專利名稱：用于對(duì)包括全血的生物流體執(zhí)行免疫測(cè)定的配體分析中的結(jié)合標(biāo)記和游離標(biāo)記的虛擬分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在人和動(dòng)物的生物流體(諸如全血、血清、血漿、尿液、乳液、胸 膜液和腹膜液、以及精液)中通過電子手段對(duì)免疫檢測(cè)物質(zhì)的有效檢測(cè)、量化和表征， 在薄腔室中對(duì)靜態(tài)流體樣本執(zhí)行該檢測(cè)、量化和表征，所述腔室具有至少兩個(gè)平行平板 壁，所述至少兩個(gè)平行平板壁中的至少一個(gè)是透明的。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及對(duì)所有免疫測(cè)定的性能的改進(jìn)，其目前涉及通過在配體分析中執(zhí)行 結(jié)合光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記和游離光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的虛擬分離來代替從游離分析物分離出結(jié)合分析 物的物理分離，其中，雖然任意可光學(xué)檢測(cè)和量化的標(biāo)記都行，但所述標(biāo)記優(yōu)選地為熒 光標(biāo)記。下列頒發(fā)的美國專利中描述了該分析中所使用的腔室和用于測(cè)量這些腔室中的 分析物的儀器頒發(fā)給 S.C.Wardlaw 的 No.6,9^,953、No.6,869,570、No.6,866,823 ；以及 2007年4月19日公布的頒發(fā)給S.C.Wardlaw的美國專利申請(qǐng)US 2007/0087442。
在現(xiàn)有技術(shù)中，從游離分析物分離出結(jié)合分析物的物理分離由多種方法完成， 所述多種方法包括但不限于通過木炭或滑石粉來吸收游離標(biāo)記；對(duì)包含有結(jié)合分析物 或未結(jié)合分析物的珠狀物(beads)的磁分離；通過諸如附著于試管壁的抗體之類的容器 來吸收結(jié)合標(biāo)記分析物并且在針對(duì)結(jié)合了抗體的分析物使用二次析出抗體之后通過離心 法；以及上述專利和公開中所描述的方法。
下列美國專利中描述了結(jié)合目標(biāo)分析物分析的現(xiàn)有技術(shù)物理分離的一些類 型5,834,217 ； 5,776,710 ； 5,759,794 ； 5,635,362 ； 5,593,848 ； 5,342,790 ； 5,460,979 ； 5,480,778 ；以及5,360,719，所有這些專利都頒發(fā)給了 R.A丄evine等人。在上述專利中， 通過離心法、或者其他物理方法(諸如傾析、過濾等)來執(zhí)行從游離分析物分離出結(jié)合分 析物。
現(xiàn)有技術(shù)還描述了免疫測(cè)定的類型，其被稱為“均相免疫測(cè)定”。均相免疫 測(cè)定不需要從未結(jié)合分析物或游離分析物物理分離出結(jié)合分析物?！皬挠坞x分析物分離 出結(jié)合分析物”是通過利用相對(duì)較大抗體對(duì)酶的空間位阻影響并且通過對(duì)酶促作用的著 色產(chǎn)物或熒光產(chǎn)物進(jìn)行量化來實(shí)現(xiàn)的。均相免疫測(cè)定的另外的方法利用熒光團(tuán)的熒光淬 滅來從游離分析物區(qū)分出結(jié)合分析物。盡管這些方法極大地簡(jiǎn)化了免疫測(cè)定的執(zhí)行， 但是，它們通常僅對(duì)高濃度低分子量的分析物有用，這是因?yàn)橹T如蛋白質(zhì)(例如，胰島 素)、生長(zhǎng)激素等之類的高分子量的目標(biāo)分析物對(duì)酶也有干擾并且可能影響淬滅。另外，這種均相類型的免疫測(cè)定通常沒有標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定的高靈敏度。
提供一種目標(biāo)分析物的配體分析是非常理想的，在該配體分析中，對(duì)目標(biāo)分析 物的量化是虛擬的，其可以通過電子手段來執(zhí)行，從而在保持標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定的靈敏度的 同時(shí)還具有均相免疫測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)，以及可用于諸如類激素胰島素、生長(zhǎng)激素等之類的大 尺寸目標(biāo)分析物。發(fā)明內(nèi)容
免疫測(cè)定用于分析諸如血液中的激素等之類的各式各樣的分析物。它們通過找 到特別結(jié)合至被測(cè)量目標(biāo)分析物的特定結(jié)合物的通用技術(shù)起作用。此處，將結(jié)合物稱為 配體。此處，配體被限定為包括但不限于用于結(jié)合目標(biāo)分析物的那些抗體、凝集素、適 配體或天然物質(zhì)。將要被測(cè)量的樣本摻合有特定于目標(biāo)分析物的配體以及標(biāo)記型式的被 測(cè)量分析物。隨著對(duì)該混合物的培養(yǎng)，有標(biāo)記目標(biāo)分析物分子和無標(biāo)記目標(biāo)分析物分子 競(jìng)爭(zhēng)配體上的結(jié)合部位。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段之后，通過任意多種方法將配體移除，并且對(duì) 結(jié)合到配體的標(biāo)記與未結(jié)合的并在混合物中保持游離的標(biāo)記進(jìn)行比較。該結(jié)合/游離比 與目標(biāo)分析物最初在樣本中的濃度相關(guān)，盡管結(jié)合標(biāo)記或游離標(biāo)記都可以給出相同的信 息。該比例的使用可以用于進(jìn)行質(zhì)量管理檢驗(yàn)，其中，如果體積恒定，則結(jié)合的加上游 離的所得的總數(shù)相對(duì)恒定。在本發(fā)明的實(shí)踐中也可以采用該質(zhì)量管理。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種用于針對(duì)可能存在于生物流體樣本中的目標(biāo)分 析物材料對(duì)該流體樣本進(jìn)行分析的方法。該方法利用流體樣本內(nèi)配置的游離目標(biāo)分析物 和結(jié)合目標(biāo)分析物的虛擬分離，其涉及對(duì)樣本的電子掃描。該方法涉及將流體樣本置于 具有預(yù)定和固定高度的試驗(yàn)腔室中，以便在該腔室中產(chǎn)生流體樣本的薄層。腔室的至少 一個(gè)壁(通常是頂壁)是透明的，以使得可以觀察到腔室中的樣本。在某些情況下，腔 室的頂壁和底壁都是透明的。腔室的高度(例如，通常為Iym至200 μιη)可以根據(jù)當(dāng) 前應(yīng)用而改變。例如，當(dāng)要分析抗凝全血時(shí)，6 μ m的腔室高度是優(yōu)選的，這是因?yàn)槠湓?血液樣本中造成了紅細(xì)胞的單細(xì)胞層以及散布的血漿空隙。
固定結(jié)構(gòu)或者覆蓋有配體的珠狀物(legand-coated bead)的高度最佳地應(yīng)該不小 于腔室高度的十分之一，并且理想地達(dá)到腔室的高度。這是因?yàn)?，如果包圍結(jié)合有標(biāo)記 的微粒或結(jié)構(gòu)的處于游離狀態(tài)的標(biāo)記(即，熒光團(tuán))的總量遠(yuǎn)大于將要檢測(cè)到的結(jié)合標(biāo)記 的最低量，則精確地確定結(jié)合到珠狀物或結(jié)構(gòu)的標(biāo)記的量的能力將由于信噪比的影響而 減小。數(shù)學(xué)上不存在對(duì)腔室高度的限制，但是由于被檢測(cè)標(biāo)記的信噪比的實(shí)際限制，為 了實(shí)現(xiàn)最佳的功能，需要薄腔室和結(jié)構(gòu)，其占據(jù)圍攏在結(jié)構(gòu)外圍的柱體的體積的至少十 分之一，并且從腔室的底部延伸至頂部。在配體附著于腔室頂部或底部而不是附著于結(jié) 構(gòu)或珠狀物的示例中，上述比例適用，但是，所述分析最佳地應(yīng)該被規(guī)劃為使得結(jié)合配 體區(qū)域之上的柱狀體積包含不多于結(jié)合到期望檢測(cè)的配體區(qū)域的最低量的十倍。可以通 過使腔室盡可能的薄或者可以通過改變反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量來減小該限制。
本發(fā)明的方法可以用于在現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理時(shí)對(duì)病人的藥物過敏或過敏原敏感進(jìn)行測(cè) 試。藥物過敏和過敏原敏感是常見且重要的問題。對(duì)病人和社會(huì)來說代價(jià)是昂貴的。例 如，對(duì)青霉素過敏的病人使用青霉素類藥物進(jìn)行治療可能導(dǎo)致死亡或嚴(yán)重反應(yīng)。在該討 論中，將青霉素用作代表性藥物是因?yàn)槠涫窃斐蓢?yán)重過敏反應(yīng)的最常見的藥物類型。本發(fā)明并不限于對(duì)青霉素過敏的測(cè)試，而可以用于測(cè)試對(duì)其他藥物(例如，抗生素、肌肉 松弛藥、麻醉劑等)和過敏原的敏感性。
青霉素是廉價(jià)、有效且通常無毒的藥物。鑒于已感知的過敏，可以使用另一種 較少微生物靶向的藥物對(duì)認(rèn)為其對(duì)青霉素過敏的病人進(jìn)行治療。然而，這種替代藥物可 能對(duì)病人產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，并且給保健制度帶來巨大的開銷，因?yàn)樾碌乃幬锟赡軙?huì)比 青霉素藥物昂貴幾百或幾千倍。同樣重要的是社會(huì)的開銷，這種開銷與使用更廣譜的藥 物來代替更集中于目標(biāo)組織的藥物時(shí)所發(fā)生的抗藥細(xì)菌、病毒、或其他感染病原物的興 起有關(guān)。因此，對(duì)具體病人、醫(yī)療服務(wù)提供者、以及社會(huì)來說重要的是，通過除了病人 給出病歷之外的方法來確定是否存在藥物過敏或過敏原敏感。本發(fā)明的一個(gè)目的是在病 人的全血或血漿樣本中檢測(cè)是否存在藥物過敏和/或過敏原敏感。
有充分的文件證明，許多聲稱對(duì)青霉素過敏的病人可能是不過敏的，并且類似 地，一些認(rèn)為其不過敏的病人從其最后暴露以后可能已發(fā)展為過敏。據(jù)報(bào)告，大約80% 的認(rèn)為其對(duì)青霉素過敏的病人實(shí)際上可以使用青霉素，因此，對(duì)于這些病人來說，對(duì)抗 生素選擇的限制是不必要的，而這種限制會(huì)潛在地導(dǎo)致不太有效、更大毒性以及更昂貴 的治療。
在任何地方，對(duì)檢測(cè)藥物過敏的能力的需要都大于對(duì)現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理時(shí)處理病人的能 力的需要。醫(yī)師在他們的辦公室、急診室或醫(yī)院開藥都不需要為等待在體外或通過皮 試執(zhí)行的試驗(yàn)而耗費(fèi)幾個(gè)小時(shí)或一天。皮試可以額外地暴露病人對(duì)試驗(yàn)物質(zhì)反應(yīng)的危險(xiǎn) 性，并且通過回憶反應(yīng)具有導(dǎo)致過敏或增大過敏的理論上的可能性。目前，體外試驗(yàn)是 復(fù)雜的，執(zhí)行體外試驗(yàn)是耗時(shí)的并且在其最有用很久之后才能將信息提供給醫(yī)師。另 外，許多藥物(包括青霉素類型的藥物)的過敏原性質(zhì)可能是由于多于一個(gè)表位(epitope) 而引起的，并且精確的測(cè)試將需要對(duì)可能引起過敏反應(yīng)的所有共同表位進(jìn)行測(cè)試。通常 對(duì)有限數(shù)量的試驗(yàn)過敏原及其表位執(zhí)行文獻(xiàn)中充分描述了的RAST測(cè)試。
普遍認(rèn)為，IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是最嚴(yán)重的過敏反應(yīng)(包括過敏性反應(yīng)、蕁麻 疹、痢疾性腸道腫脹、以及由于氣道腫脹引起的呼吸道阻塞)的起因。一些專家認(rèn)為， 其他免疫球蛋白類型也可能引起對(duì)藥物的過敏反應(yīng)，但是對(duì)^G和IgM介導(dǎo)的藥物過敏 的過敏反應(yīng)通常不危及生命并且更有可能是皮疹。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是其提供了一種優(yōu)選地在現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理時(shí)執(zhí)行的方法，該方法確定IgE 的存在或?qū)σ环N或多種藥物具有親和力的任意其他免疫球蛋白的存在，所述一種或多種 藥物是或者可能是在既定情景下指定使用的藥物。
所選標(biāo)記是使用容易檢測(cè)并附著于配體的熒光團(tuán)。但是，本發(fā)明不限于使用 熒光標(biāo)記。如果需要在同一腔室中檢查是否存在可附著于珠狀物的多于一類的免疫 球蛋白，則可以使用多于一個(gè)顏色的熒光團(tuán)。沒有附著抗原的珠狀物被用作對(duì)照物 (controls)。對(duì)照珠狀物可以在化學(xué)和幾何上類似于被覆蓋的珠狀物，而僅在顏色或者其 他使其被檢測(cè)到的方法(例如，熒光或者并入其結(jié)構(gòu)中的熒光染料的組合)上不同。對(duì)照 珠狀物提供對(duì)照以使得可以將檢測(cè)(例如，來自針對(duì)附著于珠狀物的IgE的熒光標(biāo)記抗體 的顯著的熒光信號(hào)，所述珠狀物包含被作為潛在過敏原而測(cè)試的藥物的決定簇(表位)) 與表示不覆蓋或沒有結(jié)合至表位的類似珠狀物的信號(hào)相比較。因此，非特異性結(jié)合被控 制并且將不會(huì)導(dǎo)致誤診。


圖1是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的可用于對(duì)血液或其它樣本執(zhí)行免疫測(cè)定的配體支撐表面 的示意性側(cè)視圖。
圖1(a)是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的類似于圖1但是示出了洗去樣本之后的表面的視圖。
圖2是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的類似于圖1但是示出了可用于對(duì)血液或其它樣本執(zhí)行夾心 免疫測(cè)定的配體支撐表面的示意性側(cè)視圖。
圖2(a)是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的類似于圖2但是示出了將第二標(biāo)記加入樣本之后樣本 的視圖。
圖2(b)是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的類似于圖2(a)但是示出了洗去樣本之后的表面的視 圖。
圖3是根據(jù)本發(fā)明形成的采樣腔室的第一實(shí)施例的平面圖，該腔室包含添加有 血液樣本配體支撐分析物捕獲微粒的抗凝全血樣本。
圖4是圖3所示采樣腔室的一部分的側(cè)視截面圖，該部分包含一個(gè)配體覆蓋的目 標(biāo)分析物捕獲微粒。
圖5是試驗(yàn)腔室的平面圖，類似于圖4所示，其示出了血液樣本中包含一個(gè)配體 覆蓋的目標(biāo)分析物捕獲微粒的樣本區(qū)域，并且還示出了不包含配體覆蓋的目標(biāo)分析物捕 獲微粒而僅包含游離的標(biāo)記目標(biāo)分析物的樣本區(qū)域。
圖6是部分配體覆蓋的目標(biāo)分析物捕獲表面的分段截面圖，其中所述表面的部 分覆蓋有配體而其他部分不覆蓋有配體。
圖7是具有如圖6所示的頂面的封閉腔室的截面示意圖。
圖8是圖6中所示表面的平面圖。
圖9是圖6和圖8所示捕獲表面上的配體帶的發(fā)光蹤跡。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)在參照附圖，圖1和圖1(a)示出了現(xiàn)有技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定(也被稱為 “平衡分析”)，其通常用于低分子量的分析物，諸如甲狀腺激素、甲狀腺素，其中標(biāo)號(hào) 1表示通過任意多種已知方法將特定于目標(biāo)分析物的配體2附著其上的表面。表面1可 以是玻璃或塑料管或者微粒的透明壁。溶液3包含無標(biāo)記目標(biāo)分析物4 (未知)和有標(biāo)記 目標(biāo)分析物5的混合物。一段時(shí)間(可以是從幾分鐘到幾小時(shí)，這取決于目標(biāo)和標(biāo)記) 之后，有標(biāo)記目標(biāo)分析物5和無標(biāo)記目標(biāo)分析物4將相互平衡，其中許多(但通常不是全 部)配體部位2將被有標(biāo)記目標(biāo)分析物5或無標(biāo)記目標(biāo)分析物4占據(jù)。此時(shí)(圖la)，以 保留結(jié)合到配體2的有標(biāo)記目標(biāo)分析物5的方式將混合物3與配體支撐表面1分離。然 后，測(cè)量結(jié)合到表面1的有標(biāo)記目標(biāo)分析物5 (參見圖la)，并且游離的有標(biāo)記目標(biāo)分析物 也可以被測(cè)量或者通過以下方法計(jì)算總量=游離的+結(jié)合的，或者結(jié)合的=總量-游離 的。結(jié)合目標(biāo)分析物與游離目標(biāo)分析物之比與樣本中的總目標(biāo)分析物量成反比。
圖2至圖2(b)示出了通常被稱為“夾心”分析的配體分析，其中利用了兩種不 同的配體。表面1具有以上述類似方式結(jié)合到其上的配體2 ( “結(jié)合配體”)，并且包含 目標(biāo)分析物4的樣本被引入溶液3并且在表面1上培養(yǎng)。立即或者經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段之后，不同的標(biāo)記配體6被引入溶液，該標(biāo)記配體6結(jié)合到目標(biāo)分析物4上與結(jié)合配體2的 部位不同的部位(圖2a)。實(shí)際上，這造成了在中心包含目標(biāo)分析物4的“夾心”。然 后，從表面1洗去游離的有標(biāo)記配體6以使其離開覆蓋著有標(biāo)記部位的表面1 (圖2b)。 然后，對(duì)結(jié)合到表面1的有標(biāo)記分析物4進(jìn)行量化，并且因此獲得的信號(hào)與原始樣本中目 標(biāo)分析物4的量成正比。通常認(rèn)為夾心分析更精確并且某種程度上更準(zhǔn)確，但是其僅可 適用于具有至少兩個(gè)不同的可結(jié)合配體的部位的目標(biāo)分析物分子。
在上述任何一種分析中，從游離標(biāo)記分離結(jié)合標(biāo)記被認(rèn)為是對(duì)生產(chǎn)過程的挑戰(zhàn) 方面之一，并且通常需要一個(gè)或多個(gè)機(jī)械上復(fù)雜的步驟，諸如離心、傾析、沖洗等。因 此，使這些測(cè)試自動(dòng)化的儀器也相對(duì)復(fù)雜并且需要多種操作。
與之相比，本發(fā)明的方面提供了一種“虛擬分離”的方法，其中結(jié)合標(biāo)記和游 離標(biāo)記不進(jìn)行物理上的分離，而通過試驗(yàn)細(xì)胞構(gòu)造和來自試驗(yàn)細(xì)胞中不同區(qū)域的信號(hào)的 數(shù)學(xué)運(yùn)算的組合來進(jìn)行分離。因此，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化的自動(dòng)化配體分析的方法和設(shè)備。
根據(jù)本發(fā)明的方面，執(zhí)行免疫測(cè)定或者配體分析，其中結(jié)合物是配體或者對(duì)目 標(biāo)分析物具有高親和力的其他物質(zhì)。
例如，可以使用在美國專利公開NO.2007/0M3117和No.2007/0087442以及美國 專利No.6,866,823中描述的樣本容器和成像儀器系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的分析，所有這些 專利公開和專利以引文的方式整體并入本文。但是，本發(fā)明的分析不限于這些腔室和成像裝置。
本公開以及權(quán)利要求中所使用的術(shù)語“免疫測(cè)定”意味著基于抗體的結(jié)合劑和 不基于抗體的結(jié)合劑兩者。后者的示例包括但不限于用于結(jié)合維生素B12的內(nèi)在因子、 以及用于結(jié)合生物素標(biāo)記目標(biāo)的抗生素蛋白或者相反。
在本發(fā)明的方面下，提供了一種配體附著的限定明確并按照自然規(guī)律限定的表 面，并且然后，從數(shù)學(xué)上對(duì)來自結(jié)合到該表面的標(biāo)記的信號(hào)與來自可能留在溶液中的任 意周圍的游離標(biāo)記的信號(hào)進(jìn)行區(qū)分。通常存在下述兩種情況。
圖3是樣本腔室組件40的截面的平面圖，該腔室組件40包含抗凝全血樣本。腔 室組件40包括上壁和下壁7 (參見圖4)，其中至少一個(gè)壁是透明的。優(yōu)選地，兩個(gè)壁7 都是透明的。腔室組件40包括隔離構(gòu)件42 (參見圖幻，其可以任意地位于腔室組件40 的內(nèi)部。隔離構(gòu)件42優(yōu)選地為球狀的，并且確定和控制腔室組件40的高度。在分析抗 凝全血樣本的情況下，具有約6μιη直徑的隔離組件42尤其有效。包含于腔室組件40中 的血液樣本將包括各紅細(xì)胞44和紅細(xì)胞結(jié)塊46。血液樣本還包括不包含任何形成的血 液成分的空血漿空隙區(qū)48。最后，血液樣本還包括多個(gè)配體覆蓋的目標(biāo)分析物捕獲微粒 8，其優(yōu)選地為球狀的形式。目標(biāo)分析物捕獲微粒8任意地分布在整個(gè)血液樣本中，并且 其針對(duì)血液樣本分析的直徑可以為約3μιη-4μιη，從而使得可以容易地在血液樣本中檢 測(cè)到它們。
圖4示出了圖3所示腔室組件40的結(jié)構(gòu)。腔室組件40由頂壁和底壁7限定，其 中至少一個(gè)壁必須為透明的。腔室內(nèi)為微粒8，其表面被配體9覆蓋。只要其體積可以被 確定，微粒8可以為任意形狀，但是其體積優(yōu)選地為球狀。微粒8可以為配體可附著的任 意材料，諸如玻璃、聚苯乙烯等。微粒不限于任何特定直徑(例如，2 μ m至100 μ m)， 并且該直徑可以根據(jù)被分析流體以及所使用腔室高度而改變。壁7之間的距離通常不小于微粒8的直徑，但是上限距離將取決于微粒8的性質(zhì)。
混合物10以結(jié)合圖1描述的類似方式包含目標(biāo)分析物11和有標(biāo)記目標(biāo)分析物12 兩者。在經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間段后，對(duì)來自結(jié)合目標(biāo)分析物和游離目標(biāo)分析物的信號(hào)進(jìn) 行分析。
圖5是試驗(yàn)腔室組件的頂視圖，類似于圖4所示，其示出了混合物10的未限定 的延伸區(qū)域13。在該延伸區(qū)域內(nèi)，來自標(biāo)記12的總信號(hào)被收集于限定區(qū)域14上，該區(qū) 域不限于任意特定形狀。收集的方法可以是熒光掃描(在熒光標(biāo)記的情況下)或者放射 性核苷酸掃描(在放射性標(biāo)記的情況下)。該區(qū)域被選擇為使其包括具有已知的或可測(cè)量 的直徑的至少一個(gè)微粒8。也對(duì)不包含微粒的相鄰限定的區(qū)域16進(jìn)行測(cè)量。來自區(qū)域 16的信號(hào)表示來自未結(jié)合標(biāo)記的信號(hào)，因?yàn)樵趨^(qū)域16的位置處沒有結(jié)合部位。但是， 來自區(qū)域14的信號(hào)具有來自結(jié)合標(biāo)記和來自游離標(biāo)記兩者的信號(hào)?？梢砸远喾N方法來確 定每個(gè)信號(hào)的影響。如果微粒為球狀的(其為優(yōu)選的形狀)，則可以根據(jù)其直徑來計(jì)算 其體積(Vp)，可以使用從標(biāo)記收集信號(hào)的同一光學(xué)系統(tǒng)來測(cè)量該直徑。限定區(qū)域14的 體積(V14)和限定區(qū)域16的體積(V16)均可以根據(jù)其寬度和腔室深度容易地計(jì)算出來。 假設(shè)與限定區(qū)域14和16相關(guān)的腔室體積相同，則來自游離標(biāo)記的信號(hào)等于來自區(qū)域16 的信號(hào)(S16)。S卩，在不存在來自微粒(結(jié)合標(biāo)記)的信號(hào)的情況下，來自區(qū)域14的信 號(hào)應(yīng)該為Sf = S16X (V14-Vp)。任意超過該量的信號(hào)6b)來自結(jié)合標(biāo)記Sb = S14-Sf。與區(qū)域14內(nèi)的體積相比，如果微粒的體積較小，則不需要進(jìn)行體積校正。所 要確定的是掃描的每個(gè)像素(或者像素的集群)的平均標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度。本申請(qǐng)中所使用 的術(shù)語“像素”可以包括一個(gè)或多個(gè)相鄰像素的含義。
在第二并且是最優(yōu)選的實(shí)施例中，配體附著于腔室本身的至少一個(gè)表面。圖6 示出了(上)透明腔室表面17，其可以是玻璃或塑料(諸如聚丙烯的或者聚苯乙烯)，該 表面上附著有通過任意多種已知的方法均勻覆蓋的配體。形成均勻覆蓋之后，通過機(jī)械 或化學(xué)方法或者通過激光燒蝕從一個(gè)或多個(gè)區(qū)域18選擇性地移除配體，相應(yīng)地在相鄰區(qū) 域19中留下活性配體。
圖7示出了該表面17作為包含混合物20的薄腔室的部分，其包括無標(biāo)記目 標(biāo)分析物21和有標(biāo)記分析物22。該腔室高度優(yōu)選地小于約1mm，并且最優(yōu)選地小于 200 μ m( S卩，在Iym至200 ym的范圍內(nèi))。如上所述，在經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間段之后，有 標(biāo)記分析物和無標(biāo)記分析物將與配體達(dá)到平衡，留下一部分結(jié)合至表面的有標(biāo)記分析物 23，但是僅在配體剩余的區(qū)域中。在熒光標(biāo)記的情況下，使用適當(dāng)波長(zhǎng)的光源M來照亮 腔室表面17以激發(fā)標(biāo)記中的熒光。透鏡25收集通過濾光器沈過濾并且投射到析像裝 置27上的熒光發(fā)射，所述析像裝置可以為電耦合器件(CCD)、互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體 (CMOS)等?？商鎿Q地，光源可以為聚焦極小的激光，其將光點(diǎn)移動(dòng)到腔室上，并且在 該情況下，光收集裝置27可以為簡(jiǎn)單的光電管或者光電倍增器。
圖8所示腔室觀的示意性頂視圖示出了任何一種處理的最終結(jié)果，其中活性配 體四和燒蝕配體30呈現(xiàn)為一系列垂直條紋。來自圖7設(shè)備的掃描線由線a-a表示。圖 9是沿掃描線a-a截取的波形表示，其中峰值31是來自活性配體的信號(hào)，而波谷32來自 非活性區(qū)域。因此，結(jié)合標(biāo)記濃度由從波峰到波谷的距離表示，并且波谷的高度表示游 離標(biāo)記?；钚詤^(qū)域和非活性區(qū)域均不限于任意特定幾何形狀。
在一些實(shí)施例中，可以使用非常柔韌的腔室壁17，通過對(duì)其施加相對(duì)較小的點(diǎn) 負(fù)荷其可以局部地發(fā)生彈性變形。腔室壁17的彈性性能使得可以進(jìn)行獨(dú)特的選擇以捕 獲非常微弱的“結(jié)合”信號(hào)。如果對(duì)腔室壁17進(jìn)行按壓(諸如通過成像區(qū)域之外的細(xì) 針)，則游離標(biāo)記22被從局部視域側(cè)向排出，從而其信號(hào)顯著地減小。隨著該“背景” 信號(hào)的減小，可以檢測(cè)到來自結(jié)合標(biāo)記23的非常微弱的信號(hào)。
如果標(biāo)記熒光為不同波長(zhǎng)，或者如果分析物1的配體和分析物2的配體分別處于 腔室中不同的物理位置，則可以同時(shí)測(cè)量多種分析物。
根據(jù)本發(fā)明方法的方法示例包括執(zhí)行分析以確定病人是否可能對(duì)一種或多種藥 物(例如，抗生素，包括青霉素等)或過敏原過敏。通過使用具有分析腔室的萃取柱 (cartridge)來執(zhí)行該分析，所述分析腔室包含大量(例如，成千上萬)抗生素表位覆蓋的 珠狀物以及未覆蓋抗生素表位的對(duì)照珠狀物。為了針對(duì)多于一個(gè)抗生素表位進(jìn)行分析， 每個(gè)特定抗生素表位與一種特定類型的珠狀物匹配，以用于進(jìn)行識(shí)別?？梢允褂弥T如珠 狀物顏色、大小、形狀等之類的特征來相互區(qū)分與不同表位相關(guān)的珠狀物群，例如，表 位A被覆蓋在白色珠狀物上，表位B被紅色珠狀物覆蓋等。少量(例如，0.5至5微升) 毛細(xì)管樣本或者靜脈抗凝全血被沉積在腔室中(例如，通過毛細(xì)管作用被吸入腔室)，并 且一旦關(guān)閉了腔室，則將血液引入腔室內(nèi)包含珠狀物的區(qū)域。在第一時(shí)間段(例如，幾 分鐘到一小時(shí))的培養(yǎng)之后，樣本內(nèi)存在的免疫球蛋白結(jié)合到那些覆蓋有免疫球蛋白分 子對(duì)其具有特定親和力的藥物(或過敏原)的珠狀物上。樣本內(nèi)存在的不同的免疫球蛋 白分子對(duì)不同的藥物(或過敏原)可能具有特有的不同親和力。組合的珠狀物和血液樣 本還混合有針對(duì)被測(cè)免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白E( “IgE” )等)并且可以被培養(yǎng) 第二時(shí)間段(例如，幾秒鐘到幾分鐘)的一種或多種有標(biāo)記抗體?？梢詫?duì)針對(duì)被測(cè)免疫 球蛋白的抗體標(biāo)記熒光團(tuán)以生成“有標(biāo)記抗體”。然后，將樣本引入上述類型的分析腔 室。兩個(gè)階段的培養(yǎng)所需的實(shí)際時(shí)間可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，并且可能取決于當(dāng)前抗體的 親抗原性(avidity)和濃度。通過以上述一種或多種方式從游離的和結(jié)合的有標(biāo)記抗體收 集信號(hào)來分析布置在腔室內(nèi)的樣本。如果分析涉及確定多于一種藥物的過敏易感性、或 者對(duì)多于一種過敏原的敏感性，則該分析還將包括根據(jù)不同類型的被覆蓋珠狀物來區(qū)分 結(jié)合的有標(biāo)記抗體。結(jié)合標(biāo)記表示那些結(jié)合到被測(cè)免疫球蛋白的有標(biāo)記抗體，該免疫球 蛋白結(jié)合到覆蓋有該特定免疫球蛋白微粒與其具有特定親和力的藥物(或者過敏原)的微 粒?？梢酝ㄟ^測(cè)量被成像微粒的總信號(hào)并且減去包括在圖像中的圍繞該微粒的最接近的 區(qū)域中的周圍游離信號(hào)，來計(jì)算結(jié)合到微粒上的標(biāo)記量?？梢酝ㄟ^測(cè)量相同類型的有標(biāo) 記的被覆蓋珠狀物和無覆蓋珠狀物來計(jì)算給定類型的被覆蓋珠狀物上的標(biāo)記量之比。因 此，可以通過實(shí)踐本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)確定樣本是否包含對(duì)給定藥物(或過敏原)具有親和力的 免疫球蛋白分子。另外，通過使用每種類型覆蓋有不同藥物(或過敏原)的不同類型的 可檢測(cè)珠狀物或微粒，在本發(fā)明的情況下可以同時(shí)執(zhí)行對(duì)多于一種藥物過敏(或者對(duì)多 于一種過敏原敏感)的檢測(cè)。對(duì)于所有藥物過敏(過敏原敏感)測(cè)試，如果微粒大小和 組分與被覆蓋微粒相同，則可以使用單一類型的微粒(或珠狀物)作為對(duì)照微粒。根據(jù) 需要，可以使用多于一種對(duì)照微粒，對(duì)照微粒的大小和與其相比較的覆蓋有藥物或過敏 原的微粒的大小相匹配。
在一些實(shí)施例中，在第二次培養(yǎng)(包含有標(biāo)記配體的培養(yǎng))之后，所述方法包括以下步驟，即對(duì)腔室內(nèi)布置的包含未結(jié)合標(biāo)記的樣本添加不包含標(biāo)記的液體，從而主要 留下附著于固定珠狀物或結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。隨后，如前所述實(shí)現(xiàn)結(jié)合和游離的虛擬分離，但 是對(duì)包含標(biāo)記的液體的移除可以用來以復(fù)雜性為代價(jià)增大分析的靈敏度。由于腔室的總 容量以及腔室中的液體量處于小于一至幾微升的范圍內(nèi)，因此對(duì)腔室添加大量(例如， 幾十微升)無標(biāo)記流體將會(huì)移除大部分包含標(biāo)記的流體，而通過利用結(jié)合與游離的虛擬 分離處理來移除剩余的游離標(biāo)記信號(hào)。
上述方法提供了一種新的和有利的技術(shù)，用于確定包含配體的腔室區(qū)域或者沒 有針對(duì)樣本內(nèi)目標(biāo)分析物的配體的腔室區(qū)域內(nèi)結(jié)合的和游離的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的量， 并且從而提供與樣本有關(guān)的定性和定量信息。在一些情況下，諸如知道樣本中是否存在 目標(biāo)分析物之類的定性信息對(duì)于當(dāng)前分析是足夠的信息。這種情況的示例是當(dāng)存在IgE 為正常狀態(tài)時(shí)，確定樣本是否具有針對(duì)給定藥物的該特定IgE。如果需要更多的定量信息 (例如，樣本中目標(biāo)分析物的濃度)，則可以將所獲得的結(jié)合/游離信息與標(biāo)準(zhǔn)曲線一起 使用以確定該定量信息(例如，樣本內(nèi)的目標(biāo)分析物的量)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是針對(duì)所考慮的 特定目標(biāo)分析物和樣本根據(jù)經(jīng)驗(yàn)得出的。已知可用于與所有類型的免疫測(cè)定一起使用的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且本發(fā)明不限于任意特定標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢栽诜治鲋盎蛘吲c分析同時(shí)實(shí)現(xiàn) 樣本虛線，并且將其結(jié)果存儲(chǔ)于執(zhí)行分析的儀器上。
盡管關(guān)于本發(fā)明的特定具體實(shí)施例描述和示出了本發(fā)明，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不脫離本發(fā)明的思想和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的 改變。
權(quán)利要求
1.一種用于執(zhí)行流體樣本的目標(biāo)分析物免疫測(cè)定的方法，包括以下步驟在腔室內(nèi)布置流體樣本；在樣本內(nèi)提供可檢測(cè)標(biāo)記，所述標(biāo)記用于結(jié)合至目標(biāo)分析物以產(chǎn)生有標(biāo)記的目標(biāo)分 析物，所述有標(biāo)記的目標(biāo)分析物在樣本中是可檢測(cè)到的；在腔室內(nèi)提供至少一個(gè)第一表面區(qū)域，所述第一表面區(qū)域具有附著到其上的目標(biāo)分 析物特定配體，所述目標(biāo)分析物_特定配體用于選擇性地將樣本中存在的目標(biāo)分析物結(jié) 合至第一表面區(qū)域；在腔室內(nèi)提供至少一個(gè)第二表面區(qū)域，所述第二表面區(qū)域沒有用于選擇性地將樣本 中存在的目標(biāo)分析物結(jié)合至第二表面區(qū)域的目標(biāo)分析物_特定配體；光學(xué)掃描所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域，以檢測(cè)和記錄所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域中 有標(biāo)記目標(biāo)分析物的每個(gè)像素分布的平均標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度；光學(xué)掃描所述至少一個(gè)第二表面區(qū)域，以檢測(cè)和記錄所述至少一個(gè)第二表面區(qū)域中 有標(biāo)記目標(biāo)分析物的每個(gè)像素分布的平均標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度；以及確定所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域中的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的量、所述至少一個(gè)第二表 面區(qū)域中的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的量、以及所述第一和第二表面區(qū)域中有標(biāo)記目標(biāo)分析物 的量的比中的至少一個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腔室具有1μ m至200 μ m的高度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述腔室具有約6μ m的高度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流體樣本為全血。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腔室具有3μιη至15μιη范圍內(nèi)的高度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腔室具有至少一個(gè)壁，并且在該壁上布置所 述至少一個(gè)第一表面區(qū)域和所述至少一個(gè)第二表面區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域和所述至少一個(gè)第二 表面區(qū)域布置在在所述腔室內(nèi)布置的物體上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟使用在腔室的第一表面區(qū)域中確 定的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的總量和在腔室的第二表面區(qū)域中確定的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的總 量來確定流體樣本中目標(biāo)分析物的總量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中確定流體樣本中目標(biāo)分析物的總量的步驟使用標(biāo) 準(zhǔn)曲線。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，還包括以下步驟使用在流體樣本中確定的有標(biāo)記 目標(biāo)分析物的總量和在腔室的第二表面區(qū)域中確定的有標(biāo)記目標(biāo)分析物的總量來確定流 體樣本中結(jié)合目標(biāo)分析物的總量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中確定流體樣本中結(jié)合目標(biāo)分析物的總量的步驟 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是可檢測(cè)的熒光分子。
13.一種用于執(zhí)行流體樣本的目標(biāo)分析物免疫測(cè)定的方法，包括以下步驟在腔室內(nèi)布置流體樣本；在樣本內(nèi)提供附著于第一配體的可檢測(cè)標(biāo)記，所述第一配體特定于目標(biāo)分析物的表 位，所述第一配體用于結(jié)合至目標(biāo)分析物以產(chǎn)生有標(biāo)記的配體目標(biāo)分析物，所述有標(biāo)記的配體目標(biāo)分析物在樣本中是可檢測(cè)到的；在腔室內(nèi)提供至少一個(gè)第一表面區(qū)域，所述第一表面區(qū)域具有附著到其上的目標(biāo)分 析物特定第二配體，所述目標(biāo)分析物_特定第二配體用于選擇性地將樣本中存在的目標(biāo) 分析物結(jié)合至第一表面區(qū)域；在腔室內(nèi)提供至少一個(gè)第二表面區(qū)域，所述第二表面區(qū)域沒有用于選擇性地將樣本 中存在的目標(biāo)分析物結(jié)合至第二表面區(qū)域的目標(biāo)分析物_特定第二配體；光學(xué)掃描所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域，以檢測(cè)和記錄所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域中 有標(biāo)記配體目標(biāo)分析物的每個(gè)像素分布的平均標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度；光學(xué)掃描所述至少一個(gè)第二表面區(qū)域，以檢測(cè)和記錄所述至少一個(gè)第二表面區(qū)域中 有標(biāo)記配體目標(biāo)分析物的每個(gè)像素分布的平均標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度；以及確定所述至少一個(gè)第一表面區(qū)域中的有標(biāo)記配體目標(biāo)分析物的量、所述至少一個(gè)第 二表面區(qū)域中的有標(biāo)記配體目標(biāo)分析物的量、以及所述第一和第二表面區(qū)域中有標(biāo)記配 體目標(biāo)分析物的量的比中的至少一個(gè)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述目標(biāo)分析物是給定子類型的免疫球蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一表面區(qū)域布置在第一微粒之上。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一微粒是覆蓋有第一藥物的第一類型的 微粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第二表面區(qū)域布置在第二微粒之上，所述 第二微粒是沒有藥物覆蓋的第一類型的微粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一表面區(qū)域布置第一類型的第一微粒和 第二類型的第二微粒之上，所述第二類型不同于所述第一類型。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一微粒覆蓋有第一藥物，而所述第二微 粒覆蓋有第二藥物，所述第二藥物不同于所述第一藥物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第二表面區(qū)域布置在第三微粒之上，所述 第三微粒是沒有藥物覆蓋的第一或第二類型的微粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述流體樣本是全血。
22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述腔室具有3μιη至15μιη范圍內(nèi)的高度。
全文摘要
對(duì)人和動(dòng)物的生物流體(諸如全血、血清、血漿、尿液、乳液、胸膜液和腹膜液、以及精液)通過電子手段執(zhí)行免疫檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)和表征，所述流體包含于薄腔室中形成靜態(tài)流體樣本，所述腔室具有至少兩個(gè)平行平板壁，所述平行平板壁中的至少一個(gè)是透明的。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102027370SQ200980116791
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日
發(fā)明者斯蒂芬·C·沃德洛, 羅伯特·A·萊文 申請(qǐng)人:艾博特健康公司