專利名稱：測(cè)定方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析液體樣本的方法和測(cè)定設(shè)備。
背景技術(shù)：
在很多測(cè)定中都需要在同一樣本中同時(shí)測(cè)量?jī)煞N或多種分析物的濃度。在基于親 和力的測(cè)定例如免疫測(cè)定中同樣如此。分析物經(jīng)常以明顯不同的濃度存在。對(duì)基于親和力 的測(cè)定來說，由于存在源于一種分析物測(cè)量的信號(hào)可以影響源于另一種分析物測(cè)量的信號(hào) 或使之飽和的風(fēng)險(xiǎn)，因此在要同時(shí)測(cè)量不同分析物的濃度時(shí)可能會(huì)有問題。飽和可能會(huì)在包括捕捉裝置的基于親和力的測(cè)定中發(fā)生，例如在所有的捕捉區(qū)域 都被占據(jù)時(shí)發(fā)生。飽和也可能會(huì)在變送器(例如測(cè)量來自于被標(biāo)記分子的熒光的傳感器)飽 和時(shí)發(fā)生。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)為解決在基于親和力的測(cè)定中測(cè)量?jī)煞N或多種具有明顯不同 濃度的分析物的問題進(jìn)行了努力。一種方法是將樣本分為幾等份，將其稀釋為不同的濃度。 另一種方法是調(diào)節(jié)變送器、檢測(cè)器或傳感器對(duì)不同濃度的增益。US7271009公開了用于樣本中若干生物標(biāo)志物的免疫測(cè)定，包括使用顆粒物。每一 種顆粒物都涂有參與到基于親和力的測(cè)定中的一種類型的分子。有幾種類型的顆粒物，每 一種都涂有一種類型的分子。為了處理各種分析物的水平明顯不同的情況，通過使用稀釋 劑降低了用于某些分析物的信號(hào)。介紹了稀釋劑不會(huì)介入與任何一種分析物的具體結(jié)合。 稀釋劑爭(zhēng)奪顆粒物上的可用面積并降低分析物的涂層密度。由此通過使用稀釋劑而減小被 捕獲的分析物分子數(shù)量。還介紹了其中某些顆粒物被涂有提高特定分析物靈敏度的試劑的 實(shí)施例。在根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)發(fā)展水平的某些分析設(shè)備中，捕捉抗體或捕捉分子捕獲一種或多 種分析物。將分析物結(jié)合到捕捉區(qū)域在所有捕捉區(qū)域飽和以前的平衡之前被中斷以使信號(hào) 不會(huì)變得過高。在某些情況下，在要檢測(cè)的至少一種分析物上只有一個(gè)可用的結(jié)合表位。盡管根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)有工藝中對(duì)于可能必須要對(duì)幾等份在若干步驟中進(jìn)行稀 釋的樣本和/或變送器、檢測(cè)器和/或傳感器必須要調(diào)節(jié)以適應(yīng)不同濃度水平的增益仍然 存在改進(jìn)的空間，但是仍然希望能有步驟盡可能少的(例如不必在其中處理顆粒物)快速測(cè) 定方法。還希望能有不必加入稀釋劑的測(cè)定方法。還希望能有可以只用一個(gè)表位來測(cè)量至 少一種分析物的測(cè)定方法。還希望能有在液體樣本混合物中可以只用一個(gè)表位來測(cè)量分析 物濃度的測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種改進(jìn)的方法和一種用于實(shí)現(xiàn)所述方法以避免了現(xiàn) 有技術(shù)中的至少部分缺點(diǎn)的設(shè)備。所述方法和設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)包括不用將樣本劃分為必須要進(jìn)行不同稀釋的幾等份。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不必再為了顧及明顯不同的濃度水平而調(diào)節(jié)變送器、檢測(cè)器和/或 傳感器的增益。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是在基于親和力的測(cè)定中不必再向捕捉分子中加入稀釋劑。而且不 必再加入增強(qiáng)親和力的添加劑。優(yōu)點(diǎn)還包括不必再處理顆粒物，所述方法由于要執(zhí)行的步驟較少而變得簡(jiǎn)單并且 易于執(zhí)行。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是直到達(dá)到平衡之前都可以進(jìn)行分析物分子與捕捉分子的結(jié)合。因此 在達(dá)到平衡之前不必為了使所有的捕捉區(qū)域飽和而停止結(jié)合。這樣所具有的優(yōu)點(diǎn)是不必在 精確確定的時(shí)刻停止結(jié)合。由此得到的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以通過達(dá)到平衡來實(shí)現(xiàn)高精度。在根 據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的工藝中，由于難以控制影響結(jié)合速率的所有參數(shù)，因此難于每一次都恰好在 相同的階段停止結(jié)合。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是可以測(cè)量幾種分析物，其中至少一種分析物只具有一個(gè)能夠結(jié)合 抗體的表位。設(shè)備制造簡(jiǎn)單并且節(jié)約成本。簡(jiǎn)易性也使所述方法非常節(jié)約成本。在第一種應(yīng)用中，提供了一種用于分析液體樣本中的至少兩種分析物的方法，所 述方法包括以下步驟
a)提供基板，其中至少兩種不同類型的捕捉分子被固定在基板上并且其中每一種類型 的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力，
b)使樣本與所述捕捉分子接觸，
c)對(duì)于要分析的至少一種分析物在捕捉分子和針對(duì)分析物具有特定親和力的被標(biāo) 記檢測(cè)分子之間引發(fā)接觸，并且對(duì)于要分析的至少另一種分析物在捕捉分子和被標(biāo)記形 式的分析物之間引發(fā)接觸，以及
d)測(cè)量來自于被標(biāo)記檢測(cè)分子和基板上的被標(biāo)記分析物的可檢測(cè)信號(hào)，其中被標(biāo)記分 析物的濃度與樣本中分析物的濃度相適應(yīng)。在第二種應(yīng)用中，提供了 一種適用于所述方法的設(shè)備。本發(fā)明更多的應(yīng)用和實(shí)施例在所附權(quán)利要求中加以確定，通過引用將它們并入本文。


在以下的說明、示例和附圖中更加詳細(xì)地介紹本發(fā)明，其中 圖1將相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)作為微流體通道內(nèi)位置的函數(shù)示出。圖加和沘分別示出了用于NTproBNP和CRP的測(cè)定結(jié)果。圖3將相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)作為另一微流體通道內(nèi)位置的函數(shù)示出。圖4示出了用于cTnl和CRP的測(cè)定結(jié)果。定義
在介紹本發(fā)明的方法和設(shè)備之前，應(yīng)該理解本發(fā)明并不局限于特定結(jié)構(gòu)、方法步驟以 及本文中公開的設(shè)備，因而結(jié)構(gòu)、步驟和設(shè)備都可以在一定程度上加以改變。還應(yīng)該理解本 文中使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了用于介紹特定實(shí)施例而并不是為了加以限定，原因在于本發(fā)明 的保護(hù)范圍應(yīng)該只由所附權(quán)利要求及其等價(jià)形式限定。
還有必須要注意的是，除非上下文另有清楚地說明，否則如本說明書和所附權(quán)利 要求中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這個(gè)”也包括復(fù)數(shù)形式的限定。因此，例如對(duì)含 有“一種抗體”的反應(yīng)混合物的限定包括了兩種或多種抗體的混合物。在介紹和以權(quán)利要求限定本發(fā)明時(shí)，以下術(shù)語(yǔ)將根據(jù)本文中闡述的定義使用。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“大約”在用于數(shù)值語(yǔ)境中時(shí)表示本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉和可接受的準(zhǔn)確度區(qū)間。所述區(qū)間為士 10%。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“分析物”表示在分析過程中確定其 一種或多種性質(zhì)的物質(zhì)或者是化學(xué)或生物成分。分析物或其組分經(jīng)常不能被測(cè)量，但是可 以測(cè)量分析物的可測(cè)量性質(zhì)。例如，可以測(cè)量葡萄糖濃度。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“捕捉分子”表示具有結(jié)合并捕獲分 析物分子的能力的分子。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)組”表示在基板上存在時(shí)就 能夠被檢測(cè)到的任何分子或原子排列。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)信號(hào)”表示能夠被檢測(cè)到的 任意信號(hào)，包括但不限于電磁波、電子信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、化學(xué)信號(hào)、磁場(chǎng)、放射性信號(hào)和質(zhì)譜。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)分子”表示具有結(jié)合分析物的 能力并且包括可檢測(cè)組的分子。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“被標(biāo)記分析物”表示包括可檢測(cè)組 的分析物。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“被標(biāo)記檢測(cè)分子”表示包括可檢測(cè) 組的檢測(cè)分子。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“樣本”表示要分析的混合物或溶 液。樣本的示例包括但不限于血液、血漿、血清、汗液、唾液、尿液、淚液、水樣本以及食品樣 本的懸浮液或溶液。如權(quán)利要求和說明書中一直使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“基板”表示承載構(gòu)成分析物的分子 的載體。
具體實(shí)施例方式在第一種應(yīng)用中，提供了一種用于分析液體樣本中的至少兩種分析物的方法，所 述方法包括以下步驟
a)提供基板，其中至少兩種不同類型的捕捉分子被固定在基板上并且其中每一種類型 的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力，
b)使樣本與所述捕捉分子接觸，
c)對(duì)于要分析的至少一種分析物在捕捉分子和針對(duì)分析物具有特定親和力的被標(biāo) 記檢測(cè)分子之間引發(fā)接觸，并且對(duì)于要分析的至少另一種分析物在捕捉分子和被標(biāo)記形 式的分析物之間引發(fā)接觸，以及
d)測(cè)量來自于被標(biāo)記檢測(cè)分子和基板上的被標(biāo)記分析物的可檢測(cè)信號(hào)， 其中被標(biāo)記分析物的濃度與樣本中分析物的濃度相適應(yīng)。
提供了一種有捕捉分子固定于其上的基板。在一個(gè)實(shí)施例中，捕捉分子被固定在 特定區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，不同的區(qū)域具有被固定的不同類型的捕捉分子。捕捉分子對(duì) 要分析的分析物具有親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，每一種類型的捕捉分子都對(duì)要分析的至少 一種分析物具有親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，有一種類型的捕捉分子對(duì)每一種要分析的分析 物都具有親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，一種類型的捕捉分子對(duì)一種分析物具有特定的親和力。 在一個(gè)實(shí)施例中，有兩種不同類型的捕捉分子。在一個(gè)實(shí)施例中，有兩種不同類型的捕捉分 子被固定到基板上兩個(gè)特定并且分離的區(qū)域。在一個(gè)可選實(shí)施例中，不同類型的捕捉分子 被固定到同一個(gè)特定區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，捕捉分子被固定到能夠由測(cè)定中使用的可檢 測(cè)組的類型加以區(qū)分的相同區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，至少兩種不同類型的捕捉分子被固定 到基板上的至少兩個(gè)不同區(qū)域上。在一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種已經(jīng)將幾種類型的捕捉分子固定于其上的基板。在 一個(gè)實(shí)施例中，每一種類型的捕捉分子都被固定到至少一個(gè)特定區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，有將多于一種不同類型的捕捉分子的混合物連接于其上的區(qū) 域。捕捉分子的示例包括但不限于抗體、適體、核酸探針和抗體片段。核酸探針的示例 包括但不限于DNA、RNA和PNA?？贵w片段的示例包括但不限于Fab和scFv。在一個(gè)實(shí)施 例中，捕捉分子是抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，捕捉分子是從抗體、適體、核酸探針、DNA探針、 RNA探針、PNA探針、抗體片段、Fab片段和scFv片段中選出的至少一種分子。在進(jìn)一步的 實(shí)施例中，所述捕捉分子中的每一種都是從抗體、適體、核酸探針、DNA探針、RNA探針、PNA 探針、抗體片段、Fab片段和scFv片段構(gòu)成的組中獨(dú)立選出的。樣本與捕捉分子相接觸以使樣本中的分析物能夠結(jié)合對(duì)它們有特定親和力的捕 捉分子。在一個(gè)實(shí)施例中，通過將樣本添加至設(shè)備中的基板來使樣本與捕捉分子接觸。在 一個(gè)實(shí)施例中，樣本與設(shè)備相接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，樣本與捕捉分子接觸足夠長(zhǎng)的一段時(shí) 間以達(dá)到平衡，用于將分析物分子結(jié)合至捕捉分子。能夠允許反應(yīng)進(jìn)行至平衡是有利的。在樣本已與捕捉分子相接觸時(shí)，至少兩個(gè)不同種類的分子與捕捉分子相接觸。與 捕捉分子相接觸的分子種類與所用的分析物和測(cè)定相適應(yīng)。添加有至少一種類型的被標(biāo)記 檢測(cè)分子。檢測(cè)分子對(duì)分析物具有特定的親和力并且包括允許通過任意裝置能被檢測(cè)的 組。進(jìn)一步添加有至少一種被標(biāo)記分析物。作為被標(biāo)記分析物的可選或附加，可以加有被 標(biāo)記分析物片段，該片段包括具有結(jié)合捕捉分子能力的表位。被標(biāo)記分析物是包括可檢測(cè) 組的分析物?？蓹z測(cè)組的示例包括但不限于熒光團(tuán)、放射性追蹤跡、質(zhì)譜、生物發(fā)光組、化學(xué)發(fā) 光組和電化學(xué)標(biāo)記。對(duì)于預(yù)計(jì)會(huì)以低濃度存在于樣本中的分析物，加有被標(biāo)記檢測(cè)分子。被標(biāo)記檢測(cè) 分子結(jié)合至與捕捉分子相結(jié)合的分析物分子。標(biāo)記允許檢測(cè)到檢測(cè)分子。檢測(cè)的信號(hào)是分 析物濃度的函數(shù)。檢測(cè)的信號(hào)隨著分析物濃度的增加而增大。這是一種夾心測(cè)定法。對(duì)于預(yù)計(jì)會(huì)以高濃度存在于樣本中的分析物，樣本中加有被標(biāo)記分析物。被標(biāo)記 分析物是一種包括可檢測(cè)組的分析物。可選地或附加地，可以加入分析物的類似物。被標(biāo) 記分析物與分析物爭(zhēng)奪捕捉分子上的結(jié)合面積。被標(biāo)記分析物的數(shù)量與樣本中分析物分子 的濃度相適應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在本說明書的教導(dǎo)下用不同濃度的被標(biāo)記分析物以樣本中給定濃度的分析物分子進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)并由此確定合適的被標(biāo)記分析物的數(shù)量。在加入 的(被標(biāo)記和未被標(biāo)記的)已捕捉分析物的數(shù)量接近平衡值之后，已捕捉的被標(biāo)記分析物 和未被標(biāo)記的分析物之比即可反映出樣本中這些種類的比值。檢測(cè)的信號(hào)是分析物濃度的 函數(shù)。檢測(cè)的信號(hào)隨著分析物濃度的增加而減小。這是一種競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法。在一個(gè)實(shí)施例中，被標(biāo)記檢測(cè)分子和被標(biāo)記分析物被同時(shí)加到基板中。在一個(gè)可 選實(shí)施例中，它們被相繼添加。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一種被標(biāo)記分析物被首先添加而至少 一種被標(biāo)記檢測(cè)分子被隨后添加。在一個(gè)可選實(shí)施例中，至少一種被標(biāo)記檢測(cè)分子被首先 添加而至少一種被標(biāo)記分析物被隨后添加。在一個(gè)實(shí)施例中，被標(biāo)記檢測(cè)分子和被標(biāo)記分析物被加到基板中。在一個(gè)實(shí)施例 中，被標(biāo)記檢測(cè)分子被預(yù)先分配到基板上。在一個(gè)實(shí)施例中，被標(biāo)記分析物被預(yù)先分配到基 板上。在一個(gè)實(shí)施例中，被標(biāo)記檢測(cè)分子和被標(biāo)記分析物都被預(yù)先分配到基板上。在一個(gè) 實(shí)施例中，一種被標(biāo)記檢測(cè)分子和/或一種被標(biāo)記分析物被預(yù)先分配而一種被標(biāo)記檢測(cè)分 子和/或一種被標(biāo)記分析物被加到基板中。在一個(gè)實(shí)施例中，捕捉分子和被標(biāo)記分析物之間的接觸是通過首先將被標(biāo)記分析 物加入樣本并且隨后使樣本與捕捉分子相接觸而引發(fā)的。因此存在將樣本與至少一種要分 析的分析物混合并隨后將樣本加到設(shè)備中以使包含分析物的樣本與捕捉分子形成接觸的 可能性。在一個(gè)實(shí)施例中，步驟b)和C)在一個(gè)步驟內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，預(yù)先分配的被標(biāo)記檢測(cè)分子或預(yù)先分配的被標(biāo)記分析物通過向 基板中加入一種物質(zhì)并對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行干燥以使溶劑蒸發(fā)而制成。在一個(gè)實(shí)施例中，溶劑是 水。用這種方式使預(yù)先分配的干燥物質(zhì)處于基板上。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一種試劑被添 加到溶劑中。這些添加劑的示例包括但不限于BSA(牛血清白蛋白)和海藻糖。在加入液體樣本后，預(yù)先分配的一種或多種物質(zhì)就開始溶解。在一個(gè)實(shí)施例中，設(shè) 備相對(duì)于被固定的捕捉分子在上游具有預(yù)先分配的一種或多種物質(zhì)并且溶解的預(yù)先分配 的一種或多種物質(zhì)可以向下游流動(dòng)并在捕捉分子的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，設(shè)備具有定時(shí)門，其允許液體樣本與捕捉分子接觸并且在一段 時(shí)間之后使預(yù)先分配的一種或多種物質(zhì)溶解并允許其與分析物和捕捉分子反應(yīng)。用于在一 段時(shí)間間隔期間使液體停止的微流體開關(guān)例如可以從US 2004/0206408中獲知，通過引用 其全文將其明確地并入本文。在一個(gè)實(shí)施例中，設(shè)備是為了用于分析液體樣本中的第一和第二分析物的濃度。 第一分析物以低濃度存在而第二分析物則以高濃度存在。第一分析物被預(yù)計(jì)以低濃度存在 并利用夾心測(cè)定法進(jìn)行分析。第二分析物被預(yù)計(jì)以高濃度存在并利用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法進(jìn)行分 析?；迳系牡谝粎^(qū)域固定了具有特定地結(jié)合第一分析物的能力的捕捉分子，而基板上的 第二區(qū)域則固定了具有特定地結(jié)合第二分析物的能力的捕捉分子。在樣本已與捕捉分子相 接觸之后，就加入具有特定地結(jié)合第一分析物的能力的被標(biāo)記檢測(cè)分子。也可以加入被標(biāo) 記形式的第二分析物。在一段時(shí)間之后即可檢測(cè)被標(biāo)記檢測(cè)分子和被標(biāo)記形式的分析物。檢測(cè)分子的示例包括但不限于抗體、抗體片段、Fab、scFv、適體、核酸探針、DNA、 RNA和PNA。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)分子是抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)分子是從抗體、抗體 片段、Fab片段、scFv片段、適體、核酸探針、DNA探針、RNA探針和PNA探針中選出的至少一種分子。在一個(gè)實(shí)施例中，樣本與捕捉分子接觸足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間以達(dá)到平衡，用于將分 析物分子結(jié)合至捕捉分子。在一個(gè)實(shí)施例中，使用微流體設(shè)備來進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，使用包括至少一條通道的設(shè)備。在一個(gè)實(shí)施例中，使用包括至少 一條通道的設(shè)備，通道具有固定了捕捉分子的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，這樣的通道進(jìn)一步包 括預(yù)先分配的被標(biāo)記分析物分子和/或預(yù)先分配的被標(biāo)記被標(biāo)記檢測(cè)分子。樣本被加入設(shè) 備中并且樣本沿至少一條通道流動(dòng)至捕捉分子和預(yù)先分配的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，基板至少部分地由基本上垂直于所述表面并且具有高度(HI)、 直徑(Dl)和倒易間距(xl，yl)的凸起覆蓋以實(shí)現(xiàn)所述液體樣本的橫向毛細(xì)流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施例中，基板包括至少一個(gè)樣本添加區(qū)域、具有接納至少一部分樣本能 力的至少一個(gè)接受區(qū)域以及在一個(gè)或多個(gè)樣本添加區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)接受區(qū)域之間建立 起流體連接的至少一個(gè)連接區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，樣本添加區(qū)域、接受區(qū)域以及連接樣本添加區(qū)域和接受區(qū)域的 區(qū)域包括基本上垂直于所述表面，具有高度(HI)、直徑(Dl)和倒易間距(xl，yl)的凸起以 實(shí)現(xiàn)所述液體樣本的橫向毛細(xì)流動(dòng)。在第二種應(yīng)用中，提供了一種包括基板的分析設(shè)備，所述基板包括至少一個(gè)樣本 添加區(qū)域、具有接納至少一部分樣本能力的至少一個(gè)接受區(qū)域以及在一個(gè)或多個(gè)樣本添加 區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)接受區(qū)域之間建立起流體連接的至少一個(gè)連接區(qū)域，所述區(qū)域至少部分 地由基本上垂直于所述表面并且具有高度(Hl)、直徑(Dl)和倒易間距(xl，yl)的凸起覆蓋 以實(shí)現(xiàn)所述液體樣本的橫向毛細(xì)流動(dòng)，其中所述基板包括固定在基板上的至少兩種不同類 型的捕捉分子并且其中每一種類型的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，基板進(jìn)一步包括至少一種預(yù)先分配的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，基板包括至少一種預(yù)先分配的被標(biāo)記檢測(cè)分子。在一個(gè)實(shí)施例中，基板包括至少一種預(yù)先分配的被標(biāo)記分析物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基板包括預(yù)先分配的被標(biāo)記檢測(cè)分子和預(yù)先分配的被標(biāo)記 分析物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基板包括至少一種預(yù)先分配的被標(biāo)記檢測(cè)分子和至少一種 預(yù)先分配的被標(biāo)記分析物。
實(shí)施例實(shí)施例1
微流體芯片被用作以熱塑性塑料注模成形并在氧等離子體內(nèi)氧化的基板(honor 1060R, Zeon,日本)。氧化在處于等離子腔000等離子系統(tǒng))內(nèi)的6分鐘期間以0. ^mbar 的工作壓力、1000W并以100毫升/分鐘的氧氣流量進(jìn)行。芯片被浸入95%乙醇(Kemetyl， 瑞典)中含有3%體積APTES(Fluka)的溶液中2小時(shí)。固化在夜間室溫下的空氣中進(jìn)行， 這就允許在穩(wěn)定的胺功能化表面中生成的硅烷交聯(lián)。涂有APTES的表面隨后被浸入氧化的 洲葡萄聚糖溶液(Dextran T40 (40kDa), Pharmacosmos,丹麥)中2小時(shí)，用純凈水沖洗并 在30mM的NaIO4(Sigma Aldrich)中進(jìn)一步氧化2小時(shí)。
模制的芯片具有一個(gè)可以加入樣本的樣本添加區(qū)域、具有接納至少一部分樣本能 力的一個(gè)接受區(qū)域以及在接受區(qū)域和樣本添加區(qū)域之間建立起流體連接的一個(gè)連接區(qū)域。 連接區(qū)域具有在設(shè)備中部居中的帶有捕捉抗體的區(qū)域。樣本添加區(qū)域、接受區(qū)域和連接區(qū) 域具有垂直于基板表面的凸起，具有70 μ m的高度、90 μ m的直徑和50 μ m的間距以在加入 樣本時(shí)形成橫向的毛細(xì)流動(dòng)。設(shè)備被用于C反應(yīng)蛋白(CRP)和NTproBNP的雙重檢測(cè)。血清中CRP的臨床相關(guān) 濃度范圍大約在0. 5-500 μ g/ml，而對(duì)于NTproBNP來說則為10-10000pg/ml，也就是多于四 個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度差異。為了能夠測(cè)量在濃度上具有這么大差異的分析物，以競(jìng)爭(zhēng)模式測(cè)量 CRP而以?shī)A心模式測(cè)量NTproBNP。通過首先將用于兩種分析物的捕捉抗體固定在連接區(qū)域內(nèi)的不同位置來同時(shí)確 定同一液體樣本內(nèi)兩種分析物的濃度。捕捉抗體(單克隆的α CRP和α NTproBNP)被沿著 流體通道在兩條直線上點(diǎn)樣。點(diǎn)樣的溶液含有1%體積的海藻糖(Sigma Aldrich)，50mM的 NaPO4(Ph 7.5，Sigma Aldrich)緩沖劑和0. 5mg/ml的捕捉抗體?；旌衔镌诔睗竦臈l件下 (相對(duì)濕度75%)被用Nano-plotter NP 2. 1 (Ge-Sim,德國(guó))沿著流體通道點(diǎn)樣，形成一個(gè) 大約為0. 5X2mm的譜帶。用于每一個(gè)譜帶的總沉積量是5. 25nl。通過將混有Alexa 647被標(biāo)記CRP (250ng/ml)的15 μ 1血清樣本溶液加至芯片的 樣本區(qū)域來實(shí)現(xiàn)測(cè)定。樣本流過連接通道，由此使其與捕捉抗體相接觸。在全部樣本液滴 都已被移入孔柱陣列內(nèi)之后，5 μ 1的Alexa 647被標(biāo)記檢測(cè)抗體(血清中為20 μ g/ml，與 捕捉抗體相比朝向不同表位引導(dǎo)的單克隆aNTproBNP)被加入樣本區(qū)域。最后，將15μ1 的血清加入樣本區(qū)域作為清洗步驟。利用線照明的熒光掃描儀來記錄沿微流體連接通道的 熒光信號(hào)強(qiáng)度，示出已沉積了捕捉抗體的特有波峰。圖1將相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)作為微流 體通道內(nèi)位置的函數(shù)示出。每一條曲線都表示在一個(gè)芯片上記錄的熒光信號(hào)。垂直線表示 積分邊界。對(duì)于每一次測(cè)定都使用一個(gè)新芯片。對(duì)具有由瑞典Uppsala大學(xué)醫(yī)院的中心實(shí)驗(yàn)室確定的已知NTproBNP和CRP濃度 的五個(gè)病人血清樣本重復(fù)上述過程，所得強(qiáng)度曲線中的波峰作為由中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)量濃度的 函數(shù)被積分并繪出，參見圖加和2b。針對(duì)NTproBNP的測(cè)定表現(xiàn)出響應(yīng)于分析物濃度的線 性信號(hào)(圖2a)而針對(duì)CRP的信號(hào)則隨著分析物的濃度而下降(圖2b)。最高的CRP濃度 (21 μ g/ml)比最低的 NTproBNP 濃度(55pg/ml)超出了 380000 倍以上。實(shí)施例2
重復(fù)實(shí)施例1中的試驗(yàn)，但是這一次是組合了心肌肌鈣蛋白I(cTnl)和CRP的測(cè)定。 用與實(shí)施例1中所述相同的方式來準(zhǔn)備和完成芯片與測(cè)定，其修改之處是使用單克隆的 α cTnl用于cTnl的捕捉和檢測(cè)。以競(jìng)爭(zhēng)模式測(cè)量CRP而以?shī)A心模式測(cè)量cTnl。通過在耗 盡了 CRP的血清中摻入已知濃度的CRP和cTnl來制備血清樣本。制備并測(cè)定五個(gè)具有恒 定的CRP濃度(5 μ g/ml)和增加的cTnl濃度(O, 2，10，50，250ng/ml)的樣本。圖3將相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)作為微流體通道內(nèi)位置的函數(shù)示出。積分的波峰被作 為實(shí)施例1中所述的濃度函數(shù)繪出。針對(duì)cTnl的測(cè)定表現(xiàn)出響應(yīng)于分析物濃度的線性信 號(hào)(圖4)而針對(duì)CRP的信號(hào)則保持恒定。CRP信號(hào)不受cTnl信號(hào)改變的影響。盡管已經(jīng)參照對(duì)于發(fā)明人來說構(gòu)成目前已知的最佳實(shí)施方式的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施 例介紹了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說可以進(jìn)行各種修改和變形而
10并不背離由以下所附權(quán)利要求闡明的本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于分析液體樣本中的至少兩種分析物的方法，所述方法包括以下步驟a.提供基板，其中至少兩種不同類型的捕捉分子被固定在基板上并且其中每一種類 型的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力，b.使樣本與所述捕捉分子接觸，c.對(duì)于要分析的至少一種分析物在結(jié)合至捕捉分子的分析物分子和針對(duì)分析物具 有特定親和力的被標(biāo)記檢測(cè)分子之間引發(fā)接觸，并且對(duì)于要分析的至少另一種分析物在捕捉分子和被標(biāo)記形式的分析物之間引發(fā)接觸，以及d.測(cè)量來自于被標(biāo)記檢測(cè)分子和基板上的被標(biāo)記分析物的可檢測(cè)信號(hào)，其中被標(biāo)記 分析物的濃度與樣本中未標(biāo)記分析物的濃度相適應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕捉分子中的每一種都是從抗體、適體、核酸探 針、DNA探針、RNA探針、PNA探針、抗體片段、Fab片段和scFv片段構(gòu)成的組中獨(dú)立選出的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕捉分子是抗體。
4.如權(quán)利要求1至3中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)分子是從抗體、抗體片 段、Fab片段、scFv片段、適體、核酸探針、DNA探針、RNA探針和PNA探針中選出的至少一種 分子。
5.如權(quán)利要求1至3中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)分子是抗體。
6.如權(quán)利要求1至5中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過將被標(biāo)記檢測(cè)分子加入設(shè)備 中來引發(fā)捕捉分子和被標(biāo)記檢測(cè)分子之間的所述接觸。
7.如權(quán)利要求1至5中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過在設(shè)備上溶解預(yù)先分配的物 質(zhì)來引發(fā)捕捉分子和被標(biāo)記檢測(cè)分子之間的所述接觸。
8.如權(quán)利要求1至7中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過在設(shè)備中加入被標(biāo)記分析物 來引發(fā)捕捉分子和被標(biāo)記分析物之間的所述接觸。
9.如權(quán)利要求1至7中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過首先在樣本中添加被標(biāo)記分 析物并隨后使樣本與捕捉分子相接觸來引發(fā)捕捉分子和被標(biāo)記分析物之間的所述接觸。
10.如權(quán)利要求1至7中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過在設(shè)備上溶解預(yù)先分配的物 質(zhì)來引發(fā)捕捉分子和被標(biāo)記分析物之間的所述接觸。
11.如權(quán)利要求1至10中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中樣本與捕捉分子接觸足夠長(zhǎng)的 一段時(shí)間以達(dá)到平衡，用于將分析物分子結(jié)合至捕捉分子。
12.如權(quán)利要求1至11中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述基板至少部分地具有基本 上垂直于所述表面的凸起，所述凸起具有高度(HI)、直徑(Dl)和倒易間距(xl，yl)以實(shí)現(xiàn) 所述液體樣本的橫向毛細(xì)流動(dòng)。
13.如權(quán)利要求1至12中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述基板包括至少一個(gè)樣本添 加區(qū)域、具有接納至少一部分樣本能力的至少一個(gè)接受區(qū)域以及在一個(gè)或多個(gè)樣本添加區(qū) 域和一個(gè)或多個(gè)接受區(qū)域之間建立起流體連接的至少一個(gè)連接區(qū)域。
14.如權(quán)利要求1至13中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少兩種不同類型的捕捉 分子被固定在基板上的至少兩個(gè)不同區(qū)域上。
15.一種包括基板的分析設(shè)備，所述基板包括至少一個(gè)樣本添加區(qū)域、具有接納至少一 部分樣本能力的至少一個(gè)接受區(qū)域以及在一個(gè)或多個(gè)樣本添加區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)接受區(qū)域之間實(shí)現(xiàn)流體連接的至少一個(gè)連接區(qū)域，所述區(qū)域至少部分地由基本上垂直于所述表面 的凸起覆蓋，所述凸起具有高度(HI)、直徑(Dl)和倒易間距(xl，yl)以實(shí)現(xiàn)所述液體樣本 的橫向毛細(xì)流動(dòng)，其中所述基板包括固定在基板上的至少兩種不同類型的捕捉分子并且其 中每一種類型的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力，并且其中所述基板進(jìn)一步 包括預(yù)先分配的被標(biāo)記檢測(cè)分子和預(yù)先分配的被標(biāo)記分析物。
全文摘要
提供了一種用于分析液體樣本中的至少兩種分析物的方法，所述方法包括以下步驟a)提供基板，其中至少兩種不同類型的捕捉分子被固定在基板上并且其中每一種類型的捕捉分子都具有針對(duì)一種分析物的特定親和力，b)使樣本與所述捕捉分子接觸，c)對(duì)于要分析的至少一種分析物在捕捉分子和針對(duì)分析物具有特定親和力的被標(biāo)記檢測(cè)分子之間引發(fā)接觸，并且對(duì)于要分析的至少另一種分析物在捕捉分子和被標(biāo)記形式的分析物之間引發(fā)接觸，以及d)測(cè)量來自于被標(biāo)記檢測(cè)分子和基板上的被標(biāo)記分析物的可檢測(cè)信號(hào)，其中被標(biāo)記分析物的濃度與樣本中分析物的濃度相適應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102066936SQ200980122643
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者約恩森 C., 梅林 J. 申請(qǐng)人:阿米克股份公司