專利名稱：用于流感免疫應(yīng)答測(cè)量的陣列檢測(cè)器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于檢測(cè)對(duì)于特定抗原的免疫應(yīng)答的傳感器芯片，其可用于檢測(cè) 個(gè)體之前暴露于具有抗原的病原體，以為了流行病學(xué)目的來(lái)監(jiān)測(cè)在個(gè)體群中傳染的程度， 或測(cè)量疫苗針對(duì)所述病原體的效力。
背景技術(shù)：
流感病毒是膜包圍的(membrane-enclosed)RNA病毒，其基因組由離散的陰性-正 義RNA的鏈段構(gòu)成，并且主要是禽類和人的傳染劑(Lamb et al. ,"The Gene Structure and Replication of Influenza Virus,，，Annu Rev Biochem52 :467-506 (1983))。負(fù)責(zé) ?？康牧鞲械鞍祝?xì)胞凝集素(HA)和出芽神經(jīng)氨酸酶(NA)錨定于病毒脂質(zhì)膜中，并且 是預(yù)防和治療傳染的主要抗原關(guān)注點(diǎn)。有三種不同的流感病毒屬-稱為A、B和C，并且通 常區(qū)別在于結(jié)構(gòu)蛋白-其引起不同嚴(yán)重程度的免疫學(xué)效果(Cox et al. ,"The Molecular Epidemiology of Influenza Viruses, " Semin Virol 6 :359-370 (1995))，例如和流感有 關(guān)的典型癥狀(Monto et al. , "Clinical Signs and Symptoms Predicting Influenza Infection, "Arch Intern Med 160:3243-3247(2000))。流感 A 和 B 是最免疫相關(guān)的，因 為它們?cè)谌巳褐芯哂泄餐h(huán)傳播的季節(jié)傳染性(Lin et al. ,"Recent Changes Among Human Influenza Viruses, "Virus Resl03 :47-52 Q004))，并且流感 A 對(duì)于所有記錄的大 流行負(fù)責(zé)。流感A傳染除了人的多種不同的動(dòng)物種，包括鴨子、雞、豬、鯨、馬和海豹。流感 B病毒通常只傳染人。所有三種類型的流感病毒具有由8種不同RNA螺旋構(gòu)成的基因組，所述螺旋編碼 單獨(dú)基因，并且結(jié)合決定病毒類型A、B或C的核蛋白。實(shí)際上，流感基因組由8種單獨(dú)的核 酸片構(gòu)成，當(dāng)細(xì)胞受到多于一種病毒類型的共傳染時(shí)，其可以一起形成具有新的病毒基因 組合的病毒。這些RNA螺旋中的兩種編碼重要的病毒表面蛋白-血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸 酶，它們嵌入成熟病毒顆粒的脂質(zhì)雙層中。病毒血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的變化決定了病毒亞型。血細(xì)胞凝集素負(fù)責(zé)病毒 進(jìn)入宿主細(xì)胞，而神經(jīng)氨酸酶在新形成的病毒從傳染的細(xì)胞中釋放中是重要的。血細(xì)胞凝 集素的抗體可以中和病毒，并且是免疫性的主要決定簇。神經(jīng)氨酸酶的抗體不中和病毒，但 是可限制病毒復(fù)制和傳染過(guò)程。特定類型的血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的宿主抗體預(yù)防并 通常改善相同病毒毒株的將來(lái)傳染。然而，由于病毒毒株的基因構(gòu)成是動(dòng)態(tài)和不斷變化的， 因此在傳染一年的過(guò)程中獲得的通過(guò)成功耐受一種毒株而具有的免疫性可能在下一年在 抵抗新的重組變異毒株中是無(wú)用的。
在由于抗原性漂移的過(guò)程病毒毒株跟隨時(shí)間而變化時(shí)，流感流行被認(rèn)為產(chǎn)生?？?原性漂移(由主要病毒抗原基因的突變引起，特別是在血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶基因中 的突變)導(dǎo)致表面抗原較小改變，并且隨著時(shí)間基本上連續(xù)地發(fā)生。當(dāng)這些改變?cè)诨蛑?的合適位置發(fā)生時(shí)，它們產(chǎn)生抗體不識(shí)別的新的抗原，所述抗體是在之前傳染過(guò)程中針對(duì) 其他流感病毒毒株而產(chǎn)生的。流感大流行(或世界范圍流行)由于“抗原性轉(zhuǎn)變”而發(fā)生?？乖赞D(zhuǎn)變是流感 A病毒中的突然、主要的改變，其源自在流感A毒株中出現(xiàn)的新的血細(xì)胞凝集素和/或新的 血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶蛋白。這種轉(zhuǎn)變通常被認(rèn)為是在下列條件下產(chǎn)生的產(chǎn)生病毒 基因組RNA的新的聯(lián)合時(shí)，可能在非人種中，并且新的聯(lián)合傳播給人。當(dāng)發(fā)生這種抗原性轉(zhuǎn) 變時(shí)，大部分人對(duì)于病毒具有較小保護(hù)或沒(méi)有保護(hù)，因此傳染可以證明是致命的。周期性地，流感病毒的獨(dú)特毒株可出現(xiàn)，并且病原體的抗原新穎性導(dǎo)致傳染 率、傳播率和死亡率增加。歷史顯示這些流感大流行可以是極度致死的。例如，“西 班牙流感”(Johnson et al. ,"Updating the Accounts :Global mortality of the 1918-1920 “Spanish” Influenza Pandemic，”Bull Hist Med76 :105-115(2002)) (H1N1 ； 1918-1920 超過(guò) 5 千萬(wàn)人死亡)、“亞洲流感”(Rajagopal et al.，"Pandemic (avian) Influenza，” Semin Respir Crit Care28 159-17(^2007)) (H2N2 ； 1957-1958，1 百萬(wàn)人死 亡)，禾口“香港、流感，，(Shalala et al. ,"Collaboration in the Fight Against Infectious Diseases，” Emerg Infect Dis 4 :354-357 (1998)) (H3N2 ; 1968-1969，700，000 死亡)證實(shí) 病毒的效力和其快速世界范圍內(nèi)傳播的能力，另外，傳染性毒株可出現(xiàn)的快速性和我們對(duì) 于它們先天的耐受性也明確地強(qiáng)調(diào)。為了抵抗這些大流行，在二十世紀(jì)四十年代中期開發(fā) 了第一種單價(jià)和二價(jià)流感疫苗，其由滅活流感病毒構(gòu)成(Henle et al. ,"Demonstration of the Efficacy of Vaccination Against Influenza Type A by Experimental Infection of Human Beings, "J Immunol 46 :163-175 (1943),Francis et al. ,"Protective Effect of Vaccination Against Induced Influenza A,，，J Clin Invest 24:536-546(1945), Salk et al. , "Protective Effect of Vaccination Against Induced Influenza B,，，J Clin Invest24 :547-553(1945)).從那之后三價(jià)流感疫苗變得標(biāo)準(zhǔn)并且由三種滅活毒株 I^J(Halperin et al. , "Safety and Immunogenicity of a Trivalent, Inactivated, Mammalian Cell Culture-derived Influenza Vaccine in Healthy Adults, Seniors, and Children，” Vaccine 20 : 1M0-1247 Q002))，或由三種活的減毒毒株構(gòu)成(Belshe et al. , "The Efficacy of Live Attenuated, Cold-adapted, Trivalent, Intranasal Influenzavirus Vaccine in Children, "New Engl J Med 338 1405-1412 (1998)) - Mft 流感A和一種流感B-以提供針對(duì)共循環(huán)傳播的季節(jié)性毒株的更廣的預(yù)防措施。由于這些 初期努力，已經(jīng)進(jìn)行了多種研究，所述研究基于重組技術(shù)針對(duì)開發(fā)改善的更多包膜疫苗以 不僅針對(duì)當(dāng)前病毒毒株產(chǎn)生免疫(Kilbourne et al. ,"Future Influenza Vaccines and the Use of Genetic Recombinants, "Bull World Health Org 41 :643-645(1969),Webby et al. ,"Are We Ready for Pandemic Influenza ？ ，”Science 302 :1519-1522(2003), Treanor et al. , "Safety and Immunogenicity of a Baculovirus-Expressed Hemagglutinin Influenza Vaccine :A Randomized Controlled Trial,，，J Am MedAssoc 297 :1577-1582 (2007))，還提供針對(duì)過(guò)去流行的毒株的保護(hù)。
禽流感，命名為H5N1，是目前國(guó)際上主要研究努力的對(duì)象。過(guò)去的流感大流行已 經(jīng)證明在缺乏合適的防護(hù)時(shí)，流感的新和高病原性毒株可以是極度致死的。隨著全球人口 的增加和國(guó)際旅游和貿(mào)易的進(jìn)展，大流行的后果將變得嚴(yán)重。自從其初始在1997分離以 來(lái)(de Jong et al.，“A Pandemic Warning ？ "Nature 389 :554(1997))，已近報(bào)道 380 M H5N1, -^ 240 A^t (World Health Organization, "Epidemic and Pandemic Alert and Response :Avian Influenza, "accessed online from the WHO on April 16,2008)。 這些報(bào)道的情況中的大多數(shù)都是從禽類傳播至人，但也報(bào)道了人與人之間傳播的分離的情 況(Ungchusak et al,"Probable Person-to-Person Transmission of Avian Influenza A(H5N1), "N Engl J Med 352 :333-340 (2005)) 近期報(bào)道了 A型H1N1，豬流感的毒株，其具有獨(dú)特的基因性能并且能夠在人與人 之間傳播。初始發(fā)作出現(xiàn)在墨西哥，但現(xiàn)在病例已經(jīng)在美國(guó)和世界其他地區(qū)的大多數(shù)城市 中心報(bào)道。截止2009年4月30日，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)升至5期的警報(bào)水平。疫苗作為針對(duì)疾病的預(yù)防措施是必須的，但是傳統(tǒng)藥物基治療法在疫苗供應(yīng)受 到限制或無(wú)法獲得的情況下、高毒力流行病毒毒株(例如禽類流感H5m)特別嚴(yán)重的情 況下也是需要的(Kilpatrick et al. ,"Predicting the Global Spread of H5N1 Avian Influenza, "Proc Natl Acad Sci USA103 19368-19373 (2006)) 例如，神經(jīng)氨酸酶，控 制新包裝的病毒從宿主細(xì)胞膜中釋放的流感酶(Wagner et al. , ”Interdependence of Hemagglutinin Glycosylation Neuraminidase as Regulators of Influenza Virus Growth =AStudy by Reverse Genetics，，，J Virol 74 :6316-6323 (2000))在流感生命周 期中是吸引人的藥物靶。奧塞米韋(TAMIFLU ) (Kim et al.，“ Influenza Neuraminidase Inhibitors Possessing a Novel Hydrophobic Interaction in the Enzyme Active Site :Design, Synthesis, and Structural Analysis of Carboxylic Acid Sialic Acid Analogues with Potent Anti-Influenza Activity, " J Am Chem Soc 119: 681-690(1997))是口服活性抗病毒劑，其起到神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)模擬劑 的作用。目前顯示，世界中心地區(qū)開始囤積TAMIFLU 供應(yīng)(和其他抗病毒劑，例如在突 發(fā)流行的情況下(Moscona etal.，“Neuraminidase Inhibitors for Influenza,，，New Engl J Med353 :1363-1373(2005))扎那米韋(Itzstein et al.，“Rational Design of Potent Sialidase-Based Inhibitors of Influenza Virus Replication，，，Nature363 418-423(1993)))。盡管抗病毒劑能夠起到治療效果，預(yù)防而不是反應(yīng)的措施將最終 確保針對(duì)致死性流感病毒大流行的長(zhǎng)期成功，因?yàn)楹苋菀壮霈F(xiàn)流感的耐藥性形式(de Jong et al. , "Oseltamivir Resistance During Treatment of Influenza A (H5N1) Infection, "New Engl J Med 353 :2667-2672 (2005)) 源自研究者的生產(chǎn)和擴(kuò)增重組蛋 白和來(lái)自編碼它們的基因的能力的輔助開發(fā)是高通量微陣列。盡管高通量篩選的初始應(yīng) ffl^^^SiailPi^J (Schena et al. ,"Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns With a Complementary DNA Microarray, "Science 270 :467-470(1995), Lipshutz et al. , "High density Synthetic Oligonucleotide Arrays, " Nat Genet 21 :20-M(1999))，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白微陣列也具有多種顯著的應(yīng)用。例如，通過(guò)蛋白 微陣列的蛋白組分布研究已經(jīng)揭示了大量新的相互作用(MacBeath et al. , "Printing Proteins as Microarrays for High—Throughput Function Determination,，，Science289 :1760-1763(2000) , Michaud et al. ,"Analyzing Antibody Specificity With Whole Proteome Microarrays, "Nat Biotech 21 :1509-1512(2003), Chan et al., "Protein Microarrays for Multiplexed Analysis of Signal Transduction Pathway s," Nat Med 10 1390-1396 (2004)) 蛋白微陣列已經(jīng)用于開發(fā)抗原蛋白和監(jiān)控 對(duì)于它們的人免疫應(yīng)答(Davies et al. , "Profiling the Humoral Immune Response to Infection by Using Proteome Microarrays High-Throughput Vaccine and Diagnostic Antigen Discovery,"Proc Natl Acad Sci USA 102 :547-552(2005), Li et al. , "Protein Microarray for Profiling Antibody Responses to Yersinia pestis Live Vaccine,，，Infect Immun 73 :3734-3739 (2005), Qiu et al. , "Antibody Responses to Individual Proteins of SARS Coronavirus and Their Neutralization Activities, "Microbes Infect7 =882-889 (2005)) 該策略之前沒(méi)有用于多種同種型流感 抗原血細(xì)胞凝集素的固定。此外，在這種報(bào)道中的各種情況下，使用標(biāo)記的試劑實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。將期望提供固定的抗原同種型陣列，其可用于在使用未標(biāo)記的試劑的情況下篩選 針對(duì)傳染劑的抗體和包括多種類似特異性(例如在傳染劑的不同毒株之間的區(qū)分，所述傳 染劑例如基于由這些傳染劑或針對(duì)它們的疫苗所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的流感)的疫苗。考慮到 可能的流感大流行，還期望開發(fā)能夠篩選推定疫苗治療的針對(duì)各種流感毒株的效力和/或 交叉保護(hù)。此外，在監(jiān)控疾病的狀態(tài)和傳播時(shí)，能夠快速篩選禽類流感或其他野生動(dòng)物和家 畜中的毒株存在的系統(tǒng)具有顯著的實(shí)用性。本發(fā)明旨在克服本領(lǐng)域這些和其他缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面涉及用于檢測(cè)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的傳感器芯片。傳感器 芯片包括具有表面的基板和與所述基板的所述表面上的離散位置結(jié)合的多個(gè)血細(xì)胞凝集 素多肽，各血細(xì)胞凝集素多肽具有血細(xì)胞凝集素表位，優(yōu)選其免疫顯性表位。傳感器芯片可 以任選地包括與所述基板的所述表面上的離散位置結(jié)合的多個(gè)神經(jīng)氨酸酶多肽，各神經(jīng)氨 酸酶多肽具有神經(jīng)氨酸酶表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，傳感器芯片適用于陣列成像反射測(cè)量術(shù)(“AIR”)檢測(cè)系 統(tǒng)、表面等離子體共振(“SPR”)檢測(cè)系統(tǒng)、Brewster角離散干涉測(cè)量術(shù)(Brewster Angle Straddle Interferometry) ( “BASI”)檢測(cè)系統(tǒng)和橢圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明的第二方面涉及檢測(cè)系統(tǒng)，其包括根據(jù)本發(fā)明的第一方面的傳感器芯片。 檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)選包括被定位以照射所述芯片的光源；以及檢測(cè)器，所述檢測(cè)器被定位以檢測(cè) 從所述芯片表面反射的光線，從而測(cè)定抗體是否結(jié)合所述血細(xì)胞凝集素多肽。本發(fā)明的第三方面涉及用于檢測(cè)樣品中的抗-流感抗體的流通池。流通池包括 具有入口和出口的基底；透光蓋，所述透光蓋以基本上流體密封的方式設(shè)置在所述基底上， 并且和所述基底形成隔室，通過(guò)所述隔室流體可以從所述入口流到所述出口 ；并且根據(jù)本 發(fā)明的第一方面的傳感器芯片；所述傳感器芯片位于所述隔室中，并且通過(guò)所述透光蓋暴 露于入射光，從而用于以合適的入射角照射所述芯片表面的入射光在不存在結(jié)合血細(xì)胞凝 集素多肽的抗體的情況下實(shí)現(xiàn)幾乎完全相消干擾的條件，和在存在結(jié)合血細(xì)胞凝集素多肽 的抗體的情況下實(shí)現(xiàn)光反射率的實(shí)質(zhì)性改變的條件。
本發(fā)明的第四方面涉及檢測(cè)系統(tǒng)，包含根據(jù)本發(fā)明的第三方面的流通池；和所 述流通池的所述入口流體連通(fluid communicate)的流體樣品源；被定位以照射所述芯 片的光源；以及檢測(cè)器，所述檢測(cè)器被定位以檢測(cè)從所述芯片表面反射的光線，其中所述照 射光的所述入射角適于產(chǎn)生下列條件在不存在結(jié)合血細(xì)胞凝集素多肽的抗體的情況下幾 乎完全相消干擾和在存在結(jié)合血細(xì)胞凝集素多肽的抗體的情況下光反射率的實(shí)質(zhì)性改變。本發(fā)明的第五方面涉及傳感樣品中的抗-流感抗體的方法，該方法包括提供根 據(jù)本發(fā)明的第二或第四方面的檢測(cè)系統(tǒng)；在所述傳感器芯片表面處導(dǎo)向光線；在有效地允 許樣品中的抗-流感抗體特異性結(jié)合被所述抗體識(shí)別的血細(xì)胞凝集素多肽的條件下使所 述傳感器芯片和所述樣品接觸；以及在有效地鑒定結(jié)合所述樣品的抗體的血細(xì)胞凝集素多 肽的條件下檢測(cè)從所述芯片反射的光線。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)使用MR檢測(cè)系統(tǒng)、Sra檢測(cè)系統(tǒng)、BASI檢測(cè)系統(tǒng)或橢 圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的第六方面涉及使用根本本發(fā)明的第四方面的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)傳感抗-流感 抗體的方法，該方法包括下列步驟以有效地導(dǎo)致幾乎完全相消干擾的條件的方式在所述 傳感器芯片處導(dǎo)向光線；將流體樣品加入所述流通池；測(cè)量從所述芯片反射的光線；以及 基于所述測(cè)量的反射光，提供鑒定結(jié)合所述流體樣品的抗體的血細(xì)胞凝集素多肽的輸出。本發(fā)明的第七方面涉及篩選流感疫苗的效力的方法。該方法包括下列步驟將流 感疫苗施用至一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體；從所述一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體獲得血清樣品；以及進(jìn)行根據(jù) 本發(fā)明的第五或第六方面的方法，以測(cè)量由所述流感疫苗產(chǎn)生的抗-流感免疫應(yīng)答。含有流感血細(xì)胞凝集素多肽陣列的本發(fā)明的傳感器芯片已被證實(shí)在少于30分鐘 內(nèi)使用無(wú)標(biāo)記“無(wú)試劑”技術(shù)產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果，并且所述結(jié)果顯示為和那些通過(guò)比較ELISA測(cè) 定衍生的結(jié)果一致，而比較ELISA測(cè)定采用更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)進(jìn)行并且根據(jù)樣品和傳感器芯片 的反應(yīng)需要加入另外的標(biāo)記的試劑。因此，本發(fā)明提供用于測(cè)量疫苗效力和流感病毒毒株 的交叉反應(yīng)性的更快、可靠的檢測(cè)系統(tǒng)。本文中的實(shí)施例證實(shí)通過(guò)使用A^檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)實(shí) 施，和ELISA相比可以在單獨(dú)試驗(yàn)中篩選在更寬的動(dòng)態(tài)范圍的抗體滴度。附圖簡(jiǎn)述

圖1示意性示出A^檢測(cè)系統(tǒng)。圖2是本發(fā)明的流通池的剖視圖，其包括適于在MR檢測(cè)系統(tǒng)中用于水性環(huán)境的 傳感器芯片。圖3示意性示出橢圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)。圖4A示意性示出SPR檢測(cè)系統(tǒng)。圖4B示出SPR的輸出。圖5A-B是來(lái)自Genbank登錄ABW80979 (毒株A/新喀里多尼亞/20/1999，H1N1) (SEQ ID NO :1)、ATO31033(毒株 A/懷俄明州/3/2003，H3N2) (SEQ ID NO :2)、EF541403 (毒 株A/越南/1203/2004，H5N1) (SEQ IDNO :3)、AF250479 (毒株A/短頸野鴨/香港/W312/199， H6N1) (SEQ ID NO 4)和 NC_004908 (毒株 A/ 香港 /1073/1999，H9N2) (SEQ ID NO 5) 的血細(xì)胞凝集素序列的比對(duì)，其均通過(guò)引用的方式整體并入。該比對(duì)使用Multalin版 5. 4. 1 (Corpet,"Multiple Sequence Alignment with Hierarchical Clustering,，，Nucl. Acids Res.，1602) :10881-10890(1988)來(lái)制備，其通過(guò)引用的方式整體并入。在共有序 列(SEQ ID NO 6)中，符號(hào)“！ ”表示I或V，符號(hào)“$”表示L或M，符號(hào)“ ％ ”表示F或Y和
9符號(hào)“#”表示N、D、Q、E、B或Z中的一個(gè)。X可以是任何氨基酸。共有序列中的大寫字母表 示絕對(duì)保守氨基酸殘基(100%同一性)，而小寫字母表示優(yōu)勢(shì)殘基(50-99%同一性)。圖6示出血細(xì)胞凝集素的三維結(jié)構(gòu)，不同顏色表示五種HA同種型H1N1、H3N2、 H5NUH6N1和H9N2的序列同源性?！谏硎就耆恍?，‘暗灰色，表示序列類似和‘淺 灰色，使各種序列符號(hào)化。左側(cè)結(jié)構(gòu)是HA病毒外結(jié)構(gòu)域刺突的側(cè)視圖，右側(cè)結(jié)構(gòu)是HA受體 結(jié)合位點(diǎn)的俯視圖。圖7示意性示出手工制備本發(fā)明的血細(xì)胞凝集素陣列的關(guān)鍵。圖8A-B分別是使用來(lái)自疫苗試驗(yàn)對(duì)象的未稀釋的血清治療前和后陣列化流感測(cè) 試芯片的圖像。基于選擇的抗原斑的反射強(qiáng)度差異的結(jié)果圖示于圖9中。圖9是示出在暴露于來(lái)自六個(gè)臨床對(duì)象的血清時(shí)所有HA同種型的反射率變化量 的圖。參照?qǐng)D7中陣列關(guān)鍵中對(duì)于全抗原的描述，α-熒光素對(duì)照在圖中表示為“抗-F”。圖10是示出證實(shí)ELISA和western印跡結(jié)果的對(duì)象樣品的A^數(shù)據(jù)的比較分析 的圖。對(duì)象1是對(duì)象056 ；對(duì)象2是對(duì)象080 ；安慰劑對(duì)照是對(duì)象079。H5血細(xì)胞凝集素是 H5，3(越南 /1203/2004)。圖11是示出H5N9禽類抗血清滴定結(jié)果的圖。相對(duì)于α-熒光素陰性對(duì)照斑中的 改變，將所有反射率變化歸一化。重組GFP起到第二陰性對(duì)照和補(bǔ)充陽(yáng)性加標(biāo)對(duì)照的作用。 IgY抗體起到試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照的作用。暴露于單獨(dú)緩沖液的第二組芯片是0.0%對(duì)照陣列。圖12是Η7Ν3抗血清試驗(yàn)的HA微陣列的AIR圖像。所述芯片暴露于10% Η7Ν3 抗血清溶液。各探針類型以一列印刷8次。從左至右，探針?lè)肿邮浅?、!13、！15、!16、空白、 α -IgY > α-IgG和α-熒光素。注意α -熒光素陰性對(duì)照不容易看到，α-IgY在該濃度的 抗血清下是幾乎沒(méi)有活性的。圖13是示出以連續(xù)10 稀釋的形式進(jìn)行的Η7Ν3禽類抗血清滴定結(jié)果的圖。相 對(duì)于α-熒光素對(duì)照斑將所有變化歸一化。將各濃度重復(fù)三次。圖14是顯示在5%稀釋下篩選的對(duì)象抗血清的結(jié)果的圖?！熬彌_液”柱對(duì)應(yīng)于來(lái) 自六個(gè)試驗(yàn)的MPBS-ET對(duì)照芯片的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，HA陣列應(yīng)答根據(jù)對(duì)象數(shù)量和接受的 Η5劑量(微克)標(biāo)記。圖15是顯示對(duì)于從5%至0. 04%的Iog5抗血清稀釋對(duì)象06FR0033的接種前和 后的反射率變化的比較的圖。圖16是示對(duì)于從5%至0. 04%的抗血清滴定對(duì)象06FR0033的結(jié)果的圖。圖17Α-Β示出人抗血清試驗(yàn)的自動(dòng)印刷的HA微陣列。示出背景圖像(圖17Α) 和暴露于5%抗血清的試驗(yàn)陣列的圖像(圖17Β ；對(duì)象071)。從左至右，斑身份是α -IgG, α -IgM, α -熒光素、HAS、空白、HI、H3、H5、H6 和 H9。圖18示出用于安慰劑對(duì)象064的抗血清滴定。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的傳感器芯片。傳感器 芯片包括具有表面的基板和與所述基板的所述表面上的離散位置結(jié)合的多個(gè)血細(xì)胞凝集 素多肽，各血細(xì)胞凝集素多肽具有血細(xì)胞凝集素表位，優(yōu)選其免疫顯性表位。傳感器芯片的總體設(shè)計(jì)和構(gòu)造可以根據(jù)其應(yīng)用于的特定檢測(cè)系統(tǒng)而改變。這些包 括例如但不限于設(shè)計(jì)用于MR檢測(cè)系統(tǒng)、Sra檢測(cè)系統(tǒng)、BASI檢測(cè)系統(tǒng)和橢圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)的傳感器以及任何其他無(wú)標(biāo)記或熒光標(biāo)記的陣列技術(shù)。A^檢測(cè)系統(tǒng)描述于美國(guó)專利No. 7，292，349 (Miller et al)，其通過(guò)引用的方式 整體并入，該構(gòu)造示于圖1。系統(tǒng)10包括光源12、偏振器14、受器16(即，本發(fā)明的功能化 傳感器芯片)和檢測(cè)器18。光源12產(chǎn)生和朝向受器的表面?zhèn)鬏斣O(shè)定波長(zhǎng)的光線(L)。一 個(gè)或更多個(gè)透鏡和濾光器可用于優(yōu)化所述系統(tǒng)。A^利用來(lái)自受器上的介質(zhì)/覆層和覆層 /基板界面的反射之間的干擾，在使生物分子結(jié)合覆層時(shí)顯示出反射率的變化。實(shí)際上，使 用具有氧化物覆層的硅晶片，入射角和波長(zhǎng)的明智選擇可使用S-偏振光以在不存在靶的 情況下(在該情況下是抗血細(xì)胞凝集素抗體)獲得幾乎完全相消干擾(即反射率優(yōu)選小于 約10_5，或在一些情況下甚至小于10_6)。在靶結(jié)合后除去幾乎完全(或幾乎完美)相消干 擾的條件。因此，甚至更小量的抗-血細(xì)胞凝集素抗體的高靈敏度檢測(cè)也是可能的。盡管使用S-偏振光的AIR已經(jīng)證明具有高靈敏度，但是定量檢測(cè)多種生物分子分 析物的簡(jiǎn)便分析方法，在上述參考文獻(xiàn)美國(guó)專利No. 7，292，349 (Miller et al.)中所述的 系統(tǒng)，更容易在干燥狀態(tài)下操作，即，利用空氣/氧化物界面而不是水/氧化物界面。在水 環(huán)境中進(jìn)行MR的改善系統(tǒng)在共同待審美國(guó)專利申請(qǐng)No. 12/261, 818 (Mace et al.)和PCT 國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/2008/081804(Mace et al.)中有所描述，其通過(guò)引用的方式整體并入?；?本上，本文所述的流通池允許S-偏振光耦合到水性環(huán)境中以檢測(cè)靶結(jié)合。使用該相同的流 通池，其含有功能化有多個(gè)血細(xì)胞凝集素多肽的傳感器芯片，也在本文的涵蓋中。流通池示于圖2中。流通池包括基底112、90°棱鏡形式的透光蓋114、位于基底 和蓋之間的襯墊116和一個(gè)或更多個(gè)安裝支架118，所述安裝支架118用于以基本上流體 密封的方式固定基底和蓋?；?12包括形成在其一面中的孔120以及分別經(jīng)過(guò)通道1 和1 和孔連通(communicate)的入口 122和出口 124。入口 122和出口 1 形成在基底 的相對(duì)端上，使得連通孔120的通道1 和1 確保當(dāng)置于孔中時(shí)流體流過(guò)芯片130。為了 輔助就此而言的流體流過(guò)，凹痕131形成在孔的各端出的孔120的側(cè)壁中，使得流體可以容 易地從通道1 流到孔中，和通過(guò)通道1 從孔中流出。通道1 和1 優(yōu)選設(shè)置有配件 132，其允許導(dǎo)管或其他形式管連接至流通池。例如，流體樣品源可以連接至入口 122，出口 IM可連接至另外的流體分析儀或僅連接至廢液儲(chǔ)庫(kù)。芯片130優(yōu)選通過(guò)成角度的芯片支 撐器140支撐在孔120中。在干式和濕式AIR系統(tǒng)中，傳感器芯片具有相同的功能構(gòu)造，具有基板、基板上的 一個(gè)或更多個(gè)覆層，然后探針?lè)肿?在該情況下血細(xì)胞凝集素多肽-結(jié)合覆層表面。在上 述參考文獻(xiàn)美國(guó)專利No. 7，292, 349 (Miller et al.)，美國(guó)專利申請(qǐng)No. 12/261, 818 (Mace et al.)和PCT國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/2008/081804(Mace et al.)中所述，多種不同材料可 被選擇用于基板和一個(gè)或更多個(gè)覆層。任何合適基板和覆層的組合都涵蓋于MR檢測(cè)系統(tǒng) 中使用的傳感器芯片中。BASI檢測(cè)系統(tǒng)在美國(guó)專利公開No. 20070076214 (Rothberg)中有所描述，其通過(guò) 引用的方式整體并入。類似MR系統(tǒng)，BASI系統(tǒng)利用來(lái)自介質(zhì)/覆層和覆層/基板界面的 反射之間的干擾，在使生物分子結(jié)合覆層時(shí)顯示出反射率的變化。所述系統(tǒng)的基本設(shè)計(jì)類 似于圖I(AIR)中所述，但是傳感器芯片的結(jié)構(gòu)有區(qū)別。BASI系統(tǒng)功能化有任何基板/覆層 組合，其中覆層非常薄(例如硅上的天然氧化物膜)，并且當(dāng)兩個(gè)界面(基板/覆層或覆層 /介質(zhì))中的一個(gè)上的入射角大于其Brewster角，兩個(gè)界面中的另一者上的入射角小于其業(yè)開發(fā)用于入射s_偏振光的A^系統(tǒng)，BASI系統(tǒng)依賴ρ-偏振光的 檢測(cè)。作為Brewster角離散和ρ-偏振光的結(jié)果，其中覆層厚度<< λ，反射偏振的相位翻 轉(zhuǎn)允許幾乎完全相消干擾(其中反射率優(yōu)選小于約10_4，或甚至在不存在靶結(jié)合的情況下 小于10_5)。對(duì)于A^檢測(cè)系統(tǒng)，甚至更小量的抗-血細(xì)胞凝集素抗體的靈敏度檢測(cè)也是可 能的。橢圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量反射光的偏振分量作為傳感器芯片的表面上覆層厚度改 變的度量。當(dāng)電磁輻射被樣品反射或透射時(shí)，橢圓對(duì)稱法靈敏地檢測(cè)偏振態(tài)的改變。這種橢 圓對(duì)稱檢測(cè)系統(tǒng)的典型實(shí)施方案示于圖3，包括發(fā)射準(zhǔn)直光束的光源，所述準(zhǔn)直光束通過(guò)由 線性偏振器(P)和四分之一波長(zhǎng)試板(C)形式的補(bǔ)償器的組合提供的可變偏振控制器。偏 振光束在已知斜角下入射到傳感器表面( 上，從樣品表面反射，并且通過(guò)連接至合適的 光檢測(cè)器(統(tǒng)稱A)的第二線性偏振器來(lái)分析。在該橢圓對(duì)稱器構(gòu)造中，測(cè)量可通過(guò)下列方 式進(jìn)行改變組件P和A的方位角，同時(shí)C的光學(xué)軸保持為恒定方位角(例如相對(duì)于入射面 45° )，直到光檢測(cè)器接受最小強(qiáng)度。對(duì)于該“無(wú)效”條件的組件P、C和A的方位角可用于 計(jì)算橢圓對(duì)稱角Delta和I^si，它們對(duì)于在給定入射角和光線波長(zhǎng)處的樣品的光學(xué)參數(shù)是 特異性的。使用合適的光學(xué)模型和數(shù)值回歸，量Delta和I^i可就其生長(zhǎng)過(guò)程中的光學(xué)層的 厚度或改變而言重新計(jì)算。使用橢圓對(duì)稱法監(jiān)控生物分子的結(jié)合反應(yīng)追溯到1942 (Rothen et al. ,"Serological Reactions of Protein Films and Denatured Proteins,"J. Exp. Med 76 :437(1942),其通過(guò)引用的方式整體并入)，其中在結(jié)合反應(yīng)中在表面處吸附的生 物材料的量可從量Delta和Psi來(lái)重新計(jì)算。成像橢圓對(duì)稱法，如美國(guó)專利No. 5，076，696 (Cohn et al.)中所述，其通過(guò)引用 的方式整體并入，使用空間解析檢測(cè)器和成像光學(xué)儀以允許橢圓對(duì)稱數(shù)據(jù)的大規(guī)模平行測(cè) 量，例如以Delta和/或I^i圖的形式。這些圖可進(jìn)而轉(zhuǎn)化成層厚度、光學(xué)折射率、在陣列 上的各斑的吸附的材料的化學(xué)組成或量的表面圖。利用其內(nèi)在平行檢測(cè)方案的成像橢圓對(duì) 稱法可有利地用作這些所謂的生物芯片、微陣列或微板的檢測(cè)技術(shù)(Eing et al. ,Imaging Ellipsometry in Biotechnology, ISBN 3-9807279-6-3 U002)，其通過(guò)引用的方式整體并 入)。成像橢圓對(duì)稱法已經(jīng)證實(shí)利用用于測(cè)量照射到待測(cè)表面上的來(lái)自環(huán)境介質(zhì)的光 線。其他測(cè)量構(gòu)造基于全內(nèi)反射，如美國(guó)專利NO.6，594，011(Kempen，)中所述，其通過(guò)引用 的方式整體并入。此處，來(lái)自光源的光線被導(dǎo)向通過(guò)內(nèi)反射元件以將待檢測(cè)的樣本反射掉。檢測(cè)信號(hào)的改善可使用sra橢圓對(duì)稱法獲得，如圖4A中所示。在sra橢圓對(duì)稱法 中使用的基板232使用薄金屬層234以允許表面等離子體的激發(fā)和傳播。盡管金屬層234 的一側(cè)和透明支撐結(jié)構(gòu)236接觸，但是通常連接棱鏡238以允許光線在斜角下耦合進(jìn)來(lái)，所 述層的另一側(cè)暴露于環(huán)境介質(zhì)M0。在環(huán)境中由于形成吸附層(例如抗體244結(jié)合表面結(jié) 合的血細(xì)胞凝集素多肽對(duì)2)而導(dǎo)致的光線折射率的改變被監(jiān)控為入射角的偏移(△ Θ)， 其產(chǎn)生表面等離子體共振，從而引起反射光強(qiáng)度改變(參見(jiàn)圖4B)。對(duì)于SI^R基傳感器，已 知金屬膜和探測(cè)的表面之間的中間電介質(zhì)層可起到進(jìn)一步增加靈敏度的構(gòu)件的作用。一種示例性SI3R基板在美國(guó)專利No. 7，332，329 (ffark et al.)中有所描述，其通 過(guò)引用的方式整體并入。該sra基板特別適用于血細(xì)胞凝集素多肽的生物分子陣列，其中 基板包括多個(gè)金屬島，所述金屬島由疏水層或電介質(zhì)材料包圍，并且血細(xì)胞凝集素多肽結(jié)
無(wú)論旨在施用基板的傳感器芯片基板或檢測(cè)系統(tǒng)如何，傳感器芯片包括與所述傳 感器芯片的所述表面結(jié)合的多個(gè)血細(xì)胞凝集素多肽。結(jié)合至傳感器芯片表面的各血細(xì)胞凝 集素多肽可以是全長(zhǎng)蛋白或其多肽片段。所有生物傳感器固有的特點(diǎn)，無(wú)論標(biāo)記狀態(tài)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，都是探針固 定。二氧化硅表面的末端羥基的作用是在其可起到親核試劑作用(Bikiaris et al., “Compatibilisation effect of PP-g-MA copolymer on iPP/Si02 nanocomposites prepared by melt mixing, " Eur Polym J 41 1965-1978 (2005) ；Tripp et al., “Chemical Attachment of Chlorosilanes to Silica :A Two-step Amine-promoted Reaction, "J Phys Chem 97 :5693-5698 (1993)，其均通過(guò)引用的方式整體并入)或支 持吸附時(shí)是高度撓性的。為此，二氧化硅容易通過(guò)多種化學(xué)方法來(lái)衍生化。這些化學(xué) 反應(yīng)導(dǎo)致羥基有效地轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N化學(xué)官能團(tuán)中的任一種，包括但不限于胺(Huang et al.，“Directed Assembly of One-dimensional Nanostructures Into Functional Networks，"Science 291 :630-633(2001),其通過(guò)引用的方式整體并入)或鹵化物 (Hergenrother et al. ，“Small-molecule Microarrays :Covalent Attachment and Screening of Alcohol-containing Small Molecules on Glass Slides，”J Am Chem Soc 122 :7849-7850 (2001)，其通過(guò)引用的方式整體并入)。從各初始反應(yīng)中，第二化學(xué)物 可加入以進(jìn)一步改變表面反應(yīng)性，或探針可直接偶接。另外，多種官能化硅烷，在二氧化硅 上偶聯(lián)和自組裝的分子(Onclin et al. ,"Engineering Silicon Oxide Surfaces Using Self-assembled Monolayers，，，Angew Chemie Int Ed 44 :2-24 (2005)，其均通過(guò)引用的方 式整體并入)是市售的，并且可賦予基板表面多種化學(xué)前景(landscape)(胺、環(huán)氧化物、鏈 烯烴等)。多種這樣的方案一般描述于美國(guó)專利No. 7，2 ，733 (Chan et al.)和美國(guó)專利 No. 7, 292, 349 (Miller et al.)，其均通過(guò)引用的方式整體并入。美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No. 61/101，831 (Mace et al.)，其通過(guò)引用的方式整體并 入，教導(dǎo)在含有結(jié)合至陣列表面的探針?lè)肿拥闹苿┲惺褂梅怯H核性添加劑。非親核性添加 劑的用量為有效地避免或減小由于反應(yīng)劑在結(jié)合反應(yīng)劑的陣列上的斑上非均勻分布而引 起的表面形態(tài)性畸形的嚴(yán)重性。這些表面形態(tài)性畸形包括明亮中心斑和“咖啡漬”環(huán)(或 孔環(huán))，其可以干擾在特定斑處靶分子結(jié)合的精確檢測(cè)。換言之，使用有效量的非親核性添 加劑促進(jìn)反應(yīng)劑在定位探針的陣列上的各斑上基本上均勻分布。通過(guò)均勻分布，旨在使在 斑表面上的反應(yīng)劑濃度的變化最小化(相對(duì)于在不存在非親核性添加劑的情況下制備的 斑)。另一種方式表示為，優(yōu)選在陣列斑上的像素變化小于約10%，更優(yōu)選變化小于5%，最 優(yōu)選變化小于約3 %，變化小于2 %，或甚至變化小于約1 %。可以使用任何有效量的非親核性添加劑。典型地，這種有效量為約0. 001至約3% v/v，更優(yōu)選約0. 01至約ν/ν。非親核性添加劑的一個(gè)實(shí)施方案包括具有下式(I)結(jié)構(gòu)的化合物R1——0——[(CH2)mOJn——R2(I)其中，η是O至約250的整數(shù)；m是1至3的整數(shù)，優(yōu)選1或2 ；并且R1和R2獨(dú)立 地選自Cl至C3烷基或R1和R2 —起形成Cl至C3烷基，在該情況下式(I)的化合物具有環(huán) 狀結(jié)構(gòu)。R1和R2優(yōu)選為甲基或乙基或一起形成乙基。這些添加劑優(yōu)選分子量為約5000Da
13或更小，更優(yōu)選約4000Da或更小，或約3000Da或更小，最優(yōu)選約2000Da或更小，或甚至約 IOOODa或更小。式(I)的示例性非親核性添加劑包括但不限于冠醚(18-冠-6，15-冠-5， 12-冠-4等)、雙甲氧基乙基)醚、二烷基醚和聚乙二醇。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，非親核性添加劑是二甲基亞砜(DMSO)。使用非親核性添加劑(不參與反應(yīng)劑(或探針前體)和官能化芯片基板的化學(xué)偶 接)的益處是添加劑促進(jìn)探針?lè)肿釉陉嚵猩系乃鼈兏麟x散位置上的更好的分散。因此該改 善的分散使可降低檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度的表面形態(tài)性畸形最小化或完全避免。結(jié)果，可以獲 得檢測(cè)靶分子的改善的靈敏度。血細(xì)胞凝集素Q22kDa的跨膜同源三聚體)是負(fù)責(zé)通過(guò)唾液酸受體介導(dǎo)宿主細(xì) 胞識(shí)另 1J的流感抗原(Copeland et al. ,"Assembly of Influenza Hemagglutinin Trimers and Its Role in Intracellular Transport,"J Cell Bioll03 :1179-1191(1986)，其 通過(guò)引用的方式整體并入)。目前，已經(jīng)鑒定有16種主要HA同種型(Fouchier et al., “Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype(H16) Obtained from Black-headed Gulls, " JVirol 79 J814-2822 (2005)，其通過(guò)引用的方 式整體并入)，并且分離的病毒血清型和神經(jīng)氨酸酶都基于它們的決定簇而被分類。當(dāng)接 觸宿主時(shí)，細(xì)胞嘗試內(nèi)吞病毒。內(nèi)涵體的更低的PH環(huán)境引起HA的顯著結(jié)構(gòu)重排(Skehel et al. , "Changes in the confirmation of Influenza Virus Hemagglutinin at the pH Optimum of Virus-mediated Membrane Fusion,，，Proc Natl Acad Soc USA79 968-972 (1982)，其通過(guò)引用的方式整體并入)，這導(dǎo)致膜融合，并最終遞送病毒有效負(fù) 荷(Skehel et al.,"Receptor Binding and Membrane Fusion in Virus Entry :the Influenza Hemagglutinin, ”Annu Rev Biochem 69 :531-569 Q000)，其通過(guò)引用的方式整 體并入)。編碼HA的病毒RNA基因組的區(qū)域非常易于突變(Plotkin et al. ,"Codon Bias and Frequency-dependent Selection on the Hemagglutinin Epitopes of Influenza A Virus, "Proc Natl Acad Sci USA 100 :7152-7157 (2003)，其通過(guò)引用的方式整體并 入)，并且是流感病毒能夠回避宿主防御的主要原因。這種類型的進(jìn)化被分類為‘抗原 性漂移’或‘抗原性轉(zhuǎn)變’‘抗原性漂移’是基因中編碼抗原蛋白的突變的自然積累，其 中產(chǎn)生抗原的免疫原性的改變(Jin et al. ,"Two Residues in the Hemagglutinin of A/Fujian/411/02-1 ikeInfluenza Viruses are Responsible for Antigenic Drift from A/Panama/2007/99, "Virology 336 :113-119(2005),其通過(guò)引用的方式整體并 入)。另一方面，‘抗原性轉(zhuǎn)變’是在兩個(gè)同時(shí)傳染宿主細(xì)胞的病毒毒株之間產(chǎn)生的顯著 基因重組，并因此產(chǎn)生免疫學(xué)不同的抗原(Laver et al. ,"Studies on the Origin of Pandemic Influenza III.Evidence Implicating Duck and Equine Influenza Viruses as Possible Progenitors of the Hong Strain of Human Influenza, "Virology 51: 383-391 (1973)，其通過(guò)引用的方式整體并入)。通過(guò)理解和期望兩種進(jìn)化途徑，可以通過(guò) 測(cè)序抗原決定簇在系統(tǒng)發(fā)育上追蹤一種流感血清型至另一種的進(jìn)程(Lindstrom et al., "Genetic Analysis of Human H2N2 and Early H3N2 Influenza Viruses,1957-1972 Evidence for Genetic Divergence and Multiple Reassortment Events, "Virology 328 :101-lliK2004)，其通過(guò)引用的方式整體并入)。例如，以這種方式繪制了人大流行H2N2 病毒至大流行 H3N2 病毒的偏離的圖(Scholtissek，et al.，“0n the Origin of the Human Influenza Virus Subtypes H2N2 and H3N2, "Virology 87 :13-20 (1978)，其通過(guò) 引用的方式整體并入)。本發(fā)明的傳感器芯片陣列旨在包括任何兩種或更多種血細(xì)胞凝集素多肽，但優(yōu)選 任何一種或更多種Hl多肽(例如來(lái)自Hmi-H1N9中的那些)、任何一種或更多種H2多肽 (例如來(lái)自H2m-H2N9中的那些)、任何一種或更多種H3多肽(例如來(lái)自H3m_H3N9中的那 些)、任何一種或更多種H4多肽(例如來(lái)自Η·1-Η4Ν9中的那些)、任何一種或更多種Η5多 肽(例如來(lái)自H5m-H5N9中的那些)、任何一種或更多種H6多肽(例如來(lái)自H6m_H6N9中 的那些)、任何一種或更多種H7多肽(例如來(lái)自H7m-H7N9中的那些)、任何一種或更多種 H8多肽(例如來(lái)自H8m-H8N9中的那些)、任何一種或更多種H9多肽(例如來(lái)自Η·1_Η9Ν9 中的那些)、任何一種或更多種HlO多肽(例如來(lái)自Η1(Μ1-Η10Ν9中的那些)、任何一種或 更多種Hll多肽(例如來(lái)自Himi-H11N9中的那些)、任何一種或更多種H12多肽(例如 來(lái)自H12N1-H12N9中的那些)、任何一種或更多種H13多肽(例如來(lái)自H13m_H13N9中的 那些)、任何一種或更多種H14多肽(例如來(lái)自Η1·1-Η14Ν9中的那些)、任何一種或更多 種Η15多肽(例如來(lái)自H15m-H15N9中的那些)、任何一種或更多種Η16多肽(例如來(lái)自 H16N1-H16N9中的那些)、及其所有可能的組合。任何新發(fā)現(xiàn)的血細(xì)胞凝集素變體也可加入 到本發(fā)明的傳感器芯片上。除了血細(xì)胞凝集素多肽，本發(fā)明的傳感器芯片陣列還可以包括任意兩種或更多 種神經(jīng)氨酸酶多肽。優(yōu)選地，傳感器芯片陣列包括任意一種或更多種W多肽(例如來(lái)自 Hmi-H16m中的那些)、任意一種或更多種N2多肽(例如來(lái)自H1N2-H16N2中的那些)、任意 一種或更多種N3多肽(例如來(lái)自H1N3-H16N3中的那些)、任意一種或更多種N4多肽(例 如來(lái)自H1N4-H16N4中的那些)、任意一種或更多種N5多肽(例如來(lái)自H1N5-H16N5中的那 些)、任意一種或更多種N6多肽(例如來(lái)自H1N6-H16N6中的那些)、任意一種或更多種N7 多肽(例如來(lái)自H1N7-H16N7中的那些)、任意一種或更多種N8多肽(例如來(lái)自H1N8-H16N8 中的那些)、任意一種或更多種N9多肽(例如來(lái)自H1N9-H16N9中的那些)、及其所有可能 的組合。任何新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)氨酸酶變體也可加入到本發(fā)明的傳感器芯片陣列上。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識(shí)到的，抗原經(jīng)歷翻譯后修飾，這種糖基化可包括在陣列 上。例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或Baculovirus細(xì)胞中血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶多肽(待結(jié) 合陣列表面)的重組表達(dá)應(yīng)該導(dǎo)致它們的糖基化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識(shí)到的，基于發(fā)生檢測(cè)的位置的表面積，結(jié)合芯片上的各 離散位置的血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶的量可被優(yōu)化。通過(guò)例子的方式，據(jù)信在血細(xì)胞凝 集素或神經(jīng)氨酸酶多肽/位置的濃度為約100fg/mm2至約lOOng/mm2、優(yōu)選約lpg/mm2至約 10ng/mm2時(shí)可以獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明中使用的試驗(yàn)HA陣列(下述)具有不同同種型和分離株。然而這不阻止 特異產(chǎn)生的抗血清與表面固定的重組血細(xì)胞凝集素的交叉反應(yīng)性。因此，為了獲得在抗原 陣列中的血細(xì)胞凝集素之間的細(xì)微區(qū)別的分子理解，對(duì)來(lái)自HlNl、H3N2、H5Nl、H6m和H9N2 毒株(得自Genbank-參見(jiàn)下文材料和方法)的血細(xì)胞凝集素進(jìn)行多個(gè)氨基酸序列比對(duì)。如 圖5中所示，發(fā)現(xiàn)5種蛋白序列的24. 5%的氨基酸具有完全同一性，和另外42. 4%序列類 似性。這認(rèn)為是高的序列保守百分比，但這不保證在待被中和抗體識(shí)別的蛋白表面上可得共同表位。因此，獲得結(jié)構(gòu)信息以補(bǔ)充序列分析。為此，將來(lái)自1918流感大流行的Hmi 血細(xì)胞凝集素的已知結(jié)構(gòu)(Gamblin et al.，“The Structure and Receptor Binding Properties of the 1918 Influenza Hemagglutinin, "Science303 1838-1842 (2004),^ 通過(guò)引用的方式整體并入)用作HA支架以三維表示序列同源性(圖6)。HA結(jié)構(gòu)被染色以 可視性表示同一性(黑色)，類似性(暗灰色)和多樣性(淺灰色)。比對(duì)研究的結(jié)果(圖 5)示出相當(dāng)大程度的序列類似性依賴于血細(xì)胞凝集素作為可接近的潛在表位的表面。因 此，對(duì)于抗血清可預(yù)計(jì)某些程度的同種型之間交叉反應(yīng)性，特別是當(dāng)對(duì)象(人或其他)接種 重組病毒外結(jié)構(gòu)域和非天然病毒錨定的血細(xì)胞凝集素時(shí)。另外，血細(xì)胞凝集素的活性位點(diǎn) 的俯視圖(圖6)揭示出在同種型之間蛋白的高度不類似區(qū)域。因此，一種同種型的受體結(jié) 合位點(diǎn)的抗體或小分子抑制劑不太可能針對(duì)其他血細(xì)胞凝集素具有廣泛的活性。血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶多肽可使用任何合適的偶接多肽的化學(xué)法而偶接至 陣列表面。一些不同的結(jié)合化學(xué)方法描述于上述美國(guó)專利No. 7，292，349(Miller et al.), 其通過(guò)引用的方式整體并入。優(yōu)選的方案，特別對(duì)于氧化物覆層，包括使用氨基烷基三烷氧 基硅烷，然后使用戊二醛，這賦予能夠結(jié)合血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶多肽的氨基反應(yīng)性 表面。血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶多肽結(jié)合各離散位置可以手工或使用自動(dòng)系統(tǒng)來(lái)進(jìn) 行。對(duì)于手工陣列化，在從&母液(修飾的磷酸鹽-緩沖鹽水(“MPBS”))至含有10%甘 油和0. 01 % Tween-20的溶液以1 1稀釋后，多肽溶液可在最終濃度1_100 μ g/mL、優(yōu)選 10-60 μ g/mL下以 1 μ L的體積進(jìn)行陣列化。在周圍環(huán)境中孵育10分鐘后，芯片可浸入阻 斷緩沖溶液中(在H印es緩沖鹽水(“HBS，，)中的lmg/mL胎牛血清白蛋白(“BSA”))45分 鐘，然后用含有另外的3mM EDTA和0. 005% Tween-20 ( "MPBS-ET")的MPBS緩沖液沖洗。 對(duì)于自動(dòng)陣列化，在從h母液(MPBS)至含有MPBS中的0. 01-1 % (ν/ν) 12-冠-4醚的溶 液以1 1稀釋后，多肽溶液可在最終濃度1-100 μ g/mL、優(yōu)選40-60 μ g/mL下使用Virtek Chipffriter Pro或可相比裝置通過(guò)自動(dòng)印刷來(lái)進(jìn)行陣列化。在微陣列室中在70 °F、70%相 對(duì)濕度下孵育60分鐘后，芯片可浸入阻斷緩沖溶液中(在HBS中的300 μ g/mL BSA) 60分 鐘，然后使用MPBS-ET沖洗。一旦制得陣列，傳感器芯片可暴露于得自個(gè)體的血清樣品(或稀釋的血清樣品)， 然后存在(或不存在)一種或更多種特定流感毒株的抗體可以基于在將傳感器芯片暴露于 血清樣品后，檢測(cè)器輸出的變化(或缺少變化)的檢測(cè)來(lái)測(cè)定。本領(lǐng)域中熟知的是，不存在 可檢測(cè)的信號(hào)并不必然表示抗體不存在而是它們低于檢測(cè)限，因此不太可能展示出來(lái)。圖 像捕獲可通過(guò)任何上述檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)獲得，但優(yōu)選通過(guò)捕獲芯片表面的至少實(shí)質(zhì)性部分的圖 像的圖像陣列檢測(cè)器來(lái)獲得。對(duì)于數(shù)百到數(shù)十萬(wàn)探針的陣列，自動(dòng)芯片讀取器可被編程以 基于捕獲的圖像來(lái)評(píng)價(jià)陣列上的各斑的反射率的改變。如本文所使用，獲得血清樣品的個(gè)體可以是任何易于被流感傳染的動(dòng)物，包括人 和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、家畜、馴化動(dòng)物和野生動(dòng)物(特別是禽類)。篩選家畜是特別期望的，因?yàn)?其有用于監(jiān)控野生動(dòng)物的流感的傳播。血清樣品可得自活的個(gè)體和死后的尸體。本發(fā)明的陣列特別有用于篩選流感疫苗的效力?；旧希嚵袃?yōu)選用于篩選得自 個(gè)體(其已經(jīng)被施用疫苗)的免疫前和后的血清。在足夠時(shí)間以允許免疫應(yīng)答后，獲得免疫后樣品，然后針對(duì)本發(fā)明的陣列篩選。稀釋血清樣品，通常從約1 20至約1 2500，可 基于陣列的各離散位置上負(fù)載的血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶的量來(lái)優(yōu)化。然而，在使樣品 暴露于陣列后，可以通過(guò)AIR、SPR、BASI、橢圓對(duì)稱法等使用用于讀取傳感器芯片表面的系 統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)抗體-血細(xì)胞凝集素或抗體-神經(jīng)氨酸酶反應(yīng)性的檢測(cè)?？梢栽u(píng)價(jià)免 疫反應(yīng)性的定量測(cè)定。如果期望或需要，通過(guò)加入第二抗體，例如IgG的特異性抗體，可以進(jìn)一步增強(qiáng)靈敏度。另外的分析可包括但不限于ELISA、PCR、實(shí)時(shí)-PCR，質(zhì)譜法和液相色譜一NMR光譜 法。此外，在使用芯片的過(guò)程中檢測(cè)到存在抗體后，抗體本身可從在使用裝置的過(guò)程中與之 結(jié)合的血細(xì)胞凝集素或神經(jīng)氨酸酶多肽中離解。離解可以通過(guò)多種方式的任一種來(lái)實(shí)現(xiàn)， 包括但不限于在低PH下的甘氨酸溶液、低pH水溶液、高pH水溶液、洗滌劑溶液(低、中或 高濃度)、低濃度變性劑溶液(例如脲)。在離解后抗體(現(xiàn)在沒(méi)有芯片表面)可以回收， 然后如果需要進(jìn)行分析。取決于隨后下游分析的方案，可以直接或在一個(gè)或更多個(gè)濃縮目 標(biāo)抗體的步驟后使用洗脫的樣品。一旦傳感器芯片清除之前的結(jié)合抗體，傳感器芯片可重新使用以篩選其他血清樣 品是否存在抗-流感抗體。
實(shí)施例本發(fā)明可通過(guò)參照下列例子來(lái)進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1-3的材料和方法血細(xì)胞凝集素對(duì)于HA陣列，下列同種型用于手工和自動(dòng)陣列(分離自人，除非另有說(shuō)明)A/新 喀里多尼亞 /20/1999 (HlNl)，A/ 懷俄明州 /3/2003 (H3N2)，A/ 香港 /56/1997 (H5N1)，A/ 香 港 /213/2003 (H5N1)，A/ 越南 /1203/2003 (H5N1)，A/ 短頸野鴨 / 香港 /W312/1997 (H6N1)， A/ 香港 /1073/1999 (H9N2)。所有 HA 購(gòu)自 Protein Sciences, Corp. (Meriden, CT)和 / 或 ^ David Topham(University of Rochester, Rochester, NY)白勺石if@ilil#^。人、禽類和小鼠樣品Η5 ^ftWAiilifiiyf/Λ University of Rochester Retrovirology Lab and Vaccine Evaluation Unit 獲得。標(biāo)記 9 個(gè)研究對(duì)象031、033 (前和后)、036、037、038、 064、067、069和071。血清的潛在病原性狀態(tài)是未知的(即，關(guān)于HIV 1/2的測(cè)試的信息等 是未知的)，這樣，當(dāng)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中處理樣品時(shí)要特別注意。針對(duì)禽類流感毒株H5N9和 H7N3 Wxlifiiiiyf Cornell University ^Whittaker lab of the College of Veterinary Medicine 惠贈(zèng)。陰性對(duì)照小鼠血漿得自 University of Rochester Medical Center 的 Pearce Laboratory0在IP注射戊巴比妥和心臟右心室穿刺后，收集來(lái)自5只4個(gè)月大的 雌性129Sv/J鼠(原始來(lái)源Taconic，現(xiàn)在室內(nèi)飼養(yǎng))的全血樣品。將血液在肝素上混合并 離心除去紅血球。血細(xì)胞凝集素序列比對(duì)所有研究的血細(xì)胞凝集素的完全氨基酸序列通過(guò)NCBI (Genbank)檢索和從基因 組核苷酸序列的轉(zhuǎn)化(除了 H1N1，其作為肽序列進(jìn)行保藏)而定位。各序列的Genbank登錄號(hào)如下，其通過(guò)引用的方式整體并入ABW80979(A/新喀里多尼亞/20/1999，H1N1) (Bragstad et al. , "The Evolution of Human Influenza A Viruses from 1999 to 2006-A Complete Genome Study, "Virol J 5 :40 (2008)，其通過(guò)引用的方式整體并入)， AY531033(A/懷俄明州/3/2003，H3N2) (Bragstad et al. ,"New Avian Influenza A Virus Subtype Combination H5N7 Identified in Danish Mallard Ducks,，，Virus Res. 109 181-190(2005)，其通過(guò)引用的方式整體并入)，EF541403 (A/越南 /1203/2004, H5N1) (World Health Organization Global Influenza Program Surveillance Network, "Evolution of H5N1 Avian Influenza Viruses in Asia, "Emerg. Infect.Dis.11 1515-1521 (2005)，其通過(guò)引用的方式整體并入)，AF250479 (A/短頸野鴨/香港/ W312/1997,H6N1)(Hoffmann et al. ,‘‘Characterization of the Influenza A Virus Gene Pool in Avian Species in Southern China :ffas H6N1 a Derivative or a Precursor of H5N1 ？，” J. Virol. 74 :6309-6315(2000),其通過(guò)引用的方式整體并入)和 NC_004908 (A/ /1073/1999, H9N2) (Lin et al. , Avian-to-Human Transmission of H9N2 Subtype Influenza A Viruses-Relationship Between H9N2 and H5N1 Human Isolates,，，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :96M_9658 (2000)，其通過(guò)引用的方式整體并入)。一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì) 軟件 Multalin (ν5· 4. 1) (Corpet, F. , "Multiple Sequence Alignment with Hierarchial Clustering，，，Nucl Acids Res 16 :10881-10890(1988) ；Combet et al. ,"NPSi =Network Protein Sequence Analysis, "Trends Biochem Sci. 25 :147-15(^2000)，其通過(guò)引用的方 式整體并入)用于比對(duì)約560-570個(gè)氨基酸的各HA序列。Multalin參數(shù)被設(shè)定以使用同 一性符號(hào)比較表和同一性評(píng)分方法。序列保守性的上限和下限分別設(shè)定為100%和50%。 比對(duì)輸出示于圖5。為了圖示，經(jīng)解析的血細(xì)胞凝集素結(jié)構(gòu)Hmi的序列(Combet et al. ,"NPSi Network Protein Sequence Analysis, "Trends Biochem Sci. 25 :147-150 (2000),其通過(guò) 引用的方式整體并入)(PDB ID =IRUZ)被用作支架，并且使用MacPYMOL提供(DeLano，W. L.， The PyMOL Molecular Graphics System,DeLano Scientific，Palo Alto, CA,USA(2002), 其通過(guò)引用的方式整體并入)。為了證實(shí)各保守的/類似的氨基酸殘基的位置，將其序列加入Multalin比對(duì)算法 中；在MacPYMOL中，100%保守的各殘基被染色為‘黑色，50% -99%保守的各殘基被染色為 ‘暗灰色’，并且< 50%保守的各殘基被染色為‘淺灰色’。然后血細(xì)胞凝集素同源性結(jié)構(gòu)被 射線追蹤以顯示‘刺突’(側(cè)面)和‘活性位點(diǎn)’(俯視)取向(參見(jiàn)圖6)。手工血細(xì)胞凝集素陣列試驗(yàn)制備MR基板以使初始SW2厚度為1381人，并且使用 PITC總胺連接化學(xué)法(general amine attachment chemistry)進(jìn)行官能化。用于手工陣 列試驗(yàn)的HA是Hmi、H3N2、所有三個(gè)H5W和H6W。在從h母液(MPBQ至含有10%甘油 和0. 01 % Tween-20的溶液以1 1稀釋后，HA在最終濃度20 μ g/mL下以1 μ L的體積進(jìn) 行手工陣列化。以相同的體積和緩沖液稀釋在最終濃度50 μ g/mL下將人IgG(陽(yáng)性對(duì)照) 和熒光素抗體陣列化。探針溶液被允許在周圍環(huán)境下孵育10分鐘，之后將芯片立即浸入 阻斷緩沖劑溶液(在HBS中的lmg/mL BSA)45分鐘。然后將芯片用MPBS-ET沖洗，并且將 150 μ L 100%人血清樣品滴在表面上(將發(fā)生一些可變的樣品稀釋)。在45分鐘的孵育時(shí) 間后，將芯片用MPBS-ET沖洗并加入MPBS-ET的振蕩浴5分鐘。然后將芯片用ddH20沖洗，在氮?dú)庀赂稍?，并且在G3反射計(jì)上成像。將各斑的反射值和陰性對(duì)照芯片(只有MPBS-ET) 上的相應(yīng)斑進(jìn)行比較，并相對(duì)于α -熒光素陰性對(duì)照進(jìn)行歸一化。微陣列化血細(xì)胞凝集素試驗(yàn)制備A^基板以使初始SW2厚度為1393人，并且使用戊二醛總胺連接化學(xué)法進(jìn) 行官能化。大和微陣列化HA測(cè)定所要求的氧化物厚度之間的差異推測(cè)是通過(guò)由于反射光 低效地耦合至G4反射計(jì)檢測(cè)器而引起的A^反射最小值的輕微擴(kuò)寬引起的。所有探針斑 以8個(gè)重復(fù)印刷。用于手工陣列試驗(yàn)的HA是HlNl、Η3Ν2、Η5Ν1 (越南/1203/2003)、H6W 和Η9Ν2 (只有人抗血清試驗(yàn))。在從h母液(MPBQ至含有在MPBS中的0. 1 % 12-冠-4 的溶液以1 1稀釋后，HA在最終濃度40 μ g/mL (對(duì)于H9N2是50 μ g/mL)下使用Virtek Chipffriter Pro自動(dòng)印刷。人IgG和人IgM抗體(陽(yáng)性對(duì)照)在100 μ g/mL陣列化。人血 清白蛋白(HSA)和α -熒光素(陰性對(duì)照)分別在最終濃度200 μ g/mL和10 μ g/mL在相 同緩沖液稀釋液中陣列化。使探針溶液在微陣列室中在70下和70%相對(duì)濕度下孵育60分 鐘。此后，芯片立即浸入阻斷緩沖溶液中(在HBS中的300 μ g/mL BSA)60分鐘。然后將芯 片用MPBS-ET沖洗，并且將50 μ L人血清樣品滴在表面上(將發(fā)生一些可變的樣品稀釋)。 在60分鐘的孵育時(shí)間后，將芯片用MPBS-ET沖洗并加入MPBS-ET的振蕩浴5分鐘。然后將 芯片用ddH20沖洗，在氮?dú)庀赂稍?，并且在G4反射計(jì)上成像。將各斑的反射值和陰性對(duì)照 芯片(只有MPBS-ET)上的相應(yīng)斑進(jìn)行比較，并相對(duì)于HSA陰性對(duì)照進(jìn)行歸一化。對(duì)于雞Η5Ν9和Η7Ν3抗血清試驗(yàn)，所有方法保持相同，不同之處在于排除Η9Ν2 作為探針(缺乏可利用性)，除去HSA作為陰性對(duì)照，除去α-IgM作為陽(yáng)性對(duì)照，并且將 α -IgG交換為α -IgY作為陽(yáng)性對(duì)照。此外，重組綠色熒光蛋白(rGFP)在濃度50 μ g/mL下 陣列化為第二對(duì)照。在雞抗血清存在下，rGFP起到另外的陰性對(duì)照的作用；在低抗血清稀 釋，α -rGFP以濃度5 μ g/mL補(bǔ)充為陽(yáng)性加標(biāo)(spike)對(duì)照。實(shí)施例1-手工制備的血細(xì)胞凝集素陣列進(jìn)行利用高濃度的手工陣列化的血細(xì)胞凝集素的初始試驗(yàn)以研究這些蛋白的陣 列能力和合適的初始芯片厚度。在lOOyg/mL A/越南/1203Λ004(H5m)，1360人的氧化 物被測(cè)得為理想膜厚度以給予合適的未結(jié)合的探針強(qiáng)度。盡管這些斑是可解析的，但是早 期試驗(yàn)的關(guān)注在于總胺連接化學(xué)法HA是同源三聚體的，并且含有約30個(gè)溶劑可及胺/單 體。因此，固定的分子的取向?qū)⑹峭耆S機(jī)的。低聚狀態(tài)可確保存在結(jié)合特異性抗體的溶 劑可及面，但是導(dǎo)致有效的無(wú)活性傳感器的取向也是可能的。在這些高HA濃度下嘗試觀察在加入對(duì)于A/越南/1203/2004 (H5N1)血細(xì)胞凝集 素(eEnzyme產(chǎn)品號(hào)IA-005-01000)特異性的抗體后的信號(hào)改變失敗，推測(cè)是因?yàn)樽璧K大抗 體的表位識(shí)別的表面處的空間擁擠。理想地，由于各HA同種型尺寸相同-序列只有細(xì)微差 別-用于陣列的溶液濃度均還應(yīng)該是相同的。A/新喀里多尼亞/20/1999 (HlNl)同種型在 最低母液濃度66 μ g/mL下供應(yīng)，因此是該研究的限制探針；所有探針?lè)肿颖幌♂?，使得?們可以補(bǔ)充足夠量的由甘油和Tween-20構(gòu)成的穩(wěn)定溶液。因此，隨后試驗(yàn)對(duì)于所有HA使用 20 μ g/mL作為最終濃度來(lái)進(jìn)行。在表面衍生化的過(guò)程中該低濃度和洗滌方案的細(xì)微改變使 新的最佳芯片初始厚度增加為1381人。試驗(yàn)陣列產(chǎn)生，并且由上述Hmi和H5m試驗(yàn)血細(xì) 胞凝集素探針斑、以及分別α-IgG和α-熒光素的陽(yáng)性和陰性對(duì)照斑構(gòu)成。這些陣列針對(duì) 特異性A/新喀里多尼亞/^20/1999 011^)抗體(Fitzgerald產(chǎn)品號(hào)M32210)以及H5W抗體而進(jìn)行篩選。這些試驗(yàn)的有意思的結(jié)果是Hmi抗體似乎優(yōu)選識(shí)別H5m同種型，而H5m 抗體僅僅適度識(shí)別兩種HA。這并不完全是不可預(yù)見(jiàn)的，盡管由于抗血清交叉反應(yīng)性由序列 同源性預(yù)測(cè)。在用于小規(guī)模臨床試驗(yàn)的制備中手工產(chǎn)生全HA陣列，其含有6個(gè)同種型與陽(yáng)性和 陰性對(duì)照(圖7)?？寡宓米?個(gè)不同的對(duì)象在兩個(gè)分別就診時(shí)5個(gè)接種各種量的A/香 港/156/1997 (H5m)，并且1個(gè)對(duì)象只給予安慰劑注射劑(參見(jiàn)表1)。所有試驗(yàn)進(jìn)行盲測(cè)。表1 來(lái)自接種變化量的抗原的各對(duì)象的傳統(tǒng)接種效力試驗(yàn)的表格結(jié)果
對(duì)象量ELISAWesternNeutHAI, 1ΗΑΙ’3No.(Pg)OD印跡滴度滴度滴度05690/901.748陽(yáng)性4532,5602006890/100.652陰性143201007625/251.677陰性20η/ρη/ρ079安慰劑0.235陰性10η/ρη/ρ08025/251.856陽(yáng)性80η/ρη/ρ08190/601.160陰性1416020n/p =試驗(yàn)未進(jìn)行等份未稀釋的血清通過(guò)使用下列文獻(xiàn)中所述類型的檢測(cè)系統(tǒng)的A^用在全HA陣 列上美國(guó)專利申請(qǐng)序列No. 10/282, 274 (Miller et al.)，2002年10月28日提交，現(xiàn)在的 美國(guó)專利No. 7，292, 349，公布于2007年11月6日，其通過(guò)引用的方式整體并入。代表性暴 露前和暴露后圖像示于圖8A-B中，而所有芯片的反射率變化的全定量示于圖9中。重要的是知道這些研究是進(jìn)行盲測(cè)，事先不知道各對(duì)象接種的抗原量，由傳統(tǒng)方 式監(jiān)控的抗血清應(yīng)答的結(jié)果，或安慰劑樣品的身份。在它們第二次免疫后7天對(duì)于從對(duì)象 收集的血清進(jìn)行傳統(tǒng)測(cè)定ELISA、針對(duì)抗血清的western印跡、病毒中和以及血細(xì)胞凝集素 抑制(HAI)。這些結(jié)果示于表1中。從臨床抗血清數(shù)據(jù)中立即顯示一些特征證實(shí)研究具有純化的抗體。首先，在對(duì) 新喀里多尼亞/20/1999和越南/1203/2004血細(xì)胞凝集素的應(yīng)答之間有高度的相關(guān)性。其 次，與對(duì)象無(wú)關(guān)，來(lái)自香港/156/1997斑的應(yīng)答有限。第三，特異性抗血清顯示出引起比對(duì) 其他的更高的對(duì)一般HA表位的應(yīng)答。然而，特別地，在香港/156/1997斑觀察到非常少的 應(yīng)答，因?yàn)檫@是用于接種患者群的重組同種型。然而，盡管該同種型已經(jīng)證實(shí)在T-細(xì)胞測(cè) 定中的活性，但是不太可能以天然折疊構(gòu)象存在。另外，產(chǎn)生的反射率變化相對(duì)于HA探針 是特異性的，因?yàn)棣?-熒光素對(duì)照斑強(qiáng)度改變對(duì)于所有測(cè)定可忽略(平均值5. 4個(gè)單位)。 考慮到試驗(yàn)使用的未稀釋的抗血清，這是異常的結(jié)果。比較AIR結(jié)果和表1中示出的常規(guī)分析，觀察到高度的類似性。來(lái)自對(duì)象056和 080的樣品顯示出高的MR反射率(圖9和10) ,ELISA 0D、良好的中和滴度和陽(yáng)性western 印跡。對(duì)象056示出高的新喀里多尼亞/20/1999交叉反應(yīng)性(圖9)。對(duì)象068具有高的 HA交叉反應(yīng)性，如MR和HAI滴度(圖9)所看到的。盲性研究的重要方面是確定是否安慰 劑對(duì)象可以由MR解析?；贏IR結(jié)果，安慰劑樣品的三個(gè)候選物是對(duì)象068、076和079。 對(duì)象068由于低的應(yīng)答而被鑒定，除了新喀里多尼亞/20/1999和越南/1203/2004HA。對(duì)象 076被鑒定因?yàn)樵摌悠樊a(chǎn)生最低的兩種總反應(yīng)性中的一種。對(duì)象079也被鑒定，因?yàn)樵谒蠬5血細(xì)胞凝集素斑上的低活性。實(shí)際上，安慰劑樣品的身份稍后被傳播為來(lái)自對(duì)象079。對(duì)象068的低反應(yīng)性可由較小的第二次接種劑量來(lái)解釋，所述劑量可導(dǎo)致第二免 疫應(yīng)答降低，因此產(chǎn)生更少量的抗體。來(lái)自對(duì)象076的結(jié)果更難于解釋。可能的是ELISA OD 是誤導(dǎo)的，該對(duì)象對(duì)于接種具有非常弱的免疫應(yīng)答，或者當(dāng)香港/156/1997血細(xì)胞凝集素 表面固定時(shí)，對(duì)于該對(duì)象免疫原性HA表位不可獲得。然而，一種不類似的情況是對(duì)象081。 通過(guò)傳統(tǒng)方法，對(duì)象081表現(xiàn)出是成功接種的較差候選物，因?yàn)樗鼈兊目寡逯泻偷味群?低并且western印跡是陰性，但是通過(guò)MR對(duì)象081在陣列上積累了一些最高的應(yīng)答。然 而，具有以下可能通過(guò)將這些HA束縛到某些表位優(yōu)選暴露或遮掩的基板表面。因此，對(duì)于 基于溶液或基于基質(zhì)的測(cè)定，觀察的反射率值將失真。重要地，這些結(jié)果一使用無(wú)標(biāo)記、“無(wú)試劑”技術(shù)在不到30分鐘獲得一和通過(guò)比較 ELISA測(cè)定衍生的那些結(jié)果是完全一致的。實(shí)施例2-禽群(Avian Flock)中的病毒監(jiān)測(cè)禽類與人接觸是H5m流感病毒傳播的主要途徑(Sandrock et al. , "Clinical Review :Update of Avian Influenza A Infections in Humans,，，Crit Care 11: 209 (2007)，其通過(guò)引用的方式整體并入)。因此，監(jiān)控全球家禽群的能力對(duì)于保護(hù)人的健康 是關(guān)鍵的。另外，監(jiān)測(cè)也是農(nóng)學(xué)和人類學(xué)的關(guān)注點(diǎn)截止2006年底，超過(guò)240百萬(wàn)家禽已經(jīng) 被預(yù)防性殺死以制止禽流感病毒的傳播(World Organization for Animal Health,Avian influenza =Fact Sheet, accessed April 16，2008，其通過(guò)引用的方式整體并入)。雞H5N9 和 H7N3 抗血清的樣品得自 Cornell University 的 the College of Veterinary Medicine的Whittaker lab。H5N9抗血清將起到替換禽類H5m的作用，而H7N3 病毒也顯示了傳染人的可能性(Tweed et al. ,"Human Illness from Avian Influenza H7N3, British Columbia, "Emerg. Infect. Dis. 10 :2196-2199 Q004)，其通過(guò)引用的方式整 體并入)。另外，禽類抗血清試驗(yàn)將起到優(yōu)異的模型系統(tǒng)的作用以同時(shí)利用MR方法的改進(jìn) 進(jìn)行研究。這些試驗(yàn)使用上述自動(dòng)印刷陣列來(lái)進(jìn)行。對(duì)于禽類抗血清試驗(yàn)，產(chǎn)生含有新喀里多尼亞/20/1999 (HlNl)、懷俄明州 /3/2003 (H3N2)、越南/1203/2004 (H5N1)和短頸野鴨 / 香港/W312/1997 (H6m)的陣列。對(duì) 于這些陣列，加入α-IgY陽(yáng)性對(duì)照和α-熒光素以及重組綠色螢光蛋白(rGFP)陰性對(duì)照。 rGFP斑將同時(shí)起到稀釋溶液的陽(yáng)性加標(biāo)對(duì)照的作用。不幸地，H5N9抗血清以有限的體積供 應(yīng)，只可以獲得最初滴度，示于圖11中。對(duì)于H3、H5和H6在更高濃度的抗血清處觀察到相 當(dāng)大的反射率增加。H3表現(xiàn)出較低的特異性，因?yàn)槠洳幌褚氲南♂屇菢恿己玫剡M(jìn)行滴定， 而H5和H6良好地對(duì)應(yīng)于濃度改變而改變。Hl血細(xì)胞凝集素示出對(duì)于所有篩選的濃度可忽 略的反射率變化。IgY抗體表現(xiàn)出比期望的、給定的大血清免疫球蛋白濃度更低的活性；例 如，當(dāng)陣列補(bǔ)充另外的α-人IgG列時(shí)，人免疫球蛋白-特異性抗體展示出比對(duì)于雞免疫球 蛋白的抗體更高的靈敏度(在Η7Ν3抗血清試驗(yàn)的上下文中)。重組GFP示出針對(duì)雞抗血清 的小的、但是‘活性’非特異性吸附，因?yàn)橥ㄟ^(guò)將α-GFP加入稀釋抗血清溶液中，其容易被 識(shí)別。50% Η5Ν9抗血清稀釋也在一套芯片上進(jìn)行，但是對(duì)于表面的非特異性結(jié)合排除結(jié)合 的可重復(fù)的定量。盡管Η5Ν9抗血清迅速耗盡，但是至少其提供滴定窗，在其中有效地研究Η7Ν3抗血 清活性。對(duì)于這些試驗(yàn)，稀釋窗集中為從10%至0.37% (三個(gè)1呢3稀釋)。處理更稀的抗血清濃度允許保存和進(jìn)行大量的重復(fù)試驗(yàn)。圖12示出在暴露于10% H7N3抗血清后在 64八頂反射計(jì)上成像的血細(xì)胞凝集素微陣列圖像。斑形態(tài)是各探針類型典型的。圖像的右 下角的較大亮點(diǎn)是由反射計(jì)成像系統(tǒng)上的顆粒引起的散射。這種反射異常在圖像處理過(guò)程 中容易規(guī)避。H7N3抗血清滴定的結(jié)果非常不同于H5N9抗血清，如觀察到的較大H3交叉反 應(yīng)性(圖13)。不幸地，重組H7N3血細(xì)胞凝集素不是市售的，因此不能在該陣列中實(shí)施。對(duì) 于所有陣列化血細(xì)胞凝集素都觀察到中度反射率增加，并且在減小的抗血清濃度下所有HA 信號(hào)都滴定良好。MR的靈敏度由暴露于10%抗血清對(duì)3. 33%抗血清的基板的統(tǒng)計(jì)上不同 的反射率變化來(lái)明確證實(shí)。在平均觀察到的信號(hào)改變中的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)于更稀的溶液較大， 但是這可以由系統(tǒng)誤差負(fù)責(zé)，所述系統(tǒng)誤差源自由加入靶溶液至濕芯片而引起的另外的樣 品稀釋。如預(yù)計(jì)的，在H5N9和H7N3禽類抗血清之間觀察到明顯的差異。單獨(dú)高抗血清稀 釋(如下述人抗血清所進(jìn)行的)的比較建立在陣列化HA之間產(chǎn)生交叉反應(yīng)性的趨勢(shì)H5N9 抗血清特異于H5，并且在更少程度上特異于H6，盡管對(duì)于Hl或H3血細(xì)胞凝集素不展示出 反應(yīng)性；另一方面，H7N3抗血清顯示出在整個(gè)血細(xì)胞凝集素組的反應(yīng)性，其中對(duì)于Hl和H3 具有輕微特異性。這些結(jié)果用于準(zhǔn)備用于在將來(lái)進(jìn)行的更深入的禽類監(jiān)測(cè)研究，包括更大 的HA陣列和更多樣的家禽群。實(shí)施例3-較大血細(xì)胞凝集素陣列利用下列五種血細(xì)胞凝集素同種型使用自動(dòng)微陣列印刷器來(lái)制備陣列H1 =A/ 新喀里多尼亞 /20/1999 (HlNl) ；H3 = A/ 懷俄明州 /3/2003 (H3N2) ；H5 = A/ 越 南 /1203/^2004 015^) ；H6 = A/ 短頸野鴨 / 香港 /W312/1997 (H6N1)；和 H9 = A/ 香港 /1073/1999 (H9N2)。一些對(duì)照也包括在陣列上，包括人血清白蛋白(HSA)作為“歸一化”陰 性對(duì)照，和抗-熒光素作為第二陰性對(duì)照元件。針對(duì)人IgG和人IgM的抗體起到陽(yáng)性對(duì)照 的作用。盡管最初人抗血清結(jié)果在提供下列方面中是成功的義頂數(shù)據(jù)可以提高傳統(tǒng)接種 測(cè)定的結(jié)果，但是存在兩個(gè)不能由常規(guī)手工陣列化技術(shù)克服的主要限制擴(kuò)大陣列以包括 增加的探針多余物和通過(guò)自動(dòng)控制印刷陣列的體積和形態(tài)來(lái)除去“人的可變因素”。如前面 章節(jié)禽類抗血清試驗(yàn)所證實(shí)的，使用自動(dòng)微陣列儀以控制和可重復(fù)的方式來(lái)解決兩種技術(shù) 不足。另外，A/香港/1073/1999 (H9N2)血細(xì)胞凝集素補(bǔ)充到全陣列，同時(shí)還有兩種或更多 種對(duì)照探針針對(duì)人IgM的抗體將起到第二陽(yáng)性對(duì)照的作用(Lacroix-Desmazes et al., "Analysis of Antibody Reactivities Toward Self Antigens of IgM of Patients with Waldenstrom' s Macroglobulinemia," Int Immunol 9 :1175—1183(1997)，gilil弓IM的 方式整體并入)，和人血清白蛋白通過(guò)溶液-相位競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，將是有效的另外陰性對(duì)照(圖 14)。圖17B示出在暴露于對(duì)象071的5%抗血清后在射計(jì)上成像的血細(xì)胞凝集素 微陣列的代表性圖像。由對(duì)來(lái)自隨機(jī)選擇的對(duì)象(來(lái)自臨床群)的血清進(jìn)行的測(cè)定，人抗血清試驗(yàn)的有 效地試驗(yàn)滴定范圍被測(cè)定為在5% (1 20稀釋)至0.04% (1 2500稀釋)之間。5% 抗血清被稀釋至足以否定來(lái)自非特異性結(jié)合的信號(hào)，而保持大的非飽和反射率增加，并且 事實(shí)上0.04% (1 2，500稀釋)被稀釋至足以對(duì)于大多數(shù)樣品滴定出至零的反射率變化。 對(duì)于所有滴定的樣品該稀釋系列以10 步驟進(jìn)行。然而，大部分抗血清只在5%稀釋下研究以定量在交叉反應(yīng)性中的趨勢(shì)和鑒定潛在的安慰劑對(duì)象?；谠谏? %滴度的低H5反射 率變化，來(lái)自06FR0037和06FR0069的樣品可能是安慰劑接受者(圖14)。此外，抗血清試 驗(yàn)的緩沖液對(duì)照陣列(N = 6)被分析以定量陣列-至-陣列的再現(xiàn)性。對(duì)于α -IgG斑觀 察到在對(duì)照芯片之間最大的反射率變化(3.05+/-8. 1)，而大部分可重復(fù)的斑是α-熒光素 (2. 66+/-1. 8)。然后測(cè)定的“噪音”約3個(gè)單位，因此在該范圍內(nèi)的反射率變化被認(rèn)為是可 忽略的。一個(gè)對(duì)象也具有接種前血清，其被等分以定量先天耐性和測(cè)得Η5接種的實(shí)際保 護(hù)效果。衍生自對(duì)象06FR0033的反射率變化指示針對(duì)Η3血細(xì)胞凝集素的中等應(yīng)答，可能 由于衍生自現(xiàn)有流感感染的記憶免疫性和針對(duì)Hl和Η9血細(xì)胞凝集素的細(xì)微交叉反應(yīng)性 (圖15)。然而，在接種前抗血清等份中只觀察到Η5和Η6血細(xì)胞凝集素的基礎(chǔ)識(shí)別，由于 這些相互反應(yīng)在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)不是可滴定的，因此推測(cè)它們對(duì)于那些同種型不是特異 性的。然而，在接種Η5后，對(duì)象06FR0033獲得針對(duì)陣列中的Η5和所有HA的相當(dāng)大特異 性保護(hù)效果(圖16)。此外，由于這些相互作用在篩選濃度-4個(gè)1呢5系列稀釋(5%、1%、 0. 2%和0. 04% )內(nèi)滴定良好，因此它們確實(shí)是特異性免疫應(yīng)答的結(jié)果。此外，如所預(yù)期的，在稀釋過(guò)程中在信號(hào)中有劑量-依賴性改變。A^的靈敏度由 暴露于小至0. 2%抗血清的基板的統(tǒng)計(jì)上不同的反射率變化來(lái)明確證實(shí)。安慰劑樣品鑒定為衍生自對(duì)象064，其在圖14中展示的反射率數(shù)據(jù)中明確觀察 到。然后進(jìn)行全抗血清滴定以監(jiān)控針對(duì)HA的信號(hào)耗盡的速度。類似于使用對(duì)象033的接 種前樣品所觀察到的，在非接種群中存在非常微小地基礎(chǔ)識(shí)別H5和H6 ；然而，在正常人血 清中存在針對(duì)H1、H3和H9血細(xì)胞凝集素的抗體。這示于圖18。對(duì)于所有通過(guò)MR篩選的 對(duì)象，通過(guò) National Institutes of Health, John Treanor (University of Rochester, Rochester,NY)提供H5血細(xì)胞凝集素抑制數(shù)據(jù)(表2)。除了對(duì)象036和067，在用于接種 對(duì)象的H5的量和它們產(chǎn)生抑制性抗血清能力(通過(guò)H5HAI滴度觀察)之間表現(xiàn)出較小的 相關(guān)性。感興趣的是，和在接種過(guò)程中檢測(cè)到的情況相比，在研究得出結(jié)論后6個(gè)月對(duì)象 031和036具有更高的HAI滴度(表2中的接種后就診1和2)。然而，AIR結(jié)果很少有差 別。在劑量、HAI滴度(接種后就診2)和MR反射率改變之間有明確的差異，典型為源自 衍生自對(duì)象036、067和071的樣品。盡管期望由于針對(duì)血細(xì)胞凝集素-特異性表位產(chǎn)生的 所有抗體具有引起反射率增加的潛力，但是并不是抑制活性的那些。然而，不可能斷定通過(guò) A^監(jiān)控的HA陣列明確能夠識(shí)別接種前和后的抗血清以及衍生自安慰劑和試驗(yàn)對(duì)象的樣 品。此外，關(guān)于與HAI滴度和接種劑量的一致，這些結(jié)果和從類似進(jìn)行的ELISA和western 印跡試驗(yàn)中預(yù)期的那些一致，而大量增加可從單獨(dú)對(duì)象衍生的樣品獲得的數(shù)據(jù)的量。表2 在各個(gè)臨床研究階段進(jìn)行的H5血細(xì)胞凝集素抑制滴度的比較
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的傳感器芯片，所述傳感器芯片包括具有表 面的基板和與所述基板的所述表面上的離散位置結(jié)合的多個(gè)血細(xì)胞凝集素多肽，各血細(xì)胞 凝集素多肽包含血細(xì)胞凝集素表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，其中所述血細(xì)胞凝集素多肽是全長(zhǎng)血細(xì)胞凝集 素蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，其中所述血細(xì)胞凝集素多肽是全長(zhǎng)血細(xì)胞凝集 素蛋白的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的傳感器芯片，其中所述血細(xì)胞凝集素多肽片段包含免疫顯性 血細(xì)胞凝集素表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，其中所述傳感器芯片適用于陣列成像反射測(cè)量 術(shù)(“AIR”)檢測(cè)系統(tǒng)、表面等離子體共振(“SPR”)檢測(cè)系統(tǒng)、Brewster角離散干涉測(cè)量 術(shù)(“BASI”)檢測(cè)系統(tǒng)或橢圓對(duì)稱法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，其中所述血細(xì)胞凝集素多肽通過(guò)戊二醛接頭結(jié) 合所述基板。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，其中各離散位置包含的血細(xì)胞凝集素多肽的濃 度為約 IOOfg/mm2 至約 100ng/mm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片，還包含與所述基板的所述表面上的離散位置結(jié) 合的多個(gè)神經(jīng)氨酸酶多肽，各神經(jīng)氨酸酶多肽包含神經(jīng)氨酸酶表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的傳感器芯片，其中所述神經(jīng)氨酸酶多肽是全長(zhǎng)神經(jīng)氨酸酶蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的傳感器芯片，其中所述神經(jīng)氨酸酶多肽是全長(zhǎng)神經(jīng)氨酸酶 蛋白的片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的傳感器芯片，其中所述神經(jīng)氨酸酶多肽片段包含免疫顯性 神經(jīng)氨酸酶表位。
12.—種檢測(cè)系統(tǒng)，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片；被定位以照射所述芯片的光源；以及檢測(cè)器，所述檢測(cè)器被定位以檢測(cè)從所述芯片表面反射的光線，從而測(cè)定抗體是否結(jié) 合所述血細(xì)胞凝集素多肽。
13.一種檢測(cè)系統(tǒng)，包含根據(jù)權(quán)利要求8所述的傳感器芯片；被定位以照射所述芯片的光源；以及檢測(cè)器，所述檢測(cè)器被定位以檢測(cè)從所述芯片表面反射的光線，從而測(cè)定抗體是否結(jié) 合所述血細(xì)胞凝集素多肽或神經(jīng)氨酸酶多肽。
14.一種流通池，包括具有入口和出口的基底；透光蓋，所述透光蓋以基本上流體密封的方式設(shè)置在所述基底上，并且和所述基底形 成隔室，通過(guò)所述隔室流體可以從所述入口流到所述出口 ；和根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器芯片；所述傳感器芯片位于所述隔室中，并且通過(guò)所述透光蓋暴露于入射光，從而用于以合適的入射角照射所述芯片表面的入射光在不存在結(jié)合 血細(xì)胞凝集素多肽的抗體的情況下實(shí)現(xiàn)幾乎完全相消干擾的條件。
15.一種檢測(cè)系統(tǒng)，包含 根據(jù)權(quán)利要求14所述的流通池；和所述流通池的所述入口流體連通的流體樣品源； 被定位以照射所述芯片的光源；以及檢測(cè)器，所述檢測(cè)器被定位以檢測(cè)從所述芯片表面反射的光線，其中所述照射光的所 述入射角適于產(chǎn)生下列條件在不存在結(jié)合血細(xì)胞凝集素多肽的抗體的情況下幾乎完全相 消干擾和在存在結(jié)合血細(xì)胞凝集素多肽的抗體的情況下光反射率的實(shí)質(zhì)性改變。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中(i)所述光源發(fā)射偏振光或(ii)所述系統(tǒng) 還包含至少一個(gè)偏振器，所述偏振器位于所述光源和所述芯片之間并位于從所述光源發(fā)射 的光程中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述光源使所述光線以非法線入射角導(dǎo)向覆層。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中(i)所述光源發(fā)射偏振光或(ii)所述系統(tǒng) 還包含至少一個(gè)偏振器，所述偏振器位于所述光源和所述芯片之間并位于從所述光源發(fā)射 的光程中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述光源使所述光線以非法線入射角導(dǎo)向覆層。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器是捕獲所述芯片表面的至少實(shí) 質(zhì)性部分的圖像的成像陣列。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器是捕獲所述芯片表面的至少實(shí) 質(zhì)性部分的圖像的成像陣列。
22.—種傳感抗-流感抗體的方法，該方法包括 提供根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的檢測(cè)系統(tǒng)； 在所述傳感器芯片表面處導(dǎo)向光線；在有效地允許樣品中的抗_流感抗體特異性結(jié)合被所述抗體識(shí)別的血細(xì)胞凝集素多 肽的條件下使所述傳感器芯片和樣品接觸；以及在有效地鑒定結(jié)合所述樣品的抗體的血細(xì)胞凝集素多肽的條件下檢測(cè)從所述芯片反 射的光線。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測(cè)通過(guò)AIR檢測(cè)系統(tǒng)、Sra檢測(cè)系統(tǒng)、 BASI檢測(cè)系統(tǒng)或橢圓對(duì)稱法來(lái)進(jìn)行。
24.一種傳感抗-流感抗體的方法，該方法包括 提供根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測(cè)系統(tǒng)；以有效地導(dǎo)致幾乎完全相消干擾的條件的方式在所述傳感器芯片處導(dǎo)向光線； 將流體樣品加入所述流通池； 測(cè)量從所述芯片反射的光線；以及基于所述測(cè)量的反射光，提供鑒定結(jié)合所述流體樣品的抗體的血細(xì)胞凝集素多肽的輸出ο
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述測(cè)量反射光還包括捕獲所述芯片表面的至 少實(shí)質(zhì)性部分的圖像。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述流體是水溶液。
27.—種篩選流感疫苗的效力的方法，包括 將流感疫苗施用至一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體；從所述一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體獲得血清樣品；以及進(jìn)行權(quán)利要求22所述的方法，以測(cè)量由所述流感疫苗產(chǎn)生的抗-流感免疫應(yīng)答。
28.—種篩選流感疫苗的效力的方法，包括 將流感疫苗施用至一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體；從所述一個(gè)或更多個(gè)個(gè)體獲得血清樣品；以及進(jìn)行權(quán)利要求M所述的方法，以測(cè)量由所述流感疫苗產(chǎn)生的抗-流感免疫應(yīng)答。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述樣品得自選自人和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、家畜、馴 化動(dòng)物以及野生動(dòng)物的個(gè)體。
30.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述樣品得自選自人和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、家畜、馴 化動(dòng)物以及野生動(dòng)物的個(gè)體。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述樣品得自選自人和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、家畜、馴 化動(dòng)物以及野生動(dòng)物的個(gè)體。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述樣品得自選自人和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、家畜、馴 化動(dòng)物以及野生動(dòng)物的個(gè)體。
全文摘要
一種用于檢測(cè)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的傳感器芯片，所述傳感器芯片包括具有表面的基板和與所述基板的表面上的離散位置結(jié)合的多個(gè)血細(xì)胞凝集素多肽，各血細(xì)胞凝集素多肽具有血細(xì)胞凝集素表位。本文還描述含有所述傳感器芯片的檢測(cè)裝置和檢測(cè)流感免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)G01N35/02GK102084252SQ200980125645
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月2日
發(fā)明者B·L·米勒, C·R·梅斯, D·托普漢, T·R·莫斯曼 申請(qǐng)人:羅切斯特大學(xué)