專利名稱：用抗體陣列選擇乳腺癌治療藥物的制作方法
用抗體陣列選擇乳腺癌治療藥物相關(guān)申請的交叉參考本申請是2009/2/24提交的PCT申請PCT/US2009/035013的后續(xù)部分，該 PCT申請要求2008/2/25提交的美國臨時申請序列號61/031,319、2008/10/24提交的 美國臨時申請序列號61/106,404、2008/10/24提交的美國臨時申請序列號61/108,384、 2008/11/25提交的美國臨時申請序列號61/117,908、以及2008/12/23提交的美國臨時 申請序列號61/140,558的優(yōu)先權(quán)，通過引用將這些申請的內(nèi)容全文納入本文用于所有目 的。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程負(fù)責(zé)各種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞分裂和死亡、代謝、免疫 細(xì)胞活化、神經(jīng)傳遞和感知覺等等。因此，細(xì)胞正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的錯亂可導(dǎo)致許多疾病狀 態(tài)，例如糖尿病、心臟病、自身免疫病和癌癥。一種經(jīng)充分特征鑒定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是MAP激酶途徑，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)表皮生長因 子(EGF)的信號從而促進(jìn)細(xì)胞增殖(參見，

圖1)。EGF能結(jié)合連接酪氨酸激酶的跨膜受 體，即通過EGF結(jié)合可活化表皮生長因子受體(EGFR)。EGF與EGFR結(jié)合活化了該受 體胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活性。該激酶活化的一種結(jié)果是EGFR的酪氨酸殘基自身磷 酸化。被活化EGFR上的磷酸化酪氨酸殘基為含有SH2結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，例如GRB2 的結(jié)合提供了停泊位點(diǎn)。作為銜接蛋白，GRB2的功能還能通過GRB2上的SH3結(jié)構(gòu)域 結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS。形成EGFR-GRB2-S0S復(fù)合物而導(dǎo)致SOS活化(能 促進(jìn)除去Ras中的GDP)鳥嘌呤核苷酸交換因子。GDP除去后，Ras才能結(jié)合GTP而被 活化。活化后，Ras結(jié)合并活化一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶-RAF激酶-的蛋 白激酶活性。然后活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖。概括地說，RAF激酶隨 后磷酸化活化另一種絲氨酸/蘇氨酸激酶MEK。活化的MEK磷酸化活化促分裂原活化 的蛋白激酶(MAPK)。MAPK進(jìn)一步磷酸化的靶標(biāo)是40S核糖體蛋白S6激酶(RSK)。 MAPK磷酸化RSK可導(dǎo)致RSK激活，進(jìn)而磷酸化核糖體蛋白S6。MAPK的另一已知靶 標(biāo)是各種癌癥中對細(xì)胞增殖至關(guān)重要的基因_突變的原癌基因c-Myc。MAPK還能磷酸 化激活另一種蛋白激酶MNK，進(jìn)而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB。MAPK也能間接調(diào)節(jié)Fos基 因的轉(zhuǎn)錄，而該基因還編碼參與細(xì)胞增殖的另一種轉(zhuǎn)錄因子。通過改變這些轉(zhuǎn)錄因子的 水平和活性，MAPK將EGF的最初胞外信號轉(zhuǎn)換成對細(xì)胞周期進(jìn)程至關(guān)重要的基因轉(zhuǎn)錄 改變。鑒于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞生長中所起的核心作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的突變和其它 改變導(dǎo)致細(xì)胞增殖途徑異常激活而產(chǎn)生許多癌癥并不令人驚奇。例如，EGFR的過表達(dá) 或過度活化與許多癌癥，包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌和肺癌相關(guān)。這促進(jìn)開發(fā)了 針對EGFR的抗癌藥物，包括用于肺癌的吉非替尼(gefitinib)和埃洛替尼(erlotinib)，以 及用于結(jié)腸癌的西妥昔單抗(cetuximab)。西妥昔單抗是單克隆抗體抑制劑的一個例子，它能結(jié)合EGFR的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，阻止其配體結(jié)合活化EGFR酪氨酸激酶。相反，吉非替尼和埃洛替尼是抑制位 于胞內(nèi)的EGFR酪氨酸激酶的小分子。沒有這些激酶活性，EGFR的酪氨酸殘基不能自 身磷酸化，而這是下游銜接蛋白，例如GRB2結(jié)合的先決條件。通過中斷細(xì)胞中的信號 級聯(lián)反應(yīng)(細(xì)胞生長依賴該途徑)，減少了腫瘤的增殖和遷移。此外，其它研究顯示約70%的人黑色素瘤和較低比例其它腫瘤的Raf基因中含 有導(dǎo)致MAPK途徑持久活化的點(diǎn)突變(V599E)(參見，例如Davies等，Nature，417 949-954 (2002))。這些結(jié)果提示特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的突變可能是某些類型腫瘤特征性 的，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的這種特異性改變可能是化療干預(yù)有希望的靶點(diǎn)。鑒于不同的癌癥治療，特別是癌癥化療可能分別通過阻斷或活化參與細(xì)胞增殖 或死亡的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而直接或間接起作用，那么可將某特定形式癌癥中的某給定 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化用作各種癌癥治療方法效力是否良好的指標(biāo)。因此，除了滿足這些 要求外，本發(fā)明提供了潛在抗癌治療對個體患者效力的評估方法。因此，本發(fā)明提供了 協(xié)助醫(yī)師為各患者選擇劑量合適和時間合適的癌癥治療的方法。發(fā)明簡述本發(fā)明提供檢測腫瘤細(xì)胞(例如，乳腺腫瘤的循環(huán)細(xì)胞)中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分 活化狀態(tài)的組合物和方法?？衫脤?shí)施本發(fā)明獲得的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分活化狀態(tài)的信 息進(jìn)行癌癥的診斷、預(yù)后和設(shè)計(jì)癌癥治療方法。本發(fā)明一方面提供選擇治療乳腺腫瘤合適抗癌藥物的方法，所述方法包括(a)給予抗癌藥物后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物一起培 育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；和(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥物時所產(chǎn)生的參比活化 狀態(tài)，確定該抗癌藥物是否適于治療該乳腺腫瘤。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，選擇治療乳腺腫瘤合適抗癌藥物的方法包括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物一起培 育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥物時所產(chǎn)生的參比活化 狀態(tài)；和(e)當(dāng)一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)比參比活化狀態(tài)實(shí)質(zhì)性降低時，表明該 抗癌藥適合治療乳腺腫瘤。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于幫助或輔助篩選治療乳腺腫瘤的合適 抗癌藥。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于促進(jìn)對治療乳腺腫瘤合適抗癌藥的篩選。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定乳腺腫瘤對抗癌藥治療反應(yīng)的方法，所述方法包 括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；和(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時所產(chǎn)生的參比活化狀 態(tài)，鑒定該乳腺腫瘤是否對該抗癌藥有反應(yīng)或無反應(yīng)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，鑒定乳腺腫瘤對抗癌藥治療反應(yīng)的方法包括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；(d)比較一種或多種分析物的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時所產(chǎn)生的參比活化狀態(tài)； 和(e)當(dāng)一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)比參比活化狀態(tài)實(shí)質(zhì)性降低時，表明該 乳腺腫瘤對于用該抗癌藥治療有反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于幫助或輔助鑒定乳腺腫瘤對抗癌藥治 療的反應(yīng)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于促進(jìn)對某抗癌藥治療有反應(yīng)的乳腺 腫瘤的鑒定。在還有另一方面，本發(fā)明提供預(yù)測患乳腺腫瘤對象對抗癌藥治療有無反應(yīng)的方 法，所述方法包括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；和(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時所產(chǎn)生的參比活化狀 態(tài)，預(yù)測該對象對該抗癌藥治療有反應(yīng)的可能性。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，預(yù)測患乳腺腫瘤對象對抗癌藥治療有無反應(yīng)的方法包 括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離腫瘤細(xì)胞與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(C)用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，檢 測細(xì)胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛在固體支持物 上；
(d)比較一種或多種分析物的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時所產(chǎn)生的參比活化狀態(tài)； 和(e)當(dāng)一種或多種分析物的活化狀態(tài)比參比活化狀態(tài)實(shí)質(zhì)性降低時，表明該對象 對該抗癌藥治療可能有反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于幫助或輔助預(yù)測對象對抗癌藥治療有 反應(yīng)的可能性。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于促進(jìn)對象可能對抗癌藥治療有 反應(yīng)的預(yù)測。在還有一方面，本發(fā)明提供具有優(yōu)秀動態(tài)范圍的陣列，其包含多個束縛于固體 支持物上的系列稀釋捕捉抗體，各系列稀釋捕捉抗體是對應(yīng)于細(xì)胞提取物中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑組分的一種或多種分析物或其他蛋白質(zhì)(如細(xì)胞核激素受體)的特異性抗體。本文所 述的可尋址陣列尤其可用于測定涉及乳腺癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和其他蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活 化狀態(tài)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測截短受體存在(或不存在)的方法，所述方 法包括以下步驟(a)將細(xì)胞提取物與多個全長受體胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)的特異珠一起培育；(b)從細(xì)胞提取物中除去多個珠，從而除去全長受體形成缺乏全長受體的細(xì)胞提 取物；(c)將不含全長受體的細(xì)胞提取物與多個捕捉抗體一起培育，其中所述多個捕捉 抗體是截短受體胞內(nèi)域(ICD)結(jié)合區(qū)的特異性抗體，該多個捕捉抗體被束縛在固體支持 物上，從而形成多個被捕獲的截短受體；(d)將該多個被捕獲截短受體與相應(yīng)截短受體的特異性檢測抗體一起培育，形成 多個可檢測的被捕獲截短受體；(e)將多個可檢測的被捕獲截短受體與信號放大對第一和第二成員一起培育，產(chǎn) 生放大的信號；和(f)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種檢測截短受體存在(或不存在)的方法，所述 方法包括以下步驟(a)將細(xì)胞提取物與多個全長受體胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)特異珠一起培育；(b)從所述細(xì)胞提取物中除去多個珠，從而除去全長受體形成缺乏全長受體的細(xì) 胞提取物；(c)將不含全長受體的細(xì)胞提取物與多個捕捉抗體一起培育，其中所述多個捕捉 抗體是截短受體胞內(nèi)域(ICD)結(jié)合區(qū)的特異性抗體，該多個捕捉抗體被束縛在固體支持 物上，從而形成多個被捕獲的截短受體；(d)將該多個被捕獲截短受體與檢測抗體一起培育形成多個可檢測的被捕獲的截 短受體，所述檢測抗體包含相應(yīng)被截短受體的特異性多個活化狀態(tài)非依賴性抗體和多個 活化狀態(tài)依賴性抗體，其中所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分子標(biāo)記，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號 放大對的第一成員標(biāo)記，所述輔助分子能產(chǎn)生傳送給信號放大對第一成員并與之反應(yīng)的 氧化劑；
(e)將多個可檢測的被捕獲的截短受體與信號放大對第二成員一起培育，產(chǎn)生放 大的信號；和(f)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下詳述和附圖可以明白本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡要說明圖1顯示了可用于實(shí)施本發(fā)明的參與細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的例子。描述了 細(xì)胞用于將絲裂信號轉(zhuǎn)變成細(xì)胞增殖的EGFR/MAPK/ERK途徑的諸組分。圖2顯示了本發(fā)明的一個實(shí)施方式，其中，本文所述的鄰近試驗(yàn)可檢測磷酸化 EGFR(pEGFR)和磷酸化HER-2 (pHER_2)，其靈敏度為一個細(xì)胞。圖3顯示了本文所述的鄰近試驗(yàn)檢測HER-2為高特異性試驗(yàn)，可檢測一個細(xì)胞 水平細(xì)胞表達(dá)的HER-2。圖4是用本發(fā)明可尋址陣列選擇癌癥治療期間藥物的示意圖。圖5顯示了包含受體酪氨酸激酶途徑諸組分，例如EGFR/MAPK/ERK途徑諸組 分稀釋抗體的可尋址陣列的示意性例子。四種不同稀釋度的抗體一式3份被固定在可尋 址陣列上。圖6顯示了包含腫瘤血管生成中被活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分的稀釋抗體的可 尋址陣列的示意性例子。以四種不同稀釋度的抗體一式3份被固定在可尋址陣列上。圖7顯示了包含腫瘤血管生成中被活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分的稀釋抗體的另 一種可尋址陣列的示意性例子。四種不同稀釋度的抗體一式3份被固定在可尋址陣列 上。圖8顯示了包含腫瘤血管生成中被活化的受體酪氨酸激酶途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 諸組分的稀釋抗體的可尋址陣列的示意性例子。四種不同稀釋度的抗體以一式3份被固 定在可尋址陣列上。圖9顯示了包含腫瘤血管生成中被活化的受體酪氨酸激酶途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 諸組分的稀釋抗體的另一種可尋址陣列的示意性例子。系列稀釋的抗體一式3份被固定 在可尋址陣列上。圖10顯示了 5份乳腺癌樣品和6份正常樣品EGFR磷酸化的相對水平。數(shù)據(jù)也
顯示于表40。圖11顯示了 5份乳腺癌樣品和6份正常樣品HER-2磷酸化的相對水平。數(shù)據(jù) 也顯示于表41。圖12顯示了 5名乳腺癌患者的Veridex CellSearch 系統(tǒng)的CTC染色圖像。對 照細(xì)胞系是A431 (EGFR陽性)和SKBr3 (HER-2陽性)。圖13顯示，可用能與附著于聚苯乙烯珠或多聚葡聚糖的ErbB2胞外域結(jié)合的抗 體來除去患者樣品中的全長HER-2 (ErbB2)。圖14顯示了本發(fā)明檢測截短受體如p95ErbB2的一個實(shí)施方式。SA =鏈霉親和 素；HRP =辣根過氧化物酶；TSA =酪酰胺信號擴(kuò)增。圖15顯示，用抗ErbB2(HER_2)胞外域(ECD)的抗體包被預(yù)處理珠，幾乎完全 除去了全長ErbB2信號而不影響ErbB2胞內(nèi)域(ICD)信號。圖16顯示，APMA((4-氨基苯基)醋酸汞)處理提高了 BT-474細(xì)胞的p95ErbB2磷酸化。圖17顯示，異調(diào)蛋白(heregulin)提高了 T47D細(xì)胞的p95ErbB2磷酸化。圖18顯示了對于選擇適合特定患者乳腺癌的治療方法，可用本發(fā)明方法影響臨 床實(shí)踐的幾個(干預(yù))點(diǎn)。圖19顯示了本發(fā)明試驗(yàn)?zāi)Ｊ降囊粋€實(shí)施方式，該試驗(yàn)依賴于連有酶的兩種額外 檢測抗體的共同定位，以隨后引導(dǎo)各靶蛋白的結(jié)合。圖20顯示了 pHER-Ι和pHER_2試驗(yàn)的靈敏度為單個細(xì)胞。圖21顯示了用EGF或HRG B處理后各細(xì)胞系的ErbB表達(dá)/活化。圖22顯示了用EGF或HRG β刺激得到的T47D ErbB RTK狀態(tài)。圖23顯示了 ErbB途徑陣列的一個示范性實(shí)施方式。發(fā)明詳述I.引言如上所述，參與細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化和參與細(xì)胞死亡途徑的滅活是許 多不同類型癌癥分子特征的非限制性例子。在許多情況中，特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其諸組 分的活化可作為某給定類型癌癥的分子特征。這些活化的組分還可為治療干預(yù)提供有用 的靶點(diǎn)。因此，了解治療之前、期間和之后癌細(xì)胞內(nèi)特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的活化水平可為 醫(yī)師提供用于選擇合適治療進(jìn)程的高度相關(guān)信息。此外，隨治療進(jìn)展持續(xù)監(jiān)測癌細(xì)胞中 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化狀態(tài)可為醫(yī)師提供治療效果的額外信息，例如，當(dāng)癌細(xì)胞通過進(jìn)一 步變異導(dǎo)致同一或另一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化因而對治療耐受時，可提醒醫(yī)師是否繼續(xù)特定 治療或改用另一治療方法，。因此，本發(fā)明提供用特異性的多重高通量試驗(yàn)，檢測腫瘤組織或腫瘤外細(xì)胞， 例如實(shí)體瘤的稀少循環(huán)細(xì)胞中多種失調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)和活化狀態(tài)的方法和組合 物。本發(fā)明還提供選擇合適的治療藥物(單一藥物或藥物組合)以下調(diào)或關(guān)閉失調(diào)信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法和組合物。因此，利用本發(fā)明將有利于為癌癥患者設(shè)計(jì)個性化的治療。通過測定單個細(xì)胞水平的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否活化而能檢測和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞 是本發(fā)明的重要優(yōu)點(diǎn)?！拔⑿∞D(zhuǎn)移”的腫瘤細(xì)胞(播散的腫瘤細(xì)胞)常見于各種癌癥早期 階段的患者血液中，也見于轉(zhuǎn)移癌。血液中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量取決于腫瘤的階段和類型。 雖然通?？色@得原發(fā)性腫瘤的活檢樣品，但大多數(shù)轉(zhuǎn)移瘤無法活檢，使得極難對這種腫 瘤樣品進(jìn)行分子分析。在腫瘤轉(zhuǎn)移期間，大多數(shù)侵襲性腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)性腫瘤，通過 血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到達(dá)遠(yuǎn)端部位。因此，血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞代表了腫瘤細(xì)胞中最 具侵襲性的均質(zhì)細(xì)胞群。然而，血液中轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的數(shù)量常常極低，從每毫升血液 含1個到數(shù)千個細(xì)胞不等。能夠分離這種稀少細(xì)胞和檢驗(yàn)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及利用該信息 更有效地治療癌癥是本發(fā)明的目的之一。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多重高通量免疫試驗(yàn)?zāi)芤詥蝹€細(xì)胞水平檢測實(shí)體 瘤循環(huán)細(xì)胞中一種或多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化狀態(tài)。事實(shí)上，對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如EGFR 的檢測靈敏度可達(dá)到約100個10_21摩爾(zeptomole)，線性動態(tài)范圍約為100個10_21摩爾 到約100毫微微摩爾(femtomole)。因此，稀少循環(huán)細(xì)胞中多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化狀態(tài)的 單細(xì)胞檢測有助于癌癥預(yù)后和診斷以及設(shè)計(jì)個性化的靶向治療。稀少循環(huán)細(xì)胞包括實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤循環(huán)細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞、
18癌癥干細(xì)胞和遷移至腫瘤(因趨化作用)的細(xì)胞，例如循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、 循環(huán)前血管原髓樣細(xì)胞和循環(huán)樹突細(xì)胞是與實(shí)體瘤相關(guān)的循環(huán)細(xì)胞的一些例子。通常在分離這種循環(huán)細(xì)胞后不久，優(yōu)選在約24、6或1小時內(nèi)，更優(yōu)選在約30、 15或5分鐘內(nèi)提取感興趣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分予以保留它們的原位活化狀態(tài)。也可將分離的細(xì) 胞與通常為納摩爾到微摩爾濃度的一種或多種生長因子一起培育約1-30分鐘，以恢復(fù)或 刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化(參見，例如Irish等，Cell, 118 217-228(2004))。如本文更詳細(xì)解釋的那樣，為評估用于某患者個體的可能抗癌治療，可將其分 離的細(xì)胞與不同劑量的一種或多種抗癌藥一起培育。然后用生長因子刺激數(shù)分鐘(例 如，約1-5分鐘)或數(shù)小時(例如，約1-6小時)。用和不用抗癌藥來差異激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑有助于為各患者個體選擇合適劑量的合適癌癥治療方法。也可分離抗癌藥治療期間 患者樣品的循環(huán)細(xì)胞用一種或多種生長因子刺激以確定是否應(yīng)改變治療。因此，本發(fā)明 方法有利于幫助臨床醫(yī)生為每位患者提供劑量正確時間正確的正確抗癌藥。就乳腺癌而言，目前的檢測選項(xiàng)并不令人滿意，因?yàn)閷θ橄侔┗颊咴l(fā)和轉(zhuǎn)移 性腫瘤的治療都是根據(jù)獲自疾病早期活檢樣品時的診斷。具體說，由于實(shí)際上不能獲得 轉(zhuǎn)移癌患者的活檢樣品，對乳腺癌早期和轉(zhuǎn)移階段的治療性干預(yù)都僅僅根據(jù)對取自疾病 早期活檢樣品的初步診斷。然而，乳腺腫瘤會隨時間和治療而演變，因此對乳腺腫瘤的 時序監(jiān)測是優(yōu)化乳腺癌患者治療方法的關(guān)鍵。例如，受體酪氨酸激酶ErbB(HER)家族一 個或多個成員活化狀態(tài)的改變可能會影響對復(fù)發(fā)的治療選擇。實(shí)際上，常見原發(fā)與轉(zhuǎn)移 癌癥之間的HER-2狀態(tài)不一致，因?yàn)楦哌_(dá)37%的乳腺癌患者從HER-2-陰性原發(fā)性腫瘤 轉(zhuǎn)變?yōu)镠ER-2-陽性轉(zhuǎn)移癌。此外，由于HER-1/2活化，患者可能會重新耐受激素治療 或?qū)に刂委煯a(chǎn)生獲得性耐受。在一些情況下，由于存在表達(dá)p95HER_2的腫瘤細(xì)胞， 患者可能會重新耐受ErbB-靶向治療或?qū)rbB-靶向治療產(chǎn)生獲得性耐受。結(jié)果，由于 目前的技術(shù)缺乏靈敏度和特異性，不能用于監(jiān)測患者的治療，不能利用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑模 式來指導(dǎo)對個體治療的決策，因此臨床上迫切需要能幫助醫(yī)師在適當(dāng)時間處方給予合適 的癌癥治療藥物的試驗(yàn)。與目前使用的乳腺癌檢測選項(xiàng)相反，本發(fā)明方法通過采用例如血液循環(huán)腫瘤細(xì) 胞(CTC)和/或細(xì)針抽吸物(RNA)等樣品，對實(shí)體乳腺腫瘤作“實(shí)時活檢”而能夠監(jiān) 測乳腺癌患者疾病的所有階段。一個非限制性例子是，本文所述的乳腺癌試驗(yàn)可用于疾 病早期患者的乳腺癌初步診斷。采用本文所述的單一檢測或鄰近0雙重檢測試驗(yàn)，通過 對有和沒有抗癌藥時特定信號傳導(dǎo)途徑活化狀態(tài)模式的分析，可以指導(dǎo)選擇合適的癌癥 治療。由于治療性干預(yù)可根據(jù)疾病任何階段獲得的樣品用本文所述的單一檢測或鄰近雙 重檢測試驗(yàn)分析，因此本發(fā)明方法也可有利地用于監(jiān)測疾病的發(fā)展或消退。因此，通過 實(shí)時診斷和對特定信號傳導(dǎo)途徑分子活化狀態(tài)的分析，可指導(dǎo)對乳腺癌早期或轉(zhuǎn)移階段 合適的癌癥治療藥物的選擇。本發(fā)明的方法可有利地解決癌癥治療中的關(guān)鍵問題并為乳腺癌患者提供更高的 護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗?1)靈敏度高(例如，檢測所有的和磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如EGFR 和HER-2時可實(shí)現(xiàn)單個細(xì)胞檢測，(2)特異性高(例如，三抗體鄰近試驗(yàn)檢測磷酸化信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的特異性高)，(3)可對轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的概況進(jìn)行分析(例如，可檢測患者的CTC或 FNA中特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化狀態(tài))，和(4)減輕了獲得患者樣品帶來的問題(例如，很少的腫瘤細(xì)胞就可試驗(yàn)檢測)。盡管任何樣品都可用于本文所述的新試驗(yàn)，但CTC特 別有效，因?yàn)樗鼈兇砹俗罹咔忠u性的腫瘤細(xì)胞，已知每種腫瘤都會排出CTC，它們可 能是殘余腫瘤或難以觸及轉(zhuǎn)移腫瘤的唯一來源，并且可出現(xiàn)在血液中。因此，本發(fā)明的 方法能夠連續(xù)采集乳腺腫瘤組織的樣品，得到腫瘤細(xì)胞隨時間和治療方法而變的有價值 信息，為醫(yī)師提供快速監(jiān)測變化的癌癥途徑特征的方法?？傊?，本發(fā)明方法有利地提供了對癌癥患者(如乳腺癌患者)的精確選擇和監(jiān) 測，采用基于多種抗體的單一檢測或鄰近試驗(yàn)對容易獲得的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑概況 的分析，而最可能有益于靶向治療。II.定義除非另有規(guī)定，本文所用的以下術(shù)語具有歸于它們的含義。術(shù)語“癌癥”包括特征是異常細(xì)胞不受控制生長的疾病類型的任何成員。該術(shù) 語包括所有已知的癌癥和腫瘤病癥，無論其特征是惡性、良性、軟組織或是實(shí)體，以及 所有階段和等級的癌癥，包括轉(zhuǎn)移前和后癌癥。不同類型癌癥的例子包括但不限于乳 腺癌、肺癌(例如，非小細(xì)胞肺癌)；消化道和胃腸道癌，例如結(jié)腸直腸癌、胃腸道間質(zhì) 瘤、胃腸類癌腫瘤、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門癌、膽管癌、小腸癌和胃癌；食道癌；膽囊 癌；肝癌；胰腺癌；闌尾癌(appendix cancer)；乳腺癌；卵巢癌；腎癌(例如，腎細(xì)胞 癌)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌；皮膚癌；淋巴瘤；絨毛膜癌；頭頸癌；骨肉瘤；和血癌。本文 所用的“腫瘤”包括一種或多種癌細(xì)胞。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述乳腺腫瘤為對象 的侵襲形式或原位形式導(dǎo)管癌或小葉癌。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述乳腺腫瘤為對 象的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移乳腺癌。術(shù)語“分析物”包括測定其存在、含量和/或身份的任何感興趣分子，通常是 大分子，例如多肽。在某些例子中，分析物是實(shí)體瘤循環(huán)細(xì)胞的一種細(xì)胞組分，優(yōu)選信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。本文所用的術(shù)語“系列稀釋液”包括一系列濃度遞降的特定樣品(例如，細(xì)胞 裂解液)或試劑(例如，抗體)。一般通過以下過程產(chǎn)生系列稀釋液混合測定量的起 始濃度樣品或試劑與稀釋液(例如，稀釋緩沖液)產(chǎn)生較低濃度的樣品或試劑，重復(fù)該過 程足夠次數(shù)獲得所需數(shù)量的系列稀釋液?？蓪悠坊蛟噭┫盗邢♂屩辽?、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、或 1000-倍而產(chǎn)生包含 至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 25、 30、35、40、45、或50種濃度遞降的樣品或試劑的系列稀釋液。例如，為制造包含起始 濃度為1毫克/毫升的捕捉抗體試劑的2-倍系列稀釋液，可將一定量起始濃度的捕捉抗 體與等量稀釋緩沖液混合，產(chǎn)生濃度為0.5毫克/毫升的捕捉抗體，重復(fù)該過程獲得濃度 為0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.0625毫克/毫升、0.0325毫克/毫升等的捕捉 抗體。術(shù)語“優(yōu)秀的動態(tài)范圍”在本文中指該試驗(yàn)?zāi)軌驒z測少至1個細(xì)胞或多至數(shù)千 細(xì)胞中的特異性分析物。例如，本文所述免疫試驗(yàn)?zāi)苡貌蹲娇贵w濃度的系列稀釋液有效 地檢測約 1-10,000 個細(xì)胞(例如，約 1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、 1000、2500、5000、7500或10,000個細(xì)胞)中感興趣的特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，因此具有高
的動態(tài)范圍。
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術(shù)語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子”或“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物”包括細(xì)胞中胞外信號或刺激轉(zhuǎn)變成 反應(yīng)過程的蛋白質(zhì)和其它分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)過程通常涉及細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)有序序列。信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的例子包括但不限于受體酪氨酸激酶，例如EGFR(例如，EGFR/HER-1/ ErbBU HER_2/Neu/ErbB2、HER_3/ErbB3、HER_4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-1、 VEGFR-2/FLK-l/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如，PDGFRA、 PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰島素受體)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰島素受 體-相關(guān)受體)、CSF-1R、FGFR 1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C> MET、RON、 EPHA 1-8, EPHB 1-6、AXL> MER、TYR03、TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 卜2、 RET、c-ROS> V-鈣粘蛋白、LTK(白細(xì)胞酪氨酸激酶)、ALK(退行發(fā)育性淋巴瘤激 酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3、RTK 106以及受體酪氨酸激酶的截短形式如 p95ErbB2 ；非受體酪氨酸激酶，例如 BCR-ABL、Src> Frk、Btk> Csk、Abl> Zap70、 Fes/Fps、Fak> Jak、Ack和LIMK ；酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)組分，例如Akt、MAPK/ ERK、MEK、RAF> PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、PI3K、Ras (例 如，K-Ras、N-Ras> H-Ras) > Rho> RacU Cdc42、PLC、PKC> p70S6 激酶、p53、 細(xì)胞周期蛋白 Dl、STATU STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、 ROCK、IP3、TSP-U NOS> PTEN、RSK 1-3、JNK、c_Jun、Rb、CREB> Ki67 和樁蛋 白；核激素受體如雌激素受體(CR)、孕酮受體(PR)、雄激素受體、糖皮質(zhì)激素受體、 鹽皮質(zhì)激素受體、維生素A受體、維生素D受體、類視色素受體、甲狀腺激素受體和孤 兒受體；核受體輔激活物和抑制物，分別例如AIBl (在乳腺癌-1中擴(kuò)增)和核受體輔阻 遏物I(NCOR);以及它們的組合。本文所用的術(shù)語“循環(huán)細(xì)胞”包括實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移的腫瘤外細(xì)胞 (extratumoral cell)。循環(huán)細(xì)胞的例子包括但不限于循環(huán)腫瘤細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞和/或 遷移至腫瘤的細(xì)胞(例如，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)前血管原髓樣細(xì)胞、 循環(huán)樹突細(xì)胞等)。本文所用的術(shù)語“樣品”包括獲自患者的任何生物學(xué)樣本。樣品包括但不限 于全血、血漿、血清、紅細(xì)胞、白細(xì)胞(例如，外周血單個核細(xì)胞)、導(dǎo)管洗出液、 乳頭抽吸物、淋巴(例如淋巴結(jié)的彌散性腫瘤細(xì)胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿液、糞便 (即，排泄物)、痰、支氣管灌洗液、眼淚、細(xì)針抽吸物(例如通過隨機(jī)乳暈緣細(xì)針抽吸 獲得)、任何其它體液、組織樣品(例如，腫瘤組織)，如腫瘤活檢(例如，針吸活檢)或 淋巴結(jié)活檢(例如前哨淋巴結(jié)活檢)樣品和它們的細(xì)胞提取物。在一些實(shí)施方式中，樣 品是全血或其組分，例如血漿、血清或細(xì)胞沉淀。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本領(lǐng)域已 知的技術(shù)分離全血中的實(shí)體瘤循環(huán)細(xì)胞或其細(xì)胞組分而獲得樣品。在其它實(shí)施方式中， 樣品是福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織樣品，例如獲自乳腺的實(shí)體瘤。“活 檢”指取出組織樣品以供診斷或預(yù)后評估的過程，也指組織樣品本身?？蓪⒈绢I(lǐng)域已知 的任何活檢技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明的方法和組合物。所用的活檢技術(shù)通常取決于待評估的組 織類型和腫瘤大小及類型(即，實(shí)體瘤或懸浮細(xì)胞(即，血液或腹水))等因素。代表性 活檢技術(shù)包括切除活檢、切開式活檢、針吸活檢(例如，芯針活檢、細(xì)針抽吸活檢等)、 手術(shù)活檢和骨髓活檢?；顧z技術(shù)的描述可參見，例如Harrison' s Principles of Internal Medicine(內(nèi)科學(xué)哈里森原理)，Kasper等編，第16版，2005，第70章，以及整個第V部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，可通過活檢技術(shù)來鑒定給定組織樣品中的癌細(xì)胞和/或 前癌細(xì)胞。術(shù)語“對象”或“患者”或“個體”通常包括人，但也可包括其它動物，例如 其它靈長類、嚙齒類、犬、貓、馬、綿羊、豬等。“陣列"或"微陣列"包括固定或束縛于固相支持物上的分散和/或系列稀釋 捕捉抗體，所述固相支持物例如有玻璃(例如，玻璃載玻片)、塑料、芯片、針、濾膜、 珠(例如，磁珠，聚苯乙烯珠，等等)、紙、膜(例如，尼龍、硝酸纖維素，聚偏二氟乙 烯(PVDF)等膜)、纖維束或任何其他合適的基材。捕捉抗體一般通過共價或非共價相 互作用(例如，離子鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華力、偶極-偶極鍵)而固定或束縛 于固體支持物上。某些情況下，捕捉抗體包含能與結(jié)合于固相支持物的捕獲劑相互作用 的捕獲尾。本發(fā)明試驗(yàn)所用的陣列通常包含偶聯(lián)于固體支持物表面的不同已知/可尋址 位置的多個不同捕捉抗體和/或不同濃度的捕捉抗體。術(shù)語"捕捉抗體"意指包括對樣品中一種或多種感興趣分析物如實(shí)體瘤循環(huán)細(xì) 胞的細(xì)胞提取物具有特異性(即，結(jié)合、被結(jié)合或形成復(fù)合體)的固定抗體。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，捕捉抗體束縛于陣列中的固體支持物上。用于將各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子固定在 固體支持物上的合適捕捉抗體可購自加利福尼亞州泰姆庫拉市奧普斯特公司(Upstate， Temecula，CA)、加利福尼亞州卡馬里奧市生物資源公司(Biosource，Camarillo, CA)、 馬薩諸塞外丨丹弗斯市細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(Cell Signaling Technologies，Danvers， ΜΑ)、明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯研發(fā)系統(tǒng)公司(R&D Systems，Minneapolis, MN)、加 利福尼亞州弗里蒙特市LV公司(Lab Vision，F(xiàn)remont, CA)、加利福尼亞州圣克魯斯市 圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Craz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、密蘇里州圣路易斯 市西格瑪公司(Sigma，St.Louis, MO)和加利福尼亞州圣何塞市BD生物科學(xué)公司(BD Biosciences, San Jose, CA)。本文所用的術(shù)語“檢測抗體”包括含有可檢測標(biāo)記的對樣品中感興趣的一種 或多種分析物具有特異性(即，結(jié)合、被結(jié)合或與之形成復(fù)合物)的抗體。該術(shù)語還 包括對于感興趣的一種或多種分析物具有特異性的抗體，該抗體可被包含可檢測標(biāo)記的 另一種抗體結(jié)合。可檢測標(biāo)記的例子包括但不限于生物素/鏈霉親和素標(biāo)記、核酸 (例如，寡核苷酸)標(biāo)記、化學(xué)反應(yīng)活性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記和它們 的組合。用于檢測各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中任何一種活化狀態(tài)和/或總量的合適的檢測抗 體可購自加州特默庫拉奧普斯特公司(Upstate，Temecula, CA)、加州卡瑪利奧的生物 源公司(Biosource，Camarillo, CA)、馬薩諸塞州丹維斯的細(xì)胞信號傳導(dǎo)技術(shù)公司(Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ)、明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems, Minneapolis, MN)、加州弗里蒙特的實(shí)驗(yàn)室視覺公司(Lab Vision，F(xiàn)remont, CA)、加州桑塔庫茲的桑塔庫茲生物技術(shù)公司(Santa Craz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，St.Louis, MO)、以及加州圣何塞的BD 生物科技公司(BD Biosciences，San Jose，CA)。一個非限制性的例子是，抗EGFR、 c-KIT、c-Src> FLK-I、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK、PTEN、Raf 和 MEK 等 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子各種磷酸化形式的磷酸化特異性抗體可購自桑塔庫茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)。
術(shù)語“活化狀態(tài)依賴性抗體”包括對樣品中感興趣的一種或多種分析物的 特定活化狀態(tài)具有特異性(即，結(jié)合、被結(jié)合或與之形成復(fù)合物)的檢測抗體。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述活化狀態(tài)-依賴性抗體能檢測一種或多種分析物，例如 一種或多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化、遍在蛋白化和/或復(fù)合狀態(tài)。在一些實(shí)施方 式中，利用活化狀態(tài)依賴性抗體檢測受體酪氨酸激酶EGFR家族諸成員的磷酸化 和/或EGFR家族成員之間形成的異質(zhì)二聚體復(fù)合物。適合用活化狀態(tài)依賴性抗 體檢測的活化狀態(tài)(括號中所列)的非限制性例子包括EGFR(EGFRvIII、磷酸 化(p-)EGFR、EGFR She、遍在蛋白化(u_)EGFR、p-EGFRvIII) ； ErbB2 (p95 截短的(Tr)_ErbB2、p_ErbB2、p95 Tr_p_ErbB2、Her-2 She、ErbB2 : PI3K、 ErbB2 EGFR、ErbB2 : ErbB3、ErbB2 : ErbB4) ； ErbB3 (p_ErbB3、ErbB3 : PI3K、 p-ErbB3 PI3K、ErbB3 She) ； ErbB4 (p_ErbB4、ErbB4 She) ； ER (p-ER(S118, S167) ； IGF-lR(p-IGF-lR, IGF-IR IRS, IRS PI3K, p-IRS, IGF-IR PI3K) ； INSR(p-INSR) ； KIT (p-KIT) ； FLT3 (p-FLT3) ； HGFRI (p-HGFRI)； HGFR2 (p-HGFR2) ； RET (p-RET) ； PDGFRa (p-PDGFRa) ； PDGFRP (p-PDGFRP)； VEGFRI (ρ-VEGFRI，VEGFRI PLCg, VEGFRl Src) ； VEGFR2 (p_VEGFR2， VEGFR2 PLCy, VEGFR2 Src, VEGFR2 硫酸肝素，VEGFR2 VE-鈣粘蛋白)； VEGFR3 (p-VEGFR3) ； FGFRl (p-FGFRl) ； FGFR2 (p-FGFR2) ； FGFR3 (p-FGFR3)； FGFR4 (p-FGFR4) ； Tiel (p—Tiel) ； Tie2 (p-Tie2) ； EphA (p-EphA) ； EphB (ρ-EphB)； NFKB 禾口 / 或 IKB(p_IK(S32)，p—NFKB (S536)，p-P65 IKBa) ； Akt(p_Akt(T308， S473) ) ； PTEN(p-PTEN) ； Bad (p-Bad (S 11 2 , S136) , Bad 14-3-3)； mTor(p-mTor(S2448)) ； p70S6K(p-p70S6K(T229, T389)) ； Mek(p-Mek(S217, S221)) ； Erk (p-Erk(T202，Y204)) ； Rsk-1(p_Rsk_1(Τ357，S363))； Jnk(p-Jnk(T183, Y185)) ； P38 (p-P38 (T180, Y182)) ； Stat3 (p-Stat-3 (Y705，S727))； Fak(p-Fak(Y576)) ； Rb (p-Rb (S249, T252，S780)) ； Κ 67 ； p53 (p-p53 (S392, S20))； CREB (p-CREB(S133)) ； c_Jun (p-c-Jun (S63)) ； cSrc (p-cSrc (Y416))；和樁蛋白(ρ-樁 蛋白(Υ118))。術(shù)語“活化狀態(tài)非依賴性抗體”包括對樣品中感興趣的一種或多種分析物具有 特異性(即，結(jié)合、被結(jié)合或與之形成復(fù)合物)而無論它們的活化狀態(tài)的檢測抗體。例 如，活化狀態(tài)非依賴性抗體可檢測一種或多種分析物，例如一種或多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的 磷酸化和非磷酸化形式。術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸及其聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸類似物或修飾的 主鏈殘基或連接鍵的核酸，可以是合成的、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，具有與參比 核酸相似的結(jié)合特性。這種類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、胺基磷酸酯 (phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2 ‘ -O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸 (PNA)。除非另有限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，具有與參比 核酸相似的結(jié)合特性。除非另有表述，特定核酸序列還暗示包括其保守性修飾的變體和 互補(bǔ)序列以及明確示出的序列。術(shù)語“寡核苷酸”指RNA、DNA、RNA/DNA雜交的單鏈寡聚物或聚合物和/
23或其模擬物。在某些情況中，寡核苷酸由天然產(chǎn)生(即，未修飾)的核堿基、糖和核苷 間(主鏈)連接鍵構(gòu)成。在某些其它例子中，寡核苷酸包含修飾的核堿基、糖和/或核 苷間連接鍵。本文所用的術(shù)語“錯配基序”或“錯配區(qū)”指寡核苷酸中與其互補(bǔ)序列不100% 互補(bǔ)的部分。寡核苷酸可含有至少1、2、3、4、5、6個或更多個錯配區(qū)。錯配區(qū)可以 是連續(xù)的，或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個核苷酸隔開。錯 配基序或區(qū)域可包含一個核苷酸或可包含2、3、4、5或更多個核苷酸。短語“嚴(yán)格雜交條件”指寡核苷酸與其互補(bǔ)序列雜交，但不與其它序列雜交的 條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中會有差異。較長的序列在較高溫度下特 異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛指南可參見Tijssen，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)-與核 酸探針雜交》(Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Probes)中的“雜交原理和核酸試驗(yàn)策略綜述” Overviewofprinciplesofhybridizationand the strategy of nucleic acid assays) (1993)。選擇的嚴(yán)格條件通常比具體序列在規(guī)定的離子 強(qiáng)度和pH時的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。1 是在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃 度下，與靶序列互補(bǔ)的50%探針與靶序列雜交達(dá)到平衡時的溫度(由于存在過量的靶序 列，Tm時，平衡時有50%的探針被占據(jù))。還可加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來獲得嚴(yán)格條 件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相同”或“實(shí)質(zhì)性相同”的兩條或多條核酸，指例如采用序列 比較算法或通過手工比對和目測觀察進(jìn)行比較和比對時，在比較窗口或指定區(qū)域具有的 最大對應(yīng)性，含有相同或相同特定百分比的核苷酸(即，在特定區(qū)有至少約60%，優(yōu)選 至少約65%、70%, 75%, 80%, 85%, 90%或95%相同性)的兩條或多條序列或子序 列。當(dāng)文中示出該定義時，還類似地指某序列的互補(bǔ)序列。優(yōu)選在至少長約5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、75、或100個核苷酸的區(qū)域具有實(shí)質(zhì)相同性。所用術(shù)語"培育"與“接觸”和“暴露”含義相同，不暗指任何具體的時間或 溫度要求，除非另有說明。III.實(shí)施方式描述在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供采用特異性的多重高通量試驗(yàn)，檢測衍生自腫 瘤組織的腫瘤細(xì)胞或?qū)嶓w瘤循環(huán)細(xì)胞中的多種失調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)和活化狀態(tài)的方 法。本發(fā)明還提供選擇合適治療藥物的方法和組合物，以下調(diào)或關(guān)閉一種或多種失調(diào)的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，可根據(jù)收集到的某給定患者腫瘤中活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白所提供的 特定分子特征，采用本發(fā)明實(shí)施方式來幫助設(shè)計(jì)個性化治療。實(shí)體瘤循環(huán)細(xì)胞包括實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，包括癌癥干細(xì)胞或遷移至 腫瘤的細(xì)胞(例如，因趨化作用)，例如內(nèi)皮祖細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、周質(zhì)細(xì)胞、循環(huán)前 血管原髓樣細(xì)胞、樹突細(xì)胞等等。含有循環(huán)細(xì)胞的患者樣品可獲自任何可得的生物學(xué)液 體(例如，全血、血清、血漿、痰、支氣管灌洗液、尿液、乳頭抽吸物、淋巴、唾液、 細(xì)針抽吸物等)。在某些情況中，將全血樣品分成血漿或血清組分和細(xì)胞組分(即，細(xì)胞 沉淀)。細(xì)胞組分通常含有紅細(xì)胞、白細(xì)胞和/或?qū)嶓w瘤循環(huán)細(xì)胞，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC)、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)、循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(CEPC)、癌癥干細(xì)胞(CSC)、淋巴結(jié)的 彌散性腫瘤細(xì)胞和它們的組合。血漿或血清組分通常含有實(shí)體瘤的循環(huán)細(xì)胞所釋放的核酸(例如，DNA、RNA)和蛋白質(zhì)。通常采用一種或多種分離方法分離患者樣品中的循環(huán)細(xì)胞，所述方法包 括，例如免疫磁性分離(參見，例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95 4589-4594(1998) ； Bilkenroth 等，Int.J.Cancer，92: 577-582(2001))、賓夕法尼州亨廷 頓谷的伊繆尼康公司(Immunicon，Huntingdon Valley, PA)的CellTrack 系統(tǒng)、微流體 分離(參見，例如 Mohamed 等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3 251-256(2004) ； Lin 等，第 5147號摘要，第97屆AACR年會，華盛頓，哥倫比亞特區(qū)，(2006))、FACS(參見，例 如 Mancuso 等，Blood，97: 3658-3661(2001))、密度梯度離心(參見，例如 Baker 等， Clin.CancerRes.，13 4865-4871 (2003))和消除法(參見，例如 Meye 等，Int.J.Oncol., 21 521-530(2002))。為保留原位活化狀態(tài)，宜在分離細(xì)胞后不久，優(yōu)選在96、92、48、24、6或1 小時內(nèi)，更優(yōu)選在約30、15或5分鐘內(nèi)提取信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物。還優(yōu)選將分離的細(xì)胞與通 常納摩爾到微摩爾濃度的生長因子一起培育約1-30分鐘以恢復(fù)或刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活 化(參見，例如Irish等，Cell, 118 217-228 (2004)) 0 刺激性生長因子包括表皮生長 因子(EGF)、異調(diào)蛋白(HRG)、TGF-a、PIGF > 血管生成素(Ang)、NRGU PGF > TNF-a、VEGF > PDGF > IGF、FGF > HGF >細(xì)胞因子等等。為評估用于患者個體的潛 在抗癌治療藥物，將分離的細(xì)胞與各種劑量的一種或多種抗癌藥一起培育然后用生長因 子刺激。生長因子刺激可進(jìn)行數(shù)分鐘或數(shù)小時(例如，1-5分鐘或1-6小時)。用和不 用抗癌藥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化差異有助于為各患者個體選擇合適劑量的合適癌癥治療藥 物。在分離、抗癌藥物處理和/或生長因子刺激后，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)裂解細(xì)胞提 取信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。優(yōu)選在生長因子刺激后約1-360分鐘之間開始細(xì)胞裂解，更優(yōu)選在兩 個不同時間間隔(1)在生長因子刺激后約1-5分鐘；和(2)在生長因子刺激后約30-180 分鐘之間開始細(xì)胞裂解?；蛘?，可將裂解液保存于-80°C待用。在一些實(shí)施方式中，抗癌藥包括能干擾癌細(xì)胞中活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分功能的 藥物。這種藥物的非限制性例子包括表1所列那些。表 權(quán)利要求
1.一種選擇用于治療乳腺腫瘤的合適抗癌藥物的方法，所述方法包括(a)給予抗癌藥物后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離乳腺腫瘤細(xì)胞后將其與抗癌藥一起 培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)采用包括一種或多種分析物特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液的試驗(yàn)來檢測細(xì)胞 提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛于固體支持物上；和(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥物時產(chǎn)生的參比活化狀態(tài)， 確定該抗癌藥是否適于治療該乳腺腫瘤。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳腺腫瘤來自患有乳腺導(dǎo)管癌或小葉 癌的對象。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)管癌是浸潤性導(dǎo)管癌或原位導(dǎo)管癌。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述小葉癌是浸潤性小葉癌或原位小葉癌。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括乳腺腫瘤的循環(huán)細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，通過免疫磁性分離法，分離樣品中的循環(huán) 細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述樣品選自全血、血清、血漿、導(dǎo) 管洗出液、乳頭抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、細(xì)針抽吸物和它們的組合。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)細(xì)胞選自循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循 環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、播散的腫瘤細(xì)胞和它們的組合。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織分離的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述腫瘤組織是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫 瘤組織。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織的細(xì)針抽吸物樣 品分離的細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用生長因子體外刺激所述的分離細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自單克隆抗體、酪氨酸 激酶抑制劑、化療劑、激素治療劑、放療劑、疫苗和它們的組合。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體選自群司珠單 抗(赫賽汀 )、阿侖單抗(Campath )、貝伐單抗(Avastin )、西妥昔單抗(Erbitux )、吉 姆單抗(Mylotarg )、帕尼妥莫單抗(Vectibix )、利妥昔單抗(Rituxan )、托西莫單抗 (BEXXAR )和它們的組合。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制劑選自吉 非替尼(Iressa )、蘇尼替尼(Sutent )、埃洛替尼(Tarceva )、拉帕替尼(Tykerb )、卡那替 尼(Cl 1033)、塞瑪昔尼(SU5416)、瓦塔拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉芬尼(BAY 43-9006)、甲磺酸伊馬替尼(Gleevec )、來氟米特(SU101)、凡達(dá)它尼(ZACTIMA ； ZD6474)；和它們的組合。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述化療劑選自培美曲塞 (ALIMTA )、吉西他濱(Gemzar )、西羅莫司(雷帕霉素)、雷帕霉素類似物、鉬化合物、碳鉬、順鉬、沙鉬、紫杉醇(Taxd )、多西他賽(Taxotere )、他西絡(luò)莫司(CCI-779)、依維莫司(RAD001)和它們的組合。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述激素治療劑選自芳香酶抑制 劑、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、類固醇、非那雄胺、促性腺素釋放素、其藥學(xué)上可接受 的鹽、其立體異構(gòu)體、其衍生物、其類似物、以及它們的組合。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述放療劑選自47Sc、64Cu,67Cu、 89Sr, 86Y, 87Y、90Y、105Rh, 111Ag, 111Iik 117mSn、149Pm, 153Sm, 166Hck 177Lu, 186Re, 188Re、211At, 212Bi和它們的組合。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述一種或多種分析物包含多個信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)分子。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子選自受體酪 氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)組分、核激素受體、核受體輔 激活物、核受體抑制物、和它們的組合。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子選自 EGFR(ErbBl)、Her_2 (ErbB2)、p95ErbB2、Her_3 (ErbB3)、Her_4 (ErbB4)、Raf、 SRC、Mek、NFkB-IkB> mTor、PI3K、VEGF> VEGFR-I、VEGFR-2、VEGFR-3、 Eph-a、Eph-b、Eph_c、Eph_d、cMet、FGFR > cKit、Flt_3、Tie-1> Tie_2、Flt_3、 cFMS、PDGFRA、PDGFRB> Abl> FTL 3、RET、Kit、HGFR、FGFRU FGFR2、 FGFR3、FGFR4、IGF-1R、ER、PR、NCOR、AIBU 和它們的組合。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子選自ErbBl、 ErbB2、P95ErbB2、ErbB3、ErbB4、VEGFR-I、VEGFR-2, VEGFR-3, ER、PR、禾口它 們的組合。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)選自磷酸化狀態(tài)、遍在 蛋白化狀態(tài)、復(fù)合狀態(tài)和它們的組合。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持物選自玻璃，塑料，芯 片，針，濾膜，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗體束縛于可尋址陣列中的固 體支持物上。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)的步驟(C)包括(i)將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；(ii)將該多個被捕獲分析物與相應(yīng)分析物的特異性活化狀態(tài)依賴性抗體一起培育，形 成多種可檢測的被捕獲的析物；(iii)將多個可檢測的被捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育，產(chǎn)生 放大的信號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體包含結(jié)合對的第一成員。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第一成員是生物素。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第一成員包含該結(jié)合對 的第二成員。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第二成員是鏈霉抗生物素蛋白。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第一成員是過氧化物酶。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶 (HRP)。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第二成員是酪酰胺試劑。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，通過過氧化物酶氧化生物素-酪酰胺產(chǎn) 生活化的酪酰胺而產(chǎn)生放大信號。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，直接檢測活化的酪酰胺。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，通過加入信號檢測試劑檢測活化的酪酰胺。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的熒光團(tuán)。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3'，5，5'-四甲 基聯(lián)苯胺(TMB)。
41.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)的步驟(C)包括(i)將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；( )將多個被捕獲分析物與檢測抗體一起培育，形成多個可檢測的被捕獲分析物，所 述檢測抗體包括相應(yīng)分析物的特異性多個活化狀態(tài)依賴性抗體和多個活化狀態(tài)非依賴性 抗體，其中所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分子標(biāo)記，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放 大對第一成員標(biāo)記，所述輔助分子能產(chǎn)生傳送給信號放大對第一成員并與之反應(yīng)的氧化 劑；(iii)將所述多個可檢測的被捕獲分析物與信號放大對第二成員一起培育，產(chǎn)生放大 的信號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述非活化狀態(tài)依賴性抗體用輔助分子 直接標(biāo)記。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體通過偶連于 該活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸與偶連于輔助分子的互補(bǔ)寡核苷酸之間的雜交，被 輔助分子標(biāo)記。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大對第一成員直接標(biāo)記。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體通過偶聯(lián)于該 活化狀態(tài)依賴性抗體的結(jié)合對第一成員與偶聯(lián)于信號放大對第一成員的結(jié)合對第二成員 之間的結(jié)合，被信號放大對第一成員標(biāo)記。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第一成員是生物素。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第二成員是鏈霉抗生物素蛋白。
48.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述輔助分子是葡萄糖氧化酶。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和活化狀態(tài)非依賴性 抗體偶聯(lián)于巰基活化的葡聚糖分子。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述巰基活化的葡聚糖分子的分子量為 500kDa。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述氧化劑是過氧化氫(H2O2)。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第一成員是過氧化物酶。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶 (HRP)。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述信號放大對的第二成員是酪酰胺試劑。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，通過過氧化物酶氧化生物素-酪酰胺產(chǎn) 生活化的酪酰胺而產(chǎn)生放大信號。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，直接檢測活化的酪酰胺。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，通過加入信號檢測試劑檢測活化的酪酰胺。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的熒光團(tuán)。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3'，5，5'-四甲 基聯(lián)苯胺(TMB)。
62.一種鑒定乳腺腫瘤對抗癌藥治療的反應(yīng)的方法，所述方法包括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離乳腺腫瘤細(xì)胞后將其與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(C)采用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液的試驗(yàn)來檢測細(xì) 胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛于固體支持物上； 和(d)比較所述一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時產(chǎn)生的參比活化狀 態(tài)，鑒定該乳腺腫瘤是否對該抗癌藥有反應(yīng)。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述乳腺腫瘤獲自患有乳腺導(dǎo)管癌或小 葉癌的對象。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)管癌是浸潤性導(dǎo)管癌或原位導(dǎo)管癌。
65.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述小葉癌是浸潤性小葉癌或原位小葉癌。
66.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括乳腺腫瘤的循環(huán)細(xì)胞。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，通過免疫磁性分離法，分離樣品中的循 環(huán)細(xì)胞。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述樣品選自全血、血清、血漿、 導(dǎo)管洗出液、乳頭抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、細(xì)針抽吸物和它們的組合。
69.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)細(xì)胞選自循環(huán)腫瘤細(xì)胞、 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、播散的腫瘤細(xì)胞和它們的組合。
70.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織分離的細(xì)胞。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述腫瘤組織是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫 瘤組織。
72.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織細(xì)針抽吸物樣品 分離的細(xì)胞。
73.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，用生長因子體外刺激所述分離的細(xì)胞。
74.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自單克隆抗體、酪氨 酸激酶抑制劑、化療劑、激素治療劑、放療劑、疫苗和它們的組合。
75.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述一種或多種分析物包含多個信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)分子。
76.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)選自磷酸化狀態(tài)、遍 在蛋白化狀態(tài)、復(fù)合狀態(tài)和它們的組合。
77.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述固相支持體選自下組玻璃，塑 料，芯片，針，濾膜，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
78.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗體束縛于可尋址陣列的固體 支持物上。
79.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)的步驟(C)包括(i)將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；(ii)將多個被捕獲分析物與相應(yīng)分析物的特異性活化狀態(tài)依賴性抗體一起培育，形成多個可檢測的被捕獲分析物；(iii)將多個可檢測的被捕獲的分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育，產(chǎn) 生放大的信號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
80.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)的步驟(C)包括(i)將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；( )將多個被捕獲分析物與檢測抗體一起培育，形成多個可檢測的被捕獲分析物，所 述檢測抗體包含相應(yīng)分析物的特異性多個活化狀態(tài)依賴性抗體和多個活化狀態(tài)非依賴性 抗體，其中所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分子標(biāo)記，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大 對的第一成員標(biāo)記，所述輔助分子能產(chǎn)生傳送給信號放大對第一成員并與之反應(yīng)的氧化 劑；(iii)將多個可檢測的被捕獲分析物與信號放大對第二成員一起培育，產(chǎn)生放大的信 號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
81.一種預(yù)測乳腺腫瘤對象對癌藥治療反應(yīng)的方法，所述方法包括(a)給予抗癌藥后分離乳腺腫瘤細(xì)胞，或者分離乳腺腫瘤細(xì)胞后將其與抗癌藥一起培育；(b)裂解分離的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞提取物；(c)采用包括一種或多種分析物的特異性捕捉抗體的多個系列稀釋液的試驗(yàn)來檢測細(xì) 胞提取物中該一種或多種分析物的活化狀態(tài)，其中所述捕捉抗體束縛于固體支持物上； 和(d)比較一種或多種分析物測得的活化狀態(tài)與缺乏抗癌藥時產(chǎn)生的參比活化狀態(tài)，預(yù) 測該對象對該抗癌藥治療反應(yīng)的可能性。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述乳腺腫瘤來自患乳腺導(dǎo)管癌或小葉 癌的對象。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)管癌是浸潤性導(dǎo)管癌或原位導(dǎo)管癌。
84.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述小葉癌是浸潤性小葉癌或原位小葉癌。
85.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括乳腺腫瘤的循環(huán)細(xì)胞。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，通過免疫磁性分離法，分離樣品中的循 環(huán)細(xì)胞。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述樣品選自全血、血清、血漿、 導(dǎo)管洗出液、乳頭抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、細(xì)針抽吸物和它們的組合。
88.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)細(xì)胞選自循環(huán)腫瘤細(xì)胞、 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、播散的腫瘤細(xì)胞和它們的組合。
89.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織分離的細(xì)胞。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述腫瘤組織是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤組織。
91.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織細(xì)針抽吸物樣品 分離的細(xì)胞。
92.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，用生長因子體外刺激所述分離細(xì)胞。
93.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自單克隆抗體、酪氨 酸激酶抑制劑、化療劑、激素治療劑、放療劑、疫苗和它們的組合。
94.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述一種或多種分析物包含多個信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)分子。
95.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)選自磷酸化狀態(tài)、遍 在蛋白化狀態(tài)、復(fù)合狀態(tài)和它們的組合。
96.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述固相支持體選自玻璃，塑料， 芯片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。
97.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗體束縛于可尋址陣列的固體 支持物上。
98.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)在步驟(C)中包括(i)將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；(ii)將多個被捕獲分析物與相應(yīng)分析物的特異性活化狀態(tài)依賴性抗體一起培育，形成 多個可檢測的被捕獲分析物；(iii)將多個可檢測的被捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育，產(chǎn)生 放大的信號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
99.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述試驗(yàn)的步驟(C)包括ω將細(xì)胞提取物與捕捉抗體的多個系列稀釋液一起培育，形成多個被捕獲的分析物；( )將多個被捕獲分析物與檢測抗體一起培育，形成多個可檢測的被捕獲分析物，所 述檢測抗體包含相應(yīng)分析物的特異性多個活化狀態(tài)依賴性抗體和多個活化狀態(tài)非依賴性 抗體，其中所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分子標(biāo)記，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放 大對第一成員標(biāo)記，所述輔助分子能產(chǎn)生傳送給信號放大對第一成員并與之反應(yīng)的氧化 劑；( )將所述多個可檢測的被捕獲分析物與信號放大對的第二成員一起培育，產(chǎn)生放 大的信號；和(iv)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
100.—種具有優(yōu)秀動態(tài)范圍的陣列，其包含多個束縛于固體支持物上的系列稀釋捕 捉抗體，其中各系列稀釋捕捉抗體是細(xì)胞提取物中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分的一種或多種相應(yīng) 分析物的特異性抗體。
101.如權(quán)利要求100所述的陣列，其特征在于，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞增殖。
102.如權(quán)利要求101所述的陣列，其特征在于，所述捕捉抗體包括選自能與 IGF1R、cMET、ErbBl、ErbB2、p95ErbB2、ErbB3、ErbB4、She、PI3K、Erk、Rsk、 Akt、p70S6K、ER、PR、NCOR和AIBl的一個或多個成員反應(yīng)的抗體。
103.如權(quán)利要求100所述的陣列，其特征在于，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腫瘤血管生成。
104.如權(quán)利要求103所述的陣列，其特征在于，所述捕捉抗體包括選自能與She、 PI3K、Erk、Rsk、Akt、p70S6K、VEGFR-I、VEGFR-2、Tie 2、V-鈣粘蛋白 _R2 復(fù)合 物、PDGFRA、和PDGFRB的一個或多個成員反應(yīng)的抗體。
105.一種檢測截短受體存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)將細(xì)胞提取物與多個全長受體胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)特異性珠一起培育；(b)從細(xì)胞提取物中除去多個珠，從而除去全長受體，形成缺乏全長受體的細(xì)胞提取物；(C)將不含全長受體的細(xì)胞提取物與多個捕捉抗體一起培育，形成多個被捕獲的截短 受體，其中所述多個捕捉抗體是所述截短受體胞內(nèi)域(ICD)結(jié)合區(qū)的特異性抗體，所述 多個捕捉抗體束縛于固體支持物上；(d)將多個被捕獲截短受體與相應(yīng)截短受體的特異性檢測抗體一起培育，形成多個可 檢測的被捕獲截短受體；(e)將多個可檢測的被捕獲截短受體與信號放大對的第一和第二成員一起培育，產(chǎn)生 放大的信號；和(f)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述截短受體是p95ErbB2。
107.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述全長受體是ErbB2(HER-2)。
108.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述多個胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)特異 性珠包含鏈霉抗生物素蛋白-生物素對，其中所述鏈霉抗生物素蛋白附著于珠，生物素 附著于抗體。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述抗體是全長受體ECD結(jié)合區(qū)的 特異性抗體。
110.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，通過裂解乳腺腫瘤循環(huán)細(xì)胞產(chǎn)生所述 細(xì)胞提取物。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其特征在于，通過免疫磁性分離法，分離樣品中的 循環(huán)細(xì)胞。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其特征在于，所述樣品選自全血、血清、血 漿、導(dǎo)管洗出液、乳頭抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、細(xì)針抽吸物和它們的組合。
113.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，通過裂解分離自腫瘤組織的細(xì)胞產(chǎn)生 所述細(xì)胞提取物。
114.如權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于，所述腫瘤組織是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性 腫瘤組織。
115.如權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織細(xì)針抽吸物樣 品分離的細(xì)胞。
116.如權(quán)利要求111或113所述的方法，其特征在于，用生長因子體外刺激所述分離 的細(xì)胞。
117.如權(quán)利要求116所述的方法，其特征在于，所述分離細(xì)胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。
118.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自單克隆抗體、酪 氨酸激酶抑制劑、化療劑、激素治療劑、放療劑、疫苗和它們的組合。
119.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述多個可檢測的被捕獲截短受體活 化狀態(tài)是可詢問的。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)選自磷酸化狀態(tài)、 遍在蛋白化狀態(tài)、復(fù)合狀態(tài)和它們的組合。
121.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述檢測抗體包含結(jié)合對的第一成員O
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第一成員是生物素。
123.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第一成員包含結(jié)合對第二成員。
124.如權(quán)利要求123所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第二成員是鏈霉抗生物素蛋白。
125.如權(quán)利要求124所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第一成員是過氧化物酶。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶 (HRP) ο
127.如權(quán)利要求125所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第二成員是酪酰胺試劑。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
129.如權(quán)利要求128所述的方法，其特征在于，通過過氧化物酶氧化生物素-酪酰胺 產(chǎn)生活化的酪酰胺而產(chǎn)生所述放大信號。
130.如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，直接檢測活化的酪酰胺。
131.如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，通過加入信號檢測試劑檢測活化的酪 酰胺。
132.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的熒光團(tuán)。
133.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
134.如權(quán)利要求133所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3'，5，5'-四 甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
135.—種檢測截短受體存在的方法，所述方法包括(a)將細(xì)胞提取物與多個全長受體胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)的特異性珠一起培育；(b)從細(xì)胞提取物中除去多個珠，從而除去全長受體，形成缺乏全長受體的細(xì)胞提取物；(C)將不含全長受體的細(xì)胞提取物與多個捕捉抗體一起培育，其中所述多個捕捉抗 體是截短受體胞內(nèi)域(ICD)結(jié)合區(qū)的特異性抗體，所述多個捕捉抗體束縛于固體支持物 上，形成多個被捕獲的截短受體；(d)將多個被捕獲截短受體與檢測抗體一起培育，形成多個可檢測的被捕獲截短受 體，所述檢測抗體包含相應(yīng)截短受體的特異性多個活化狀態(tài)依賴性抗體和多個活化狀態(tài) 非依賴性抗體，其中所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分子標(biāo)記，活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大 對的第一成員標(biāo)記，所述輔助分子能產(chǎn)生傳送給信號放大對第一成員并與之反應(yīng)的氧化 劑；(e)將所述多個可檢測的被捕獲截短受體與信號放大對第二成員一起培育，產(chǎn)生放大 的信號；和(f)檢測信號放大對第一和第二成員產(chǎn)生的放大信號。
136.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述截短受體是P95ErbB2。
137.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述全長受體是ErbB2(HER-2)。
138.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述多個胞外域(ECD)結(jié)合區(qū)特異 性珠包含鏈霉抗生物素蛋白-生物素對，其中鏈霉抗生物素蛋白附著于珠，生物素附著 于抗體。
139.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述抗體是全長受體ECD結(jié)合區(qū)的 特異性抗體。
140.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，通過裂解乳腺腫瘤循環(huán)細(xì)胞而產(chǎn)生所 述細(xì)胞提取物。
141.如權(quán)利要求140所述的方法，其特征在于，通過免疫磁性分離法，分離樣品中的 循環(huán)細(xì)胞。
142.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于，所述樣品選自全血、血清、血 漿、導(dǎo)管洗出液、乳頭抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、細(xì)針抽吸物和它們的組合。
143.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，通過裂解分離自腫瘤組織的細(xì)胞產(chǎn)生 所述細(xì)胞提取物。
144.如權(quán)利要求143所述的方法，其特征在于，所述腫瘤組織是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性 腫瘤組織。
145.如權(quán)利要求143所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從腫瘤組織細(xì)針抽吸物樣 品分離的細(xì)胞。
146.如權(quán)利要求141或143所述的方法，其特征在于，用生長因子體外刺激所述分離 的細(xì)胞。
147.如權(quán)利要求146所述的方法，其特征在于，所述分離細(xì)胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。
148.如權(quán)利要求147所述的方法，其特征在于，所述抗癌藥選自單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、化療劑、激素治療劑、放療劑、疫苗和它們的組合。
149.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體用輔助分 子直接標(biāo)記。
150.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)非依賴性抗體通過偶連 于該活化狀態(tài)非依賴性抗體的寡核苷酸與偶連于輔助分子的互補(bǔ)寡核苷酸之間的雜交， 被輔助分子標(biāo)記。
151.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體用信號放大 對第一成員直接標(biāo)記。
152.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化狀態(tài)依賴性抗體通過偶聯(lián)于 該活化狀態(tài)依賴性抗體的結(jié)合對第一成員與偶聯(lián)于信號放大對第一成員的結(jié)合對第二成 員之間的結(jié)合，用信號放大對第一成員標(biāo)記。
153.如權(quán)利要求152所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第一成員是生物素。
154.如權(quán)利要求152所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合對第二成員是鏈霉抗生物素 蛋白。
155.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述輔助分子是葡萄糖氧化酶。
156.如權(quán)利要求155所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和活化狀態(tài)非依賴 性抗體偶聯(lián)于巰基活化的葡聚糖分子。
157.如權(quán)利要求156所述的方法，其特征在于，所述巰基活化的葡聚糖分子的分子量 為 500kDa。
158.如權(quán)利要求155所述的方法，其特征在于，所述氧化劑是過氧化氫(H2O2)。
159.如權(quán)利要求158所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第一成員是過氧化物酶。
160.如權(quán)利要求159所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶 (HRP) ο
161.如權(quán)利要求159所述的方法，其特征在于，所述信號放大對第二成員是酪酰胺試劑。
162.如權(quán)利要求161所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺試劑是生物素-酪酰胺。
163.如權(quán)利要求162所述的方法，其特征在于，通過過氧化物酶氧化生物素_酪酰胺 產(chǎn)生活化的酪酰胺而產(chǎn)生放大信號。
164.如權(quán)利要求163所述的方法，其特征在于，直接檢測活化的酪酰胺。
165.如權(quán)利要求163所述的方法，其特征在于，通過加入信號檢測試劑檢測活化的酪 酰胺。
166.如權(quán)利要求165所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的熒光團(tuán)。
167.如權(quán)利要求165所述的方法，其特征在于，所述信號檢測試劑是鏈霉抗生物素蛋 白-標(biāo)記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。
168.如權(quán)利要求167所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑是3，3'，5，5'-四 甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測腫瘤細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分活化狀態(tài)的組合物和方法。利用本發(fā)明獲得的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑諸組分活化狀態(tài)的信息可進(jìn)行癌癥的診斷、預(yù)后和設(shè)計(jì)癌癥治療方法。
文檔編號G01N33/50GK102016581SQ200980114742
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日
發(fā)明者B·內(nèi)里, J·哈維, L·劉, P·金, R·巴罕姆, S·辛格, X·劉 申請人:普羅米修斯實(shí)驗(yàn)室股份有限公司