計算出感染性 滴度并在未治療參照組的基礎(chǔ)上建立起給定方法的降低系數(shù)。但是，這種方法具有時間長 (約1年)、昂貴以及相對來說與需要盡可能快地獲得朊病毒消除效率相關(guān)結(jié)果的工業(yè)規(guī)模 開發(fā)不相容的缺點。此外，為了增加滴定方法的靈敏度，通常需要引入濃縮感染性因子的步驟。目前所 有用于濃縮造成TSE的感染性因子的步驟都包括PrPsc的純化。已經(jīng)提出了用于TSE感染性因子的體外滴定的其他方法。通過 Western 印跡法(MacGregor, Transfusion J. Medicine 2001 ；11, 3-14)或 通過ELISA檢測PrPsc的技術(shù)一般需要用蛋白酶K預(yù)先消化待分析樣品或用離液劑進行變性，以便將病理性蛋白(PrPsc)與正常蛋白(PrP)區(qū)分開。最近，基于使用不識別PrP的PrPsc特異性抗體，已經(jīng)開發(fā)出另一種滴定方法 (Korth 等，Nature 1997 Nov 6，390 (6655) ；74-7) 美國專利6，150，583在其一部分中，描述了表達(dá)用異源表位標(biāo)記的PrP的轉(zhuǎn)基因 動物的生產(chǎn)，所述異源表位根據(jù)朊病毒蛋白的構(gòu)象而暴露或不暴露在朊病毒蛋白的表面 上。文件WO 2005/022148描述了被稱為“TCIA”(“組織培養(yǎng)物感染力測定法”)的生物 制品中NCTA的體外滴定方法，所述方法為將耐受所述NCTA復(fù)制的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與生 物制品相接觸，然后將這些細(xì)胞培養(yǎng)一代或多代，以便通過NCTA的復(fù)制擴增生物制品中存 在的NCTA的量。更具體來說，TCIA包括將感染性勻漿液(瘙癢病毒株127-S)的連續(xù)稀釋液 與多孔板上培養(yǎng)的細(xì)胞，以每個稀釋度5個孔的比例進行接觸。然后通過在8到10代后檢 測PrPsc (與感染性不可分離的標(biāo)志物)來評估陽性細(xì)胞的數(shù)量，并通過Spearman-Karber 方法確定滴度。在Saborio 等的文獻(Nature ；2001，411，810-3)中描述的被稱為 “PMCA”(蛋白 錯折疊循環(huán)擴增)的方法，在其一部分中設(shè)想了將源于來自被污染動物的組織或流體的病 理形式與非病理形式的NCTA蛋白相接觸，以便將后者轉(zhuǎn)變成病理形式。但是，TCIA和PMCA方法具有缺點。因此，對于日常應(yīng)用來說，體外TCIA滴定方法 仍被證明是長時間的(10周)。此外，在目前，它的靈敏度略低于包含實驗室動物感染的生 物測定法。PMCA方法盡管仍在開發(fā)中，但已發(fā)現(xiàn)至少與生物測定法同樣靈敏。但是，它不提 供與被檢測PrPsc相關(guān)的感染性方面的任何證據(jù)，并被證明難以使用血漿基質(zhì)來進行。此 外，不確定的可重復(fù)性和假陽性結(jié)果也已被報道(TSE meeting, Cambridge Healthtech Institute's 12thannual，2008 Feb 11-12)。因此，對于開發(fā)工業(yè)規(guī)模上適用的、用于確定 感染性的方法，仍存在極大需求，所述方法具體來說可重復(fù)，與各種不同基質(zhì)(例如血液 衍生物)相容，靈敏(具有與生物測定法相當(dāng)?shù)撵`敏度)，并且相對快速。發(fā)明簡述現(xiàn)在，本發(fā)明提供了改進的體外方法，用于樣品中非常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作 為NCTA相關(guān)感染性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的體外檢測和/或滴定。本發(fā)明的方法包括在 體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，在培養(yǎng)的細(xì)胞中或在其表面上復(fù)制或繁殖樣品中存在的NCTA，然后 重復(fù)地與允許NCTA或病理構(gòu)象蛋白擴增的底物溫育，然后確定樣品中NCTA或病理構(gòu)象蛋 白的存在和/或量。本發(fā)明人事實上已經(jīng)證實，通過將源自于細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物與用于病理構(gòu)象蛋白和 /或NCTA的底物源(對于底物來說含有例如PrP是可能的)混合，將這種底物轉(zhuǎn)變成能夠 被檢測和定量的病理構(gòu)象蛋白(PrPsc)和/或NCTA是可能的。更具體來說，本發(fā)明涉及用于樣品中非常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作為NCTA感染 性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的體外檢測和/或滴定的體外方法，所述方法包括下列步驟i)將所述樣品與耐受NCTA復(fù)制或繁殖的細(xì)胞相接觸，ii)培養(yǎng)所述細(xì)胞以便復(fù)制或繁殖所述樣品中存在的NCTA，iii)將NCTA與用于病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的底物源相接觸并溫育，通過其擴增了病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的量，iv)將可能形成的聚集物解聚，ν)確定樣品中病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的存在和/或量，步驟(iii)和(iv)構(gòu)成了一個操作循環(huán)，在步驟(ν)之前該循環(huán)被重復(fù)至少兩 次。優(yōu)選情況下，樣品選自血液制品及其衍生物、食品和美容用品。本發(fā)明還涉及對用于獲得或處理可能被NCTA污染的生物制品或材料的過程進行 評估和/或監(jiān)測的體外方法，在所述方法中，在所述過程的(A)上游和(B)下游對所述生物 制品或材料施用了如上定義的滴定方法，并對獲得的兩個滴定值(A)和(B)進行比較。本發(fā)明的另一個主題涉及對用于去除生物制品或材料污染物的步驟進行評估和/ 或監(jiān)測的體外方法，在所述方法中，在所述步驟的(A)上游和(B)下游對所述生物制品或材 料施用了如上定義的滴定方法，并對獲得的兩個滴定值(A)和(B)進行比較。本發(fā)明的另一個主題是用于在人類或非人類動物個體中診斷可傳播海綿狀腦病 的體外方法，所述方法包括在來自所述個體的生物學(xué)樣品中，利用如上定義的方法檢測非 常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作為NCTA感染性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的存在。最后，本發(fā)明的另一個主題是用于對化合物調(diào)節(jié)(即抑制或增加)NCTA的感染性 或復(fù)制或繁殖的能力進行評估的體外方法。本發(fā)明的檢測方法使得有可能檢測到由現(xiàn)有技術(shù)的已知方法、包括被當(dāng)作參比方 法的生物測定方法所能檢測到的至少相當(dāng)?shù)腘CTA量。此外，它使得有可能比現(xiàn)有技術(shù)的已 知方法更快地獲得結(jié)果。


圖是凝膠的放射自顯影照片，顯示了利用本發(fā)明的方法檢測PrPse。各個道如下1 分子量標(biāo)準(zhǔn)品2到12 用LN-3326接種并分別從第1到第10代收獲的細(xì)胞的裂解液13 用LN-3777接種的細(xì)胞的裂解液(健康腦勻漿液)14 稀釋IO6倍的被感染腦(LN-3326)的勻漿液。發(fā)明詳述定義在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“NCTA”表示任何非常規(guī)可傳播因子，例如在人類中造 成家族性或散發(fā)性CJD、庫魯病或變體CJD的可傳播因子，或可替選地在動物中造成天然 TSE例如羊瘙癢癥、?；蜇埡＞d狀腦病、鹿的慢性消耗性疾病或水貂的海綿狀腦病的非常規(guī) 可傳播因子，或最后在實驗上適應(yīng)于實驗動物的TSE毒株。本文中的術(shù)語“PrPsc”是指朊 病毒病理構(gòu)象蛋白(或病理性構(gòu)象子(conformer))。PrP的“病理”形式是其構(gòu)象與被感 染人類或非人類動物中TSE的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的蛋白形式。在本發(fā)明的上下文中，NCTA也用術(shù)語“感染性因子”表示。利用本發(fā)明的方法滴定 的NCTA優(yōu)選為羊、牛、鼠、倉鼠、鹿、靈長動物或人類來源的。優(yōu)選情況下，NCTA可以是病理 構(gòu)象蛋白自身。術(shù)語“樣品”表示任何可能被NCTA污染的材料來源。這樣的材料來源可以是例如液體、食品、飲料、美容用品或源自于遺傳工程的產(chǎn)品、能夠抑制NCTA感染性的分子，該名 單不是限制性的。優(yōu)選情況下，它是生物學(xué)樣品，例如生物學(xué)流體或組織或組織提取物。在 組織的情況下，本發(fā)明的方法可以在勻漿液上或直接在離體樣品上進行。這樣的組織可以 是腦組織、脊柱組織或扁桃腺組織，該名單不是限制性的。樣品也可以是源自于人類或動物 來源的組合物，例如生長激素或細(xì)胞提取物，例如垂體提取物。這樣的組合物事實上能夠被 NCTA污染。在生物學(xué)流體的情況下，后者可以是血液、淋巴、尿液或乳汁，該名單不是限制性 的。優(yōu)選情況下，樣品是血液制品或衍生物，例如血漿衍生物或血漿蛋白濃縮物。在步驟(i)中使用的表述“耐受NCTA復(fù)制或繁殖的細(xì)胞”表示能夠被NCTA感染、 能夠復(fù)制或繁殖這種NCTA并產(chǎn)生PrPsc和/或感染性的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選為其中 已經(jīng)整合有和/或過表達(dá)了 PrP朊病毒蛋白的非病理性構(gòu)象子的編碼基因的細(xì)胞。更優(yōu)選 情況下，這些細(xì)胞是能夠表達(dá)PrP的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞?！皞鞔币话闶菍⑴囵B(yǎng)皿中的一部分細(xì)胞傳代培養(yǎng)到另一個含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng) 皿中。因此每次傳代使得有可能將不再有空間分裂的細(xì)胞稀釋到另一個培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng) 皿中培養(yǎng)的時間能夠使NCTA復(fù)制。表述“用于NCTA的底物源”表示能夠通過體外擴增循環(huán)支持NCTA復(fù)制的任何非 感染性基質(zhì)。表述“用于病理構(gòu)象蛋白的底物源”表示不能改變另一種蛋白的構(gòu)象以使其不溶 的任何非病理構(gòu)象蛋白的來源。優(yōu)選情況下，用于NCTA和/或蛋白的非病理的正常形式的 底物源，可以與待測試生物制品屬于相同物種，或?qū)儆诓煌锓N。該源可以例如源自于與測 試樣品中所包含的相同制品的蛋白的非病理性正常形式?；蛘?，非病理性正常形式源可以 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段重組地或通過合成來生產(chǎn)。步驟⑴的細(xì)胞有利情況下，本發(fā)明方法的步驟(i)中使用的細(xì)胞表現(xiàn)出下列標(biāo)準(zhǔn)條件-細(xì)胞的復(fù)制或繁殖速度與證實NCTA在被感染細(xì)胞中的復(fù)制所需的溫育時間之 間的相容性；-細(xì)胞在已經(jīng)與感染性因子接觸后的穩(wěn)定性，這可以通過不存在與NCTA在細(xì)胞中 積累相關(guān)的細(xì)胞毒性來證明；-細(xì)胞對感染的良好敏感性，這通過例如用于在暴露于感染性因子的細(xì)胞中獲得 NCTA積累所需的低感染復(fù)數(shù)來評估。由于神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)在培養(yǎng)中不良的適應(yīng)性，對于體外滴定來 說它們不一定是最好的底物，因此優(yōu)選情況下利用已知技術(shù)，通過特定細(xì)胞類型和特定轉(zhuǎn) 基因的組合，建立起為NCTA復(fù)制提供理想環(huán)境所需的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。在一個優(yōu)選實施方案中，步驟(i)的細(xì)胞是兔上皮細(xì)胞，特別是Rov9系的細(xì)胞 (Vilette 等，PNAS, March 2001 ；98 ；4055-9)。Vilette等已經(jīng)顯示了來自表達(dá)羊PrP(轉(zhuǎn)基因)的兔的轉(zhuǎn)基因上皮細(xì)胞，在用含 有羊PrPsc的感染性腦勻漿液感染后，能夠復(fù)制瘙癢病毒株并產(chǎn)生羊PrPsc。構(gòu)建的細(xì)胞模 型Rov9系誘導(dǎo)性表達(dá)外來PrP，在這些與感染性材料接觸的細(xì)胞中PrPsc積累所需的溫育 期中保證了其維持。在另一個實施方案中，步驟(i)的細(xì)胞是鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，特別是MovS2或MovS6
6系的細(xì)胞(Archer 等，Journal of Virology，2004 ;78p. 482-90)。這些系由表達(dá)羊 PrP 并 耐受羊來源的NCTA復(fù)制的鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。與測試樣品進行接觸將耐受NCTA復(fù)制或繁殖的細(xì)胞，與可能被該NCTA感染的測試樣品或作為參比材 料的含有NCTA的感染性材料、例如來自被NCTA例如羊朊病毒感染的動物的腦提取物進行 接觸。這種接觸按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行(參見例如Archer等，Journal of Virology, Jan. 2004，p.482—490)。然后將這些細(xì)胞培養(yǎng)一代或多代，以便使NCTA復(fù)制或繁殖。有利情況下，可以將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與可能被NCTA感染的樣品在生物可接受水性溶 液中的至少一種稀釋液、特別是與幾種稀釋液、最特別與系列或連續(xù)稀釋液進行接觸。這些 稀釋液使得有可能對被測試樣品中的感染性更精確定量?？梢詫讉€細(xì)胞平行樣品與同樣的生物制品稀釋液進行接觸，以便給結(jié)果提供更 精細(xì)的統(tǒng)計學(xué)分辨率。細(xì)胞培養(yǎng)(步驟ii):按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)培養(yǎng)可能被生物制品感染的細(xì)胞的步驟，是 NCTA的復(fù)制或繁殖所需的，并因此用于擴增最初不足以被檢測的NCTA的量。在一個示例性實施方案中，所進行的用于通過NCTA的復(fù)制擴增所述生物學(xué)樣品 中存在的NCTA的量的培養(yǎng)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的步驟ii)，在添加有谷氨酰胺和胎牛血清 (終濃度5% )的DMEM+Ham-F12(4 1)培養(yǎng)基中進行。將細(xì)胞在5% CO2下在37°C溫育。 每周進行一次細(xì)胞傳代(分裂比為1到10)。從細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物含有病理形式的標(biāo)志物蛋白(特別是PrP)，其量大于生物 學(xué)樣品中最初存在的量，如果所述樣品含有它的話。處于其病理形式的標(biāo)志物蛋白(特別 是PrP)和NCTA積累在細(xì)胞培養(yǎng)物中(在被感染細(xì)胞的水平上和培養(yǎng)基中)。與用于病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的底物源進行接觸(步驟iii):在本發(fā)明方法的步驟ii)之后，將從細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物與用于病理性構(gòu)象子和 /或NCTA的底物源進行接觸并溫育。該底物源可以例如動物來源的制品例如健康腦勻漿液、或其他源自于體外培養(yǎng) 物的材料的形式提供。該材料可以例如源自于細(xì)胞例如MovS或Rov N2A(Weissmann等， (2003)，PNAS Vol. 100 No. 20p. 1666-11671)，或者也可以源自于酵母、真菌或細(xì)菌，該名單 不是限制性的。這種源自于體外培養(yǎng)物的材料可以表達(dá)在各種不同的細(xì)胞區(qū)室中，例如細(xì) 胞外區(qū)室(例如上清液、外來體，該名單不是限制性的)和/或膜和/或/胞質(zhì)區(qū)室(例如 細(xì)胞裂解液)。該步驟的作用是通過將非病理形式的標(biāo)志物蛋白(特別是PrP)(包含在底 物中)轉(zhuǎn)變成病理形式，而使步驟ii)中收獲的病理構(gòu)象蛋白(特別是PrPsc)和/或NCTA 得以體外擴增，非病理形式的自發(fā)轉(zhuǎn)變在理論上是不可能的。病理形式的蛋白將引發(fā)非病 理形式向病理形式的轉(zhuǎn)化。正如將在下面解釋的，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時，未轉(zhuǎn)化的非病理形式不被檢測系統(tǒng)檢 測。步驟(ii)的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物與用于病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的底物源的溫育所進 行的時間長度，足以允許至少一部分具有非病理形式的蛋白轉(zhuǎn)變成病理形式的蛋白，或允許NCTA擴增。優(yōu)選情況下，每個溫育步驟進行的時間長度在10秒到4小時之間，優(yōu)選在20 分鐘到1小時之間，特別優(yōu)選為30分鐘。擴增介質(zhì)有利情況下可以由緩沖液構(gòu)成，其典型地包含(lx PBS)、150mM NaCl和 Triton，以及至少含有非病理構(gòu)象的標(biāo)志物蛋白(特別是PrP)的底物(例如比待擴增
樣品的體積大10倍以上體積)。聚集物分離已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)變成病理形式(PrPse類型)的蛋白能夠彼此和與其他病理形式 (PrPsc)粒子聚集，阻止了其他非病理形式的蛋白轉(zhuǎn)變成病理形式。這是一種障礙，因為由 于反應(yīng)介質(zhì)中存在低數(shù)量的“轉(zhuǎn)化焦點”，方法因此可能被減慢。因此，本發(fā)明方法的步驟iv)由將可能形成的聚集物解聚，以便釋放出病理構(gòu)象 的標(biāo)志物蛋白粒子和/或NCTA，使它們能夠轉(zhuǎn)化其他非病理蛋白。許多方法能夠用于在本發(fā)明方法的步驟vi)中解聚聚集物。例如，可以提到的是 用溶劑(例如十二烷基硫酸鈉、二甲基亞砜、乙腈、胍、尿素、三氟乙醇、稀三氟乙酸、稀甲 酸，該名單不是限制性的)處理，改變?nèi)芤旱奈锢砘瘜W(xué)性質(zhì)例如PH、溫度、離子強度或介電 常數(shù)，以及物理方法例如超聲、激光輻射、冷凍/融化、高壓釜溫育、高壓、溫和均質(zhì)化或可 替選的其他輻射源，該名單不是限制性的。優(yōu)選使用超聲。超聲是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 方法，通過有可能增加聚集物的溶解度而經(jīng)常用于純化PrP"的方法中。有可能在執(zhí)行單次解聚步驟中不是所有的聚集物都將被解聚。在這種情況下，病 理性蛋白的濃度隨著解聚步驟的進程而增加。解聚步驟的持續(xù)時間可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并且它可以取決于所選 的解聚方法。優(yōu)選情況下，解聚步驟的持續(xù)時間在1秒到60分鐘之間，更優(yōu)選在5秒到30 分鐘之間，更特別在5秒到30秒之間。有利情況下，被稱為循環(huán)的連續(xù)的步驟iii)和iv)，被重復(fù)至少2次、優(yōu)選5到100 次、優(yōu)選20到60次。該重復(fù)2到100次的循環(huán)構(gòu)成了一系列擴增循環(huán)。一系列循環(huán)也可以被重復(fù)幾次。 在這種情況下，新的系列將從前一個系列的體積而不是最初的NCTA樣品開始。蛋白檢測檢測病理蛋白的步驟(V)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來進行。PrPsc的特異性檢測可以利用首先分離兩種同種型PrPc和PrPsc的步驟來進行。 這種分離在PrPsc的能夠使其與非病理蛋白區(qū)分開的生物化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上進行，特別是 已報道的PrPsc對基于蛋白酶的處理更有抗性和即使在去污劑存在情況下溶解性也較低 這一事實。因此，優(yōu)選情況下，擴增后的第一個步驟是從樣品中分離PrPc (非病理性可溶的 正常形式的PrP)，這可以例如利用蛋白酶處理例如蛋白酶K處理或通過離心來進行，以便 將可溶形式(PrPc)與不溶形式(PrPsc)分離開。 在一個具體實施方案中，在Western印跡之前的步驟是用蛋白酶K消化，它主要消 化PrPc而不是PrPsc。事實上，PrPsc的特性是與PrPc相比它對PK相對有抗性。因此，隨 后的檢測步驟不再檢測到非病理形式的蛋白，因為所述形式已被蛋白酶消化。
檢測步驟可以使用下述方法進行免疫細(xì)胞化學(xué)(例如通過細(xì)胞標(biāo)記和Facscan 分析)或免疫化學(xué)(例如Western印跡或ELISA測定法)、或放射活性測定法、熒光測定法、電子顯微鏡測定法、用于檢測聚集物的比濁法測試，以及結(jié)構(gòu)測試包括NMR(核磁共振)、圓 二色性、拉曼光譜、UV吸收、識別病理形式蛋白的單克隆抗體，該名單不是限制性的。利用特異性識別病理形式而不是非病理形式的抗體檢測病理形式的蛋白也是可 能的。該抗體自身可以被標(biāo)記，以便使其更容易檢測。這樣的抗體可以是例如15B3抗體 (Korth 等，1997，Nature 1997 Nov. 6，390 (6655) :74_7)。NCTA 滴定病理形式的標(biāo)志物蛋白或NCTA的檢測可以與這些蛋白或NCTA在樣品中存在的量 的測定組合進行。滴定可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何滴定方法來進行。具體來說，它可以按 照文獻W02005022148和W02006117483 (特別是參比例A和B)中描述的方法模型來進行。各種稀釋液和各種平行樣品的Western印跡的所有結(jié)果可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的能夠建立起感染滴度的統(tǒng)計學(xué)方法來分析，例如Spearman-Karber方法(Schmidt N.J.，Emmous R. W.，《用于病毒、立克次氏體和衣原體感染的診斷步驟》(Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection)，1989，第 6 片反)。在本發(fā)明的一個實施方案中，計算滴度的方法是Spearman-Karber方法。該方 法將測試樣品按照幾何級數(shù)稀釋，即連續(xù)稀釋之間具有恒定比率，并將恒定體積(一般 0. 150ml)的每種稀釋度接種到至少5個孔中。最常用的稀釋系數(shù)是十進制系數(shù)。為了使Spearman-Karber公式適用，需要使用恒定數(shù)量的接種有每種稀釋度的 孔、恒定的稀釋系數(shù)，并且稀釋度的范圍寬得足以涵蓋下述兩個稀釋度，一側(cè)的稀釋度在 100%的孔中將給出陽性反應(yīng)，另一側(cè)的稀釋度在100%的孔中將給出陰性反應(yīng)。如果這些條件中的一個或多個沒有滿足，有時假定對于恒定的稀釋系數(shù)來說，與 執(zhí)行的最后稀釋緊鄰的較高或較低稀釋度將給出所需結(jié)果。這種數(shù)據(jù)的“編造”不是基于 任何理論基礎(chǔ)，但是如果足夠小心地施用，它沒有危險。但是，優(yōu)選使用更適合的稀釋度范 圍重復(fù)滴定，并且如果在數(shù)據(jù)中存在嚴(yán)重缺口，這是必需的。根據(jù) Spearman-Karber 公式Log10 中值劑量=(X0) - (d/2) +dS (巧/叫)其中X0 =所有測試接種物都為陽性的最低稀釋度的倒數(shù)值的log1(l。d =稀釋系數(shù)的loglO，也被稱為“稀釋級(dilution step) ” (即稀釋度對數(shù)間隔 之間的差)。η,=在每個稀釋度使用的測試接種物的數(shù)量。Ri =陽性測試接種物的數(shù)量(缺乏Iii)。S(^ni) =S(P)=從給出100%陽性結(jié)果的最低稀釋度開始的陽性測試比例的總 和。求和從Xtl稀釋度開始。估算的標(biāo)準(zhǔn)偏差使用下列公式計算Log 標(biāo)準(zhǔn)偏差=d* V (E(p*(l-p)/(ni_l)))其中ρ = IVni=每個稀釋度處陽性測試(即表現(xiàn)出反應(yīng)的接種物的孔)的比例。本發(fā)明的方法能夠在約41og、即10000體外感染單位的范圍內(nèi)對NCTA相關(guān)感染性
9進行定量。這能夠例如使其可以滿足用于證實獲得消除了 NCTA的生物制品的方法的有效 性的標(biāo)準(zhǔn)。用于測定NCTA相關(guān)感染性的方法的應(yīng)用本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的滴定方法應(yīng)用于體外評估和/或監(jiān)測可能被NCTA污染 的生物制品的獲得或處理方法的方法中。該評估和/或監(jiān)測方法的特征在于，在所述過程 的上游和下游對生物制品使用上面描述的本發(fā)明的滴定方法，并將獲得的兩個滴定值進行 比較。通過兩個測量值之間的比較，確定了 NCTA的消除程度或NCTA折減系數(shù)。具體來說，本發(fā)明的滴定方法具有使用例如色譜或納濾、特別是在文獻EP 0 359 593和WO 02/092632中描述的色譜或文獻W02005/022148中描述的納濾，容易地適用于任 何類型的用于獲得或純化生物制品、特別是血液制品例如血漿衍生物的方法的能力。因此，本發(fā)明方法的實施，通過使用促進NCTA復(fù)制的特定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系與含有 NCTA的待測試感染性或潛在感染性材料進行接觸的滴定方法，能夠評估和/或監(jiān)測任何可 能被NCTA污染的生物制品的獲得或處理或甚至純化方法消除該NCTA的有效性。在希望評 估對NCTA有效性的過程(或過程的一部分)的上游和下游測量NCTA的量。通過這兩個測 量值的比較，確定了病原性因子的消除程度。因此，本發(fā)明方法的實施，可以在獲得生物制 品的方法過程中或在獲得生物制品后用于消除NCTA的處理的情況下執(zhí)行。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的滴定方法應(yīng)用于體外評估和/或監(jiān)測用于去除材料污 染的步驟的方法中。在這種情況下，利用本發(fā)明的滴定方法測定含有NCTA的生物制品的 NCTA滴度。然后將該被感染的生物制品與去污染材料進行接觸，然后對該材料進行去污染 步驟。最后，再次測定經(jīng)歷過去污染步驟的生物制品的滴度。將在去污染步驟上游和下游 進行的兩個滴定測量值進行比較，以評估去污染步驟的有效性。材料可以是例如純化材料 特別是色譜柱，或者也可以是使用氫氧化鈉消毒色譜柱。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的滴定方法應(yīng)用于調(diào)節(jié)(降低或增加)感染性物質(zhì)滴度的 候選化合物的篩選步驟和/或評估其能力的方法中。在這種情況下，利用本發(fā)明的滴定方 法測定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后將該被感染的生物制品與測試化合物進行 接觸，然后再次測定經(jīng)歷過篩選步驟和/或評估方法的生物制品的滴度。對在樣品與測試 化合物進行接觸的上游和下游進行的兩個滴定測量值進行比較。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的滴定方法應(yīng)用于能夠抑制NCTA感染性的化合物的篩選 步驟和/或其評估方法中。在這種情況下，利用本發(fā)明的滴定方法，在存在以及然后在不存 在待評估化合物的情況下測定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。根據(jù)行動是阻止了感染 周期的起始還是阻斷了已經(jīng)起始的感染周期，對與化合物進行接觸的方法進行測定。在任 何情況下，都測定用或不用測試產(chǎn)物處理的生物制品的滴度。將進行的兩個滴度測量值進 行比較，以便評估化合物對NCTA感染性的抑制活性。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的滴定方法應(yīng)用于能夠調(diào)節(jié)標(biāo)志物蛋白或NCTA從非病理 形式向病理形式的轉(zhuǎn)化、例如PrP向PrPse的轉(zhuǎn)化的化合物的鑒定方法中。在這種情況下， 利用本發(fā)明的滴定方法測定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后將該被感染的生物制 品與測試化合物進行接觸，然后施用本發(fā)明的滴定方法以便再次測定生物制品的滴度。對 在與化合物進行接觸的上游和下游進行的兩個滴定測量值進行比較，以便評估測試化合物 的有效性。
在下面的附加描述的幫助下將會更清楚地理解本發(fā)明的方法，這些描述不對本發(fā) 明的范圍構(gòu)成限制。
實施例材料與方法選擇了 MovS6細(xì)胞(Archer F.等，2004，同上)作為耐受NCTA復(fù)制的細(xì)胞，對 Tg301轉(zhuǎn)基因小鼠適應(yīng)的127-S瘙癢病毒株被用作天然感染性源(Vilette JL等，2001，同 上)。Tg301轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有從羊人工染色體文庫分離到的大DNA片段，羊PrP的表達(dá)水 平為羊腦中觀察到的水平的約8倍高。初始感染性源由來自被感染小鼠的200mg/ml的腦 勻漿液(批號LN-3326)。該樣品的滴度是5. 71og10uffB/ml和6. 35TCID50/ml。細(xì)胞培養(yǎng)和接種將MovS6細(xì)胞培養(yǎng)在添加有谷氨酰胺和胎牛血清(終濃度5 % )的 DMEM+Ham-F12 (4 1)培養(yǎng)基中，在5% CO2和37°C下溫育。每周將10%細(xì)胞重新接種在 每個孔中。剩余90%的細(xì)胞或者用PBS清洗然后以干燥細(xì)胞沉淀的形式儲存，或者除去。在接種前24小時準(zhǔn)備滴定板。將細(xì)胞以每個孔100 000個細(xì)胞的比例接種在約 2cm2的孔中(24孔板格式)，即約50000個細(xì)胞/cm2。接種物由稀釋IO4倍的LN-3326樣品或用作“陰性對照”的健康腦勻漿液樣品(批 號LN-3777)組成。接種進行5個平行樣。將細(xì)胞與150μ 1稀釋接種物接觸24小時，然后加入Iml新培養(yǎng)基。將細(xì)胞在培 養(yǎng)物中維持另外72小時，即直到第一次傳代，在傳代過程中，對于每個孔來說，將整個細(xì)胞 層轉(zhuǎn)移到約9. 6cm2的孔中(6孔板格式)。然后將細(xì)胞培養(yǎng)物維持10周。每周，對于每個孔來說更換培養(yǎng)基并將10%細(xì)胞重 新接種。在用感染的接種物(LN-3326)接種的沒有用于重新接種的細(xì)胞中，5個平行樣品中 的兩個在PBS中洗滌一次，然后以干燥沉淀的形式儲存在-80°C (打算按照本發(fā)明的方法進 行擴增的樣品)，其余3個平行樣品不事先洗滌就作為干燥沉淀保存(打算用于WB檢測的 樣品)。在用健康樣品接種并且沒有用于重新接種的細(xì)胞中，所有平行樣品不事先洗滌就以 干燥沉淀的形式儲存。獲得的細(xì)胞沉淀能夠用于執(zhí)行下文中描述的分析。細(xì)胞中PrPsc的檢測在每次傳代中儲存的細(xì)胞沉淀能夠用于研究細(xì)胞所產(chǎn)生的PrPsc。產(chǎn)生的PrPsc 的檢測，通過對未洗滌的細(xì)胞沉淀樣品直接進行Western印跡，或利用本發(fā)明的方法對洗 滌過的細(xì)胞沉淀樣品進行擴增后通過Western印跡來進行。-直接通過Western印跡的檢測將未洗滌的細(xì)胞沉淀樣品(5份平行樣品中的三 份)融化并吸取到60 μ 1 PBS中。使用超聲水浴(功率15W)通過15秒超聲裂解細(xì)胞。取 出20μ 1超聲過的細(xì)胞裂解液以便用蛋白酶K處理。將消化產(chǎn)物變性，然后在變性條件下 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。將在凝膠中遷移的蛋白通過電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移 到PVDF膜上。通過與6Η4抗體(Prionics)然后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體(“抗小 鼠抗體”的山羊抗體)溫育，來檢測膜上存在的PrPsc。標(biāo)記的膜通過化學(xué)放光進行顯示。 如果在放射自顯影照片上可以看到三種形式的糖基化PrPsc的電泳分布圖，樣品被認(rèn)為是 陽性的。
-利用本發(fā)明方法的檢測將每個洗滌過的細(xì)胞沉淀樣品融化，然后吸取到90μ1 含有5%健康腦勻漿液的溶液中并放置在200μ 1微量離心管中。步驟(iii)到(ν)的循環(huán) 由在37°C的溫度下30分鐘的溫育階段，然后是20秒的超聲階段構(gòu)成。使用自動化Misonix 超聲儀3000 (功率水平設(shè)定在7)對樣品進行一系列50個循環(huán)。使用18 μ 1擴增產(chǎn)物，用 蛋白酶K消化，然后通過Western印跡進行分析，以檢測可能存在的PrPsc。結(jié)果在各種不同樣品中檢測PrPsc顯示在圖中并總結(jié)在表1中。表1 在MovS6細(xì)胞裂解液中檢測PrPsc后的陽性孔數(shù)量
權(quán)利要求
一種體外方法，用于樣品中非常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作為NCTA感染性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的檢測和/或滴定，所述方法包括下列步驟i)將所述樣品與耐受NCTA復(fù)制或繁殖的細(xì)胞相接觸，ii)培養(yǎng)所述細(xì)胞以便復(fù)制或繁殖所述樣品中存在的NCTA，iii)將NCTA與用于病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的底物源相接觸并溫育，通過其擴增了病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的量，iv)將可能形成的聚集物解聚，v)確定樣品中病理構(gòu)象蛋白和/或NCTA的存在和/或量，步驟(iii)和(iv)構(gòu)成了一個操作循環(huán)，在步驟(v)之前該循環(huán)被重復(fù)至少兩次。
2.權(quán)利要求1的方法，其中作為NCTA標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白是PrPse朊病毒蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(i)的細(xì)胞是其中已經(jīng)整合有編碼PrP朊病毒蛋白的 非病理性構(gòu)象子的基因的細(xì)胞。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中步驟(ν)中病理構(gòu)象蛋白的存在和/或量的確定 通過免疫化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)來進行。
5.權(quán)利要求1到4任一項的方法，其中細(xì)胞是兔上皮細(xì)胞、特別是Rov9系的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1到4任一項的方法，其中細(xì)胞是鼠類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、特別是MovS2或 MovS6系的細(xì)胞。
7.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述步驟(iii)和(iv)的循環(huán)在步驟(ν)之前被 重復(fù)5到60次。
8.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中樣品選自血液制品及其衍生物、食品和美容用品。
9.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中用于蛋白的病理形式和/或用于NCTA的底物以健 康腦勻漿液的形式提供。
10.一種體外方法，所述方法對用于獲得或處理可能被NCTA污染的生物制品或材料的 過程進行評估和/或監(jiān)測，在所述方法中，在所述過程的(A)上游和(B)下游對所述生物制 品或材料施用了權(quán)利要求1到9任一項的滴定方法，并對獲得的兩個滴定值(A)和(B)進 行比較。
11.一種體外方法，所述方法對用于去除生物制品或材料的污染物的步驟進行評估和 /或監(jiān)測，在所述方法中，在所述步驟的(A)上游和(B)下游對所述生物制品或材料施用了 權(quán)利要求1到9任一項的滴定方法，并對獲得的兩個滴定值㈧和⑶進行比較。
12.—種體外方法，所述方法用于對化合物調(diào)節(jié)感染性生物制品的感染性的能力進行 評估，在所述方法中，在存在(A)和不存在(B)待評估的所述化合物的情況下，對所述感染 性生物制品施用了權(quán)利要求1到9任一項的滴定方法，并對獲得的兩個滴定值(A)和(B) 進行比較。
13.—種體外方法，所述方法用于在人類或非人類動物個體中診斷可傳播海綿狀腦病， 所述方法包括在來自所述個體的生物學(xué)樣品中，利用權(quán)利要求1到9任一項中定義的方法 檢測非常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作為NCTA感染性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于樣品中非常規(guī)可傳播因子(NCTA)或作為NCTA相關(guān)感染性標(biāo)志物的病理構(gòu)象蛋白的體外檢測和/或滴定的體外方法，所述方法包括在培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制或繁殖樣品中存在的NCTA，然后重復(fù)地與允許NCTA或病理構(gòu)象蛋白，NCTA的非病理構(gòu)象子(conformer)擴增的底物溫育，然后確定樣品中NCTA或病理構(gòu)象蛋白的存在和/或量。
文檔編號G01N33/68GK101981453SQ200980111119
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者伯努瓦·弗蘭, 布魯諾·尤 申請人:Lfb生物科技公司;法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院