專利名稱：不溶性載體顆粒的制造方法、不溶性載體顆粒、測(cè)定試劑、待測(cè)物分析用具和免疫比濁法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不溶性載體顆粒的制造方法、不溶性載體顆粒、測(cè)定試劑、待測(cè)物分析 用具和免疫比濁法。
背景技術(shù)：
一直以來(lái)，作為免疫學(xué)測(cè)定方法，利用酶免疫分析法(EIA法)、免疫比濁法等。其 中，使用不溶性載體顆粒的免疫比濁法，由于能夠利用自動(dòng)分析儀器，因此近年來(lái)在臨床檢 查等中被廣泛使用。所述免疫比濁法通常使用負(fù)載有作為測(cè)定對(duì)象的抗原或抗體的不溶性載體顆粒。 試樣中含有測(cè)定對(duì)象時(shí)，通過(guò)使其與所述不溶性載體顆粒所負(fù)載的抗體或抗原結(jié)合，從而 所述不溶性載體顆粒凝集。因此，通過(guò)測(cè)定該凝集的程度，能夠檢測(cè)測(cè)定對(duì)象。在臨床檢查中，通過(guò)所述免疫比濁法，例如測(cè)定生物試樣中所含的抗原或抗體的 濃度作為診斷指標(biāo)來(lái)進(jìn)行疾病的診斷。由于生物試樣中所含的抗原或抗體的濃度根據(jù)疾患 的有無(wú)等而有很大差異，因此要求該檢查方法能夠在很寬的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。在使用不溶性載體顆粒的免疫比濁法中，根據(jù)其測(cè)定原理，通過(guò)擴(kuò)大能夠反應(yīng)的 抗體或抗原的量的上限，能夠擴(kuò)大測(cè)定對(duì)象的測(cè)定濃度范圍。因此，不溶性載體顆粒需要負(fù) 載更多的抗體或抗原。但是，用于免疫比濁法的不溶性載體顆粒，通常在顆粒表面的官能團(tuán) 負(fù)載抗體或抗原時(shí)，表面電荷減少。因此，存在如下問(wèn)題容易產(chǎn)生顆粒自身的凝集反應(yīng)、和 因抗原或抗體以外的物質(zhì)所產(chǎn)生的凝集反應(yīng)(非特異性凝集)，分散性降低，且測(cè)定靈敏度 降低。因而，在所述免疫比濁法中，為了抑制非特異性凝集，公開(kāi)了以下方法使用對(duì)于 抗原為非特異性的蛋白質(zhì)的方法(專利文獻(xiàn)1)、使用表面活性劑的方法(專利文獻(xiàn)2)和使 用鹽類(lèi)的方法(專利文獻(xiàn)3)。然而，所述使用抗原非特異性蛋白質(zhì)的方法中，若用于致敏不 溶性載體顆粒的抗體或抗原量增加，則非特異性凝集的抑制效果降低。此外，使用表面活性 劑的方法中，連物理性吸附的抗體或抗原也被除去或變性，可能會(huì)喪失反應(yīng)性。進(jìn)而，使用 鹽類(lèi)的方法中，抗體或抗原的反應(yīng)性和靈敏度可能降低。并且，這些方法根據(jù)所負(fù)載的抗體 或抗原的種類(lèi)、批次的不同，所得到的不溶性載體顆粒的品質(zhì)容易產(chǎn)生不均?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2004-117068號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)平11-258239號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2004-117022號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種即使所負(fù)載的抗體或抗原量增加也能夠抑制非 特異性凝集的不溶性載體顆粒的制造方法、不溶性載體顆粒、測(cè)定試劑、待測(cè)物分析用具和 免疫比濁法。用于解決問(wèn)題的方案為了達(dá)成所述目的，本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法的特征在于，其為在顆 粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆粒的制造方法，其具有下述㈧和⑶中的至少一個(gè)致敏反應(yīng)工序。(A)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所 述抗體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，所述致敏反應(yīng)液中的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸濃度為超過(guò)0. lmol/L且lmol/L以 下的范圍。(B)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所 述抗體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，作為所述不溶性載體顆粒，使用化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。本發(fā)明的不溶性載體顆粒的特征在于，其為用于免疫比濁法的不溶性載體顆粒， 通過(guò)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法來(lái)制造。本發(fā)明的測(cè)定試劑的特征在于，其為用于免疫比濁法的測(cè)定試劑，且含有本發(fā)明 的不溶性載體顆粒。本發(fā)明的待測(cè)物分析用具的特征在于，其含有本發(fā)明的測(cè)定試劑。本發(fā)明的免疫比濁法的特征在于，所述免疫比濁法具有如下工序凝集反應(yīng)工序， 使在顆粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆粒、與作為抗原或抗體的測(cè)定對(duì)象發(fā)生免疫 反應(yīng)，使所述不溶性載體顆粒在免疫反應(yīng)液中凝集；測(cè)定工序，測(cè)定因所述凝集反應(yīng)而產(chǎn)生 的所述免疫反應(yīng)液的濁度變化；作為所述不溶性載體顆粒，使用本發(fā)明的不溶性載體顆粒。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法，能夠制造即使所負(fù)載的抗體或抗原量 增加也能夠抑制非特異性凝集的不溶性載體顆粒。此外，本發(fā)明的制造方法中，抗體或抗原 的種類(lèi)、抗體或抗原的批次間差異的影響很少。進(jìn)而，本發(fā)明的制造方法只要在致敏反應(yīng)時(shí) 存在極性電荷側(cè)鏈氨基酸即可，工序也簡(jiǎn)便。本發(fā)明的不溶性載體顆粒由于能夠抑制因抗 體或抗原量的增加所引起的非特異性凝集，因此能夠負(fù)載充分量的抗體或抗原。因此，將本 發(fā)明的不溶性載體顆粒用于免疫比濁法時(shí)，測(cè)定濃度范圍廣，且測(cè)定靈敏度高。并且，本發(fā) 明的不溶性載體顆粒，由于所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸與不溶性載體顆粒結(jié)合，因此例如干 燥引起濃縮的影響低，也能夠用于微芯片、屬于干式免疫測(cè)定試劑的試驗(yàn)片等待測(cè)物分析 用具，能夠應(yīng)用于小型的自動(dòng)分析裝置。本發(fā)明的不溶性載體顆粒的非特異性凝集的抑制機(jī)理例如可以如下推定。S卩，若 用所述抗體致敏所述不溶性載體顆粒，則所述抗體物理性吸附在所述不溶性載體顆粒的表 面后，與其附近的所述不溶性載體顆粒表面的官能團(tuán)(例如羧基)結(jié)合。因此，所述不溶性 載體顆粒表面的電荷減少。另一方面，由于所結(jié)合的所述抗體造成的位阻，所述表面的一部 分官能團(tuán)無(wú)法結(jié)合所述抗體而直接殘存。所述抗體致敏時(shí)，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在 下，使抗體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸。這樣的話，水合性高的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸與所述不溶性載體顆粒結(jié)合，進(jìn)而，所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸和水分子產(chǎn)生氫鍵。因此 認(rèn)為，所述不溶性載體顆粒的親水性和電荷增高，分散性提高，其結(jié)果，抑制了非特異性凝 集。另外，所述機(jī)理是推定的，本發(fā)明不受其任何限定和限制。


圖1是表示比較例和本發(fā)明的實(shí)施例的分散性的測(cè)定結(jié)果的圖。圖2是表示比較例和本發(fā)明的實(shí)施例的測(cè)定前后的分散性的變化率的圖。圖3是表示使用比較例和本發(fā)明的實(shí)施例的免疫比濁法的測(cè)定結(jié)果的圖。圖4是表示使用其它比較例和其它本發(fā)明的實(shí)施例的免疫比濁法的測(cè)定結(jié)果的 圖。圖5是表示使用其它比較例和其它本發(fā)明的實(shí)施例的免疫比濁法的測(cè)定結(jié)果的 圖。圖6是表示其它比較例和其它本發(fā)明的實(shí)施例的分散性的測(cè)定結(jié)果的圖。圖7是表示對(duì)其它比較例和其它本發(fā)明的實(shí)施例的測(cè)定前后的分散性的變化率 進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的圖。圖8是表示使用其它比較例和其它本發(fā)明的實(shí)施例的免疫比濁法的測(cè)定結(jié)果的 圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法中，所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸優(yōu)選為堿性氨
基酸或酸性氨基酸。本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法，在所述(A)的致敏反應(yīng)工序中，所述不溶 性載體顆粒優(yōu)選為膠乳顆粒。本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法，在所述(A)的致敏反應(yīng)工序中，所述膠乳 顆粒優(yōu)選為化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。本發(fā)明的測(cè)定試劑包含含有多個(gè)不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群，所述不溶 性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群，所述兩種不溶性載體顆粒群 中，至少一種不溶性載體顆粒群優(yōu)選為含有多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆 粒群。本發(fā)明的測(cè)定試劑優(yōu)選的是，在所述兩種不溶性載體顆粒群中平均粒徑較大的不 溶性載體顆粒群為含有多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。本發(fā)明的測(cè)定試劑中，本發(fā)明的不溶性載體顆粒的平均粒徑優(yōu)選為例如0. 03 2. Oμm的范圍，更優(yōu)選為0. 08 2. 0 μ m的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 12 0. 5 μ m的范圍。本發(fā)明的待測(cè)物分析用具可以為試驗(yàn)片、測(cè)試盒(cartridge)和微芯片中的任意 一種。本發(fā)明的免疫比濁法優(yōu)選的是，在所述凝集反應(yīng)工序中，使用包含多個(gè)不溶性載 體顆粒的不溶性載體顆粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種不溶性載體 顆粒群，所述兩種不溶性載體顆粒群中的至少一種為包含多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的 不溶性載體顆粒群。
在本發(fā)明的免疫比濁法中，所述兩種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑較大的不溶 性載體顆粒群優(yōu)選為包含多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。在本發(fā)明的免疫比濁法中，本發(fā)明的不溶性載體顆粒的平均粒徑優(yōu)選為例如 0. 03 2. Ομπι的范圍，更優(yōu)選為0. 08 2. Ομπι的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 12 0. 5μπι的范圍。接著，舉出例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。<制造方法>如前所述，本發(fā)明的制造方法為在顆粒表面負(fù)載有抗體或抗原的不溶性載體顆粒 的制造方法，其具有以下致敏反應(yīng)工序在致敏反應(yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在 下，使所述抗體或者所述抗原與所述不溶性載體顆粒接觸。如前所述，本發(fā)明的制造方法中，作為所述致敏反應(yīng)工序，具有下述(A)和(B)中 的至少一種致敏反應(yīng)工序。另外，以下，在本發(fā)明的制造方法中，將具有下述(A)的致敏反 應(yīng)工序的制造方法稱為“制造方法Α”，將具有下述(B)的致敏反應(yīng)工序的制造方法稱為“制 造方法B”。(A)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所 述抗體或者所述抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，所述致敏反應(yīng)液中的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸濃度為超過(guò)0. lmol/L且lmol/L以 下的范圍，(B)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所 述抗體或者所述抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，作為所述不溶性載體顆粒，使用化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。在本發(fā)明的制造方法中，所述致敏反應(yīng)液包含所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸、和負(fù)載 抗體或抗原的所述不溶性載體顆粒。本發(fā)明中，所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸是指?jìng)?cè)鏈具有極性和電荷的氨基酸。因此，所 述極性電荷側(cè)鏈氨基酸為親水性，并且在水溶液中具有正或負(fù)的電荷。所述極性電荷側(cè)鏈 氨基酸中， 具有正的電荷的氨基酸為堿性氨基酸，具有負(fù)的電荷的氨基酸為酸性氨基酸。所 述堿性氨基酸包括例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸。此外，所述酸性氨基酸包括例如天門(mén)冬氨 酸和谷氨酸。所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸只要在水溶液中具有正或負(fù)的電荷即可，也包括例 如極性電荷側(cè)鏈氨基酸的鹽等。作為所述鹽，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如鈉鹽或鉀鹽等， 具體而言，可以例示天門(mén)冬氨酸鈉等酸性氨基酸鹽。此外，作為所述鹽，可以列舉例如鹽酸 鹽，具體而言，可以例示精氨酸鹽酸鹽、賴氨酸鹽酸鹽等堿性氨基酸鹽。作為本發(fā)明的制造 方法中使用的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸，其中，優(yōu)選為天門(mén)冬氨酸鈉、谷氨酸鈉。在本發(fā)明的制造方法A中，如前所述，所述致敏反應(yīng)液中的所述極性電荷側(cè)鏈氨 基酸濃度為超過(guò)0. lmol/L且lmol/L以下的范圍，優(yōu)選為0. 2mol/L 0. 8mol/L的范圍。在本發(fā)明的制造方法B中，所述致敏反應(yīng)液中的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸濃度沒(méi) 有特別限定，例如可以為超過(guò)0. lmol/L且lmol/L以下的范圍，優(yōu)選為0. 2mol/L 0. 8mol/ L的范圍。在本發(fā)明的制造方法A中，作為所述不溶性載體顆粒，沒(méi)有特別限定，可以舉出例 如合成高分子顆粒、無(wú)機(jī)化合物顆粒、多糖類(lèi)顆粒等。所述合成高分子顆粒沒(méi)有特別限定，可以舉出例如膠乳顆粒、聚乳酸顆粒等，優(yōu)選為膠乳顆粒。所述膠乳顆粒的材質(zhì)沒(méi)有特別限 定，可以列舉例如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-馬 來(lái)酸共聚物、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯等，優(yōu)選為聚苯乙 烯。所述無(wú)機(jī)化合物顆粒沒(méi)有特別限定，可以列舉例如多孔性玻璃顆粒、硅石顆粒等。所述 多糖類(lèi)顆粒沒(méi)有特別限定，可以舉出例如瓊脂糖顆粒、葡聚糖顆粒、殼聚糖顆粒等。 在本發(fā)明的制造方法A中，所述不溶性載體顆粒例如可以為化學(xué)結(jié)合用不溶性載 體顆粒，也可以為物理吸附用不溶性載體顆粒。作為所述化學(xué)結(jié)合用不溶性載體顆粒，沒(méi)有 特別限定，可以列舉例如顆粒表面附加有官能團(tuán)的不溶性載體顆粒等。作為所述官能團(tuán)，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如羧基、氨基、磺基、甲醇基、氨基甲 ?；?、三甲基氨基、聚乙烯亞胺基、酚性羥基、甲醇基等醇性羥基、聚乙二醇基、羧基末端聚 乙二醇基、羧基末端聚乙二醇基、辛基、十八烷基、三甲基甲硅烷基等，優(yōu)選為羧基。在本發(fā)明的制造方法A中，所述不溶性載體顆粒也可以與制造方法B同樣地為后 述化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。本發(fā)明的制造方法B中，作為所述不溶性載體顆粒，使用所述化學(xué)結(jié)合用膠乳顆 粒。作為所述化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒，可以列舉例如顆粒表面附加有官能團(tuán)的膠乳顆粒等。 所述膠乳顆粒的材質(zhì)，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如前述的材質(zhì)等，優(yōu)選為聚苯乙烯、苯乙 烯_ 丁二烯共聚物、苯乙烯_丙烯酸酯共聚物等，更優(yōu)選為聚苯乙烯。作為所述官能團(tuán)，沒(méi) 有特別限定，可以列舉例如前述的官能團(tuán)等，優(yōu)選為羧基、氨基、磺基、甲醇基、酰基氨基，更 優(yōu)選為羧基。本發(fā)明的制造方法中，所述不溶性載體顆粒的平均粒徑?jīng)]有特別限定，例如為 0. 03μπι 2. Ομ 的范圍，更優(yōu)選為0. 05μπι 1. O μ m的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 07μπι 0. 5μπ 的范圍。本發(fā)明的制造方法中，所述致敏反應(yīng)液中的所述不溶性載體顆粒的濃度沒(méi)有特 別限定，例如為0. lw/v% 10 八％的范圍，優(yōu)選為0. 3w/v% 8w/v%的范圍，更優(yōu)選為 0. 5w/v% 范圍。本發(fā)明中，所述不溶性載體顆粒所負(fù)載的抗原沒(méi)有特別限定，例如可以根據(jù)分析 對(duì)象適當(dāng)決定。作為具體例子，可以列舉例如CRP(C反應(yīng)性蛋白)、ASO(抗鏈球菌溶血素 0)、AFP (甲胎蛋白)、FDP (纖維蛋白降解產(chǎn)物)、CEA (癌胚抗原)、HCG β (人絨毛膜促性腺 激素-β )、SCC(鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原)、類(lèi)風(fēng)濕因子、HbAlc、肌酐、纖維蛋白原、各種病 毒(肝炎病毒、HTLV-I、HIV、HCV、HBs、HBe)抗原、各種酶等。本發(fā)明中，所述不溶性載體顆粒所負(fù)載的抗體沒(méi)有特別限定，例如可以根據(jù)分析 對(duì)象適當(dāng)決定。所述抗體的種類(lèi)沒(méi)有特別限定，可以列舉例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等免 疫球蛋白分子，F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2等抗體片段等。所述抗體可以通過(guò)以往公知的方法由例 如小鼠、兔子、山羊、綿羊、雞等來(lái)源的血清進(jìn)行制備，也可以利用市售的各種抗體，沒(méi)有特 別限定。作為所述抗體的具體例子沒(méi)有特別限定，可以列舉例如針對(duì)所述各種抗原的抗體等。所述不溶性載體顆粒所負(fù)載的抗體，例如可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗 體。所述致敏反應(yīng)工序中，所述不溶性載體顆粒上例如可以負(fù)載所述兩種抗體，也可以只負(fù) 載所述兩種抗體中的一種。
本發(fā)明的制造方法中，所述致敏反應(yīng)液中的所述抗體的濃度沒(méi)有特別限定，例如 為0. 01mg/mL 20mg/mL的范圍，優(yōu)選為0. 05mg/mL 10mg/mL的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為 0. lmg/mL 5mg/mL的范圍。此外，作為所述抗體，用所述多克隆抗體和所述單克隆抗體 這兩種抗體致敏所述不溶性載體顆粒時(shí)，所述多克隆抗體和所述單克隆抗體的抗體濃度 比(多克隆抗體單克隆抗體的比)沒(méi)有特別限定，例如為1 9 7 3的范圍，優(yōu)選為 1 9 5 5的范圍。另外，所述致敏反應(yīng)液中的所述多克隆抗體和單克隆抗體的比率， 例如可以是重量比，也可以是抗體分子數(shù)的比。本發(fā)明的制造方法中，所述致敏反應(yīng)液包含所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸、所述抗體 或抗原、和所述不溶性載體顆粒，還可以進(jìn)一步包含其它成分。所述其它成分沒(méi)有特別限 定，可以列舉例如緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)等。作為所述緩沖液，沒(méi)有特別限定，可以使用例如MES(2-(N_嗎啉代)乙磺酸)緩沖 液、磷酸緩沖液、Tris (三羥甲基氨基甲烷)緩沖液等。所述緩沖液的pH例如為pH5 9的 范圍，優(yōu)選為PH6. O 7. 5的范圍。本發(fā)明的制造方法中，所述致敏反應(yīng)工序可以使用例如化學(xué)結(jié)合法等以往公知的 方法而適當(dāng)實(shí)施，沒(méi)有特別限定。本發(fā)明的制造方法除了所述致敏反應(yīng)工序以外沒(méi)有特別限定，還可以進(jìn)一步具有 例如官能團(tuán)活化工序、清洗工序、封閉工序等。所述官能團(tuán)活化工序?yàn)?，例如在所述致敏反?yīng)工序前，將所述不溶性載體顆粒表 面所附加的氨基或羧基等所述官能團(tuán)活化的工序。所述官能團(tuán)活化工序沒(méi)有特別限定，例 如可以使所述不溶性載體顆粒在包含NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)和EDAC (1-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基)碳二亞胺)的緩沖液中反應(yīng)。作為所述官能團(tuán)，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如 前述的官能團(tuán)等。所述清洗工序?yàn)?，例如將所述不溶性載體顆粒用緩沖液等進(jìn)行清洗的工序。所述 清洗工序優(yōu)選為例如在所述致敏反應(yīng)工序之后進(jìn)行。所述清洗工序沒(méi)有特別限定，可以采 用以往公知的方法而實(shí)施。作為所述緩沖液，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如所述的MES緩沖 液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。所述封閉工序優(yōu)選為例如在所述清洗工序之后進(jìn)行。所述封閉工序?yàn)?，為了抑?作為測(cè)定對(duì)象的抗原或抗體的非特異性結(jié)合，通過(guò)例如BSA等包覆所述不溶性載體顆粒表 面的工序。所述封閉工序可以通過(guò)例如以往公知的方法而適當(dāng)實(shí)施，例如將所述不溶性載 體顆粒在包含所述封閉劑的緩沖液中靜置一夜。作為所述封閉劑，沒(méi)有特別限定，可以列舉 例如B SA等。作為所述緩沖液，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如前述的緩沖液等。<不溶性載體顆粒>如前所述，本發(fā)明的不溶性載體顆粒為用于免疫比濁法的不溶性載體顆粒，為通 過(guò)本發(fā)明的制造方法而制造的不溶性載體顆粒。所述本發(fā)明的不溶性載體顆粒除了通過(guò)所 述本發(fā)明的制造方法而制造以外，沒(méi)有任何限定。另外，本發(fā)明中，負(fù)載抗體或抗原的不溶 性載體顆粒、所述不溶性載體顆粒所負(fù)載的抗體或抗原如前所述。通過(guò)本發(fā)明的制造方法而制造的不溶性載體顆粒，例如所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸 與所述顆粒表面結(jié)合。作為所述結(jié)合的方法，沒(méi)有特別限定，例如所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸 可以與所述不溶性載體顆粒如前所述直接結(jié)合，也可以間接性結(jié)合。后者的情況下，所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸殘基可以與例如在所述不溶性載體顆粒的表面化學(xué)結(jié)合的官能團(tuán)結(jié)合。<測(cè)定試劑>如前所述，本發(fā)明的測(cè)定試 劑包含本發(fā)明的不溶性載體顆粒。本發(fā)明的測(cè)定試劑 中，作為所述本發(fā)明的不溶性載體顆粒，可以使用通過(guò)本發(fā)明的制造方法A和制造方法B中 的任意一種制造方法而制造的不溶性載體顆粒，也可以組合使用通過(guò)所述各制造方法分別 制造的不溶性載體顆粒。 本發(fā)明的測(cè)定試劑可以包含例如不溶性載體顆粒群。另外，本發(fā)明中，所述不溶性 載體顆粒群是指，例如包含多個(gè)具有一定的性能和形狀的所述不溶性載體顆粒的不溶性載 體顆粒群。所述不溶性載體顆粒群例如可以包含一種不溶性載體顆粒群，也可以包含多種 不溶性載體顆粒群，沒(méi)有特別限定。前者的情況下，所述不溶性載體顆粒群為包含多個(gè)本發(fā) 明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。此外，后者的情況下，所述不溶性載體顆粒群可 以包含一種或兩種以上例如所述含有多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。所述不溶性載體顆粒群沒(méi)有特別限定，優(yōu)選的是，例如包含兩種以上平均粒徑不 同的不溶性載體顆粒群，其中，至少一種不溶性載體顆粒群為包含多個(gè)本發(fā)明的不溶性載 體顆粒的不溶性載體顆粒群。所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種以上的不 溶性載體顆粒群時(shí)，所述包含多個(gè)本發(fā)明的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群沒(méi)有特 別限定，可以為例如平均粒徑不同的多種不溶性載體顆粒群中平均粒徑最大的不溶性載 體顆粒群。本發(fā)明的測(cè)定試劑通過(guò)包含所述平均粒徑不同的兩種以上的不溶性載體顆粒 群，能夠在更寬的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，此外，能夠得到充分高的測(cè)定精度。所述平均粒徑 的種類(lèi)沒(méi)有特別限定，可以列舉例如數(shù)均粒徑、長(zhǎng)度平均粒徑、平均(體積_面積)粒徑 (Volume-Surface meandiameter)、質(zhì)量平均粒徑、體積平均粒徑、表面積平均粒徑、比表面 積等價(jià)粒徑(equivalent specific surface diameter)、中值粒徑、眾數(shù)徑等。本發(fā)明中，“不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種以上的不溶性載體顆粒 群”可以指例如，在通過(guò)以往公知的規(guī)定的方法求出平均粒徑時(shí)，所述不溶性載體顆粒群 包含顯示不同的平均粒徑的兩種以上的不溶性載體顆粒群；也可以指在測(cè)定所使用的全 部不溶性載體顆粒的粒徑分布時(shí)，直方圖中顯示2個(gè)以上的峰。后者的情況下，本發(fā)明中， “包含平均粒徑不同的兩種以上的不溶性載體顆粒群的不溶性載體顆粒群”也可以指例如 “其粒度分布具有2個(gè)以上的峰的不溶性載體顆粒群”。作為所述粒度分布的測(cè)定方法，可 以列舉例如使用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡的顯微鏡法、光散射法、遮光法、激光衍射法、電 阻法、電感帶法(electric sensing zone method)、篩分法、液相沉降法、離心沉降法、慣性 碰撞法等。所述平均粒徑也可以從通過(guò)這種測(cè)定方法得到的粒度分布算出。本發(fā)明中，所 述平均粒徑不同的兩種以上的不溶性載體顆粒群也可以是能夠通過(guò)網(wǎng)眼大小不同的兩種 以上的篩子進(jìn)行分類(lèi)的兩種以上的不溶性載體顆粒群。此外，分別以各平均粒徑作為基準(zhǔn)，所述不溶性載體顆粒群中所含有的平均粒徑 不同的兩種以上的不溶性載體顆粒群例如可以含有粒徑為平均粒徑士 15%的顆粒，優(yōu)選含 有粒徑為平均粒徑士 5 %的顆粒。所述平均粒徑不同的不溶性載體顆粒群的種類(lèi)只要為兩種以上，則沒(méi)有特別限 定，例如為2 5種，優(yōu)選為2 3種，更優(yōu)選為兩種。所述不溶性載體顆粒群包含例如平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群時(shí)，平均粒徑大的不溶性載體顆粒(以下，稱為“大顆?！薄?群的所述平均粒徑?jīng)]有特別限定，例如 為0. 08 μ m 2. 0 μ m的范圍，優(yōu)選為0. 1 μ m 1. 0 μ m的范圍，更優(yōu)選為0. 12ym~0. 5ym 的范圍。此外，此時(shí)，平均粒徑小的不溶性載體顆粒(以下，稱為“小顆粒”。)群的平均粒 徑也沒(méi)有特別限定，例如為0. 03 μ m 0. 2 μ m的范圍，優(yōu)選為0. 05 μ m 0. 15 μ m的范圍， 更優(yōu)選為0. 07μπι 0. 12 μ m的范圍。所述不溶性載體顆粒群包含所述平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群時(shí)，沒(méi)有 特別限定，但優(yōu)選例如所述大顆粒和小顆粒中的至少任意一者負(fù)載有多克隆抗體和單克隆 抗體。這樣負(fù)載有抗體的測(cè)定試劑，例如能夠以很少的顆粒量和抗體量，高靈敏度地測(cè)定從 低濃度到高濃度的測(cè)定對(duì)象，且能夠?qū)⒋郎y(cè)物的稀釋率設(shè)定為較低。本發(fā)明的測(cè)定試劑中的所述不溶性載體顆粒濃度沒(méi)有特別限定，例如為0. Ollw/ ν % 15w/v %的范圍，優(yōu)選為0. 06w/v % 6w/v %的范圍，更優(yōu)選為0. 15w/v % 1. 5w/v % 的范圍。本發(fā)明的測(cè)定試劑包含例如所述平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群時(shí)，所述 測(cè)定試劑中的所述大顆粒的濃度例如為0. 001w/v% 5 八％的范圍，優(yōu)選為0. 01w/v% lw/v%的范圍，更優(yōu)選為0. 05w/v% 0.范圍。本發(fā)明的測(cè)定試劑包含例如所述平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群時(shí)，所述 測(cè)定試劑中的所述小顆粒群的所述顆粒濃度例如為0.01w/v% 10 八％的范圍，優(yōu)選為 0. 05w/v% 5w/v%的范圍，更優(yōu)選為0. lw/v% 范圍。本發(fā)明的測(cè)定試劑中，作為除了所述不溶性載體顆粒以外的其它成分，還可以包 含例如緩沖液、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、糖苷、高分子化合物、防腐劑等。作為所述緩沖液，沒(méi)有特別限 定，可以列舉例如所述的MES緩沖液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。作為所述糖類(lèi)，沒(méi)有特 別限定，可以列舉例如蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等。作為所述蛋白質(zhì)，沒(méi)有特別限定，可以列舉 例如牛血清白蛋白(BSA)、明膠等。作為所述糖苷，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如皂角苷、洋 地黃皂苷等。作為所述高分子化合物，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如聚乙二醇、聚乙烯基吡 咯烷酮等。作為所述防腐劑，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如疊氮化鈉、Kathon(商標(biāo))等?！创郎y(cè)物分析用具〉如前所述，本發(fā)明的待測(cè)物分析用具，其特征在于含有本發(fā)明的測(cè)定試劑。本發(fā)明 的待測(cè)物分析用具只要含有本發(fā)明的測(cè)定試劑，則其它構(gòu)成和條件沒(méi)有任何限制。本發(fā)明 的待測(cè)物分析用具中，所述測(cè)定試劑例如根據(jù)其形態(tài)，可以以干燥體形式進(jìn)行配置，也可以 以分散液或者懸浮液等液體形式進(jìn)行配置。本發(fā)明的待測(cè)物分析用具的形態(tài)沒(méi)有任何限定，可以列舉例如測(cè)試盒、試驗(yàn)片、微 芯片等。這些待測(cè)物分析用具，優(yōu)選能夠連接到例如用于檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的凝集程度的 通用測(cè)定儀器上。作為所述測(cè)試盒，沒(méi)有特別限定，例如可以列舉以下形態(tài)基板具備配置有所述測(cè) 定試劑的試劑槽。作為所述測(cè)試盒，可以是如下形式等具有填充有用于免疫反應(yīng)的試劑的 存儲(chǔ)槽(試劑槽)或進(jìn)行免疫反應(yīng)的反應(yīng)槽，組裝入自動(dòng)分析裝置中，對(duì)待測(cè)物中所含的成 分進(jìn)行測(cè)定。這種情況下，本發(fā)明的測(cè)定試劑例如可以填充到所述存儲(chǔ)槽(試劑槽)中，也 可以填充到所述反應(yīng)槽中，沒(méi)有特別限定。所述測(cè)試盒中，例如所述測(cè)試盒在連接到例如所 述測(cè)定儀器之前或之后，將測(cè)定試樣導(dǎo)入配置有所述測(cè)定試劑的所述試劑槽，在抗原抗體反應(yīng)之后，通過(guò)所述測(cè)定儀器，可以測(cè)定所述試劑槽內(nèi)的凝集程度。此外，關(guān)于所述測(cè)試盒， 例如，所述基板可以進(jìn)一步具有通過(guò)流路而與所述試劑槽連接的反應(yīng)槽。此時(shí)，可以向所述 試劑槽導(dǎo)入測(cè)定試樣，使所述測(cè)定試樣與所述測(cè)定試劑的混合液通過(guò)所述流路而移動(dòng)到所 述反應(yīng)槽中，從而測(cè)定所述反應(yīng)槽內(nèi)的凝集程度。關(guān)于所述測(cè)試盒，根據(jù)所述凝集程度，能 夠測(cè)定例如待測(cè)物中所含的成分或者其濃度。配置于所述測(cè)試盒的所述試劑槽的所述本發(fā) 明的測(cè)定試劑，例如可以是液體(分散液)，也可以是干燥體。作為所述試驗(yàn)片，例如可以列舉在長(zhǎng)方形等的基板上配置有具有本發(fā)明的測(cè)定試 劑的試劑部的形態(tài)。作為所述試劑部的材質(zhì)，可以列舉例如濾紙或各種聚合物制的多孔質(zhì) 體。這樣的試驗(yàn)片，例如，將測(cè)定試樣添加到配置有所述測(cè)定試劑的所述試劑部，在抗原抗 體反應(yīng)后，通過(guò)所述測(cè)定儀器，可以測(cè)定所述試劑部中的凝集程度。作為所述試驗(yàn)片，可以 是例如在長(zhǎng)方形的支持體上具有含有所述測(cè)定試劑(免疫反應(yīng)用試劑)或檢測(cè)用試劑的 試劑層的試驗(yàn)片等。這樣的試驗(yàn)片，例如將測(cè)定試樣添加到含有本發(fā)明的不溶性載體顆粒 的所述試劑層，在抗原抗體反應(yīng)后，通過(guò)所述檢測(cè)用試劑，可以測(cè)定所述試劑部中的凝集程 度。所述檢測(cè)用試劑的組成沒(méi)有特別限定，可以列舉例如著色色素、熒光色素、緩沖液等。在 所述試驗(yàn)片中，所述本發(fā)明的測(cè)定試劑優(yōu)選例如以干燥狀態(tài)進(jìn)行配置。例如，在將所述多孔 質(zhì)體等配置到所述基板之前或之后，向所述多孔質(zhì)體等供給分散液狀的所述測(cè)定試劑，然 后將其干燥即可。所述微芯片等芯片例如可以列舉以下形態(tài)所述基板具有試樣的導(dǎo)入口、試劑部 和流路，所述導(dǎo)入口和所述試劑部通過(guò)所述流路而連結(jié)。這種芯片，例如，從所述導(dǎo)入口導(dǎo) 入測(cè)定試樣，使所述測(cè)定試樣通過(guò)所述流路向所述試劑部移動(dòng)，在所述試劑部進(jìn)行抗原抗 體反應(yīng)后，通過(guò)所述測(cè)定儀器，可以測(cè)定所述試劑部?jī)?nèi)的凝集程度。配置于所述芯片的所述 試劑部的所述本發(fā)明的測(cè)定試劑，例如可以為液體，也可以為干燥體。所述微芯片等芯片， 可以是例如具有試樣的導(dǎo)入和分離用的流路和試劑槽等的芯片。這種芯片，例如可以在所 述分離用的流路含有本發(fā)明的不溶性載體顆粒。此外，關(guān)于這些待測(cè)物分析用具，例如所述試劑部或試劑槽根據(jù)需要可以進(jìn)一步 含有用于檢測(cè)凝集體的檢測(cè)試劑?！疵庖弑葷岱ā等缜八?，本發(fā)明的免疫比濁法，其特征在于，具有以下工序凝集反應(yīng)工序，使顆 粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆粒與作為抗原或抗體的測(cè)定對(duì)象發(fā)生免疫反應(yīng)，使 所述不溶性載體顆粒在免疫反應(yīng)液中凝集；測(cè)定工序，對(duì)由所述凝集反應(yīng)帶來(lái)的所述免疫 反應(yīng)液的濁度變化進(jìn)行測(cè)定；作為所述不溶性載體顆粒，使用本發(fā)明的不溶性載體顆粒。 本發(fā)明的免疫比濁法除了具有所述工序且使用本發(fā)明的不溶性載體顆粒以外，沒(méi)有特別限 定，例如可以是膠乳免疫凝集法。本發(fā)明的免疫比濁法中，作為所述測(cè)定對(duì)象，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如前述的 抗體或抗原等。本發(fā)明的免疫比濁法中，包含所述測(cè)定對(duì)象的待測(cè)物沒(méi)有特別限定，可以列舉例 如臨床檢查中的一般的待測(cè)物。作為所述待測(cè)物，可以列舉例如全血、血細(xì)胞、血清、血漿、 溶血試樣、尿等生物試樣。本發(fā)明中，例如，可以將所采集的所述待測(cè)物直接作為測(cè)定試樣使用，也可以將在抗原抗體反應(yīng)之前預(yù)先對(duì)待測(cè)物實(shí)施了稀釋處理、過(guò)濾處理、加熱處理等的待測(cè)物作為測(cè) 定試樣使用。作為用于所述稀釋處理的溶劑，沒(méi)有特別限定，可以列舉水、生理鹽水、緩沖液等。作為所述緩沖液的緩沖劑，例如，只要不妨礙所述反應(yīng)即可，可以列舉例如 MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、磷酸、Tris(三羥甲基氨基甲烷)等。所述緩沖液中例如還 可以添加其它成分，例如，為了穩(wěn)定反應(yīng)，可以添加牛血清白蛋白(BSA)等。所述稀釋處理中的所述待測(cè)物的稀釋率沒(méi)有特別限定，例如，在使用所述的待測(cè) 物分析用具測(cè)定的情況下，也可以為低稀釋率。所述凝集反應(yīng)工序中，作為使所述負(fù)載有抗體或抗原的不溶性載體顆粒與所述測(cè) 定對(duì)象發(fā)生免疫反應(yīng)(抗原抗體反應(yīng))的方法，沒(méi)有特別限定，例如可以使用公知的方法。 作為所述反應(yīng)方法，例如可以向所述測(cè)定試樣中添加分散有所述不溶性載體顆粒群的分散 液而進(jìn)行反應(yīng)，也可以向所述不溶性載體顆粒群中添加所述測(cè)定試樣而進(jìn)行反應(yīng)。作為前 者的方法，例如可以應(yīng)用如前所述的測(cè)定試劑。后者的情況下，所述不溶性載體顆粒群例如 可以是分散液，也可以是干燥狀態(tài)。作為所述后者的方法，例如可以應(yīng)用如前所述的試驗(yàn) 片、微芯片、測(cè)試盒(cartridge)等待測(cè)物分析用具。具體而言，將所述不溶性載體顆粒群 例如以分散液或者干燥狀態(tài)預(yù)先配置在基板的試劑部，向所述試劑部添加所述測(cè)定試樣， 從而能夠進(jìn)行免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)液，除了所述不溶性載體顆粒和所述測(cè)定對(duì)象以外，還可以含有例 如所述的緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)等。所述免疫反應(yīng)液中的所述不溶性載體顆粒濃度沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為0. Ollw/ v% lw/v%的范圍，更優(yōu)選為0. 033w/v% 0. 5w/v%的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 055w/ v% 0. 3 八％的范圍。此外，所述不溶性載體顆粒濃度中，所述小顆粒群的所述顆粒濃度 優(yōu)選為0. 0 lw/v % 0. 5w/v %的范圍，更優(yōu)選為0. 03w/v % 0. 3w/v %的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選 為0. 05w/v% 0. 2 八％的范圍。此外，所述不溶性載體顆粒濃度中，所述大顆粒群的顆粒 濃度優(yōu)選為0. 00lw/v% 0. 05w/v%的范圍，更優(yōu)選為0. 003w/v% 0. 04w/v%的范圍，進(jìn) 一步優(yōu)選為0. 005w/v% 0.范圍。所述免疫反應(yīng)液中，所述小顆粒群的顆粒與所述大顆粒群的顆粒的比例沒(méi)有特 別限定。作為具體例子，所述小顆粒群的顆粒與所述大顆粒群的顆粒的重量比優(yōu)選為 100 1 1 100的范圍，更優(yōu)選為10 1 1 10的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為5 1 1 5的范圍。本發(fā)明的免疫比濁法中，測(cè)定所述免疫反應(yīng)液的濁度變化的測(cè)定工序，例如可以 使用通用的測(cè)定裝置等，通過(guò)測(cè)定所述免疫反應(yīng)液的吸光度的變化來(lái)實(shí)施。作為具體例子，以血液作為待測(cè)物，將用于通過(guò)免疫比濁檢測(cè)CRP的免疫反應(yīng)液 的條件示于以下，但本發(fā)明不限于此。所述免疫反應(yīng)液中的所述不溶性載體顆粒濃度沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為0. Ollw/ v% lw/v %的范圍，更優(yōu)選為0. 033w/v% 0. 5w/v%的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 055w/ v% 0. 3 八％的范圍。此外，所述不溶性載體顆粒濃度中，所述小顆粒群的所述顆粒濃度 優(yōu)選為0. 01w/v% 0. 5w/v%的范圍，更優(yōu)選為0. 03w/v% 0. 3w/v%的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選 為0. 05w/v% 0. 2 八％的范圍。此外，所述不溶性載體顆粒濃度中，所述大顆粒群的顆粒濃度優(yōu)選為O. 001w/v% 0. 05w/v%的范圍，更優(yōu)選為0. 003w/v% 0. 04w/v%的范圍，進(jìn) 一步優(yōu)選為0. 005w/v% 0.范圍。接著，測(cè)定由于 所述凝集反應(yīng)而產(chǎn)生的濁度變化。即，例如，根據(jù)濁度變化，來(lái)檢測(cè) 由于所述免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的所述不溶性載體顆粒的凝集程度。由此，可以間接地定量所述 測(cè)定對(duì)象。作為所述免疫反應(yīng)的測(cè)定方法，沒(méi)有特別限定，例如可以列舉通過(guò)光學(xué)方法測(cè)定 免疫反應(yīng)后的所述免疫反應(yīng)液的吸光度或散射光等的方法。所述光學(xué)方法中，例如，可以使 用通用的光學(xué)測(cè)定儀器。此外，測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)方法也沒(méi)有特別限定，例如，可以將所述免 疫反應(yīng)的反應(yīng)開(kāi)始后一定時(shí)間內(nèi)的吸光度變化量作為指標(biāo)。此時(shí)，作為所述反應(yīng)開(kāi)始后一 定時(shí)間，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為反應(yīng)開(kāi)始后O 5分鐘的范圍，更優(yōu)選為30 180秒鐘的范 圍，進(jìn)一步優(yōu)選為30 150秒鐘的范圍。所述定量，例如，可以基于含有已知濃度的測(cè)定對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)試樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn) 行。作為具體例子，首先，準(zhǔn)備多個(gè)設(shè)定為目標(biāo)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)試樣，使它們?cè)谕瑯拥臈l件 下發(fā)生免疫反應(yīng)，根據(jù)濁度變化檢測(cè)其凝集程度。然后，由表示所述濁度的吸光度等測(cè)定值 的變化和所述已知濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將待測(cè)物的測(cè)定值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而能夠 定量所述待測(cè)物中的測(cè)定對(duì)象。實(shí)施例接著，結(jié)合比較例而對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。另外，本發(fā)明不受以下的實(shí)施例 和比較例的限定或限制。(實(shí)施例1-1)本例中，作為極性電荷側(cè)鏈氨基酸，使用賴氨酸鹽酸鹽，通過(guò)下述方法，調(diào)制測(cè)定 試齊LUA.不溶性載體顆粒的調(diào)制本例中，使用平均粒徑為0.096μπι的羧基改性聚苯乙烯膠乳顆粒(10%溶液， ceradyne, inc.制)作為所述小顆粒，使用0. 213 μ m的羧基改性聚苯乙烯膠乳顆粒(10% 溶液，ceradyne, inc.制)作為所述大顆粒。首先，向下述表1所示的組成的活化液中添 加所述小顆粒，在室溫(25°C )下反應(yīng)1小時(shí)，使所述小顆粒表面的官能團(tuán)活化。另外，向 500mmol/L的MES緩沖液(pH6. 1)中添加所述MES緩沖液以外的成分后，添加蒸餾水達(dá)到該 表所示的最終濃度，調(diào)制所述活化液。下述組成所示的濃度為所述活化液中混合了所述小 顆粒后的全部液體中各成分的最終濃度，使該全部液體中的所述小顆粒的最終濃度為Iw/ v%。反應(yīng)結(jié)束后，離心分離(60000rpm，15分鐘)，除去上清，將所述活化了官能團(tuán)的小顆 粒懸浮于50mmol/L MES緩沖液(pH6. 1)中，用超聲波使其再分散，然后清洗。再次進(jìn)行該 清洗工序后，離心分離(60000rpm，15分鐘)，并除去上清。將得到的所述小顆粒用所述MES 緩沖液懸浮，用超聲波使其再分散，得到膠乳液(小顆粒)。另外，使所述膠乳液(小顆粒) 中的所述小顆粒的濃度為。此外，除了代替所述小顆粒而使用所述大顆粒以外，與所 述膠乳液(小顆粒)的調(diào)制同樣地，調(diào)制膠乳液(大顆粒)。[表1](活化液的組成) 試劑
最終濃度
MES ( pH6.1,同仁化學(xué)研究所制) NHS水溶液※1 EDAC水溶液※2
50mmol/L
1 .Ommol/L
100mmol/L※！ NHS(N_羥基琥珀酰亞胺，少力，4歹義夕公司制)※？ :EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，Sigma公司制)接著，向下述表2所示的組成的小顆粒用致敏反應(yīng)液中混合所述膠乳液(小顆 粒)，在室溫(25°C)下反應(yīng)1小時(shí)，用多克隆抗體和單克隆抗體致敏所述小顆粒。另外，向 500mmol/L的MES緩沖液(pH6. 1)中添加所述MES緩沖液以外的成分后，添加蒸餾水達(dá)到 該表所示的濃度，調(diào)制所述小顆粒用致敏反應(yīng)液。下述表2所示的組成所示的濃度為在所 述小顆粒用致敏反應(yīng)液中混合了所述膠乳液(小顆粒)后的全部液體中的各成分的最終濃 度，使該全部液體中的小顆粒的最終濃度為lw/v%。另外，所述小顆粒用致敏反應(yīng)液中，用 于致敏所述小顆粒的多克隆抗體和單克隆抗體的抗體濃度比(重量比)為多克隆抗體單 克隆抗體=1 9。[表2]
(小顆粒用致敏反應(yīng)液的組成)
組成__MES ( pH6.1,同仁化學(xué)研究所制) 50mmol/L BSA ( Sigma公司制)lmg/mL
單克隆抗體液※10.36mg/mL多克隆抗體液※20.04mg/mL※！兔來(lái)源的抗人CRP單克隆抗體液(抗體濃度 10. 5mg/mL,克隆號(hào) No. 8，Immuno Probe Co.，Ltd.制)※？兔來(lái)源的抗人CRP多克隆抗體液(蛋白質(zhì)濃度 12. 2mg/mL, Oriental Yeast Co.，ltd.制)將致敏反應(yīng)后的所述小顆粒離心分離(60000rpm，15分鐘)后，懸浮于50mmol/L MES緩沖液(pH6. 1)中，用超聲波分散后，清洗。再次離心分離(60000rpm，15分鐘)，除去上 清后，將清洗后的所述小顆粒懸浮于所述MES緩沖液中。將懸浮后的所述小顆粒與封閉緩 沖液(50mmol/L MES緩沖液(pH6. l),4w/v% BSA)混合，達(dá)到1 八％的濃度。通過(guò)超聲波使 所述小顆粒分散后，在4°C下靜置一夜，進(jìn)行封閉處理。封閉處理后，離心分離(60000rpm， 10分鐘)，回收所述小顆粒，使用下述表3所示組成的分散液分散所述小顆粒，使小顆粒的 分散濃度為3. 33w/v%，調(diào)制小顆粒分散液。[表3]
權(quán)利要求
1. 一種不溶性載體顆粒的制造方法，其為在顆粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆 粒的制造方法，其具有下述(A)和(B)中的至少一個(gè)致敏反應(yīng)工序(A)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所述抗 體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，所述致敏反應(yīng)液中的所述極性電荷側(cè)鏈氨基酸濃度為超過(guò)0. lmol/L且lmol/L以下的 范圍；(B)該致敏反應(yīng)工序?yàn)樵谥旅舴磻?yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所述抗 體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸的致敏反應(yīng)工序，作為所述不溶性載體顆粒，使用化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不溶性載體顆粒的制造方法，其中，所述極性電荷側(cè)鏈氨基 酸為堿性氨基酸或酸性氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不溶性載體顆粒的制造方法，在所述(A)的致敏反應(yīng)工序中， 所述不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不溶性載體顆粒的制造方法，在所述(A)的致敏反應(yīng)工序中， 所述膠乳顆粒為化學(xué)結(jié)合用膠乳顆粒。
5. 一種不溶性載體顆粒，其為用于免疫比濁法的不溶性載體顆粒，且通過(guò)權(quán)利要求1 所述的不溶性載體顆粒的制造方法而制得。
6. 一種測(cè)定試劑，其特征在于，其為用于免疫比濁法的測(cè)定試劑，且含有權(quán)利要求5所 述的不溶性載體顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其包含含有多個(gè)不溶性載體顆粒的不溶性載體顆 粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群，所述兩種不溶性載體顆粒群中，至少一種不溶性載體顆粒群為包含多個(gè)權(quán)利要求5所 述的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定試劑，在所述兩種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑較大 的不溶性載體顆粒群為包含多個(gè)權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平均粒 徑為0. 03 2. Oym的范圍。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平均 粒徑為0. 08 2. Ομπι的范圍。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平均 粒徑為0. 12 0. 5μπι的范圍。
12.一種待測(cè)物分析用具，其含有權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的待測(cè)物分析用具，其中，所述待測(cè)物分析用具為試驗(yàn)片、測(cè) 試盒和微芯片中的任意一種。
14.一種免疫比濁法，其特征在于，所述免疫比濁法具有以下工序凝集反應(yīng)工序，使在顆粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆粒與作為抗原或抗體的 測(cè)定對(duì)象發(fā)生免疫反應(yīng)，使所述不溶性載體顆粒在免疫反應(yīng)液中凝集；測(cè)定工序，對(duì)所述凝集反應(yīng)所產(chǎn)生的所述免疫反應(yīng)液的濁度變化進(jìn)行測(cè)定；作為所述不溶性載體顆粒，使用權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫比濁法，在所述凝集反應(yīng)工序中，使用包含多個(gè)不溶 性載體顆粒的不溶性載體顆粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的兩種不溶性載體顆粒群，所述兩種不溶性載體顆粒群中的至少一種為包含多個(gè)權(quán)利要求5所述的不溶性載體 顆粒的不溶性載體顆粒群。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫比濁法，在所述兩種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑 較大的不溶性載體顆粒群為包含多個(gè)權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆 粒群。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫比濁法，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平 均粒徑為0. 03 2. O μ m的范圍。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫比濁法，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平 均粒徑為0. 08 2. 0 μ m的范圍。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫比濁法，其中，權(quán)利要求5所述的不溶性載體顆粒的平 均粒徑為0. 12 0. 5 μ m的范圍。
全文摘要
提供一種測(cè)定試劑、使用了該測(cè)定試劑的免疫比濁法及該測(cè)定試劑的制造方法，所述測(cè)定試劑即使所負(fù)載的抗體量增加，也能夠抑制非特異性凝集，測(cè)定濃度范圍很寬，且測(cè)定靈敏度高。本發(fā)明的不溶性載體顆粒的制造方法為顆粒表面負(fù)載抗體或抗原的不溶性載體顆粒的制造方法，其具有以下致敏反應(yīng)工序在致敏反應(yīng)液中，在極性電荷側(cè)鏈氨基酸的存在下，使所述抗體或抗原與所述不溶性載體顆粒接觸。通過(guò)本發(fā)明的制造方法得到的本發(fā)明的不溶性載體顆粒由于能夠抑制非特異性凝集，因此分散性優(yōu)異，如圖3的實(shí)施例1-1～1-4所示，通過(guò)免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定濃度范圍很寬，測(cè)定靈敏度高。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102007412SQ20098011378
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者高木英紀(jì) 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社