專利名稱：用于篩選具有增加受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的紅血球細(xì)胞剛性的能力的化合物的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于篩選具有增加受瘧原蟲(Plasmodium)屬原生動(dòng)物寄生蟲特別是 熱帶瘧原蟲(Plasmodium falciparum)感染的紅血球細(xì)胞(RBC)剛性的能力的化合物的方法。本發(fā)明還涉及用于過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常和特別是降低 的變形能力的RBC保留。所述方法可以，具體地，分離和/或檢測瘧原蟲感染RBC或與下述 疾病相關(guān)的異常RBC:后天或遺傳性球形紅細(xì)胞癥、敗血癥、血紅蛋白病(α或β地中海貧 血、鐮狀細(xì)胞疾病和鐮狀細(xì)胞性狀)、自免疫溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖 6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球酶)，和與來自患者的血液樣本的脾腫大有關(guān)的其 它紅血球細(xì)胞疾病，或體外分析患者的脾功能。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法的應(yīng)用，用于篩選選擇性地與受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄 生蟲感染的紅血球細(xì)胞相互作用并適合增加它們剛性的化合物。
背景技術(shù)：
瘧原蟲屬的原生動(dòng)物寄生蟲引起人和很多動(dòng)物種類中的疾病(瘧疾)。在人類 中，瘧疾主要由熱帶瘧原蟲、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)禾口間日皰原蟲(Plasmodium vivax)引起。熱 帶瘧原蟲是最主要的病因并且是所有瘧疾病例中約80 %病例的發(fā)病原因，并且還是人類瘧 疾死亡中約90%的病因。寄生蟲瘧原蟲還感染動(dòng)物，包括鳥、爬蟲和哺乳動(dòng)物，特別是猴、 猩猩和嚙齒動(dòng)物。由幾種瘧原蟲的猿猴種類，即諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲(Plasmodium inui)、食蟹猴皰原蟲(Plasmodium cynomomlgi)、似卵形皰原蟲(Plasmodium simiovale)、 巴西瘧原蟲(Plasmodium brazilianum)、許氏瘧原蟲(Plasmodium schwetzi)和吼猴瘧原 蟲(Plasmodium simium)引起的人類感染也已經(jīng)有記載。熱帶瘧原蟲首先感染肝臟，但是然后轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液，在其中擴(kuò)增并在紅血球細(xì)胞 (也稱作RBC、紅血球或紅細(xì)胞)中持續(xù)保持無性復(fù)制循環(huán)。在侵入紅血球細(xì)胞后，熱帶瘧 原蟲經(jīng)過連續(xù)的表型變化和幾輪有絲分裂。在約48小時(shí)后，受感染的紅血球細(xì)胞破裂并釋 放游離寄生蟲(裂殖體)，其或者侵入另一個(gè)紅血球細(xì)胞，或者快速(在半小時(shí)內(nèi))通過各 種機(jī)制離開血流。瘧疾的發(fā)病機(jī)理與多種寄生蟲和宿主因子有關(guān)^脾過濾和免疫功能對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)?型中瘧原蟲感染的過程有重要影響2’3。在瘧疾流行的國家中，脾切除術(shù)容易引起發(fā)燒、更頻 繁和更高的寄生蟲感染量(包括寄生蟲的循環(huán)成熟形式)，并且可能再次激活潛伏的瘧原 蟲感染4’5。除了相對(duì)較少的已發(fā)表數(shù)據(jù)(在5中進(jìn)行了綜述)，臨床醫(yī)生將瘧疾包括在證明 在脾切除非免疫患者中日益引起重視的感染性疾病名單中6。因?yàn)閯?dòng)物和人類瘧原蟲感染 之間的關(guān)鍵特征可能不同，并且因?yàn)槿祟惼⑴K的深入探索受到倫理和技術(shù)的限制7，所以僅對(duì)熱帶瘧原蟲感染紅血球細(xì)胞(iRBC)和人脾臟微循環(huán)結(jié)構(gòu)之間的精確相互作用進(jìn)行了間 接或通過驗(yàn)尸而進(jìn)行探索“1。因此，在人瘧疾期間推定的脾臟保護(hù)或發(fā)病作用下的機(jī)制主 要仍然是推測性的。人脾臟可以感受RBC變形能力中的適度變化，所述機(jī)制導(dǎo)致衰老或異常RBC的選 擇性生理保留/破壞"’48。在幾種病理狀態(tài)中，RBC保留與脾腫大相關(guān)。同樣的機(jī)制下，脾 切除術(shù)減輕了患有各種紅血球細(xì)胞疾病的患者中的貧血，所述疾病包括遺傳性球形紅細(xì)胞 癥，和遺傳的RBC疾病49。遺傳性球形紅細(xì)胞癥由RBC膜(包括其皮質(zhì)細(xì)胞骨架)的結(jié)構(gòu) 組織改變而表征，并且脾臟隔離是RBC(球形紅細(xì)胞)壽命減少的主要機(jī)制。遺傳性球形紅 細(xì)胞癥疾病的嚴(yán)重性與膜表面積的降低程度直接相關(guān)，并且因此導(dǎo)致變形能力的降低5°。通過其紅髓(RP)的特殊微循環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行RBC變形能力的脾臟特異性感應(yīng)。最廣 為人知的變形能力-感應(yīng)結(jié)構(gòu)是紅髓竇壁中的內(nèi)皮間間隙(IES)。這是動(dòng)態(tài)的0. 2-2μπι寬 (如同從人脾臟樣本的光學(xué)和超結(jié)構(gòu)顯微鏡圖片所估計(jì)的)，0. 5-3 μ m長的間隙，位于2個(gè) 串狀內(nèi)皮細(xì)胞之間，通過所述間隙，離開脾紅髓索的RBC必須經(jīng)過擠壓，到達(dá)竇腔和靜脈循 環(huán)"’21’51。IES可能是體內(nèi)最嚴(yán)緊的RBC變形能力-感應(yīng)結(jié)構(gòu)。為了穿過靜脈竇中狹窄的 IES，RBC經(jīng)過相當(dāng)程度的變形如果細(xì)胞不能充分變形，會(huì)保留在靜脈竇壁的上游“。期望 這種RBC-處理功能作用于RBC上寄生的瘧原蟲上12。RBC是熱帶瘧原蟲的主要宿主細(xì)胞(無性和有性紅細(xì)胞階段)52。裂殖子侵入RBC， 在其中發(fā)育48小時(shí)，然后產(chǎn)生新一代裂殖子。RBC內(nèi)部寄生蟲的發(fā)育導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜的改 變，表現(xiàn)為新結(jié)構(gòu)、功能和抗原性質(zhì)，其中有些性質(zhì)與罕見的嚴(yán)重?zé)釒Н懺x感染有關(guān)13’14。 根據(jù)廣泛接受的范例，熱帶瘧原蟲的RBC寄生無性形式(iRBC)在侵入后循環(huán)16-20小時(shí) (環(huán)狀階段)，然后在紅細(xì)胞循環(huán)內(nèi)的最后觀-32小時(shí)過程中隔離在脈管系統(tǒng)中(營養(yǎng)共生 和裂殖體階段)36。因此，環(huán)狀-iRBC是循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的主要熱帶瘧原蟲形式，與細(xì)胞粘附的 成熟-iRBC的組織隔離相反。成熟-iRBC的變形能力顯著下降，將導(dǎo)致在“經(jīng)典”血管床中 那些逃逸隔離的脾臟中保留15。此外，獲得自瘧疾患者血液，然后在活體外加熱僵化、標(biāo)記 并為相同患者重新注射的RBC(熱帶瘧原蟲感染RBC)，由脾臟快速清除39。在本上下文中，定量的脾循環(huán)框架是對(duì)于瘧疾發(fā)病原因一致理解的基本先決條 件。先前對(duì)朝向動(dòng)物中開放式循環(huán)的過濾床的脾血流的比例經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定從90% 16至10% "，確保指導(dǎo)對(duì)人的體內(nèi)探索。我們?cè)诒疚?和在54中)利用兩種概念上相關(guān)的方法健康志愿者的體內(nèi)成像，和 用培育的iRBC刺激活體外的人脾臟灌注系統(tǒng)，報(bào)道人脾臟生理和瘧疾發(fā)病原因的互補(bǔ)方 面。我們?cè)诒疚闹惺紫忍峁┤似⑴K內(nèi)雙室血液循環(huán)的體內(nèi)證明，慢室占流量的10%。體外 培養(yǎng)中超過50%的熱帶瘧原蟲環(huán)狀感染RBC (環(huán)狀)由離體-灌注的人脾臟保留，并沿著竇 壁的近端積累(即，內(nèi)皮間間隙的上游54)。我們表明，在每次脾臟傳代時(shí)，環(huán)狀-iRBC中先 前忽略的子群體中的10%保留在人脾RP的緩慢、開放式循環(huán)結(jié)構(gòu)中，最有可能的是通過機(jī) 械過程實(shí)現(xiàn)。這些結(jié)果揭示了環(huán)狀階段寄生蟲的不均勻性，并為由脾臟進(jìn)行的RBC過濾提 供新視角，為瘧疾患者中寄生蟲擴(kuò)增和RBC損失的控制帶來曙光。不同于攜帶未成熟配子體的RBC-其為固著的-攜帶成熟配子體的RBC (后文稱作 成熟配子體)在外周血液中循環(huán)53。因?yàn)槌墒炫渥芋w循環(huán)，所以可為嗜血的瘧蚊所利用。當(dāng) 成熟配子體包含于瘧蚊的血液大餐中時(shí)，會(huì)啟動(dòng)寄生蟲有性階段的完全發(fā)育，這是由熱帶瘧原蟲傳播到其他人類所必需的步驟。因此，人外周血液中RBC寄生環(huán)或成熟配子體的存在是脾臟中具有這些熱帶瘧原 蟲發(fā)育階段的RBC部分同時(shí)保留或不同時(shí)保留的指示。RBC變形能力(和脾中RBC的保留)依賴(至少)3個(gè)因素膜粘彈性、細(xì)胞質(zhì)粘 性，和細(xì)胞的幾何尺度，其標(biāo)志是表面積與體積的比例28’5°?？梢愿鶕?jù)有/沒有同滲容摩變 化(激光衍射計(jì)，Lorca)時(shí)的切應(yīng)力下RBC群體的伸長指數(shù)估計(jì)RBC變形能力50。經(jīng)過過 濾膜的時(shí)間也可以在群體水平反映RBC變形能力。因此這些工具的應(yīng)用限于研究占全部的 比例小于10%的子群體(最常見的是臨床或培育樣品中的Pf-iRBC)。在先技術(shù)中公開的 微量吸管和微流體設(shè)備可以測量RBC在有限表面上變形或者流過狹窄如1 μ m(但是通常> 5μπι長)的通道的能力55。因?yàn)樗鼈兊淖x數(shù)是在單細(xì)胞水平，所以這些工具不適用于大型 (> IO3細(xì)胞)RBC群體的快速分析。因?yàn)橥ㄟ^現(xiàn)有工具不能適當(dāng)?shù)啬MRBC和Pf-iRBC體 內(nèi)通過IES時(shí)的罕見變形，所以沒有經(jīng)過驗(yàn)證的、能預(yù)測脾保留的RBC變形能力的標(biāo)志-包 括嚴(yán)緊的“內(nèi)皮間間隙通過刺激”。本發(fā)明通過提供用于過濾RBC的方法克服了上述困難，所述方法使過濾單元中具 有異常特別是降低的變形能力的RBC保留。本方法能用于從來自患者的血液樣本檢測瘧原 蟲感染RBC或變形能力改變的RBC (例如球形紅細(xì)胞)的存在，或者用于患者脾生理狀況的 體外分析。此外，可以從珠層取得僵化的RBC，在細(xì)胞、子細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步比較分析，所 述分析用不同子群體進(jìn)行。還易于自動(dòng)化，并允許進(jìn)行僵化RBC的清除和濃縮，在遺傳或后 天的RBC疾病中具有廣泛的潛在實(shí)驗(yàn)和醫(yī)療應(yīng)用。


圖1 人脾軟細(xì)胞組織中血液循環(huán)的超聲分析。(a)接收Sonovue微 氣泡恒定灌注的人志愿者的脾中超聲信號(hào)強(qiáng)度的增強(qiáng)。(bl)對(duì)子囊區(qū)域[(a)中的白 線]信號(hào)強(qiáng)度在超聲誘導(dǎo)下的降低43研究了 >8秒。用雙指數(shù)曲線(TC)獲得了對(duì)于 得到的實(shí)驗(yàn)信號(hào)-時(shí)間曲線(EC)的最佳擬合，如同這個(gè)典型實(shí)例所示(在全部16個(gè) 志愿者中，關(guān)聯(lián)系數(shù)R2> 0.96)。(b2)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的雙指數(shù)數(shù)學(xué)模型N(t)= V1 (C0Oexp (- β…)+V2 (B+ (C0-B) exp (- β )的圖示，其中第一和第二項(xiàng)分別對(duì)應(yīng)于慢室和 快室。(c)源自這些觀察的人脾軟組織細(xì)胞中血液循環(huán)的示意圖。圖2 通過離體-灌注的人脾清除iRBC。(a)在用離體-灌注人脾的6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 之一的120分鐘灌注過程中，熱帶瘧原蟲FUP裂殖體-iRBC( Δ )和環(huán)狀_iRBC(·)的寄生 蟲感染量(全部6個(gè)實(shí)驗(yàn)如圖7al-6所示)。(b)末端實(shí)驗(yàn)脾樣本的透射電鏡，表示紅髓竇 內(nèi)腔(SL，bl)中有結(jié)節(jié)的裂殖體-iRBC[S，bl-2，(橫杠=1) (b2，箭頭)，和索(Co，bl)中 的無結(jié)節(jié)環(huán)狀iRBC(R，bl-3)。保留的環(huán)狀-iRBC的另一個(gè)實(shí)例如圖4所示(dl_2)。圖3 在“循環(huán)”和“循環(huán)-再循環(huán)”實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)狀-iRBC清除的模擬。發(fā)現(xiàn)兩個(gè) 環(huán)狀-iRBC子群體。(a)灌注液中環(huán)狀-iRBC寄生蟲感染量的模擬，通過理論實(shí)例由圖形 闡述沒有殘留寄生蟲感染量的單室(al)、沒有殘留寄生蟲感染量的雙室(a2，直線對(duì)應(yīng)于 雙指數(shù)曲線，虛線對(duì)應(yīng)于單指數(shù)曲線)，和有殘留寄生蟲感染量的單室(平臺(tái)期，a3)。根據(jù) 赤池信息準(zhǔn)則(AIC)、參數(shù)評(píng)價(jià)的變異性(VC) (AIC和VC值越小，模型越差)和測量濃度和 預(yù)測濃度之間權(quán)重差相對(duì)于時(shí)間的隨機(jī)分布，評(píng)價(jià)擬合程度和估計(jì)的參數(shù)。個(gè)體數(shù)值如表1 所示。對(duì)于雙室模型和有殘留寄生蟲感染量的1-室模型，AIC低于沒有殘留寄生蟲感染量的單室模型。然而，對(duì)于雙室模型，第二個(gè)半衰期參數(shù)的變異系數(shù)不顯著(> 100%)。所 以，有殘留寄生蟲感染量的單室模型是最好的模型。(b) “循環(huán)-再循環(huán)”實(shí)驗(yàn)。將為脾刺 激制備的部分iRBC和RBC群體(“脾原初”群體)在灌注培養(yǎng)基中保持在37°C，而其它部 分灌注脾臟。(bl)灌注開始四十分鐘后，從循環(huán)灌注液獲得iRBC和RBC( “脾傳代”群體， bl)。使用PKH46或PKH-76差異標(biāo)記兩個(gè)群體，然后合并并在初始灌注步驟后110-120分 鐘重新引入灌注液。使用流式細(xì)胞儀建立的每個(gè)iRBC子群體的清除動(dòng)力學(xué)，表明清除了脾 “原初”環(huán)狀-iRBC，同時(shí)先前進(jìn)行約40次脾傳代的iRBC則沒有清除?！捌⒃酢比后w動(dòng)力 學(xué)的最差的模型還是有殘留寄生蟲感染量的單室。來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均(個(gè)體數(shù)值) AIC和半衰期與前面6個(gè)“循環(huán)”實(shí)驗(yàn)( )觀察的結(jié)果相似。對(duì)于“脾傳代”群落的最差模 型是沒有清除的殘留寄生蟲感染量(參見表1)。圖4 人脾中熱帶瘧原蟲iRBC沉積的分析。(al-2)對(duì)于環(huán)狀_iRBC(R，PFZ中，RP 中)、裂殖體-iRBC(S，PFZ中，RP中)或紅細(xì)胞外寄生蟲剩余(EER，PFZ中，RP中)毛囊周 區(qū)域(PFZ)或紅髓(RP)中的平均(SEM) iRBC數(shù)目/100個(gè)RBC (來自6個(gè)離體灌注人脾實(shí) 驗(yàn)的平均值，吉氏染色部分，WP =白髓，橫杠=50_m)。每個(gè)寄生蟲發(fā)育階段的典型方面如 插入部分所示(中間柱)。(a3)PFZ或RP中環(huán)狀-iRBC (R)或裂殖體_iRBC(Q的保留指數(shù) [RI= (a2中的“iRBC數(shù)目/100RBC”/(相應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘难h(huán)寄生蟲感染量)]。保留至少 為1(黑色斷線)對(duì)應(yīng)于沒有保留。(bl-2)與al-2中相同的方法，但是使用PAS-染色(a =主動(dòng)脈)。(cl)紫色PAS-染色部分(橫杠=5 μ m)，表示紅髓靜脈竇的基底膜。脾髓中 RBC沉降的工作分類在竇內(nèi)腔(SL)中，在與竇壁基底膜直接接觸的索中(索近腔，CoA), 或者在不接觸基底膜的索中(嚴(yán)格意義上的索，Co)。(W)使用cl中定義的RP中RBC沉 積的工作分類，對(duì)于環(huán)狀iRBC的保留指數(shù)。(dl-d2)人離體-灌注脾樣本的透射電鏡，分 別表示內(nèi)皮間間隙(黑箭頭)上游和下游的環(huán)狀iRBC(白星形)和未感染RBC(黑星形)。 這種布局反映了紅髓中RBC從索(Co)到竇內(nèi)腔(SL)的循環(huán)。環(huán)狀iRBC的無結(jié)節(jié)基底膜 與竇壁基底膜(白箭頭)非常接近。對(duì)于圖a、b和c :*、**、#分別表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差 異，ρ < 0. 05，ρ <= 0. 01，ρ < 0. 0001。圖5 :iRBC的變形能力。(a)在不同切應(yīng)力測量的紅血球細(xì)胞的伸長指數(shù)(EI) (al-2)。(U)在30帕斯卡增加寄生蟲感染量時(shí)培育的環(huán)狀iRBC和裂殖體iRBC的EI (4個(gè) 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD))。在100%寄生蟲感染量時(shí)環(huán)狀iRBC的外推EI的平 均值[95%置信區(qū)間(Cl)]是0.47 W. 43-0. 51]。(b)在灌注末期處理的脾樣本的掃描電 鏡。竇壁的腔內(nèi)視圖，顯示內(nèi)皮細(xì)胞典型的串狀方面，其中含突入竇內(nèi)腔的核(N)。細(xì)胞從 內(nèi)皮間間隙生出(箭頭，橫杠=3μπι)。左上方四方形擠壓通過內(nèi)皮間間隙的RBC的顯著 變形。圖6 在灌注人脾的快和慢循環(huán)腔室中的熱帶瘧原蟲感染RBC。使用由人志愿者體 內(nèi)成像提取的循環(huán)特征為框架(圖1)，用培育的iRBC刺激活體外人脾臟模型中觀察結(jié)果 的示意圖(參見圖2-幻。環(huán)狀和裂殖體iRBC的主要表型特征不同，環(huán)狀-iRBC在體外未 表現(xiàn)出細(xì)胞粘連性質(zhì)，并且沒有可見的表面修飾。在快室中，對(duì)應(yīng)于組織切片上的濾泡周圍 區(qū)域，只保留了裂殖體-iRBC，而環(huán)狀和裂殖體-iRBC都保留在慢室中，對(duì)應(yīng)于紅髓(b)。這 導(dǎo)致顯著不同的清除率。流向慢室的血液比例(10.2% )和在相同的腔室中保留的可保留 環(huán)狀-iRBC的比例(11%)之間的相似性是驚人的。脾微循環(huán)框架的量化尺度很重要。因?yàn)椋?%的心輸出量去往脾，指定的RBC將每20分鐘進(jìn)入脾臟一次。慢室僅占脾血漿流的 10%，相當(dāng)于脾紅血球細(xì)胞流的10-20% (依賴于血漿撇取效應(yīng)的強(qiáng)度“)。因此，指定RBC 的變形能力的性質(zhì)控制每100-200分鐘發(fā)生一次。這與健康對(duì)照中先前觀察到的僵化的加 熱RBC 60分鐘的半衰期相吻合％。這些先前臨床觀察的數(shù)量級(jí)與我們的框架完美吻合。圖7 (al-6)在120分鐘灌注過程中灌注液中熱帶瘧原蟲FUP裂殖體_iRBC( Δ三 角)和環(huán)狀_iRBC( ·圓點(diǎn))的寄生蟲感染量(6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。圖8. (a)使用來自成年非洲患者的超免疫血清池(1/100稀釋)，對(duì)于為實(shí)驗(yàn)制 備的培育裂殖體-iRBC(al)和環(huán)狀_iRBC(a2)群體進(jìn)行的表面免疫熒光，并用Hoechst 計(jì)數(shù)染色。典型的吉氏染色部分如插入部分所示。大多數(shù)裂殖體-iRBC可強(qiáng)烈染色，而 環(huán)狀-iRBC未染色(橫杠=ΙΟμπι)。(U)來自表面碘化的培育裂殖體-iRBC(Q和環(huán) 狀-iRBC(I )的Triton-SDS提取物的PAGE自動(dòng)放射攝影。僅在裂殖體-iRBC提取物中觀 察到正確地對(duì)應(yīng)于PfEMPl的^OkDa條帶(箭頭)。圖9.能夠用于篩選可增加熱帶瘧原蟲環(huán)狀感染RBC的剛性的化合物的實(shí)驗(yàn)步驟 示意圖。圖10.用多孔通道膜進(jìn)行的重力驅(qū)動(dòng)過濾常用裝置和實(shí)驗(yàn)步驟。1.將柱充滿過 濾培養(yǎng)基(補(bǔ)加4%白蛋白和5%Plasmion 的RPMI，或補(bǔ)加人白蛋白的PBS) ；2.過 濾前將過濾單元(包含補(bǔ)加溶解白蛋白的懸浮培養(yǎng)基)阻斷10分鐘；3.將樣品(過濾培 養(yǎng)基中血細(xì)胞比容為2% -2. 5% )載入柱；4.過濾步驟；5.從過濾單元的上游和下游取得 樣本；6.處理樣本用于Pf-iRBC濃度和紅血球溶解的定量。圖11.多孔通道膜過濾。A-C，E.使用的過濾單元；A.使用的聚碳酸酯膜的類型； B.膜模具；C.膜；E.與柱連接的過濾單元(不斷過濾)；D.在穿過Merlitech。聚碳酸酯 膜時(shí)RBC的理論性狀改變；F.在分別通過2和3 μ m寬通道連接的膜下游的樣本的上清液 顏色。2 μ m樣本表現(xiàn)出溫和至中等的紅血球溶解。圖12和13.珠層過濾。A.珠來源；B.用于保持珠層的吸頭(Barrier吸頭1000 ； Neptune) ；C.在傾析前(Cl)和傾析后((^)用尺度減小的珠載入吸頭；D.吸頭中珠層的示 意圖；E. 7-mm 5_25珠層的圖。圖14和15.通過自然和人工內(nèi)皮間間隙時(shí)RBC的形狀變化。圖14. Al.脾紅髓中的索(Co)和竇內(nèi)腔(si) ；A2-3.在通過竇壁時(shí)RBC發(fā)生擠壓 (箭頭)(離體-灌注人脾的吉氏染色涂片)。B和C.在離體-灌注人脾中從索到竇內(nèi)腔 通過內(nèi)皮間間隙時(shí)RBC發(fā)生擠壓(箭頭)(投射和掃描電鏡)。D1-2.通過聚碳酸酯膜通道 (Dl)或珠間空間(D2)時(shí)RBC擠壓的示意圖。圖15. A.在人脾紅髓中的內(nèi)皮間間隙觀察到的RBC和內(nèi)皮細(xì)胞(EC;虛線)的形 狀(透射電鏡)；B.在珠間空間(相同尺寸的珠的混合物)中最窄處的最大直徑的幾何計(jì)
笪弁。圖16.用于過濾的注射密封回路參照方法-原理。圖17.用于過濾的注射密封回路參照方法-三次過濾的裝置。1.具有控制屏幕的 電子注射泵(從左到右)，可顯示流量(ml/分鐘)、終體積(ml)和壓力；2. 3-三通管；3.過 濾膜(箭頭)；4.收集管。圖18.基于離心的過濾。1. Eppendorf管中過濾單元的裝置；2.離心前過濾單元中的上游樣本；3.離心機(jī)中的過濾單元和Eppendorf管；4.第一輪離心結(jié)束時(shí)的過濾單元； 5.第一輪離心結(jié)束后的收集管(下游樣本)。圖19.用于定量寄生蟲感染量的基于液相熒光的方法-熒光強(qiáng)度和寄生蟲感染量 之間的線性關(guān)聯(lián)，如根據(jù)吉氏染色涂片或液相熒光所平行確定的。對(duì)10%寄生蟲感染量的 培育樣品進(jìn)行梯度2倍稀釋的三次重復(fù)分析。圖20.用于定量寄生蟲感染量的基于液相熒光的方法-基于吉氏染色和基于熒光 對(duì)寄生RBC濃度降低(或增加)的估計(jì)值之間的線性關(guān)聯(lián)。上游到下游(下半部)或上游 到珠層(上半部)分析。X軸過濾器中的保留率，如根據(jù)吉氏染色涂片所估計(jì)的；Y軸過 濾器中的保留率，如通過熒光所估計(jì)的。圖21.來自圖20中用于定量寄生蟲感染量的基于液相熒光的方法的子部分-上 游到下游保留率的詳細(xì)分析，確證寄生蟲階段對(duì)于過濾器中保留具有強(qiáng)烈依賴性。X軸過 濾器中的保留率，如根據(jù)吉氏染色涂片所估計(jì)的；Y軸過濾器中的保留率，如通過熒光所 估計(jì)的。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及篩選能增加受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的紅血球 細(xì)胞(RBC)剛性的化合物的方法，所述方法包括或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，并可選地和單獨(dú)地培育未感染RBC，每種培育均 在存在和不存在待測試化合物的情況下進(jìn)行，其中測試化合物增加且具體為選擇性增加受 感染RBC(iRBC)的剛性的能力，和；b)測定在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力，和不存 在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，c)可選地，測量在存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力， 和不存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下 培育的iRBC的變形能力下降至少5%，優(yōu)選至少10%，并且更優(yōu)選至少15% (具體地，剛性 增加至少5%，優(yōu)選至少10%，并且更優(yōu)選至少15% )，則表明所述化合物能增加iRBC的剛 性。在具體的實(shí)施方案中，所述篩選方法包括或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，并可選地和單獨(dú)地培育未感染RBC，每種培育 均在存在和不存在待測試化合物的情況下進(jìn)行，其中測試化合物增加且具體為選擇性增加 iRBC剛性的能力，和；b)測定下述的變形能力-在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC，-不存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC，-在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC，和-不存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下 培育的iRBC的變形能力下降至少5%，優(yōu)選至少10%，并且更優(yōu)選至少15%，則表明所述化 合物能增加iRBC的剛性。本文使用的“化合物”可以是任何化學(xué)化合物、免疫球蛋白(Ig)、多肽、肽，或其它能增加iRBC剛性的生物治療劑?；瘜W(xué)試劑，在本領(lǐng)域中指“小分子”化合物，其通常是有機(jī)、 非肽分子，分子量最高10，000，優(yōu)選最高5000，更優(yōu)選最高1000，并且最優(yōu)選最高500道爾 頓?？梢允褂靡阎椒óa(chǎn)生Ig，并且Ig可以是示例性多克隆、單克隆、人化或嵌合抗體、單 鏈抗體或Fab片段?！半摹被颉岸嚯摹笔莾蓚€(gè)或更多氨基酸(“肽”是2-20個(gè)氨基酸，而“多 肽”是多于20個(gè)氨基酸)的任何鏈，包括天然發(fā)生或非天然發(fā)生的氨基酸殘基和氨基酸殘 基類似物，無論是否進(jìn)行翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)。這種化合物可以從任何合 適的來源獲得或者由任何合適的來源產(chǎn)生，無論來源是否天然。只要適當(dāng)，可以通過任何化 學(xué)或生物合成技術(shù)合成所述化合物。根據(jù)特定的實(shí)施方案，篩選化合物庫。具體地，可以篩選來自Sanofi Aventis的庫。根據(jù)特定的實(shí)施方案，篩選的化合物能與包括其皮質(zhì)細(xì)胞骨架的RBC膜(至少包 括其皮質(zhì)細(xì)胞骨架的iRBC膜)相互作用和/或進(jìn)入RBC (至少進(jìn)入iRBC)，特別是穿過RBC 的脂雙層(至少是iRBC脂雙層)，或者與修飾的脂雙層本身相互作用。根據(jù)特定的實(shí)施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與iRBC相互作 用。通過“選擇性地與iRBC相互作用”，在本文表示篩選的化合物與iRBC相互作用并增加其 剛性，而不增加未感染RBC并優(yōu)選其它類型細(xì)胞的剛性。這意味著人們篩選在化合物存在 的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感染RBC 的變形能力相同或者相差小于5%。在特定的實(shí)施方案中，通過“iRBC”，或“瘧原蟲感染iRBC”，在本文表示環(huán) 狀-RBC (或環(huán)狀-宿主RBC)和/或配子體-宿主RBC，特別是成熟配子體-宿主RBC。根據(jù)特定的實(shí)施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與環(huán)狀-iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用。通過“選擇性地與環(huán)狀-iRBC 和/或配子體-宿主RBC相互作用”，在本文表示篩選的化合物與環(huán)狀-iRBC和/或配子 體-宿主RBC相互作用并增加其剛性，而不增加未感染RBC和優(yōu)選其它類型細(xì)胞的剛性。這 意味著人們篩選(1)在化合物存在的情況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存 在化合物的情況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力相同或者相差小于5%，和(ii)在化合 物存在的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感 染RBC的變形能力相同或者相差小于5%。根據(jù)特定的實(shí)施方案，篩選的化合物通過增加其剛性而選擇性地與環(huán)狀-iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用。通過“選擇性地與環(huán)狀-iRBC 和/或配子體-宿主RBC相互作用”，在本文表示篩選的化合物與環(huán)狀-iRBC和/或配子 體-宿主RBC相互作用并增加其剛性，而不增加配子體階段iRBC(配子體-iRBC)的剛性，也 不增加未感染RBC和優(yōu)選其它類型細(xì)胞的剛性。這意味著人們篩選(1)在化合物存在的情 況下培育的裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的裂殖體-iRBC 的變形能力相同或者相差小于5%，和(ii)在化合物存在的情況下培育的未感染RBC或其 它類型細(xì)胞的變形能力，其與在不存在化合物的情況下培育的未感染RBC或其它類型細(xì)胞 的變形能力近似相同或者相差小于5%。通過“增加iRBC剛性的能力”，在本文表示將iRBC剛性增加至少5%，優(yōu)選至少 10%和更優(yōu)選至少15%的能力?；衔镌黾觟RBC剛性的能力可以特別地通過測量在所述
13化合物存在和不存在的情況下培育的iRBC變形能力而評(píng)價(jià)。因此，根據(jù)特定的實(shí)施方案， “增加剛性”表示“降低變形能力”和特別地“將變形能力降低至少5%，優(yōu)選至少10%和更 優(yōu)選至少15%”。通過“由瘧原蟲屬的原生動(dòng)物寄生蟲感染”，在本文表示包含至少一種瘧原蟲屬的 寄生蟲[即，所述原生動(dòng)物寄生蟲的子細(xì)胞，其是無性繁殖的結(jié)果]的紅血球細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，寄生蟲選自下足熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日 瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似蛋形瘧原蟲、巴西瘧原蟲、許氏瘧原 蟲和吼猴瘧原蟲，優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾氏瘧原蟲和三日 瘧原蟲，和更優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲。在特定的實(shí)施方案中，所述寄生蟲是熱帶瘧原蟲，具體為熱帶瘧原蟲的I^lo Alto I菌株。根據(jù)特定的實(shí)施方案，寄生蟲，特別是包含感染RBC的裂殖體已發(fā)育成為環(huán)狀；因 此，所述感染RBC處于環(huán)狀階段。具體地，可以收集新鮮的環(huán)狀-感染RBC (環(huán)狀-iRBC)，即 少于14小時(shí)的環(huán)形-iRBC，少于8天或者8天的RBC (優(yōu)選少于8天的RBC)。可替換地或者漸漸地，RBC可以是配子體-宿主RBC，并且優(yōu)選成熟配子體-宿主 RBC?？梢酝ㄟ^在發(fā)育瘧原蟲寄生蟲時(shí)人工同步化而篩選環(huán)狀-iRBC和/或配子體-宿 主RBC。本領(lǐng)域中已知幾種方法，例如使用山梨醇或甘露醇處理；用5%山梨醇處理iRBC (例 如37°C 5分鐘)引起包含晚期在內(nèi)的iRBC裂解，并且優(yōu)先篩選早期環(huán)狀階段的iRBC?？?以重復(fù)處理(至少兩次，例如，2、3、4或5次或者多于5次)，例如在34小時(shí)后，以進(jìn)一步篩 選早期階段并促進(jìn)同步化。其它技術(shù)包括分離晚期階段寄生蟲，例如在Plasmagel或結(jié)冷 膠中沉降。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的篩選方法的步驟a)后面進(jìn)行iRBC培育物的 同步化的步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，RBC(未感染和/或感染RBC)是人RBC。還可以使用來自靈長 類猿猴的RBC，但是更優(yōu)選使用人RBC。所有血型的人RBC都適合于瘧原蟲生長，并且特別 適合于熱帶瘧原蟲生長。0型RBC特別適用，因?yàn)樗鼈兣c所有其它血型的人血清或血漿相容。進(jìn)行的篩選可以是低通量篩選或高通量篩選?？商鎿Q地，本發(fā)明的篩選方法可以 包括低通量篩選的一個(gè)或幾個(gè)步驟和高通量篩選的一個(gè)或幾個(gè)步驟。可以將RBC或iRBC變形能力定義為在微循環(huán)期間不破裂或損失完整性而發(fā)生充 分變形的能力，和承受動(dòng)脈循環(huán)切應(yīng)力的能力。因此，RBC和iRBC變形能力的測量是表型測量?？梢栽谌后w細(xì)胞水平和/或個(gè)體 細(xì)胞水平進(jìn)行。因此，本發(fā)明的篩選方法包括在群體細(xì)胞水平變形能力分析的一個(gè)或幾個(gè) 步驟和/或在個(gè)體細(xì)胞水平變形能力分析的一個(gè)或幾個(gè)步驟。為了評(píng)價(jià)iRBC的變形能力，并且特別是評(píng)價(jià)環(huán)狀-iRBC和/或配子體-宿主RBC 的變形能力，通常在37°C或38°C，在RPMI 1640培養(yǎng)基或補(bǔ)加的RPMI 1640培養(yǎng)基中培育 RBC和iRBC，比如完全培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基、碳酸氫鹽、25mM谷氨酰胺、0. 2%葡萄糖、 100 μ M次黃嘌呤、10 μ g/ml慶大霉素和10% AB+未活化人血清池)。此外，這些細(xì)胞優(yōu)選 在低氧壓力(低PO2)條件(通常為1-5% O2)中培育，例如，在02、3% 0)2和96% N2的氣氛下培育。RBC和iRBC可以培育0. 1至10小時(shí)，優(yōu)選1至6小時(shí)，并且更優(yōu)選1至3小時(shí)，例 如用待測試化合物培育1、2或3小時(shí)。因此，在本發(fā)明的篩選方法中，步驟b)在步驟a)之 后可以進(jìn)行0. 1至10小時(shí)，優(yōu)選1至6小時(shí)，并且更優(yōu)選1至3小時(shí)，例如1、2或3小時(shí)。通常在(i)去除培育物上清液(例如通過在1500轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘)和(ii) 將細(xì)胞團(tuán)在白蛋白的PBS溶液或白蛋白的RPMI溶液中重懸后進(jìn)行變形能力分析。已經(jīng)提出了測量RBC變形能力中的各種技術(shù)，特別是激光衍射術(shù)、檢電術(shù)、微流 體、微量吸管吸引術(shù)和光鉗的使用。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過檢電器、激光衍射器、微 流體設(shè)備(特別是毛細(xì)管微流體系統(tǒng))、微量吸管和/或光鉗測量RBC和iRBC的變形能力。激光衍射器在各種切應(yīng)力水平下使用激光衍射分析。這種技術(shù)與其它技術(shù)相比有 幾點(diǎn)優(yōu)勢，它的操作相對(duì)簡單，具有可接受的精確度，能在各種切應(yīng)力操作，并且能使用極 小量的血液(少于50 μ 1)快速測量細(xì)胞變形能力。自動(dòng)化的激光衍射器市場有售。在本 發(fā)明的篩選方法中可以使用的模型包括LORCA(激光輔助光旋細(xì)胞分析儀；Mechatronics， Hoorn, Netherlands)和 RHEODYN-S SD(Myrenne, Roetgen, Germany)。激光衍射器使用激 光衍射儀和圖像分析，通過測定流體切應(yīng)力下細(xì)胞的伸長指數(shù)值而提供對(duì)細(xì)胞變形能力的 測量。處理RBC以增加切應(yīng)力并記錄通過懸浮液時(shí)的激光衍射模式。隨著切應(yīng)力值增加， 激光衍射模式從圓形變成橢圓形。根據(jù)這些測量結(jié)果，可以獲得細(xì)胞的伸長指數(shù)。根據(jù)特定的實(shí)施方案，用于測量RBC和iRBC變形能力的激光衍射器是商業(yè)旋轉(zhuǎn)類 型的激光衍射器，L0RCA。使用這種激光衍射器，將RBC的粘性懸浮液在兩個(gè)同軸圓柱體之 間剪切。如實(shí)例部分所示，一個(gè)圓柱體的旋轉(zhuǎn)引起RBC的變形(伸長)。用攝像機(jī)檢測激光 束衍射模式并通過計(jì)算機(jī)將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字值，伸長指數(shù)(EI)，而進(jìn)行分析。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，并且特別是當(dāng)使用激光衍射器時(shí)，參照伸長指數(shù)(EI) 進(jìn)行變形能力的測量。這種度量，其通常定義為橢圓體衍射模式的兩個(gè)軸之間的差和這兩 個(gè)軸的和的比例，通常使用橢圓擬合程序根據(jù)衍射模式中的強(qiáng)度曲線而確定。在群體細(xì)胞 水平分析變形能力時(shí)，用于測量RBC變形能力的技術(shù)經(jīng)常得到平均值的指標(biāo)。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，并且特別是當(dāng)使用激光衍射器時(shí)，RBC和iRBC的變形 能力，并且通常是伸長指數(shù)，通常在0至35帕斯卡(Pa)的切應(yīng)力范圍內(nèi)測量，優(yōu)選0.3至 30Pa,例如1. 7Pa至30Pa,并且特別是在1. 7Pa和/或30Pao根據(jù)特定的實(shí)施方案，iRBC的寄生蟲感染量水平為細(xì)胞群體的至少20%或30%， 優(yōu)選細(xì)胞群體的至少50%，和更優(yōu)選細(xì)胞群體的至少70%。通過“寄生蟲感染量(parasitemia)”，指用培育物中包含至少一個(gè)環(huán)狀或配子體 的RBC的百分比表示的寄生蟲的數(shù)量含量?？梢杂?jì)數(shù)寄生蟲的數(shù)量，例如，使用光學(xué)顯微 鏡，在薄血液圖片(對(duì)于高寄生蟲感染量)或厚血液斑點(diǎn)(對(duì)于低寄生蟲感染量)上計(jì)數(shù)。通常，并且特別是在群體細(xì)胞水平測量RBC和iRBC變形能力的時(shí)候(例如當(dāng)使用 激光衍射器時(shí))，在不同寄生蟲感染量(至少兩個(gè)不同寄生蟲感染量)測量EI，例如對(duì)于環(huán) 狀-iRBC為4%至76%寄生蟲感染量，并且外推至100%寄生蟲感染量。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)于在存在待測試化合物的情況下培育的iRBC，在外推至 100%寄生蟲感染量時(shí)，在30 ，低于0. 43的EI，更優(yōu)選低于0. 42的EI，則表明所述化合物 能增加iRBC剛性。
通過用iRBC的培育物，特別是用包含裂殖體階段的iRBC的培育物感染(或再 次感染)所述RBC可以在RBC(未感染或已經(jīng)感染的RBC)的培育物中誘導(dǎo)或增加寄生蟲 感染量?？梢詫⒘阎丑w階段的iRBC富集在iRBC培育物中，例如通過懸浮在凝膠狀溶液 (plasmion 處理)中或通過本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)，特別是使用細(xì)胞分離液梯度。根據(jù)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的篩選方法的步驟a)中使用的iRBC群體已經(jīng)通過 用iRBC培育物，并且特別是其中例如通過plasmion 處理已經(jīng)富集了裂殖體階段iRBC的 培養(yǎng)物，感染未感染RBC，特別是新鮮的未感染RBC( S卩，小于8天或8天的RBC，優(yōu)選小于8 天的RBC)。因此在特定的實(shí)施方案中，使用僅用于培育而不進(jìn)行任何其它處理的iRBC測量 變形能力。因此，根據(jù)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的篩選方法包括或由下述步驟組成1)富集iRBC培育物中的裂殖體階段iRBC，例如通過plasmion 處理或通過本領(lǐng) 域中已知的任何其它技術(shù)富集；2)用步驟1)的裂殖體富集iRBC培育物感染RBC，特別是新鮮RBC( S卩，小于8天 或8天的RBC，優(yōu)選小于8天的RBC)(這第二步可以獲得環(huán)狀階段的iRBC)；3)培育步驟2、獲得的iRBC，并且，可選地和單獨(dú)地培育未感染RBC，每種培育均在 存在和不存在待測試化合物的情況下進(jìn)行，所述化合物用于測試其增加iRBC剛性的能力， 和；4)測量在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC和在不存在所述化合 物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，5)可選地，測量在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC和在不 存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC的變形能力相比，在存在化合 物的情況下培育的iRBC的變形能力降低至少5 %，優(yōu)選至少10 %，并且更優(yōu)選至少15 %，則 表明所述化合物能增加iRBC的剛性。這種篩選方法的實(shí)例在實(shí)例部分中給出(參見實(shí)例B)。此外，在上述特定的實(shí)施方案中，iRBC培育物的寄生蟲，特別是裂殖體富集的 iRBC培育物的寄生蟲可以通過本領(lǐng)域任何已知的方法同步化，特別是通過本文所引用的任 何同步化方法，例如通過一次或幾次0、3、4或5或多于5次)山梨醇處理。所述同步化步 驟或至少一個(gè)同步化步驟優(yōu)選在裂殖體-富集步驟前進(jìn)行。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的篩選方法進(jìn)一步包括用離體灌注人脾模型和/或離 體灌注豬脾模型確認(rèn)篩選的化合物的步驟。所述進(jìn)一步的步驟通常在變形能力分析的步驟 后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，在上文公開的篩選方法中，使用本文定義的用于過 濾RBC的方法進(jìn)行RBC或iRBC變形能力的測量，優(yōu)選參照RBC或iRBC保留率或保留比例 (如后文所述)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的篩選方法的應(yīng)用，用于篩選選擇性地與iRBC相互作用或 選擇性地與環(huán)狀-iRBC相互作用和或與配子體-宿主RBC(特別是與成熟配子體-宿主RBC) 選擇性地相互作用并適合增加其剛性的化合物。本發(fā)明還涉及用于過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常具體為降低的變形能力的RBC保留，所述方法包含或由下述步驟組成a)使包含RBC的樣品流過過濾單元；和b)取得流過過濾單元之前所述樣本的等分試樣(上游等分試樣)和流過過濾單元 之后所述樣本的等分試樣(下游等分試樣)；和c)可選地取得已經(jīng)在過濾單元中保留的RBC (保留等分試樣)；和d)可選地分析上游和下游等分試樣和，可選地，保留等分試樣，并且特別地確定上 游和下游等分試樣，和，可選地，保留等分試樣中RBC或RBC子群體的濃度或密度。本發(fā)明用于過濾RBC的方法在過濾單元中使通?？稍谄⒅畜w內(nèi)保留的RBC保留， 并因此產(chǎn)生體內(nèi)發(fā)生的脾過濾功能，特別是在人體內(nèi)發(fā)生的脾過濾功能。通過“降低的變形能力”，(或增加的剛性或僵化)，在本文表示變形能力的部分或 全部損失。變形能力通常降低至少5%，優(yōu)選至少10%和更優(yōu)選至少15%。在本發(fā)明的特 定實(shí)施方案中，“降低的變形能力”表示“增加的剛性”。通常將取得的上游、下游和保留等分試樣放在微孔板中。密度的確定可以通過自 動(dòng)化方法平行地對(duì)上游和下游等分試樣進(jìn)行。在特定的實(shí)施方案中，用于過濾RBC的方法的步驟d)還包括計(jì)算過濾單元中RBC 或RBC子群體的保留率(即，保留的RBC或RBC子群體的百分比)，例如使用下述公式(下游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度-上游等分試樣中RBC或RBC子群體 的密度)/上游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度可替換地，方法可以包括比較下游和上游中RBC或RBC子群體的密度的步驟，例如 通過確定保留比例(下游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度/上游等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度)進(jìn)行比較。在特定的實(shí)施方案中，步驟d)包括確定上游和下游等分試樣，和，可選地，保留等 分試樣中的紅血球溶解，例如通過從離心后的上游和下游等分試樣，和，可選地，從離心后 的保留等分試樣定量上清液中的人乳酸脫氫酶(LDH)濃度而進(jìn)行。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，RBC是人RBC。包含具有異常并且特別是降低的變形能力的RBC的樣品優(yōu)選用于本發(fā)明的過濾 RBC的方法中。這些RBC包括受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的RBC、加熱RBC和來自患 有遺傳或后天的免疫障礙以及遺傳或后天的RBC疾病的患者的RBC，并且優(yōu)選來自患有遺 傳性或后天的疾病的患者的RBC，例如遺傳性或后天的球形細(xì)胞增多癥、橢圓形紅細(xì)胞增多 癥、敗血癥、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細(xì)胞疾病和鐮狀細(xì)胞性狀)、自免疫溶 血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球細(xì)胞 酶)1。在特定的實(shí)施方案中，步驟d)中分析的RBC或步驟d)中分析的至少一個(gè)RBC子群 體是異常RBC或瘧原蟲感染RBC(iRBC)，和特別地環(huán)狀-寄生iRBC或配子體-寄生iRBC， 例如成熟配子體-寄生iRBC。當(dāng)分析iRBC，和特別是環(huán)狀-寄生iRBC或配子體-寄生iRBC時(shí)，步驟d)通常包 括或由下述組成-確定上游和下游等分試樣，和，可選地，保留等分試樣中的寄生蟲感染量百分比； 和
-可選地(i)使用下述公式確定過濾單元中的RBC保留率(下游等分試樣中的寄 生蟲感染量百分比-上游等分試樣中寄生蟲感染量百分比)/上游等分試樣中寄生蟲感染 量百分比或(ii)保留比例(下游等分試樣中寄生蟲感染量百分比/上游等分試樣中寄生 蟲感染量百分比)。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧 原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧原蟲、巴西瘧原蟲、 許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾氏瘧原 蟲和三日瘧原蟲，和更優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲(Pf)和間日瘧原蟲，例如熱帶瘧原蟲的 Palo Alto I 菌株。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，樣品的RBC已經(jīng)經(jīng)過(已知或新)化合物的處理，特 別是可能調(diào)節(jié)并優(yōu)選增加RBC剛性的化合物，并且例如可以特異性調(diào)節(jié)和優(yōu)選地增加iRBC 剛性的化合物(特別是特異性作用于環(huán)狀-寄生iRBC和/或配子體-寄生iRBC的化合 物)。在本發(fā)明的過濾方法中通常使用小體積樣本，例如1-100微升積壓紅血球細(xì)胞的 樣本。樣本通常優(yōu)選懸浮在懸浮培養(yǎng)基中，其包括、由或主要由補(bǔ)加4%白蛋白和5% Plasmion 或 1 % albumax II ⑧的 PBS 或 RPMI 組成。通過“主要由組成”，在本文表示可以在樣本中加入少量成分而不具有顯著影響。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，已經(jīng)從血液樣本(例如全血樣本)并優(yōu)選從外周血 液樣本取得RBC，所述樣品先前獲得自患者。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，未從血液樣本獲取RBC，但是優(yōu)選通過稀釋血液樣本 (例如全血樣本)和優(yōu)選稀釋外周血液樣本而區(qū)的RBC，所述樣品先前獲得自患者。本發(fā)明的過濾方法中使用的RBC和特別是iRBC可以從患者的血液樣本收集，所述 患者已經(jīng)用具有調(diào)節(jié)和優(yōu)選如本文所述增加RBC剛性的能力的化合物治療。例如，可以在 用所述化合物治療幾小時(shí)后收集所述RBC?？商鎿Q地，或累積地，本發(fā)明的過濾方法中使用的RBC和特別是iRBC可以通過體
外培育而獲得。特別地，可以在體外接觸具有調(diào)節(jié)和優(yōu)選如本文所述增加RBC剛性的能力的化合 物后，特別是在存在所述化合物的情況下體外培育RBC和特別是iRBC(例如環(huán)狀-寄生 iRBC和/或配子體-寄生iRBC)后，收集用藥物處理的RBC。當(dāng)使用包含iRBC的樣本時(shí)，可以通過用iRBC，特別是用其中已經(jīng)富集配子體-階 段iRBC的iRBC培育物，感染RBC，優(yōu)選小于8天的RBC，制備iRBC培育物，所述富集例如通 過plasmion 處理進(jìn)行。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，過濾單元的孔(或通道)的直徑在1至ΙΟμπι之間， 并且優(yōu)選在1. 85至9. 4 μ m或1至3或1至2 μ m之間，例如直徑2 μ m。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，過濾單元的通道的厚度小于Μμπι，并且優(yōu)選小于 5 μ m0在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，由重力、沖洗(例如通過施加恒壓)、吸引或通過離 心驅(qū)動(dòng)經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)。
過濾單元通常放在柱(例如當(dāng)經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)是由重力或沖洗驅(qū)動(dòng)時(shí))或管 (例如當(dāng)經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)是由離心驅(qū)動(dòng)時(shí))中。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，樣品的血細(xì)胞比容較低，例如小于5%，和更優(yōu)選在 2% -2. 5%的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，過濾單元包含或由多孔通道膜組成，例如聚碳酸酯 多孔通道膜。來自Merlitech Corporation的多孔通道膜特別合適，其中通道直徑在1至 3 μ m范圍內(nèi)，并且通道長度是M μ m。例如，可以使用來自Merlitech Coporation的2 μ m 寬和Mym厚的聚碳酸酯多孔通道膜。當(dāng)使用多孔通道膜時(shí)，經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)通常是重力驅(qū)動(dòng)。特別地，步驟a)可 以是重力驅(qū)動(dòng)并在恒壓下，例如80-85cm水的恒壓，和優(yōu)選在約34-37°C的溫度進(jìn)行?？商鎿Q地，過濾單元可以包含或由一個(gè)或幾個(gè)珠層組成，并且優(yōu)選錫珠，其中過濾 單元中存在的珠的直徑在2-25 μ m或5-25 μ m的范圍內(nèi)，并且其中由過濾單元內(nèi)的珠間空 間形成的通道(孔)優(yōu)選在0. 74禾口 9. 4 μ m或1. 85 μ m禾口 9. 4 μ m之間變化。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，過濾單元中存在的每個(gè)珠層至少厚0.5-10 μ m，過濾 單元中珠的總厚度至少為5mm，優(yōu)選7mm。例如，厚度至少為5mm和優(yōu)選7mm的層，由等重的 珠的混合物組成，其直徑在5至15 μ m的范圍內(nèi)，并且可以使用直徑在15至25 μ m范圍內(nèi) 的珠。在特定的實(shí)施方案中，使用直徑從5至25μπι的珠的7mm厚的層。在另一個(gè)特定的 實(shí)施方案中，過濾單元包含直徑從5至25 μ m的珠的7mm厚的層和包含小于5 μ m的較小直 徑的珠的上層。在過濾單元中，珠層堆積在適于保留珠的過濾膜上，并且其不影響過濾單元 的保留能力。當(dāng)使用珠層時(shí)，通常使用注射壓力流或通過離心(例如通過在1500_2500g離心 1-2分鐘)實(shí)現(xiàn)經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)。例如，可以使用電泵在8分鐘內(nèi)(即終體積為8ml) 產(chǎn)生經(jīng)過層的懸浮培養(yǎng)基(例如PBS+1 ^Albumax II)的恒定Iml/分鐘流體。壓力上限 可以是例如999mbar?？商鎿Q地，也可以使用其它技術(shù)實(shí)現(xiàn)經(jīng)過過濾單元的流動(dòng)，并且可以 是，例如，重力驅(qū)動(dòng)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，使用珠層并在恒壓下，例如80-85cm水的恒壓，和優(yōu) 選在約20-25°C的溫度進(jìn)行步驟a)。當(dāng)本發(fā)明用于過濾RBC的方法包括取得已保留在珠層中的RBC的步驟c)時(shí)，這個(gè) 步驟可以例如通過差異傾析(例如，在通過重力傾析1-3分鐘的幾個(gè)步驟后)進(jìn)行。使用本發(fā)明用于過濾RBC的方法，在群體細(xì)胞水平上進(jìn)行RBC分析，特別是iRBC 分析。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，步驟d)和具體的RBC密度或寄生蟲感染量確定，通 過液相熒光定量方法或在吉氏染色后進(jìn)行。加熱RBC或感染寄生蟲的RBC的熒光定量可以 通過分別用PKH-沈或STOR-I染色而進(jìn)行。通常使用計(jì)數(shù)器定量熒光強(qiáng)度，例如FLX-800 計(jì)數(shù)器。本文公開的任何方法可以體外進(jìn)行。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本文公開的用于過濾RBC方法的應(yīng)用，其用于篩選能 調(diào)節(jié)RBC和特別是受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的RBC變形能力，并且特別是誘導(dǎo)或增 加其剛性的化合物，例如在如本文所公開的篩選能增加瘧原蟲-iRBC的剛性的化合物的方
19法中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)增加受感染RBC的保留率或保留比例的能力篩選 化合物。本發(fā)明的過濾方法允許進(jìn)行低通量篩選或中或高通量篩選。在本篩選方法的特定實(shí)施方案中，篩選的化合物能與包括其皮質(zhì)細(xì)胞骨架的RBC 膜相互作用(至少是包括其皮質(zhì)細(xì)胞骨架的iRBC膜)和/或進(jìn)入RBC (至少是進(jìn)入iRBC)， 特別是穿過RBC脂雙層(至少是iRBC脂雙層)，或者與修飾的脂雙層本身相互作用。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，這種用于篩選化合物的方法包括或由下述步驟組 成-將本發(fā)明用于過濾紅血球細(xì)胞的方法用于包含RBC的樣品的兩個(gè)等分試樣，其 中只有一個(gè)等分試樣先前已經(jīng)接觸過待測試化合物，其中要測試化合物調(diào)節(jié)和優(yōu)選增加 RBC剛性的能力(未接觸的等分試樣作為內(nèi)部對(duì)照)；和-比較兩個(gè)樣本等分試樣確定的RBC保留率或保留比例，其中RBC保留率的絕對(duì)數(shù) 值或保留比例之間至少5%，優(yōu)選至少10%和更優(yōu)選至少15%的變化說明所述化合物能調(diào) 節(jié)RBC的剛性/變形能力，并且其中與未接觸化合物的樣本等分試樣所獲得的RBC保留率 或保留比例相比，接觸化合物的樣本等分試樣所獲得的RBC保留率(絕對(duì)數(shù)值)或保留比 例至少5%，優(yōu)選至少10%和更優(yōu)選至少15%的增加說明所述化合物能增加RBC的剛性/ 降低RBC的變形能力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本文公開的用于過濾RBC的方法的應(yīng)用，其用于篩選 可以選擇性與受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的紅血球細(xì)胞(iRBC)相互作用，并且特別 地與環(huán)狀-iRBC和/或配子體-宿主RBC，特別是成熟配子體-宿主RBC相互作用，并且適 合于調(diào)節(jié)和特別地增加其剛性(降低其變形能力)和還適合于根據(jù)本發(fā)明增加這些iRBC 在過濾單元中的保留率或保留比例的化合物。因此，本發(fā)明的過濾方法可以用于篩選能特異性地降低環(huán)狀-宿主RBC和/或配 子體-宿主RBC(特別是成熟配子體-宿主RBC)的變形能力(即，增加剛性)并且因此誘 導(dǎo)、增加和/或加快這些細(xì)胞在脾中的保留并可能從循環(huán)血液將這些細(xì)胞進(jìn)行脾依賴性的 清除。因此篩選的化合物可用于治療瘧疾?；钚远x為化合物誘導(dǎo)或增加過濾介導(dǎo)的iRBC 保留的能力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本文公開的過濾RBC的方法的應(yīng)用，用于分離和/或檢 測具有異常并且特別是降低的變形能力的RBC的應(yīng)用，例如用于與異常RBC變形能力和特 別地RBC變形能力降低有關(guān)的臨床病癥的體外診斷/檢測。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，如本文所公開的用于過濾RBC的方法，用于分離和/ 或檢測來自患者的血液樣本中的iRBC和特別是環(huán)狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC (例 如成熟配子體-宿主RBC)，所述患者已經(jīng)受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲(例如熱帶瘧原蟲) 感染。在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，如本文所公開的用于過濾RBC的方法，用于 分離和/或檢測與后天或遺傳疾病相關(guān)的RBC，診斷或預(yù)診斷影響RBC變形能力的后天或遺 傳疾病，例如遺傳性或遺傳的球形紅細(xì)胞癥(即，用于分離和/或檢測球形紅細(xì)胞癥)、橢 圓形紅細(xì)胞增多癥、敗血癥、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細(xì)胞疾病和鐮狀細(xì)胞性 狀)、自免疫溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它 紅血球細(xì)胞酶)。
在本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，如本文所公開的用于過濾RBC的方法，用 于分離具有異常特別是降低的變形能力的RBC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本發(fā)明的用于過濾RBC的方法還可以用于分析和/或分離RBC子群體，和特別是 iRBC，特別是環(huán)狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC。在本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，如本文所公開的用于過濾RBC的方法用于 測試對(duì)患者施用的抗瘧疾藥物的效果。在用藥幾小時(shí)或幾天后，對(duì)從患者收集的接觸藥物 的瘧原蟲感染RBC使用過濾方法，觀察到的用藥前和用藥后取得的瘧原蟲-iRBC樣本的保 留率或保留比例的變化說明藥物降低由脾進(jìn)行的瘧原蟲-iRBC的變形能力-依賴性的瘧原 蟲-iRBC保留或消除。最后，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)RBC過濾是脾過濾功能最好的替代品，所以可以提供體外分析患 者脾功能的有用的測試基礎(chǔ)，并且特別是分析患有遺傳或后天免疫障礙以及遺傳或后天 RBC疾病的患者脾功能的有用的測試基礎(chǔ)。
實(shí)施例實(shí)施例A.在人脾的慢速、開放微循環(huán)中熱帶瘧原蟲環(huán)狀-感染紅細(xì)胞的保留患者、材料和方法人類志愿者的超聲造影。根據(jù)下述入選標(biāo)準(zhǔn)招募16名18-50歲健康男性志愿者 無動(dòng)脈粥樣化風(fēng)險(xiǎn)因素(即，動(dòng)脈壓力正常，不抽煙或無抽煙史，血清膽固醇水平正常)，無 腹部外科手術(shù)史，無重大健康問題或過去無重大健康問題(體檢正常，血清肌酸酐、AST和 膽紅素水平正常，和無HIV、HBV和HCV抗體)，通過傳統(tǒng)超聲和Doppler評(píng)價(jià)為脾微血管結(jié) 構(gòu)正常，和無紅血球細(xì)胞疾病的臨床或生物癥狀-包括血細(xì)胞數(shù)、血清觸珠蛋白和血紅蛋 白電泳正常。研究得到Necker醫(yī)院研究審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，書面的知情同意書可從所有 參加人員處獲得。以Iml/分鐘的恒定注射速率皮下注射超聲造影劑(Sonovue。，Bracco, Mi Iano, Italy)。使用 Philips HDI 5000 (Philips US, Bothell, WA, USA)進(jìn)行超聲造影。 使用反向脈沖成像以低機(jī)械指數(shù)用線性變換器(LlO-幻將脾成像，使微泡破壞降至最小17， 成像在灌注開始后2分鐘開始。每次圖像獲取重復(fù)3次，并且將原始數(shù)據(jù)傳送至PC進(jìn)一 步定量。使用HDILab (Philips US, Bothell, WA, USA)為每個(gè)回放片段定量，HDI Lab是考 慮了壓縮圖并且允許以線性單位定量的軟件。根據(jù)位于被膜下區(qū)域中的感興趣區(qū)域(ROI) 計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度。移動(dòng)ROI位置，以補(bǔ)償呼吸移動(dòng)和皮下假象。將時(shí)間-強(qiáng)度曲線導(dǎo)出至 Deltagraph(Red Rock軟件，&ilt Lake City，UT，USA)。使用雙指數(shù)模型擬合數(shù)據(jù)。使用 數(shù)據(jù)和模型之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)估計(jì)擬合的質(zhì)量。人脾的取得。如述7取得并處理脾臟。未修改治療和外科手術(shù)護(hù)理，并且獲得患 者書面知情同意書。計(jì)劃由Ile-de-France II研究調(diào)查委員會(huì)批準(zhǔn)。出現(xiàn)與外科手術(shù)有 關(guān)的30至90分鐘的熱缺血時(shí)，一旦病理學(xué)家對(duì)脾臟進(jìn)行了肉眼檢查，并且在需要時(shí)進(jìn)行了 實(shí)驗(yàn)前切片處理，即可向脾臟主動(dòng)脈中插管。為轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，脾臟中充滿冷的Krebs-白 蛋白溶液。寄生蟲。如述19培育熱帶瘧原蟲I^alo-Alto (FUP-CB13)、D10W和FCR-3。重復(fù)進(jìn)行 人無黑色素的黑素瘤細(xì)胞(C32)2°的盤選分離(panning)，直至獲得多于5個(gè)iRBC每個(gè)C32 細(xì)胞的細(xì)胞粘連率。擴(kuò)增細(xì)胞粘連iRBC，并粗略地通過凝膠浮選同步化，直至歷時(shí)少于16小時(shí)發(fā)生完全的再侵入，然后儲(chǔ)存在液氮中，每份等分試樣> :3ml。在脾臟刺激前7天內(nèi)，將 等分試樣解凍，并允許寄生蟲再侵入未感染RBC。在脾臟刺激前14小時(shí)內(nèi)，通過凝膠浮選 方法消除環(huán)狀，并且成熟形式可以在剛剛收集(< 7天)和洗滌過的RBC中再次侵入，獲得 2-7%寄生蟲感染量的7-40ml積壓的RBC，其在導(dǎo)入灌注液前在RPMI中洗滌一次。活體脾灌注。如述7在由受調(diào)節(jié)暖空氣維持在37°C的Plexiglas腔室中進(jìn)行離 體-灌注脾實(shí)驗(yàn)。簡而言之，在實(shí)驗(yàn)室中(冷缺血時(shí)間，60-90分鐘)，將脾臟與灌注設(shè)備相 連接，并通過將Krebs-白蛋白培養(yǎng)基流量歷時(shí)40-60分鐘從Iml/分鐘增加至50_150ml/ 分鐘而進(jìn)行從6-10°C至337°C的漸進(jìn)式加溫。在這個(gè)適應(yīng)階段，將患者的RBC從脾臟沖 出(在加溫末期血細(xì)胞比容<0. )。當(dāng)脾臟溫度到達(dá)35°C時(shí)，加入未感染的0+RBC(最 終的血細(xì)胞比容水平為5-10% )并使其循環(huán)30至60分鐘。使用Ktat設(shè)備(Abbott實(shí) 驗(yàn)室，abbott Ppark, ILL, USA)，每10-30分鐘監(jiān)控靜脈、動(dòng)脈和儲(chǔ)備庫中的葡萄糖、Na和 K濃度、02和0)2分壓，和？扎在穩(wěn)態(tài)時(shí)，關(guān)鍵的生理標(biāo)志維持在下述范圍灌注液流速 0. 8-1. 2ml/克灌注脾軟細(xì)胞組織/分鐘，脾被膜的溫度為36. 7-37. 2°C,Na為135_148mEq/ 1，K為4-5mEq/l，葡萄糖4-12mmol/l, pH 7. 2-7. 35，血細(xì)胞比容4-10%，而動(dòng)-靜脈氧分 壓延遲為60-120mmHg。最后，在將正常RBC沖出5_10分鐘后(引入iRBC前的血細(xì)胞比容
<0. 2% )，將0. 2-6%寄生蟲感染量的> 32小時(shí)的裂殖體_iRBC(侵入后40士8小時(shí))和
<14小時(shí)的環(huán)狀_iRBC(侵入后7士7小時(shí))的混合物引入循環(huán)系統(tǒng)2小時(shí)。在用Hoechst 33342(1 1000 稀釋；Molecular Probes, LSR, Becton-Dickinson，F(xiàn)rance)為 iRBC 染色 后，根據(jù)吉氏染色薄涂片或通過流式細(xì)胞儀分析而定量寄生蟲感染量。使用CELLQuest軟 件(B ecton-Dickinson, France)分析數(shù)據(jù)。寄生蟲分階段和計(jì)數(shù)。完全如述1固定并處理脾臟組織。脾臟組織內(nèi)的個(gè)體寄生 蟲核、細(xì)胞質(zhì)和瘧疾色素易于鑒別。根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)劃分iRBC階段。環(huán)狀-iRBC:淺褐色點(diǎn) (核)< 1 μ m，薄的藍(lán)色細(xì)胞質(zhì)或灰色圓形區(qū)域< 1/2紅細(xì)胞大小。裂殖體-iRBC 淺褐色 點(diǎn)>lym或>1( )，厚的藍(lán)色細(xì)胞質(zhì)的褐色點(diǎn)彡1/2紅細(xì)胞大小。紅細(xì)胞外寄生蟲殘 余褐色點(diǎn)周圍沒有紅色染料。對(duì)于每個(gè)脾臟切片，在濾泡周圍帶和鄰近> 3個(gè)濾泡的紅髓 中計(jì)數(shù)RBC。選擇可以清晰地與白髓相區(qū)分的紅髓、鄰近的濾泡周和紅髓進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)環(huán) 狀和裂殖體-iRBC并且每個(gè)脾臟位于約150張照片(至少4000個(gè)RBC)上。透射和掃描電子顯微鏡。在灌注末期，將脾臟樣本(Imm3)在4°C于補(bǔ)加 CaC12(0. 05% )的0. 08M甲次砷酸鹽緩沖液中的2. 5%戊二醛和多聚甲醛中過夜固定。 對(duì)于TEM，將固定的樣本用0. IM甲次砷酸鈉緩沖液漂洗三次，用四氧化餓、1. 5%鐵氰酸 鉀的0. IM甲次砷酸鈉緩沖液溶液在室溫后固定1小時(shí)，并再用0. IM甲次砷酸鈉緩沖液洗 滌。將樣本通過梯度系列的乙醇浴(25%至100% )并于室溫在Epon812/氧化丙烯混合 物中過夜，使樣本脫水。在嵌于Epon 812中后，將樣本在60°C聚合48小時(shí)。使用Leica ultracut UCT薄片切片機(jī)制備超薄片，并用在SOkV操作的JEOL 1200 EX電子顯微鏡檢查。 對(duì)于SEM，將固定切片在0. IM甲次砷酸鈉緩沖液中洗滌三次，每次10分鐘，在(w/v)四 氧化餓、1. 5%鐵氰酸鉀的0. IM甲次砷酸鈉緩沖液的溶液中后固定1小時(shí)。在25^^50%, 75%和90%梯度系列的丙酮溶液中脫水10分鐘(每次)。然后將樣品在100%丙酮中脫水 3X10分鐘，之后用C02進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。用22nm金鈀為干燥的切片鍍膜，用在5kV或7kV 操作的JEOL JSM 6700F場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢查并拍照。用上方的SE檢測器(SEI)和下方的二級(jí)檢測器(LEI)獲得圖像。RBC變形能力的測量。使用激光輔助光旋細(xì)胞分析儀(LORCA ;MeChatr0niCS， Hoorn, The Netherlands)，如前所述21，通過激光衍射器測量RBC和iRBC變形能力。RBC變 形能力的單位，即伸長指數(shù)(Ε. I.)，定義為橢圓體衍射模式的兩個(gè)軸之間差和這兩個(gè)軸之 和之間的比例。在切應(yīng)力(0.3至30帕斯卡)的范圍內(nèi)評(píng)價(jià)紅血球細(xì)胞變形能力，所述范 圍包括1. 7Pa,其近似對(duì)應(yīng)于循環(huán)14動(dòng)脈側(cè)的靜脈壓力，和30Pa，其在RBC需要擠壓通過小 的細(xì)胞間間隙時(shí)出現(xiàn)在脾的正弦曲線中。紅細(xì)胞表面免疫熒光試驗(yàn)。如述，進(jìn)行該試驗(yàn)以檢測表面iRBC寄生蟲蛋白。從 培育物制備PBS中懸浮的iRBC。用來自過免疫非洲成年人的血清(由P. Druilhe惠贈(zèng)；用 PBS/1% BSA 1 100稀釋)進(jìn)行RBC表面寄生蟲抗原的標(biāo)記，然后用結(jié)合Alexafluor 488 的羊抗人親和純化IgG(l 200稀釋；Molecular Probes，Eugene，OR)標(biāo)記。寄生蟲核用 Hoechst 33342(1 1000 稀釋；Molecular Probes)染色。將玻片插在 Vectashield 培養(yǎng)基 (Vector 實(shí)驗(yàn)室，BurIingame，CA)中。使用由 Zeiss Axiovision 軟件控制的 Axiocam HRc 照相機(jī)，在kiss Axiovert 200M顯微鏡上獲得圖像(全部來自Carl Zeiss,Heidelberg, Germany)。iRBC的表面碘化。將先前通過盤選過程在細(xì)胞C32上篩選的高度同步化的成熟階 段iRBC，通過結(jié)冷膠浮選技術(shù)富集至80 %，然后用新鮮紅細(xì)胞稀釋(即，小于8天或8天的 紅細(xì)胞，優(yōu)選小于8天的紅細(xì)胞)，在下一循環(huán)獲得約20%的環(huán)狀-iRBC。使用乳糖過氧化 酶方法μ進(jìn)行表面碘化。在再侵入后14小時(shí)培育停止。依次用Triton X-10,2% SDS 提取蛋白質(zhì)。如述μ進(jìn)行樣品的蛋白酶處理(TPCK-處理的trypsin和a-chymotrypsin TLCK(Sigma))。在5_17. 5%梯度丙烯酰胺凝膠上分離碘化的樣品。使用Kodak Bio Max MSl膜進(jìn)行自放射線照相。預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物購自Life Technologies (Gaithersburg, Maryland)禾口 NewEngland BioLabs Inc. (Beverly, Massachusetts)。細(xì)胞粘連試驗(yàn)。如前所述2°，研究了 iRBC對(duì)C32細(xì)胞的細(xì)胞粘連，其表達(dá)推定的 受體分子CD36和胞內(nèi)粘連分子1 (ICAM-I)?？偠灾?5cm3的細(xì)胞培育搖瓶(Corning Incorporated,USA)中制備單層C32細(xì)胞。將以5xl06iRBC/ml的濃度懸浮于pH 6. 8的細(xì) 胞粘連培養(yǎng)基中的RBC加入細(xì)胞培育搖瓶并通氣(1 %02,3% CO2和96%隊(duì))15秒，并每5分 鐘輕輕搖動(dòng)，在37°C孵育15分鐘。在孵育結(jié)束時(shí)，輕輕將細(xì)胞培育搖瓶在RPMI 1640培養(yǎng) 基中漂洗四次。單層固定在甲醇中，用2%吉氏染色劑染色，并通過顯微鏡檢查。計(jì)數(shù)1000 個(gè)黑素瘤細(xì)胞上粘連的iRBC的數(shù)目。用100個(gè)C32細(xì)胞上粘連的iRBC數(shù)目表示結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析。我們使用student成對(duì)t_測試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；ρ值< 0. 05認(rèn)為顯著。 使用 WinNonLin 軟件(5. 1 版本；Pharsight Corp.，Moutain View, CA, USA)進(jìn)行分區(qū)數(shù)據(jù) 分析。結(jié)果人脾中的循環(huán)腔室使用超聲造影在16名志愿者中研究人脾的循環(huán)模式。開始注入造影劑后兩分鐘 (即，一旦獲得微泡的穩(wěn)定濃度)，使用低機(jī)械指數(shù)脈沖反向成像研究脾臟。除了使用這種 較低的聲能外，隨著脾臟持續(xù)接觸超聲波束，一定量的微泡被破壞。時(shí)間-強(qiáng)度曲線反映了 信號(hào)強(qiáng)度的下降(圖1，材料與方法部分)。顯示出對(duì)于16名志愿者中實(shí)驗(yàn)延遲的最佳擬
23合的模型包括兩個(gè)指數(shù)項(xiàng)(所有案例中的關(guān)聯(lián)系數(shù)R2> 0.96)。雙指數(shù)函數(shù)可以表示為 N (t) = V1 (C0exp (- β⑷)+V^ (B+ (C0-B) exp (- β 2t))，其中第一和第二項(xiàng)分別對(duì)應(yīng)于慢速和 快速流動(dòng)腔室。Ctl指初始微泡濃度，并且認(rèn)為在兩個(gè)腔室中相等。V1和V2表示相對(duì)分?jǐn)?shù)體 積(Vi+V2 = 1)，并且^和β 2分別表示每個(gè)腔室中的微泡平均粘度。對(duì)實(shí)驗(yàn)曲線的分析 得到下述數(shù)值每個(gè)單腔室指數(shù)曲線的Y截距(Ylc^PYA)對(duì)應(yīng)于CtlV1和CtlV2，其中l(wèi)/β工和 1/β2對(duì)應(yīng)于指數(shù)-特征時(shí)間。在慢室中，慢室的平均(SD，范圍)相對(duì)分?jǐn)?shù)體積是70.6% (9.6,51.5-84. 4)并且平均(SD，范圍)相對(duì)分?jǐn)?shù)流量是 10. 12% (4. 40，3. 99-16. 47)(圖 1)?？傊?，這些觀察結(jié)果強(qiáng)烈支持人脾雙重微循環(huán)組織的存在(圖1)，其中約10%的血液 輸入經(jīng)過慢室流動(dòng)(圖1和6)。通過離體-灌注人脾清除iRBC用處于裂殖體階段(侵入后40士8小時(shí))或環(huán)狀階段(侵入后7士7小時(shí))的高 度同步化寄生蟲培育物灌注離體-灌注人脾。對(duì)灌注液的連續(xù)吉氏染色薄膜顯示，循環(huán)的 裂殖體-iRBC和出人意料的，環(huán)形-iRBC寄生蟲感染量迅速降低。在10和20分鐘內(nèi)，裂 殖體-和環(huán)形iRBC寄生蟲感染量分別降至其初始數(shù)值的4. 5% (范圍0-12.9)和沈.3% (范圍22. 9-35. 4% )(圖加)。裂殖體-iRBC的完全清除很迅速，盡管環(huán)狀-iRBC寄生蟲 感染量下降的速率更慢并且到達(dá)平臺(tái)期(圖加)。與裂殖體-iRBC相反，環(huán)形-iRBC在其表 面既未顯示出結(jié)節(jié)寄生蟲蛋白，也未顯示出碘化寄生蟲蛋白質(zhì)(圖8)，并且在C32人黑素瘤 細(xì)胞上和脾組織學(xué)檢查都未注意到有細(xì)胞粘連(數(shù)據(jù)未給出)(圖4)。脾臟刺激揭示的環(huán)狀-iRBC的不均一性環(huán)狀-iRBC的部分清除反映它們通過脾臟的較慢循環(huán)或其在脾臟中穩(wěn)定的保留。 為了闡釋這個(gè)問題，將環(huán)狀-iRBC制備物分開，一部分立即灌注進(jìn)入脾臟，而第二部分在 Krebs-白蛋白培養(yǎng)基中保持37°C (對(duì)照“脾原初”細(xì)胞)。開始灌注后四十分鐘(即40次 脾臟傳代)，從灌注液收集未保留的細(xì)胞。這些“脾傳代”和“脾原初”群體各自用不同的 PKH標(biāo)記、匯集并重新引入脾臟。接著使用流式細(xì)胞儀分析來自灌注系統(tǒng)的連續(xù)樣本(圖 3)?！捌⒃酢杯h(huán)狀-iRBC的評(píng)價(jià)(SD)半衰期(5. 7士3. 1分鐘，兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))與先前6次 試驗(yàn)中觀察到的結(jié)果相似(參見結(jié)果的下一部分“iRBC清除的模型建立”)。相反，“脾傳 代”環(huán)狀-iRBC未清除(圖:3b，c)。這表明環(huán)狀-iRBC事實(shí)上由兩個(gè)不同的子群體組成，一 個(gè)保留在脾中而一個(gè)流走。環(huán)狀-iRBC群體的這種與脾臟保留有關(guān)的不均勻性在我們的培 育條件下長時(shí)間穩(wěn)定，并且與灌注脾中引入的初始寄生蟲感染量無關(guān)(圖加)。它還與寄生 蟲菌株無關(guān)，因?yàn)橛肈lO獲得了相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.篩選能增加受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的紅血球細(xì)胞(RBC)剛性的化合物的 方法，所述方法包含下述步驟或由下述步驟組成a)培育受所述寄生蟲感染的RBC，并可選地和單獨(dú)地培育未感染RBC，每種培育均在存 在和不存在待測試化合物的情況下進(jìn)行，其中測試所述化合物增加且具體為選擇性增加受 感染RBC(iRBC)的剛性的能力；和，b)測定在存在所述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力，和不存在所 述化合物的情況下培育的一種或幾種iRBC的變形能力；和，c)可選地，測量在存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，和不 存在所述化合物的情況下一種或幾種未感染RBC的變形能力，其中與在不存在相同化合物的情況下培育的iRBC相比，在存在化合物的情況下培育 的iRBC的變形能力下降至少5%，優(yōu)選至少10%，并且更優(yōu)選至少15%，則表明所述化合物 能增加iRBC的剛性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述iRBC是環(huán)狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC， 特別是成熟配子體-宿主RBC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟a)使用的iRBC通過下述步驟獲得-用iRBC，特別是用其中裂殖體階段iRBC已經(jīng)富集的iRBC培育物，感染RBC，優(yōu)選小于 8天的RBC，所述富集例如通過用凝膠溶液例如plasmion 處理而進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)和/或權(quán)利要求3的步驟之前進(jìn) 行下述步驟-例如通過一次或幾次山梨醇處理而進(jìn)行iRBC的寄生蟲或裂殖體富集iRBC培育物的 寄生蟲的同步化，。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中-篩選在存在所述化合物的情況下培育的未感染RBC的變形能力，其與在不存在所述 化合物的情況下培育的未感染RBC的變形能力相同或者相差小于5%，和-可選地，篩選在存在所述化合物的情況下裂殖體-iRBC的變形能力，其與在不存在所 述化合物的情況下裂殖體-iRBC的變形能力近似相同或者相差小于5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行的所述篩選是低通量篩選或高通量 蹄選。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中在群體細(xì)胞水平和/或個(gè)體細(xì)胞水平測 定RBC和iRBC的變形能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中RBC和iRBC的變形能力通過檢電器、激 光衍射計(jì)、微流體設(shè)備、微量吸管和/或光鉗測定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中激光衍射計(jì)是商業(yè)自動(dòng)化儀器，優(yōu)選為激光輔助光 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞分析儀(LORCA ;Mechatronics，Hoorn, Netherlands)或 RHEODYN-SSD(Myrenne， Roetgen, Germany)，并且更優(yōu)選 LORCA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中RBC和iRBC的變形能力在從0.3至30帕斯卡 (Pa)的切應(yīng)力范圍內(nèi)測定，包括1. 71 和30Pao
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中iRBC的寄生蟲感染量水平是占細(xì)胞 群體的至少20%或30%，優(yōu)選為占細(xì)胞群體的至少50%，并且更優(yōu)選為占細(xì)胞群體的至少70%。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中通過參照伸長指數(shù)(EI)進(jìn)行變形能力 的測定。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中在100%寄生蟲感染量，30 外推時(shí)，對(duì)于在存在所 述化合物的情況下培育的iRBC，EI低于0. 43，更優(yōu)選低于0. 42，則表明所述化合物能增加 iRBC的剛性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述未感染和感染RBC是人RBC。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間 日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧 原蟲、巴西瘧原蟲、許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵 形瘧原蟲、諾氏瘧原蟲和三日瘧原蟲，和更優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法，其中所述寄生蟲是熱帶瘧原蟲，具體為熱帶 瘧原蟲的I^alo Alto I菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法，其還包括用離體灌注人脾模型和/或離體 灌注豬脾模型驗(yàn)證篩選的化合物的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述篩選的化合物能與包括其皮質(zhì)細(xì) 胞骨架的iRBC膜相互作用和/或進(jìn)入iRBC，特別是穿過iRBC脂雙層，或者與修飾的脂雙層 本身相互作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)方法的應(yīng)用，其用于篩選選擇性地與受瘧原蟲屬原 生動(dòng)物寄生蟲感染的紅血球細(xì)胞(iRBC)進(jìn)行相互作用或者選擇性地與環(huán)狀階段的iRBC和 /或配子體-宿主RBC特別是成熟配子體-宿主RBC進(jìn)行相互作用，并且適合于增加它們的 剛性的化合物。
20.用于過濾紅血球細(xì)胞(RBC)的方法，其使具有異常并且特別是降低的變形能力的 RBC在過濾單元中保留，所述方法包含下述步驟或由下述步驟組成a)使包含RBC的樣品流過過濾單元；禾口b)取得在流過過濾單元之前所述樣本的等分試樣(上游等分試樣)和在流過過濾單元 之后的所述樣本的等分試樣(下游等分試樣)；和c)可選地取得保留在過濾單元中的RBC(保留等分試樣)；和d)可選地分析上游和下游等分試樣和，可選地，保留等分試樣，并且特別地確定RBC或 上游和下游等分試樣和可選地保留等分試樣中RBC子群體的密度。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中步驟d)還包括計(jì)算⑴過濾單元中的RBC保留率， 例如使用下述公式(下游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度-上游等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度)/上游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度，或(ii)過濾單元中的RBC 保留率，使用下述公式下游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度/上游等分試樣中RBC或 RBC子群體的密度。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的方法，其中步驟d)包括確定上游和下游等分試樣中的紅 血球溶解，以及可選地，確定保留等分試樣中的紅血球溶解，例如通過定量離心后的上游和 下游等分試樣，以及可選地，離心后的保留等分試樣上清液中人乳酸脫氫酶(LDH)的濃度。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的方法，其中樣品包含具有降低的變形能力的 RBC，特別是選自下述的RBC:-受寄生蟲感染的RBC，優(yōu)選瘧原蟲屬的原生動(dòng)物寄生蟲，和特別為環(huán)狀-寄生iRBC或 配子體-寄生iRBC，例如成熟配子體-寄生iRBC ；-經(jīng)加熱的RBC，和-來自患者的RBC，所述患者患有遺傳或后天的免疫機(jī)能障礙以及遺傳或后天的RBC疾 病，和優(yōu)選來自患有下述疾病的患者的RBC 遺傳性或后天的球形紅細(xì)胞癥、橢圓形紅細(xì)胞 增多癥、敗血癥、血紅蛋白病(α或β地中海貧血、鐮狀細(xì)胞疾病和鐮狀細(xì)胞性狀)、自免疫 溶血性貧血、其它溶血性貧血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、其它紅血球酶)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述寄生蟲選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵 形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、豬尾猴瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、似卵形瘧原蟲、巴西瘧 原蟲、許氏瘧原蟲和吼猴瘧原蟲，優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、諾 氏瘧原蟲和三日瘧原蟲，和更優(yōu)選選自下組熱帶瘧原蟲和間日瘧原蟲，例如熱帶瘧原蟲的 Palo Alto I 菌株。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至M中任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)中分析的RBC或步驟d)中分 析的至少一個(gè)RBC子群體是異常RBC或瘧原蟲感染RBC (iRBC)，和特別是環(huán)狀-寄生iRBC 或配子體-寄生iRBC，例如成熟配子體-寄生iRBC。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中步驟d)包括或由下述組成-確定上游和下游等分試樣中寄生蟲感染量的百分比，以及可選地，保留等分試樣中寄 生蟲感染量的百分比；和-可選地，計(jì)算(i)過濾單元中的RBC保留率，例如使用下述公式(下游等分試樣中 RBC或RBC子群體的密度-上游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度)/上游等分試樣中 RBC或RBC子群體的密度，或(ii)過濾單元中的RBC保留率，使用下述公式下游等分試樣 中RBC或RBC子群體的密度/上游等分試樣中RBC或RBC子群體的密度。
27.根據(jù)權(quán)利要求20至沈中任一項(xiàng)的方法，其中所述RBC是人RBC。
28.根據(jù)權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)的方法，其中樣本的RBC已經(jīng)接觸過化合物，特別 是能調(diào)節(jié)和優(yōu)選增加RBC剛性的化合物，和例如可以特異性調(diào)節(jié)和優(yōu)選增加iRBC剛性的化 合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求20至觀中任一項(xiàng)的方法，其中已從血液樣本獲得RBC，并且優(yōu)選獲 得自先前從患者獲得的外周血樣本。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀或四的方法，其中RBC先前已經(jīng)在體外接觸化合物，例如，通過在 存在所述化合物的情況下體外培育RBC。
31.根據(jù)權(quán)利要求20至30中任一項(xiàng)的方法，其中過濾單元的通道的直徑在1至10μ m 的范圍中，并且優(yōu)選在1.85至9.4μπι或1至3μπι的范圍中，例如直徑2 μ m。
32.根據(jù)權(quán)利要求20至31中任一項(xiàng)的方法，其中過濾單元的通道的厚度小于Mym， 和優(yōu)選小于5 μ m。
33.根據(jù)權(quán)利要求20至32中任一項(xiàng)的方法，其中由重力、沖洗、吸引或離心驅(qū)動(dòng)通過過 濾單元的流動(dòng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求20至33中任一項(xiàng)的方法，其中樣品的血細(xì)胞比容較低，例如小于.5 %，并且更優(yōu)選在2 % -2. 5 %的范圍內(nèi)，所述樣品優(yōu)選懸浮在懸浮培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基 包含、由下述組成或主要由下述組成補(bǔ)加4%白蛋白和5%Plasmion 或1 % albumaxII 的 PBS 或 RPMI。
35.根據(jù)權(quán)利要求20至34中任一項(xiàng)的方法，其中過濾單元包含或由多孔通道膜組成， 例如聚碳酸酯多孔通道膜。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中步驟a)由重力驅(qū)動(dòng)并在恒壓下進(jìn)行，例如80-85cm 水的恒壓，并且優(yōu)選在約34-37°C的溫度進(jìn)行。
37.根據(jù)權(quán)利要求20至35中任一項(xiàng)的方法，其中過濾單元包含或由一層或多層珠組 成，并且優(yōu)選錫珠，其中過濾單元中存在的珠的直徑在2-25 μ m或5-25 μ m的范圍內(nèi)，并且 其中在所述過濾單元中由珠間空間形成的通道優(yōu)選在0. 74和9. 4 μ m之間或1. 85 μ m和 9. 4μπι之間變化。
38.根據(jù)權(quán)利要求20至35或37中任一項(xiàng)的方法，其中過濾單元中存在的每層珠至少 為0. 5-10 μ m厚，過濾單元中珠總厚度至少為5mm，優(yōu)選7mm。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中通過過濾單元的流動(dòng)是壓力注射流或通過離心 引起的流動(dòng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)在恒壓下進(jìn)行，例如80-85cm 水的恒壓，并且優(yōu)選在約20-25 °C的溫度進(jìn)行。
41.根據(jù)權(quán)利要求20至40中任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)和特別是密度或寄生蟲感染 量確定通過液相熒光定量方法進(jìn)行或者在吉氏染色后進(jìn)行。
42.根據(jù)權(quán)利要求20至41中任一項(xiàng)的方法在用于篩選化合物調(diào)節(jié)變形和具體為誘導(dǎo) 或增加紅血球細(xì)胞(RBC)剛性的能力，特別是受瘧原蟲屬原生動(dòng)物寄生蟲感染的RBC剛性 的能力的方法中，例如在根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中化合物的篩選包括或由下述步驟組成-將根據(jù)權(quán)利要求20至41中任一項(xiàng)的用于過濾RBC的方法，應(yīng)用于包含RBC的樣本的 兩個(gè)等分試樣，其中只有一個(gè)等分試樣先前已接觸過待測試其調(diào)節(jié)和優(yōu)選增加RBC剛性能 力的化合物；和-比較兩個(gè)樣本等分試樣確定的RBC保留率或保留比例，其中兩個(gè)RBC保留率或保留比 例之間至少5%，優(yōu)選至少10%和更優(yōu)選至少15%的差異表明所述化合物能調(diào)節(jié)RBC的剛 性，并且其中與未接觸化合物的樣本等分試樣獲得的RBC保留率(絕對(duì)數(shù)值)或保留比例 相比，對(duì)于已接觸化合物的樣本等分試樣獲得的RBC保留率(絕對(duì)數(shù)值)或保留比例中至 少5%，優(yōu)選至少10%和更優(yōu)選至少15%的增加表明所述化合物能增加RBC的剛性。
44.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的篩選方法，其中RBC或iRBC的變形能力的測量使 用根據(jù)權(quán)利要求20至41中任一項(xiàng)的過濾RBC的方法進(jìn)行，優(yōu)選參照RBC或iRBC保留率或 保留比例。
45.根據(jù)權(quán)利要求20至41中任一項(xiàng)的過濾RBC的方法的應(yīng)用，其用于分離和/或檢 測具有異常和特別是降低的變形能力的RBC，特別是用于實(shí)驗(yàn)研究和/或診斷或檢測瘧原 蟲感染RBC是否存在，例如環(huán)狀-宿主RBC和/或配子體-宿主RBC，或者診斷或預(yù)知影響 RBC變形能力的后天或遺傳的疾病，例如后天或遺傳性球形紅細(xì)胞癥。
46.根據(jù)權(quán)利要求20至41中任一項(xiàng)的過濾RBC的方法的應(yīng)用，其用于患者脾功能的體外分析，和特別是具有遺傳或后天的免疫功能障礙以及遺傳或后天的RBC障礙的患者脾功 能的體外分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選能增加受瘧原蟲屬原生動(dòng)物具體為熱帶瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的寄生蟲感染的紅血球細(xì)胞(RBC)剛性的化合物的方法。本發(fā)明還涉及過濾RBC的方法，其能在過濾單元中使具有異常具體為降低的變形能力的RBC保留，以此代替脾過濾功能。所述方法具體為分離和/或檢測瘧原蟲感染RBC或與由來自患者的血液樣本的獲得或遺傳性球形紅細(xì)胞性貧血有關(guān)的紅細(xì)胞，或體外分析患者的脾功能。本發(fā)明還涉及所述方法的應(yīng)用，用于篩選可以選擇性與iRBC相互作用或者選擇性與環(huán)狀-iRBC相互作用，并且適合于增加其剛性的化合物，或者涉及所述方法用于過濾RBC，分離和/或檢測具有異常并且特別是降低的變形能力的RBC的應(yīng)用。這種新過濾方法還易于自動(dòng)化，并且允許進(jìn)行粘結(jié)RBC的清除或濃縮，在遺傳或后天的RBC異常(包括瘧疾)中具有廣泛的實(shí)驗(yàn)和醫(yī)療應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102112874SQ200980129709
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者吉納維夫.米隆, 因諾森特.薩福伊奎諾比西, 奧迪爾.普伊杰倫, 弗朗索瓦.拉科斯特, 彼得.戴維, 瓦倫丁.布勞斯, 皮埃爾.A.巴菲特, 紀(jì)堯姆.德普萊恩, 納拉.莫漢達(dá)斯, 西爾維.佩羅特 申請(qǐng)人:公共救濟(jì)事業(yè)局-巴黎醫(yī)院, 國家科學(xué)研究中心, 巴斯德研究院, 皮埃爾與瑪麗·居里-巴黎第六大學(xué)