專利名稱：Parp相互作用分子的鑒定方法和parp蛋白的純化方法
PARP相互作用分子的鑒定方法和PARP蛋白的純化方法本發(fā)明涉及固定化合物(immobilization compound)和用于鑒定PARP相互作用分 子的方法和用于純化PARP蛋白的方法。另外，本發(fā)明涉及例如用于治療癌癥、代謝性 疾病或自體免疫/炎癥性障礙的包含所述相互作用分子的藥物組合物，和涉及癌癥的診 斷方法。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)組成真核細(xì)胞中存在的細(xì)胞信號傳導(dǎo)酶的家族， 所述酶催化DNA-結(jié)合蛋白的聚(ADP-核糖基化)。PARPS還已知為聚(ADP-核糖) 合成酶或聚(ADP-核糖)轉(zhuǎn)移酶(pART)。這些酶在對DNA損傷的速發(fā)型細(xì)胞應(yīng)答方 面起重要作用。對由電離輻射、氧化應(yīng)激和DNA-結(jié)合抗腫瘤藥誘導(dǎo)的DNA損傷的應(yīng) 答，PARP將ADP-核糖單元添加到靶蛋白的天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧酸酯基上。該 聚(ADP-核糖基化)為通過附著ADP-核糖單元的復(fù)雜支鏈聚合物上觸發(fā)受體蛋白失活 的翻譯后修飾(Schreiber 等，2006.Nature Reviews CellBiology 7，517-528)。ADP核糖基化為一種翻譯后蛋白修飾，該修飾中ADP-核糖部分從NAD轉(zhuǎn) 移到靶蛋白的特定氨基酸側(cè)鏈上(Schreiber等，2006.NatureReviews Cell Biology 7， 517-528)。PARPl為PARP家族中首個(gè)被表征的成員，并且是最熟知的成員。由ADPRT 基因編碼的該蛋白是高度保守的染色質(zhì)結(jié)合酶，所述酶結(jié)合帶切口的DNA并且介導(dǎo)針對 DNA損傷的保護(hù)。對重大DNA損傷的應(yīng)答，PARPl被過度激活，并且誘導(dǎo)細(xì)胞NAD+ 和ATP的耗盡，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞死亡。PARPl的過度激活涉及幾種疾病的發(fā)病 機(jī)理，所述疾病包括中風(fēng)、心肌梗塞、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和炎癥疾病。已經(jīng)提出使用小分子抑制劑靶向PARP作為用于癌癥治療的有前景的方法 (Haince 等，2005.Trends Mol Med.ll (10) 456-63)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了幾種 PARP 抑 制劑。然而，第一代的PARP抑制劑對于PARP家族的各種成員是非選擇性的，存在對 選擇性抑制劑的需要。另外，還需要用于PARP抑制劑的選擇性剖析(profiling)的新方 法。PARP抑制劑的鑒定和表征的一個(gè)前提條件是提供合適的檢測方法，優(yōu)選是使用 靶蛋白生理形式的檢測方法。本領(lǐng)域中，為了解決該問題已經(jīng)提出幾種策略。為了對來自小牛胸腺的PARP蛋白進(jìn)行純化，描述了兩步親和純化策略 (D，Amours 等，1997.Analytical Biochemistry 249，106-108)。第一步由 DNA-纖維素
色譜組成，第二步由3-氨基苯甲酰胺親和色譜組成。3-氨基苯甲酰胺是一種PARP抑制 劑，與所述酶的C-末端催化結(jié)構(gòu)域相互作用。常規(guī)而言，可以在基于溶液的檢測中使用合適的底物使用經(jīng)純化的酶或重組酶 測定 PARP 酶活性(Dantzer 等，2006.Methods inEnzymology 409，493-510)。這種類型的 檢測可用于鑒定PARP抑制劑，還可用于通過測試針對PARP家族的所有成員的抑制劑而 評估抑制劑選擇性。綜上所述，需要為PARP相互作用化合物的鑒定和選擇性剖析以及為PARP蛋白 的純化提供有效工具和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明尤其涉及式⑴的固定化合物或其鹽，
權(quán)利要求
1.一種式⑴的固定化合物，或其鹽，
2.如權(quán)利要求1所述的固定化合物，所述固定化合物選自由以下組成的組
3.固定產(chǎn)物的制備方法，其中將至少一種如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的固定化合 物固定在固相載體上，特別是其中所述固相載體選自由瓊脂糖、改性瓊脂糖、瓊脂糖珠 (例如NHS-激活的瓊脂糖)、膠乳、纖維素和鐵磁性顆粒或亞鐵磁性顆粒組成的組。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述固定產(chǎn)物由將所述固定化合物直接共價(jià)連接到固相載體而產(chǎn)生，或由將所述固定化合物通過連接子介導(dǎo)的共價(jià)連接到固相載體而產(chǎn) 生，特別是其中所述連接子是C1,亞烴基，該亞烷基可選地被選自由S、O、NH、C(O) O、C(O)和C(O)NH組成的組中的一種或多種原子或官能團(tuán)打斷，并且其中該連接子可 選地被獨(dú)立地選自由鹵素、OH、NH2 > C(0)H、C (O) NH2 > S03H、NO2和CN組成的 組中的一種或多種取代基取代，特別是其中所述固定經(jīng)由權(quán)利要求1的式⑴中的飽和環(huán) 的環(huán)氮原子發(fā)生。
5.一種固定產(chǎn)物，該固定產(chǎn)物能夠通過權(quán)利要求3或4任一項(xiàng)所述的方法獲得。
6.PARP相互作用化合物的鑒定方法，所述方法包括以下步驟a).提供包含PARP的蛋白制劑，b).使所述蛋白制劑與權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物以及與給定化合物在允許形成PARP 和固定產(chǎn)物的復(fù)合物的條件下接觸，和c).檢測步驟b)中形成的復(fù)合物。
7.PARP相互作用化合物的鑒定方法，所述方法包括以下步驟a)提供兩等份的包含PARP的蛋白制劑，b)使一等份蛋白制劑與權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物在允許形成PARP和固定產(chǎn)物的復(fù) 合物的條件下接觸，和c)使另一等份蛋白制劑與所述固定產(chǎn)物以及與給定化合物在允許形成所述復(fù)合物的 條件下接觸，和d)確定步驟b)和c)中形成的復(fù)合物的量。
8.PARP相互作用化合物的鑒定方法，所述方法包括以下步驟g)提供各自包括至少一個(gè)包含PARP的細(xì)胞的兩等份試樣，h)將一等份試樣與給定化合物溫育，i)收獲各等份試樣的細(xì)胞，j)對所述細(xì)胞進(jìn)行裂解從而獲得蛋白制劑，k)使所述蛋白制劑與權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物在允許形成PARP和固定產(chǎn)物的復(fù)合 物的條件下接觸，和1)確定步驟e)的各等份試樣中形成的復(fù)合物的量。
9.如權(quán)利要求7或8任一項(xiàng)所述的方法，其中在與所述化合物一起溫育的等份試樣中 形成的復(fù)合物的量相對于不與所述化合物一起溫育的等份試樣減少表示PARP是所述化合 物的靶。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過從所述固定產(chǎn)物中分離PARP，并 且隨后檢測分離的PARP或隨后確定分離的PARP的量，來確定所述復(fù)合物的量，特別是 其中通過質(zhì)譜法或免疫檢測法，優(yōu)選使用針對PARP的抗體的免疫檢測法來檢測PARP或 確定PARP的量。
11.如權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給定化合物選自由合成化合物或 有機(jī)合成藥，更優(yōu)選小分子有機(jī)藥，和天然小分子化合物組成的組。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給定化合物是PARP抑制劑。
13.純化PARP的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含PARP的蛋白制劑，b)使所述蛋白制劑與權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物在允許形成PARP和固定產(chǎn)物的復(fù)合 物的條件下接觸，和C)從所述固定產(chǎn)物分離PARP。
14.如權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白制劑的提供包括收獲至少一個(gè)包 含PARP的細(xì)胞和對所述細(xì)胞進(jìn)行裂解的步驟。
15.如權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中形成所述復(fù)合物的步驟在基本上生理 條件下進(jìn)行。
16.用于確定樣品中PARP的存在的方法，所述方法由以下步驟組成a)提供預(yù)期包含PARP的蛋白制劑，b)使所述蛋白制劑與權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物在允許形成PARP和固定產(chǎn)物的復(fù)合 物的條件下接觸，和c)檢測PARP是否與所述固定產(chǎn)物形成復(fù)合物。
17.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的固定化合物或如權(quán)利要求5所述的固定產(chǎn)物在鑒 定PARP相互作用化合物或在純化PARP中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定PARP相互作用化合物或用于純化或鑒定PARP蛋白的固定化合物和方法。
文檔編號G01N33/573GK102027371SQ200980117707
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者G·德勒維斯, V·雷德爾 申請人:塞爾卓姆股份公司