專利名稱：自組裝性多細胞體和使用其制備三維生物結構的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及再生醫(yī)學和組織工程領域，更特別地，本發(fā)明涉及具有期望結構的工 程組織/器官的制備。
背景技術：
組織工程為由越來越多的器官和組織置換需求以及可移植器官(包括血管)的長 期短缺導致的問題提供了有希望的解決方案。例如，在美國，成千上萬的人處于器官移植物 的國家等候目錄中。許多人可能由于缺乏病變動脈或靜脈的置換用血管或者置換用腹部器 官而死亡。為了減輕，并且最終解決移植用血管和器官的供應不足而導致的問題，組織工程 學家試圖在實驗室內(nèi)以高精度、相對較短的時間大規(guī)模地構建可移植血管、血管替代物、器 官或器官替代物，并且使之生長。人們已經(jīng)試圖開發(fā)了構建工程組織的多種方法，這些方法具有有限的成功。然而， 尚未實現(xiàn)對帶血管的三維器官的組裝。雖然現(xiàn)有技術的方案具有希望，但是其也具有各種問題。支架選擇、免疫原性、降 解速率、降解產(chǎn)物的毒性、宿主炎癥反應、由于支架降解而導致的纖維組織形成以及與周圍 組織的機械失配均可能影響工程組織構造體的長期行為，并且直接干擾其主要的生物功 能。例如，心肌組織需要高的細胞密度，以確保通過與周圍細胞緊密互連的縫隙連接實現(xiàn) 同步的搏動。在心臟組織工程中使用支架已經(jīng)導致細胞之間的連接減少，以及細胞外基質(zhì) (ECM ；例如，膠原質(zhì)和彈力蛋白)的沉積和排列失誤，從而影響支架的生物降解，以及心肌 構造物產(chǎn)生力的能力。與ECM相關的因素還可能在血管組織工程中是特別關鍵的。其原因 主要是，具有與天然血管相當?shù)臋C械強度的支架工程化小直徑血管替代物在成人動脈重建 方面的希望(也稱為組織工程的“圣杯”)仍然未實現(xiàn)。除了常見的在體外產(chǎn)生彈性纖維的 難題之外，使用支架還具有其他的問題。凝膠的固有脆弱性可能妨礙組織工程化的血管的 最終強度。此外，殘余聚合物片段的存在可能破壞血管壁的正常結構，甚至影響平滑肌細胞 (SMC)表型。因此，不出意料的是，組織工程血管移植物的一線臨床應用或者針對低壓應用， 或者依賴于被稱為基于片材的組織工程的完全無支架的方法。器官印刷法(特別是美國專利申請No. 10/590, 446中所述的技術)已經(jīng)顯示出 制造三維組織的潛力。器官印刷法通常為計算機輔助的、基于分配器的三維組織-工程 技術，其旨在以疊層方式構造功能器官模組，并且最終構造出整個器官。在美國專利申請 No. 10/590, 446中所述的技術中，單獨的多細胞聚集體被印刷到凝膠或其他支撐基質(zhì)上。最 終的功能組織由單獨聚集體的印刷后融合而獲得。發(fā)明概述
本發(fā)明的一方面是細長多細胞體。所述體包括多個活細胞和組織培養(yǎng)基。細胞彼 此粘附。多細胞體的長度為至少約1000微米，并且沿著其長度的平均橫截面積在約7，850 平方微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一方面是工程化細長多細胞體。所述體包括彼此粘附的多個活細胞。 多細胞體的長度為至少約1000微米，并且沿著其長度的平均橫截面積在約7，850平方微米 至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。另一實施方案是非神經(jīng)支配和非軟骨細長多細胞體。所述體包括彼此粘附的多個 活細胞。多細胞體的長度為至少約1000微米，并且沿著其長度的平均橫截面積在約7，850 平方微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。本發(fā)明的進一步方面是無管腔細長多細胞體。所述體包括多個活細胞和組織培養(yǎng) 基。細胞彼此粘附。多細胞體的高寬比至少約2。在本發(fā)明的一方面中，描述由粘彈性一致期望三維形狀的多個細胞或細胞聚集體 制得的多細胞體。多細胞體包含多個細胞或細胞聚集體，其中細胞或細胞聚集體粘附在一 起以形成構造體，所述構造體具有粘彈性一致的預定形狀、期望細胞密度和足夠的完整性 以用于容易地操作和處理。本發(fā)明的又一方面是制備包括多個活細胞的細長多細胞體的方法。細胞糊包括多 個活細胞成形為細長形狀。成形的細胞糊在控制環(huán)境中孵育以允許細胞彼此粘附，從而形 成細長多細胞體。根據(jù)本發(fā)明制備包括多個活細胞的多細胞體的另一方法包括使包括多個活細胞 的細胞糊在裝置中成形，所述裝置保持所述細胞糊為三維形狀。成形的細胞糊在控制環(huán)境 中孵育，同時其保持為所述三維形狀足夠的時間以制備這樣的體，所述體具有足夠的粘附 以在平坦表面上支撐自身。還提供一種制備包含多個活細胞的細長多細胞體的方法。所述方法包括使包含 多個活細胞的細胞糊成形為細長形狀；以及在控制環(huán)境中孵育所述成形的細胞糊以允許所 述細胞彼此粘附，從而形成細長多細胞體。在本發(fā)明的該方面中，描述了一種制備包含具有 粘彈性一致的預定形狀的多個細胞或細胞聚集體的細長多細胞體的方法。在一個實施方案 中，制備多細胞體的方法包括下列步驟1)提供細胞糊，所述細胞糊包含具有期望細胞密 度和粘度的多個預選擇的細胞或細胞聚集體；幻操作細胞糊成期望形狀；以及；3)通過成熟 使多細胞體成型。在本發(fā)明的又一方面中，描述了聯(lián)合使用上述多細胞體以構建期望三維生物構造 的填料體。填料體包含預定形狀的材料，其中材料抵抗細胞的向內(nèi)生長、遷移和粘連，并且 還能夠是可滲透組織培養(yǎng)基的(即，可滲透營養(yǎng)物)。填料體由諸如瓊脂糖、瓊脂和/或其 他水凝膠之類的材料制得。在生物構造的構造過程中，根據(jù)預定圖案，填料體用于限定缺乏 多細胞體的域。在本發(fā)明的又一方面中，描述了使填料體成型的方法。通常，該方法用于在凝膠樣 條件下使預選擇的合適材料制備(例如，操作)成期望形狀。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案， 所述制備方法還可包括下列步驟1)減小材料的粘度成液態(tài)樣材料；幻使液態(tài)樣材料成形 為預定形狀；以及；3)增加材料的粘度至期望凝膠樣填料基質(zhì)單元的粘度。本發(fā)明的又一實施方案是包括多個非神經(jīng)支配細長多細胞體的三維結構。多細胞體均包括彼此粘附的多個活細胞。多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其 他多細胞體，并且多細胞體不彼此粘附。本發(fā)明的進一步的方面是三維結構。結構包括多個工程化細長多細胞體。多細胞 體均包括彼此粘附的多個活細胞。多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其 他多細胞體，并且多細胞體不彼此粘附。在另一實施方案中，三維結構包括多個細長多細胞體。多細胞體均包括彼此粘附 的多個活細胞和組織培養(yǎng)基。多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其他多 細胞體，并且多細胞體不彼此粘附。在又一實施方案中，三維結構包括多個非神經(jīng)支配多細胞體。多細胞體均包括彼 此粘附的多個活細胞。多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米的接觸區(qū)域 所述多細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。在本發(fā)明的另一方面中，三維結構包括多個工程化多細胞體。多細胞體均包括彼 此粘附的多個活細胞。多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米的接觸區(qū)域 所述多細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。在本發(fā)明的又一實施方案中，三維結構包括多個多細胞體。多細胞體均包括彼此 粘附的多個活細胞和組織培養(yǎng)基。多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米 的接觸區(qū)域所述多細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。三維結構的另一實施方案包括多個多細胞體。多細胞體均包括彼此粘附的多個活 細胞。結構還包括多個離散的填料體。填料體均包括生物相容性材料，所述生物相容性材 料抵抗來自所述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述填料體中，并且抵抗所述多細胞體 中的細胞與所述填料體粘連。多細胞體和填料體布置成圖案，其中各填料體接觸至少一種 其他多細胞體或至少一種填料體。本發(fā)明的另一進一步方面是包括多個多細胞體的三維結構。多細胞體均包括彼此 粘附的多個活細胞。結構還包括多個填料體。填料體均包括生物相容性材料，所述生物相容 性材料抵抗來自所述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述填料體中，并且抵抗所述多細 胞體中的細胞與所述填料體粘連。多細胞體和填料體布置以在三維結構中形成多個空間， 所述空間不被多細胞體占據(jù)并且不被填料體占據(jù)。本發(fā)明的另一方面是制備三維生物工程組織的方法。該方法包括根據(jù)圖案布置多 個細長多細胞體，使得各多細胞體接觸至少一種其他多細胞體。多細胞體均包括多個活細 胞。所述多細胞體中的至少一種允許和至少一種其他多細胞體融合。在制備三維生物工程組織的方法的另一實施方案中，根據(jù)圖案布置多個多細胞體 和多個填料體，使得各多細胞體接觸至少一種(i)另一多細胞體或(ii)填料體。多細胞體 均包括多個活細胞。各填料體包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自所述多 細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述生物相容性材料中，并且抵抗所述多細胞體中的細胞 與所述填料體粘連。所述多細胞體中的至少一種允許和至少一種其他多細胞體融合。在制備三維生物工程組織的方法的又一實施方案中，該方法用于在預選擇的接收 環(huán)境中將多個多細胞體遞送成預定圖案。根據(jù)工程方法的一個實施方案，多細胞體可聯(lián)合 使用預選擇的填料體。更特別地，在一個實施方案中，該方法包括下列步驟1)根據(jù)預定圖 案，以預定聯(lián)合多個填料體的方式遞送多個多細胞體，以形成疊堆的或?qū)踊瘶嬙祗w，其中多細胞體和填料體是鄰接的；幻在預選擇的控制環(huán)境中沉積層化構造體以用于成熟，從而多 細胞體彼此融合以導致融合構造體；以及3)從融合構造體中除去填料體以制備期望生物 構造體。本發(fā)明的另一實施方案是三維結構，其包括至少一種填料體和彼此粘附的多個活 細胞。所述細胞形成基本上圍繞至少一種填料體的管狀結構。填料體包括適應性生物相容 性材料，所述生物相容性材料抵抗細胞遷移和向內(nèi)成長到所述材料中，并且抵抗所述細胞 與所述材料粘連。本發(fā)明的又一方面是制備包含彼此粘附的多個活細胞的多細胞體的模具。模具具 有生物相容性基底，所述生物相容性基底抵抗細胞遷移和向內(nèi)成長到所述基底中，并且抵 抗所述細胞與所述基底粘連。所述基底被成形以接收包含多個細胞的組合物，所述細胞具 有相對低的粘附性，并且在成熟期過程中保持所述組合物為期望形狀，在所述成熟期過程 中所述粘附性增加以形成所述多細胞體。所述多細胞體的期望形狀具有至少約1000微米 的長度，并且被構造使得所述多細胞體內(nèi)的每個細胞從所述體的外部不超過約250微米。本發(fā)明的另一實施方案是制備適于制備多個多細胞體的模具的工具，其中各體包 含彼此粘附的多個活細胞。所述工具包含具有頂部和底部的主體。從所述主體的底部延伸 多個葉片。所述葉片的寬度均在約100微米至約800微米的范圍內(nèi)以在生物相容性凝膠基 底中形成溝槽，所述生物相容性凝膠基底被構造用于使置于所述溝槽中的活細胞成型為細 長多細胞體。所述葉片具有縱軸，并且所述葉片中的至少一個與所述葉片的另一個的縱軸 側(cè)向間隔。附圖概述圖IA是本發(fā)明的多細胞體的一個實施方案的透視圖；圖IB是由表面支撐的多細胞體的放大透視圖；圖IC是在表面上呈彼此并列毗鄰關系的多個多細胞體的端部的放大透視圖；圖2是三維構造的一個實施方案的透視圖，所述三維構造包括多個多細胞體和多 個填料體，它們布置成適于產(chǎn)生工程組織的一個實施方案的圖案；圖3A-3D示出制備

圖1A、1B、1C和2中所示的多細胞體的方法的一個實施方案；圖4A是適用于圖3A-3D中所示的方法的模具的一個實施方案的透視圖；圖4B是模具的俯視圖；圖4C是在圖4B上沿包括線4C-4C的平面示出的模具的橫截面；圖4D是圖4C中示出的模具的一部分的放大橫截面；圖5A是可用于制備圖4A-4D中所示的模具的工具的一個實施方案的透視圖；圖5B是圖5A中所示的工具的側(cè)視圖；圖5C是圖5B中示出的工具的一部分的放大側(cè)視圖；圖6A-6C示出使用圖5A-5C中示出的工具來制備圖4A-4D中示出的模具的方法的 一個實施方案；圖7、7A和8-10是由多個多細胞體和多個填料體制得的三維構造的多種實施方案 的示意性透視圖；圖11和12示意性示出從多個多細胞體和填料體制備三維構造的多種方法；圖13根據(jù)本文所述的方法工程化的兩種管狀結構的照片，它們的外徑分別為1200微米和900微米；圖14是根據(jù)本文所述的方法工程化的另一管狀結構的照片；圖15是根據(jù)本文所述的方法聯(lián)合管狀結構的管腔中的填料體工程化的管狀結構 的一個實施方案的示意性透視圖；圖16包括示出球形多細胞體融合以形成分支管狀結構的一組照片；圖17包括示出第一組多細胞體和第二組多細胞體的融合的一組照片，所述第二 組多細胞體的細胞類型組成不同于第一組中多細胞體的組成；和圖18包括示出示出包括明膠和纖維蛋白的管狀工程化結構的一組照片。在整個附圖中對應的附圖標記表示對應的部件。發(fā)明詳述本文引用的所有的公開、專利申請、專利和其他參考文獻都通過引用的方式全部 并入本文。提供制備工程組織的新穎結構和方法。所述技術包括使用新型多細胞體作為構 件，所述構件可用于組裝三維構造，所述三維構造可通過成熟變成期望工程組織。各多細胞 體包含多個活細胞，所述多個活細胞足夠地彼此粘附，以允許所述體被作為單一目標處理 (例如，撿拾和移動)。多細胞體的粘附合適地足以允許所述體支撐自身(例如，在工作表面 上或在包括多個多細胞體的組裝中)一段時間，該時間足以使活細胞能夠粘附毗鄰多細胞 體的活細胞。以自支撐多細胞體的形式撿拾和移動多個活細胞的能力提供組裝多種不同三 維構造的靈活性。例如，多細胞體可聯(lián)合使用一種或多種填料體(例如，所述體包含生物相 容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到填料體中，并 且抵抗細胞與填料體的粘連)來組裝構造體，所述構造體可通過成熟變成管狀工程組織。 多細胞體和填料體還可用于組裝構造體，所述構造體通過成熟變成具有其他形狀的工程組 織。此外，因為多細胞體是自支撐的，因此無需使多細胞體嵌入支撐凝膠或支架。相反，“ 在空氣中印刷"的能力促進以這樣的方式布置多細胞體，該方式為確保多細胞體彼此直接 接觸。多細胞體之間更好的接觸可以促進在成熟過程中多細胞體的高效和可靠的融合。另 外，填料體可容易地從成熟工程組織的外部和內(nèi)部(例如管狀結構的管腔)中除去。另外，本發(fā)明的一些方法使用細長多細胞體作為用于工程組織的構件。因為細長 多細胞體已經(jīng)沿著所述體的縱軸在顯著長度上彼此粘附，因此多細胞體的融合更加可靠， 并且可在更少時間內(nèi)實現(xiàn)。此外，細長多細胞體可以以并排毗鄰關系布置，從而沿著具有實 質(zhì)長度的接觸區(qū)域在多細胞體之間建立接觸。這可促進毗鄰多細胞體彼此快速和可靠的融
I=I O提供了使用本發(fā)明的材料和方法來制備三維生物工程組織的方法的總的綜述，現(xiàn) 在將更詳細地說明這些方法和材料。多細胞體圖1中示出多細胞體的一個實施方案(本文中也稱為中間體細胞單元)，通常表示 為1。多細胞體1包括彼此粘附的多個活細胞。多細胞體1包含粘附在一起的多個細胞， 其為粘彈性一致的期望三維(3-D)形狀，并且具有足夠的完整性以用于在生物-工程方法 (例如組織或器官工程)的過程中容易地操作和處理。足夠的完整性是指多細胞體在隨后 的處理過程中能夠保持其物理形狀，其不是剛性的，但具有粘彈性一致，并且保持細胞的活力。多細胞體1可由任意一種或多種預選擇的細胞類型構成。通常，細胞類型的選擇 將取決于期望三維生物組織而變化。例如，如果多細胞體用于工程化血管型三維結構，用于 形成多細胞體的細胞可有利地包含通常在脈管組織(例如，內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維 細胞等)中發(fā)現(xiàn)的細胞類型或細胞類型。其他細胞類型可用于形成多細胞體，如果其用于 工程化不同類型的三維組織(例如，腸、肝、腎等)。本領域技術人員能夠選擇合適的細胞類 型或基于待工程化的三維組織的類型用于多細胞體的類型。其中，合適的細胞類型的非限 制性例子包括收縮或肌肉細胞(例如，橫紋肌細胞包括肌原細胞和心肌細胞，以及平滑肌 細胞)、神經(jīng)細胞、成纖維細胞、結締組織細胞(包括構成骨骼和軟骨的細胞類型、能夠分化 成骨骼形成細胞和軟骨細胞的細胞、以及構成淋巴組織的細胞類型)、實質(zhì)細胞、上皮細胞 (包括形成腔室和血管或通道中的內(nèi)層的內(nèi)皮細胞、外分泌和內(nèi)分泌上皮細胞、上皮吸收細 胞、角質(zhì)化上皮細胞和細胞外基質(zhì)分泌細胞)、肝細胞和未分化細胞(例如胚細胞、干細胞 和其他前體細胞)。例如，用于形成多細胞體1的細胞可得自活體人或動物受試者并且培養(yǎng) 為初級細胞系。多細胞體1可以是同型細胞的或異型細胞的。在同型細胞的多細胞體中，多個活 細胞包括單一細胞類型的多個活細胞。同型細胞的多細胞體中幾乎所有的活細胞是單一細 胞類型的細胞，對于低含量的雜質(zhì)具有一些耐受性，所述雜質(zhì)包括相對少量的不同細胞類 型的細胞，所述不同細胞類型的細胞對于構造體(包括同型細胞的多細胞體)的成熟產(chǎn)生 可忽略不計的影響。相反，異型細胞的多細胞體包括多于一種細胞類型的明顯數(shù)量的細胞。例如，多細 胞體可包含第一類型的多個活細胞和第二類型(等)的多個活細胞，第二細胞類型不同于 第一細胞類型。如果多細胞體用于產(chǎn)生脈管組織，例如，第一類型的細胞可以是內(nèi)皮細胞 并且第二類型的細胞可以是平滑肌細胞，第一類型的細胞可以是內(nèi)皮細胞并且第二類型的 細胞可以是成纖維細胞，或者第一類型的細胞可以是平滑肌細胞并且第二類型的細胞可以 是成纖維細胞。異型細胞的多細胞體還可包括第一細胞類型的多個細胞、第二細胞類型的 多個細胞和第三細胞類型的多個細胞，第一、第二和第三細胞類型中的各種不同于第一、第 二和第三細胞類型中其他種。例如，適于制備工程化血管的細胞體可包括內(nèi)皮細胞、平滑 肌細胞和成纖維細胞。異型細胞體中的活細胞可在融合過程過程中保持未整理或可"整 理"(例如，自組裝性)，以形成用于工程組織的特定內(nèi)部結構。細胞的自整理和差異粘附 假說(DAH)的預測一致。DAH解釋了就組織表面和由組成細胞之間的粘連和粘附相互作用 而產(chǎn)生的界面張力而言，細胞群的液態(tài)樣行為。通常，細胞可基于細胞的粘連強度的差異而 整理。例如，整理至異型細胞的多細胞體的中心的細胞類型通常具有更強的粘連強度(因 此更高表面張力)，這比整理至多細胞體的外側(cè)的細胞的情況要強。此外，當異型細胞的多細胞體由來自鄰近正常發(fā)育的組織的細胞構成時，在整理 的過程中它們可恢復它們的生理構象。因此，異型細胞的多細胞體可包含一種預構建內(nèi)部 結構，這基于組成細胞的粘連和粘附性能以及細胞所位于的環(huán)境。這可用于構建更復雜的 生物結構。例如，當構建簡單的收縮管時，可以使用由肌肉細胞構成的同型細胞的多細胞 體；為了構建血管樣結構，可以使用至少兩種細胞類型。例如，用于構建工程化血管的異型 細胞的多細胞體可合適地包括(i)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞；(ii)平滑肌細胞和成纖維細胞；(iii)內(nèi)皮細胞和成纖維細胞；或(iv)內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞。通過使用 由這些多種不同細胞類型構成的多細胞體隨機分散在所述體中來構建三維生物結構，在結 構成型的過程中，不同細胞類型可以進行整理，因此內(nèi)皮細胞列于管(即，管腔)的內(nèi)部結 構，平滑肌細胞形成圍繞內(nèi)皮細胞的層，并且成纖維細胞形成圍繞平滑肌層的外層。最佳結 構可通過改變多細胞體的組成(例如，各種不同細胞類型彼此的比)和多細胞體的大小而 實現(xiàn)。作為另一例子，異型細胞的多細胞體可以包括第一細胞類型的多個活細胞、第二類型 的多個細胞和第三類型的多個細胞。如果這種多細胞體用于產(chǎn)生脈管組織，例如，第一細胞 類型的細胞可合適地是內(nèi)皮細胞，第二細胞類型的細胞可合適地是平滑肌細胞，并且第三 細胞類型的細胞可合適地是成纖維細胞。再次，細胞的自整理可發(fā)生在這種異型細胞的多 細胞體中。因此，當這些多細胞體用于構建三維生物結構時，例如管狀結構，在結構成型的 過程中，這些細胞類型可以進行整理，使得內(nèi)皮細胞列于管(即，管腔)的內(nèi)部結構，平滑肌 細胞形成基本上圍繞內(nèi)皮細胞的層，并且成纖維細胞形成基本上圍繞內(nèi)皮細胞層和平滑肌 細胞層的管狀結構的外層。在一些情況下，除了多個細胞，多細胞體1合適地包括一種或多種細胞外基質(zhì) (ECM)組分、或者一種或多種ECM組分的一種或多種衍生物。例如，多細胞體可含有多種ECM 蛋白(例如，明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原質(zhì)、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈力蛋白和/或 蛋白聚糖)。ECM組分或ECM組分的衍生物可加入用于形成多細胞體的細胞糊中，下面進一 步詳細討論。加入細胞糊中的ECM組分或ECM組分的衍生物可純化自人或動物源，或通過 本領域已知的重組方法來制備?；蛘?，ECM組分或ECM組分的衍生物可由多細胞體中的細胞 自然分泌，或用于制備多細胞體的細胞可通過本領域已知的任何合適的方法基因操作來改 變一種或多種ECM組分或ECM組分的衍生物、和/或一種或多種細胞粘連分子或細胞-基 底粘連分子(例如，選擇蛋白、整聯(lián)蛋白、免疫球蛋白和鈣粘著蛋白)的表達水平。ECM組分 或者ECM組分的衍生物可促進細胞在多細胞體中的粘附，例如，明膠和/或纖維蛋白原可合 適地加入用于形成多細胞體的細胞糊中。然后通過加入凝血酶，纖維蛋白原可轉(zhuǎn)化至纖維 蛋白。如上所述，在一些情況下多細胞體1合適地包括組織培養(yǎng)基。組織培養(yǎng)基可以是 任何生理相容性培養(yǎng)基，并且通常根據(jù)本領域熟知所涉及的細胞類型來進行選擇。組織培 養(yǎng)基可包含例如基礎營養(yǎng)物，例如糖和氨基酸、生長因子、抗生素(使污染最小化)等。細胞在多細胞體1中的粘附合適地足夠強以允許多細胞體保持三維形狀，同時在 平坦表面上支撐自身。在圖IB中，例如，多細胞體1在平坦表面13上支撐自身。盡管存在 一些微小變形(例如，在多細胞體1接觸表面13的情況下)，但是多細胞體足夠地粘附以保 持這樣的高度，該高度合適地為其寬度的至少一半，更合適地約等于寬度。此外如圖IB中 所示，例如，通過多細胞體和表面13之間的接觸，多細胞體1被在多細胞體的底部上形成的 平坦外部表面15支撐。當多細胞體1的全重被表面13支撐時，由于多細胞體的輕微變形， 接觸表面15的面積Al可能大于初始接觸區(qū)域。然而，接觸表面15的面積Al合適地小于 支撐表面13上的多細胞體1的二維凸起的面積A2(參見圖1B)。這意味著多細胞體1的一 部分(例如，圖IB中示出的各個側(cè)面)被工作表面13上方的多細胞體1支撐。同樣，當兩 種或多種多細胞體1以彼此并列毗鄰的關系置于平坦表面13上時(圖1C)，它們的自支撐 能力聯(lián)合三維形狀(它們保持它們自身)可以在它們側(cè)面下方和工作表面上方形成孔隙空間17。細胞在多細胞體1中的粘附還合適地足夠強以當多細胞體組裝成構造體時(其中 多細胞體和填料體堆疊在彼此頂部)(參見圖2，下面更詳細討論)，允許多細胞體支撐至少 一種類似設置大小和成形的多細胞體或填料體的重量。細胞在多細胞體1中的粘附還合適 地足夠強以允許多細胞體通過工具被撿拾(例如，毛細管微量移液管)(參見圖3D，下面更 詳細討論)。此外，多細胞體1可合適地是非神經(jīng)支配(即，其基本上不含神經(jīng)元)或非軟骨、 或者非神經(jīng)支配和非軟骨的。多細胞體可描述為"工程化"多細胞體，因為其不同于無需 人類智慧教導而起源的生物結構。換言之，多細胞體是合成或非自然產(chǎn)生的。多細胞體1可以具有本發(fā)明范圍內(nèi)的多種大小和形狀。例如，圖1中所示的多細 胞體1是無管腔體，意味著沒有開口通道延伸通過多細胞體。例如，多細胞體1在所述體內(nèi) 合適地基本上不具有孔隙、中空空間等。在圖1中示出的多細胞體1和現(xiàn)有技術工程化血 管與其他現(xiàn)有技術管狀工程組織之間存在一點差別。圖1A-1B中示出的多細胞體1被構造為限制細胞壞死，所述細胞壞死由于氧和/ 或營養(yǎng)物不能擴散到多細胞體的中間部分而引起。例如，多細胞體1被合適地構造，使得其 中沒有活細胞從多細胞體的外部表面大于約250微米，更合適地使得其中沒有活細胞從多 細胞體的外部表面大于約200微米。因為多細胞體1的中間部分中的細胞接近多細胞體的 外部表面，所以多細胞體中的細胞可通過從多細胞體的外部表面處的孔隙空間朝向所述體 的中間部分擴散而供應氧和/或營養(yǎng)物。盡管在多細胞體的一個或多個部分(例如，中間 部分)中可能存在一些細胞壞死，但是所述壞死受到限制。圖1中的多細胞體1也是細長體，其具有明顯大于其高度Hl和其寬度Wl的長度 Li。多細胞體1的長度Ll合適地為至少約1000微米(例如，在約1000微米至約30厘米 的范圍內(nèi))，更合適地為至少約1厘米(例如，在約1厘米至約30厘米的范圍內(nèi))，甚至更 合適地為至少約5厘米(例如，在約5厘米至約30厘米的范圍內(nèi))。對于多細胞體的長度 Ll沒有理論上限。因此，認識到可以制備長度超過30厘米(或不同于30厘米的任意長度) 的多細胞體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要人們希望克服和制備長的多細胞體相關聯(lián)的實際困 難即可，所述困難例如獲得足夠量的活細胞或處理較長的多細胞體等。圖1中示出的細長多細胞體1的高度Hl和寬度Wl合適地明顯小于其長度Li。 例如，長度Ll合適地為寬度Wl的至少兩倍和高度Hl的至少兩倍，這意味著體1的高寬比 (即，長度和正交于長度的最長尺寸的比)為至少約2，更合適地為至少約10，甚至更合適地 為至少20。從上面多細胞體1的尺寸的描述注意到高寬比顯著高于20也可在本發(fā)明的范 圍內(nèi)；例如高寬比可以是2000。圖1中所示的多細胞體1也具有相對窄的寬度Wl和相對短的高度HI。例如，沿著 其長度L多細胞體1的平均橫截面積在約7，850平方微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)， 更合適地在約31，400平方微米至約250，000平方微米的范圍內(nèi)，甚至更合適地在約31，400 平方微米至約90，000平方微米的范圍內(nèi)。對于另一例子，圖1中示出的多細胞體1(其基 本上圓柱形并且具有圓形橫截面)沿著其長度合適地具有的平均直徑在約100微米至約 600微米的范圍內(nèi)(對應于平均橫截面積在約7，850平方微米至約282’ 600平方微米的范 圍內(nèi))，更合適地在約200微米至約500微米的范圍內(nèi)(對應于平均橫截面積在約31，400平方微米至約196，250平方微米的范圍內(nèi))，甚至更合適地在約200微米至約300微米的范 圍內(nèi)(對應于平均橫截面積在約31，400平方微米至約70，650平方微米的范圍內(nèi))。盡管圖1中示出的多細胞體1是基本上圓柱形并且具有基本上圓形橫截面，但是 具有不同尺寸和形狀的多細胞體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，多細胞體可以是具有方形、矩 形、三角形或本發(fā)明范圍內(nèi)的其他非圓形橫截面形狀的細長形狀(例如，圓柱形)。同樣，多 細胞體可具有本發(fā)明范圍內(nèi)的通常球形、非細長圓柱形或立方體形形狀。制備多細胞體的方法有多種方式來制備具有本發(fā)明范圍內(nèi)的上述特性的多細胞體。例如，多細胞體可 由含有多個活細胞或具有期望細胞密度和粘度的細胞糊來制備。細胞糊可以成形為期望形 狀，并且多細胞體通過成熟(例如，孵育)成型。在另一例子中，細長多細胞體通過使包括 多個活細胞的細胞糊成形為細長形狀而制備。細胞糊在控制環(huán)境中孵育以允許細胞彼此粘 附，從而形成細長多細胞體。在又一例子中，多細胞體通過使包括多個活細胞的細胞糊在裝 置中成形而制備，所述裝置保持細胞糊的三維形狀。細胞糊在控制環(huán)境中孵育，同時其保持 三維形狀足夠的時間以制備具有足夠的粘附以在平坦表面上支撐自身的體，如上所述。細胞糊可合適地通過下列方式來提供(A)混合細胞或細胞聚集體(本文中也稱 為"預選的"細胞或細胞聚集體)(可以是一種或多種細胞類型)和細胞培養(yǎng)基(本文中 也稱為"預選的"培養(yǎng)基)(例如，以預定比例)，以導致細胞懸液(本文中也稱為細胞混合 物)；以及(B)壓制細胞混合物以制備具有期望細胞密度和粘度的細胞糊。壓制可通過多種 方法來實現(xiàn)，例如通過濃縮源自細胞培養(yǎng)基的特定細胞懸液以獲得細胞糊所要求的期望細 胞濃度(密度)、粘度和一致性。例如，來自細胞培養(yǎng)基的相對稀釋的細胞懸液可被濃縮預 定時間，以獲得存在粒狀沉淀的細胞濃度，這允許在模具中成形。正切流動過濾(“TFF") 是另一種濃縮或壓制細胞的合適的方法?；衔镆部陕?lián)合細胞懸液提供要求的擠出性能。 可在本發(fā)明中使用的合適化合物的一些例子包括膠原質(zhì)、水凝膠、基質(zhì)膠、納米纖維、自組 裝性納米纖維、明膠、纖維蛋白原等。因此，在這些方法中使用的細胞糊合適地通過下列方式制備混合多個活細胞和 組織培養(yǎng)基；和壓制活細胞(例如，通過離心)。如果一種或多種ECM組分或者一種或多種 ECM組分的一種或多種衍生物包括在細胞糊中(下面進一步詳細討論)，細胞粒狀沉淀可合 適地重懸于含有ECM組分或ECM組分的衍生物的一種或多種生理學上可接受的緩沖液中， 并且將所得細胞懸液再次離心以形成細胞糊。期望用于進一步加工的細胞糊的細胞密度可以隨著細胞類型的改變而改變。細胞 之間的相互作用決定細胞糊的性能，并且不同細胞類型將在細胞密度與細胞-細胞相互作 用之間具有不同的關系。在使所述細胞糊成形之前，所述細胞可預處理以增加細胞相互作 用。例如，在離心后細胞可在離心管的內(nèi)部孵育，以在使所述細胞糊成形之前增加細胞-細 胞相互作用。多種方法可用于使本發(fā)明下的細胞糊成形。例如細胞糊可操作、手工模制或壓緊 (例如，在濃縮/壓制后)以實現(xiàn)期望形狀。例如，細胞糊可吸收(例如，吸出)到預成型裝 置，例如微量移液管(例如，毛細吸管)，使細胞糊變形以適形裝置的內(nèi)部表面。微量移液管 (例如，毛細吸管)的橫截面形狀可以是圓形、方形矩形、三角形或其他非圓形橫截面形狀。 細胞糊也可通過將其沉積到預成型模具中而成形，例如塑料模具、金屬模具或凝膠模具。此外，離心澆注或連續(xù)澆注可用于使細胞糊成形。在所述方法的一個例子中，成形包括將細胞糊保持在成形裝置中以允許細胞在成 形裝置中部分彼此粘附。例如如圖3A中所示，細胞糊55可吸出到成形裝置51 (例如，毛細 吸管)中，并保持在成形裝置中用于成熟期(本文中也稱為孵育期)(圖3B)，從而允許細胞 至少部分彼此粘附。如果細胞能夠在第一成形裝置51中實現(xiàn)足夠的粘附，多細胞體1可在 僅具有單一成熟步驟(例如單一孵育步驟)的方法中制備。例如，所述方法合適地包括使 細胞糊陽在單一成形裝置51中成形，并且在單一控制環(huán)境中孵育成形的細胞糊以允許細 胞彼此粘附，從而形成多細胞體1。如果是這樣情況，成形裝置51 (例如，毛細吸管)可合適 地是生物印刷器或類似設備的印刷頭的一部分，其可操作以自動將多細胞體放置在三維構 造中，這將在下面更詳細地描述。將ECM組分或ECM組分的衍生物(例如明膠和/或纖維 蛋白原)加入細胞糊可促進多細胞體在單一成熟步驟中的制備，因為這種組分可促進多細 胞體的總的粘附。然而，對于細胞可保持在成形裝置例如毛細吸管中的時間的量有限制，這 在細胞的活力受到影響之前提供細胞至多有限地接近氧和/或營養(yǎng)物。如果細胞不能保持在成形裝置51中用于成熟期足夠長以獲得期望粘附，部分粘 附的細胞糊陽合適地從成形裝置(例如，毛細吸管)轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301(例如，模 具)，所述第二成形裝置允許營養(yǎng)物和/或氧供應至細胞，同時它們保持在第二成形裝置中 用于另外的成熟期。允許供應細胞營養(yǎng)物和氧的合適的成形裝置301的一個例子示于圖 4A-4D中。該成形裝置是用于制備多個多細胞體(例如，基本上相同的多細胞體)的模具 301。模具301包括由這樣的材料制成的生物相容性基底303，所述材料抵抗細胞遷移和向 內(nèi)成長到基底中，并且抵抗細胞與基底的粘連。模具301可由排除細胞生長或遷移到模具 中或者與模具粘連的任何材料制成。例如，基底303可合適地由下列材料制成Tef Ion (PTFE)、不銹鋼、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、瓊脂糖、聚乙二醇、玻璃、金屬、塑料或凝膠材料(例如， 瓊脂糖凝膠或其他水凝膠)和類似材料?；?03被成形以接收包含多個細胞的組合物(例如，來自第一成形裝置51)，所 述細胞具有相對低的粘附性，并且在成熟期過程中保持所述組合物為期望三維形狀，在所 述成熟期過程中所述粘附性增加以形成所述多細胞體，所述多細胞體相對于成熟期之前的 組合物(例如具有上述多細胞體1的任意特性的多細胞體)具有更大的粘附性。模具301 還合適地被構造，使得組織培養(yǎng)基可供應至細胞糊55 (例如，通過將組織培養(yǎng)基配送到模 具的頂部上)。例如，如圖4A-4D中所示，多個細長溝槽305形成在基底303中。如圖4D中 所示，各溝槽的深度D2合適地在約500微米至約1000微米的范圍內(nèi)。在示意性實施方案 中，各溝槽305的底部合適地具有拱形(例如，半圓形)截面形狀以形成具有基本上圓形截 面形狀的細長圓柱多細胞體。溝槽305的寬度W5合適地稍微大于待在模具301中制備的多 細胞體的寬度。例如，溝槽的寬度W5合適地在約300微米至約1000微米的范圍內(nèi)。溝槽 305之間的間隔并不關鍵，但其通常期望使溝槽彼此相對緊密地間隔，以增加可在模具301 中制備的多細胞體的數(shù)量。在示意性實施方案中，例如，溝槽305之間的基底303的條帶各 自具有約2mm的寬度W4。有多種方式來制備本發(fā)明范圍內(nèi)的合適的模具。例如，圖5A-5C示出工具的一個 實施方案，通常表示為201，其可用于制備適于制備上述多細胞體的模具。通常，工具201的 一部分被構造為是在第二成熟期的過程中保持部分粘附的細胞糊的模具301的那部分的陰模(negative)。例如，工具201合適地包括體203和從所述體延伸的多個凸起205。各 凸起205被合適地設置大小和成形以在模具基底中形成凹陷或接收區(qū)域，所述模具基底保 持細胞糊陽的形狀，使得通過凸起形成在模具中的凹陷/接收區(qū)域中沒有細胞從成形的細 胞糊的外部表面超過約300微米。圖5A-5C中示出的特定工具201被構造為制備圖4A-4B中示出的模具301。凸起 205被構造為從體203的底部207延伸的多個葉片。各葉片205是模具301中的溝槽305 中的一個的陰模。葉片205具有縱軸209(圖5A)，并且被構造為制備可用于制備上述細長 多細胞體1的模具。葉片205中的至少一個從葉片的另一個的縱軸209側(cè)向間隔。在工具 201和用于在凝膠中形成孔以進行凝膠電泳的常規(guī)梳狀物之間有一個區(qū)別。在示意性實施 方案中，所有葉片205基本上彼此平行，并且各葉片相對于它們的縱軸209和其他葉片側(cè)向 間隔。葉片205合適地全是基本上彼此相同的。參照圖5C，各葉片205合適地從距離Dl為 約1. 5mm的體203延伸。葉片205的末端具有對應于模具301中的溝槽305的底部形狀的 拱形(例如，半圓形)截面形狀。各葉片的寬度W3合適地在約300微米至約1000微米的 范圍內(nèi)。分離葉片的距離W2合適地為約2mm。工具201上的唇部211合適地被構造為設置 在細胞培養(yǎng)皿的邊緣上，以保持凸起在皿的底部的上方。工具201可由多種材料制成(由 所述材料模具容易地分離)，例如Tef Ion (PTFE)、不銹鋼等。為了制備模具301，細胞培養(yǎng)皿221合適地填充液體223，所述液體可制備以固化 或建立為凝膠，如圖6A中所示。例如，液體可以是瓊脂糖溶液223。工具201放置在細胞培 養(yǎng)皿221的頂部(圖6B)，使得唇部211設置在細胞培養(yǎng)皿的邊緣225上，并且凸起205 (例 如，葉片)從工具201的底部207延伸到液體223中。液體223被允許建立以形成圍繞凸 起205(例如，葉片)的末端的固體或凝膠基底。然后工具201離開細胞培養(yǎng)皿以從新制備 的模具301分離工具201 (圖6C)。因此，如果使用第二成形裝置，部分粘附的細胞糊55合適地從第一成形裝置 51 (例如，毛細吸管)轉(zhuǎn)移至第二成形裝置(例如，圖4A-4D中示出的模具301)。部分粘附 的細胞糊陽可通過第一成形裝置51 (例如，毛細吸管)轉(zhuǎn)移至模具301的溝槽305，如圖 3C中所示。因此，所述方法包括將部分粘附的細胞糊55轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301，并且將 部分粘附的細胞糊保持在第二成形裝置中以形成多細胞體1。在成熟期后(其中模具301 被孵育以及其中的細胞糊陽保持在控制環(huán)境中以允許細胞糊中的細胞進一步彼此粘附以 形成多細胞體1)，細胞的粘附足夠強以允許所得多細胞體1通過工具51'例如圖3D中所 示的毛細吸管被撿拾。毛細吸管51'(現(xiàn)在含有已經(jīng)從模具301的溝槽305中撿拾出來的 成熟多細胞體1)可合適地是生物印刷器或類似設備的印刷頭的一部分，其可操作以自動 將多細胞體放置在三維構造中，這將在下面更詳細地描述。因此，在所述制備多細胞體1的方法的一個例子中，成形包括將細胞糊55保持在 第一成形裝置51中以允許細胞在第一成形裝置中部分彼此粘附，將部分粘附的細胞糊轉(zhuǎn) 移至第二成形裝置301，將部分粘附的細胞糊保持在第二成形裝置中以形成多細胞體1。然 而，在一些實施方案中，例如當明膠和/或纖維蛋白原加入細胞糊中時，細胞可足夠地粘附 以在第一成形裝置51中形成多細胞體，因此將細胞糊55轉(zhuǎn)移至第二成形裝置301和將細 胞糊保持在第二成形裝置中的步驟可不是必須的。第一成形裝置51可合適地包括毛細吸管，并且第二成形裝置可包括裝置，所述裝置允許營養(yǎng)物和氧供應至細胞，同時它們保持在第二成形裝置中，例如上述模具301。多細胞體的截面形狀和尺寸將基本上對應于第一成形裝置的截面形狀和尺寸，并 任選地對應于用于制備多細胞體的第二成形裝置的截面形狀和尺寸，并且熟練技術人員將 能夠選擇具有合適的成形裝置，所述裝置具有適于產(chǎn)生具有上述截面形狀、橫截面積、直徑 和長度的多細胞體的合適的截面形狀、橫截面積、直徑和長度。如上所述，大范圍細胞類型可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多細胞體。因此，一種或多種類型 的細胞或細胞聚集體，人和動物體細胞，包括例如上述所有細胞類型，可用作起始材料以產(chǎn) 生細胞糊。例如，可以使用下列細胞例如平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、間充質(zhì)細胞干 細胞、肌原細胞、成纖維細胞、心肌細胞、khwarm細胞、肝細胞或中國倉鼠卵巢(“CH0") 細胞。來自預期接受者的細胞的樣品(例如通過組織切片獲得)或來自一種或多種建立的 細胞系的細胞的樣品可被培養(yǎng)以產(chǎn)生足夠量的細胞來用于制備多細胞體。由來自預期接受 者的細胞制成的多細胞體有利地用于避免宿主炎癥反應或接受者的移植的器官或組織的 其他急性或慢性排斥。如上所述，多細胞體可以是同型細胞的或異型細胞的。為了制備同型細胞的多細 胞體，細胞糊合適地是同型細胞的，即，其包括單一細胞類型的多個活細胞。用于產(chǎn)生同型 細胞的多細胞體的細胞糊中幾乎所有的活細胞是單一細胞類型的細胞，對于低含量的雜質(zhì) 具有一些耐受性，所述雜質(zhì)包括相對少量的不同細胞類型的細胞，所述不同細胞類型的細 胞對于構造體(包括由這種細胞糊制成的同型細胞的多細胞體)的成熟產(chǎn)生可忽略不計的 影響。例如，用于制備同型細胞的多細胞體的細胞糊合適地包括第一類型的細胞，其中細胞 糊中至少約90%的細胞是第一細胞類型的細胞。為了制備異型細胞的多細胞體，另一方面，細胞糊合適地包括多于一種細胞類型 的明顯數(shù)量的細胞(即，細胞糊是異型細胞的)。例如，細胞糊可包含第一類型的多個活細 胞和第二類型的多個活細胞，第二細胞類型不同于第一細胞類型。在另一例子中，細胞糊可 包含第一細胞類型的多個活細胞、第二細胞類型的多個活細胞和第三細胞類型的多個活細 胞。因此，如果使用細胞糊來制備異型細胞的多細胞體(其繼而用于制備脈管組織)，細胞 糊中的多個活細胞可合適地包括(i)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞；(ii)平滑肌細胞和成纖維 細胞；(iii)內(nèi)皮細胞和成纖維細胞；或(iv)內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞。如上面 更詳細地討論地，當異型細胞的細胞糊用于產(chǎn)生多細胞體時，活細胞在成熟和粘附方法的 過程中基于細胞的粘連強度的差別可"整理"，并且可恢復它們的生理構象。除了多個活細胞，一種或多種ECM組分、或者一種或多種ECM組分的一種或多種衍 生物(例如，明膠、纖維蛋白原、膠原質(zhì)、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈力蛋白和/或蛋白聚糖) 可合適地包括在細胞糊中以將這些物質(zhì)引入多細胞體中，如上所述。加入細胞糊中的ECM 組分或ECM組分的衍生物可純化自人或動物源，或通過本領域已知的重組方法來制備。向 細胞糊中加入ECM組分或者ECM組分的衍生物可促進細胞在多細胞體中的粘附。例如，明 膠和/或纖維蛋白原可加入細胞糊。更特別地，10-30%明膠的溶液和10-80mg/ml纖維蛋 白原放熱溶液可和多個活細胞混合以形成含有明膠和纖維蛋白原的細胞懸液。然后細胞懸 液可壓制(例如，通過離心)以形成細胞糊。然后通過該方法形成的細胞糊可在控制環(huán)境 中成形和孵育，以允許細胞彼此粘附，從而形成多細胞體。通過凝血酶纖維蛋白原可轉(zhuǎn)化成 纖維蛋白(例如，在印刷方法的過程中)。當ECM組分或ECM組分的衍生物(例如明膠和纖維蛋白原)加入細胞糊時，成形步驟合適地包括在單一成形裝置中保持細胞糊以形成多 細胞體，并且孵育步驟合適地包括在單一控制環(huán)境中孵育成形的細胞糊以允許細胞彼此粘 附，從而形成多細胞體。本發(fā)明還提供制備包含形成為期望3-D形狀的多個細胞或細胞聚集體的多細胞 體的方法。本發(fā)明的制備方法總體上包括下列步驟1)提供細胞糊，所述細胞糊包含多個 預選擇的細胞或細胞聚集體(例如，具有期望細胞密度和粘度)；幻使所述細胞糊成形(例 如，成形為期望形狀)；以及幻通過成熟使多細胞體成型。上述成型步驟可通過一個或多個步驟實現(xiàn)以確保多細胞體(例如，細胞單元)的 粘附性。在某些方法中，在初始成熟時，細胞糊可部分穩(wěn)定或部分硬化以形成多細胞體，所 述多細胞體的完整性足以允許進一步處理。根據(jù)一個實施方案，成型步驟可包括兩個子步驟A)使細胞糊保持在成形裝置例 如微量移液管(例如，毛細吸管)中第一時間期限(例如，預定時間期限)以用于初始成熟； 和B)使成形的細胞糊沉積到保持裝置例如模具中第二時間期限(例如，預定時間期限)以 用于進一步成熟，其中保持裝置由能夠排除細胞生長或遷移到裝置中或者與裝置粘連的材 料制成。初始成熟將提供具有足夠穩(wěn)定性的細胞糊，以在進一步成熟方法的處理過程中保 持不變。多種方法可用于促進進一步成熟過程。在一個實施方案中，細胞糊可在約37°C孵 育一定時間期限(其可以是細胞類型依賴性的)以增強粘附性?；蛘呋蛄硗?，細胞糊可在 存在含有因子和/或離子的細胞培養(yǎng)基的條件下保持以增強粘附性。例如，當圓柱形狀的細胞糊在微量移液管(例如，毛細吸管)中孵育(即，初始成 熟過程)直到細胞的粘連為使得圓柱體可在不破裂的情況下從微量移液管擠出后，然后細 胞糊可在進一步成熟方法中進一步孵育并和培養(yǎng)基培養(yǎng)，這將有利于保持期望形狀。填料體本發(fā)明還提供可聯(lián)合使用上述多細胞體以形成期望三維生物工程組織的填料體。 具體而言，本發(fā)明還提供聯(lián)合使用多細胞體作為構件以用于構造生物構造的填料體(本文 中也稱為"填料基質(zhì)單元")，其中填料體用于限定缺乏多細胞體的期望3-D生物-構造體 的域。填料體合適地是具有預定形狀的體，其由能夠排除細胞生長或遷移到其中或與其粘 連的材料制成。填料體材料合適地可滲透營養(yǎng)物培養(yǎng)基(本文中也稱為組織培養(yǎng)基或細胞 培養(yǎng)基)。例如，填料體材料合適地是生物相容性凝膠材料，選自由瓊脂糖、透明質(zhì)酸、聚乙 二醇和瓊脂、或其他水凝膠或非凝膠撓性生物相容性材料構成的組。填料體可合適地用不 同材料或不同濃度的相同材料形成。例如，管腔-成型填料體可由4%瓊脂糖制成，而用于 構造期望三維生物工程組織的剩余填料體可由2%瓊脂糖制成。填料體可根據(jù)對應多細胞 體的形狀或大小而呈現(xiàn)任意形狀或大小，并且優(yōu)在一些實施方案中，填料體的形狀和尺寸基本上相同于它們用于構建期望三維生 物工程組織的多細胞體的形狀和尺寸。因此，例如，填料體可合適地具有結合多細胞體1的 上述任何形狀。例如，填料體和多細胞體可都是基本上圓柱形的，并且具有基本上相同的直 徑的基本上圓形橫截面(如圖2中所示)。填料體和多細胞體可具有不同大小和/或形狀，只要填料體和多細胞體可根據(jù)圖 案布置為使得當多細胞體彼此融合時形成期望三維生物工程組織。例如，填料體可以是基本上圓柱形，并且多細胞體可以是基本上球形(如圖2中所示)。此外，填料體和多細胞體 可是細長和基本上圓柱形的，但具有不同長度。熟練技術人員將認識到存在多種方式，其中 改變大小和形狀的填料體和多細胞體可結合以形成期望三維生物工程組織。填料體合適地通過使合適的凝膠樣材料成形為預定形狀而制備。根據(jù)一個實施方 案，該方法還可包括下列步驟1)減小(降低)填料物質(zhì)(即，預選擇的填料物質(zhì))的粘度 至液態(tài)樣材料；幻使液態(tài)樣材料成形(例如，成形為預選擇的形狀)；以及；3)提高(增加) 材料的粘度以固化成填料體(例如，具有預選擇的形狀)。許多已知方法可用于降低填料物質(zhì)的粘度，包括直接或間接加熱材料、施加壓力 或改變其濃度。而且，許多方法可用在成形步驟中，例如沉積材料到預澆注模具中，或通過 吸液管或活塞的負位移將其拉制到期望形狀的室中。此外，許多已知方法可用于增加材料 的粘度以固化其形狀，包括直接或間接冷卻材料，引起或允許溶劑除去或蒸發(fā)，允許化學作 用以硬化材料，改變組分的濃度或允許通過化學或其他作用使聚合物材料交聯(lián)。例如，根據(jù)一個實施方案，瓊脂糖溶液(初始為粉末相的瓊脂糖混合緩沖液和水) 可加熱以降低其粘度并吸收(例如，吸出)到具有期望尺寸的毛細吸管(即，微量移液管) 中(或通過活塞的負位移吸收到期望形狀的室中)。取決于填料體的期望截面形狀，可以使 用具有多種截面形狀的毛細吸管。例如，可以使用沿著其長度具有基本上圓形截面形狀的 毛細吸管來制備基本上圓柱形和具有基本上圓形橫截面形狀的填料體?；蛘?，可以使用沿 著其長度具有基本上方形橫截面的毛細吸管來制備基本上圓柱形和具有方形截面形狀的 填料體。熟練技術人員將認識到以和上述使用毛細吸管來制備多細胞體類似的方式，可以 制備具有無數(shù)截面形狀的填料體。吸液管(或室)中的瓊脂糖溶液可冷卻至室溫，例如通過使空氣置于吸液管的外 部或使吸液管投入具有冷液體的容器中來冷去，使得其可以固化成具有期望形狀的瓊脂糖 凝膠，即填料體。所得填料體可在特定生物構造體的構造過程中從吸液管或室中擠出。在其組裝包含多細胞體和填料體的布置的三維構造時，填料體可合適地通過生物 印刷器或類似設備來制備。例如毛細吸管可以是生物印刷器的印刷頭的一部分。當填料體 需要用于三維構造時，毛細吸管可傳送至液體源，其可建立為凝膠。例如，毛細吸管可傳送 以供應瓊脂糖溶液，所述溶液被加熱以保持其為液體狀態(tài)。液體可吸出到毛細吸管中，以使 液體成形為填料體的形狀。然后毛細吸管可驟冷(例如，將其浸入冷水浴)以加快瓊脂糖 凝膠的安裝。三維結構可以按照本發(fā)明的方法來使用上述多細胞體和填料體，以制備三維生物工程組 織。簡言之，根據(jù)圖案布置多個多細胞體和多個填料體，使得每個多細胞體與(i)另一多細 胞體或(ii)填料體中的至少一者相接觸。然后，使多細胞體與至少另一多細胞體相融合以 形成三維生物工程組織。然后，可以將填料體從融合多細胞體中分離以得到所述工程組織.圖2示出本發(fā)明的三維結構的一個實施方案(其統(tǒng)稱為“101”)。結構101包括 多個細長多細胞體1，合適的是，每個細長多細胞體1均與上述的細長多細胞體1相同。例 如，每個細長多細胞體1均根據(jù)上述的用于制備能夠在空氣中打印的自支撐多細胞組織體 的方法來合適地制備。將多細胞體1布置成圖案，該圖案中每個多細胞體與至少另一多細 胞體相接觸。如參照圖IC而最佳理解到的那樣，至少多細胞體1中的一個與多細胞體中的另一個沿著具有實質(zhì)長度的接觸區(qū)域相接觸。盡管圖IC示出的兩個多細胞體1是在表面 13上以并列毗鄰關系布置而不是按照圖2所示圖案布置的，應理解，在兩個多細胞體1之間 的接觸區(qū)域可以基本上與圖IC所示的接觸區(qū)域相似，無論它們是否被布置成其中它們彼 此呈并列毗鄰關系的圖案。例如，在圖2的布置中，每個多細胞體1與至少一個(例如，兩 個)其他的多細胞體在具有實質(zhì)長度的接觸區(qū)域相接觸。合適的是，位于毗鄰的并列關系 的細長多細胞體之間的接觸區(qū)域具有至少約1000微米的長度，更合適的是，至少約1厘米， 更合適的是，至少約5厘米，進一步更合適的是，在約5厘米至約30厘米的范圍。在另一例 子中，接觸區(qū)域的長度合適的是，在約1000微米至約30厘米的范圍，更合適的是，在約1厘 米至約30厘米的范圍。接觸區(qū)域的長度可對應于多細胞體1的長度。由于多細胞體1的 長度沒有理論上限，接觸區(qū)域的長度只要在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以超過30厘米(或者不同于 30厘米的任意長度)，除非某人員想要克服與長多細胞體的生產(chǎn)相關的實際困難(例如，獲 得足夠量的細胞糊的需要)。盡管多細胞體1在圖2中彼此接觸，在成熟的這個初始階段， 多細胞體沒有彼此粘附.結構還包括一個或多個填料體5，合適的是，每個填料體5均與上述的填料體相符 合。例如，圖2中的結構包括多個離散的填料體5。將填料體5與多細胞體布置成圖案，使 得每個填料體與至少一個多細胞體或另一填料體相接觸。布置圖2中的多細胞體1和填料 體5以在結構101中形成多個未被多細胞體或填料體占據(jù)的空間17。合適的是，空間17包 含組織培養(yǎng)基，可以通過將組織培養(yǎng)基傾倒在多細胞體1和填料體5的上方來將所述組織 培養(yǎng)基添加到結構101中。因此，空間17可以促進多細胞體1中營養(yǎng)物和/或氧向細胞的 供應(例如，在成熟的過程中)。圖2所示的結構中的多細胞體1可以是同型細胞體、異型細胞體、或其組合。特別 地，多細胞體1可合適地包括任一上述的細胞類型和上述細胞類型的組合。如所示的，合適 的是，所述多細胞體在所包含的細胞類型方面是基本上相同的。然而，可能一個或多個所述 多細胞體包含與結構中的另一多細胞體的細胞類型所不同的細胞類型的、本發(fā)明的范圍內(nèi) 的細胞。例如，合適的是，一個或多個多細胞體1中的每個多細胞體1中，細胞的大部分可 以是第一細胞類型的細胞(例如，內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞)，并且結構101中的一個或多個 其他多細胞體中的每個多細胞體中，細胞的大部分可以是不同于第一細胞類型的第二細胞 類型的細胞(例如，平滑肌細胞或成纖維細胞)。多細胞體1合適地具有基本上均勻的形 狀。填料體還合適地具有基本上均勻的形狀。此外，如圖2中所示，多細胞體1具有基本上 相同于填料體5的形狀的形狀。布置至少一些多細胞體1(例如，所有多細胞體)以形成管樣結構31。至少一個填 料體5'在管樣結構31中、并基本上被形成管樣結構的多細胞體1所包圍。例如，以六角形 構型布置圖2中的多細胞體1，從而形成包圍填料體5之一的管樣結構31。圖2的六角形 構型中的每個多細胞體1與至少兩個相鄰的細長多細胞體呈并列毗鄰關系。在該布置中， 管樣結構31中的一個或多個填料體5'為管腔-成型填料體。如此述及所述一個或多個管 腔-成型填料體5'是因為它們防止細胞從多細胞體1遷移并向內(nèi)成長至在整個管樣結 構31中延伸的細長空間，根據(jù)下述方法，該細長空間在所述結構成熟后成為管腔。在成熟 過程中，所述一個或多個管腔-成型填料體5'不會在其中發(fā)展出任何管腔。通常，多細胞 體(其能夠通過成熟生產(chǎn)包括有多個活細胞的管狀工程組織)的任何布置均可被認為是管樣結構，無論該管樣結構中有無填料體。由以上內(nèi)容顯而易見的是，所述管樣結構可以不同 于管狀結構，這是基于以下事實在成熟的這個階段，啦鄰多細胞體沒有彼此粘附，這樣，可 以將一個物體推入兩個形成管樣結構的毗鄰多細胞體之間的空間。圖7示出三維結構的另一實施方案(其統(tǒng)稱為“201”)。除了特別指出的內(nèi)容，該 結構可以基本上相同于上述的和圖2所示的結構。圖7中的結構201包括多個多細胞體， 每個多細胞體可以與上述的多細胞體1相符合。然而，在該結構201中，將兩個不同組的 多細胞體1'、1"布置成形成所述結構的圖案。第一組的多細胞體1'中，細胞的大部分 (例如，至少約90%的細胞)可以是第一細胞類型的細胞，并且第二組的多細胞體1"中， 細胞的大部分(例如，至少約90%的細胞)可以是不同于第一細胞類型的第二細胞類型的 細胞。例如，合適的是，第一組多細胞體1'中的細胞的大部分可以是內(nèi)皮細胞，并且，合適 的是，第二組多細胞體1"中的細胞的大部分可以是平滑肌細胞。作為另一個例子，合適的 是，第一組多細胞體1 ‘中的細胞的大部分可以是內(nèi)皮細胞，并且，合適的是，第二組多細胞 體1"中的細胞的大部分可以是成纖維細胞。作為再一個例子，合適的是，第一組多細胞體 1'中的細胞的大部分可以是平滑肌細胞，并且，合適的是，第二組多細胞體1"中的細胞的 大部分可以是成纖維細胞。第一組多細胞體1'被布置成包圍著一個或多個管腔-成型填 料體5'的六角形構型(與上述的六角形構型相似)。第二組多細胞體1"被布置成包圍 著第一組多細胞體1'以及一個或多個管腔-成型填料體5'的更大的六角形構型。多細 胞體1'、1"共同形成管樣結構231，管樣結構231包括兩種不同類型的細胞。布置第一 組多細胞體1'以形成管樣結構231的內(nèi)層，布置第二組多細胞體1"以形成管樣結構231 的外層。因此，第一細胞類型的細胞(例如，內(nèi)皮細胞)在管樣結構231的內(nèi)部更集中，第 二細胞類型的細胞(例如，平滑肌細胞)在管樣結構231的外部更集中，使得第一組多細胞 體1'中內(nèi)皮細胞數(shù)與非內(nèi)皮細胞數(shù)的比率高于第二組多細胞體1"中內(nèi)皮細胞數(shù)與非內(nèi) 皮細胞數(shù)的比率，或者第二組多細胞體1"中平滑肌細胞數(shù)與非平滑肌細胞數(shù)的比率高于 第一組多細胞體1'中平滑肌細胞數(shù)與非平滑肌細胞數(shù)的比率。該布置可促進管狀工程組 織的生產(chǎn)，該管狀工程組織具有由第一類型的細胞形成的內(nèi)層和由第二類型的細胞形成的 外層。例如，結構201可用于生產(chǎn)工程化血管，該工程化血管具有由內(nèi)皮細胞形成的內(nèi)層和 由平滑肌細胞形成的外層。在另一例子中，布置每個第一組的多細胞體1'(其包含多個 內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞)以形成管樣結構231的內(nèi)層，并布置每個第二組的多細胞體 1"(其包含成纖維細胞)以形成所述管樣結構的外層。因此，內(nèi)皮細胞在管樣結構231的 內(nèi)部更集中，平滑肌細胞在所述管樣結構的中間部分更集中，成纖維細胞在所述管樣結構 的外部更集中，使得第二組多細胞體1"中成纖維細胞數(shù)與非成纖維細胞數(shù)的比率高于第 一組多細胞體1'中成纖維細胞數(shù)與非成纖維細胞數(shù)的比率。在另一例子中，布置每個第一 組的多細胞體1'(其包含內(nèi)皮細胞)以形成管樣結構231的內(nèi)層，并布置每個第二組的多 細胞體1"(其包含多個平滑肌細胞和多個成纖維細胞)以形成所述管樣結構的外層。因 此，內(nèi)皮細胞在管樣結構231的內(nèi)部更集中，平滑肌細胞在所述管樣結構的中間部分更集 中，成纖維細胞在所述管樣結構的外部更集中，使得第一組多細胞體1'中內(nèi)皮細胞數(shù)與非 內(nèi)皮細胞數(shù)的比率高于第二組多細胞體1"中內(nèi)皮細胞數(shù)與非內(nèi)皮細胞數(shù)的比率。圖7A示出本發(fā)明的三維結構251的另一例子。該結構251與圖7所示的結構基 本相同，不同之處在于，它還包括第三組多細胞體1'"。第三組中的多細胞體1'"中，大部分細胞的細胞類型不同于分別構成第一和第二組中的多細胞體1'、1"的主要細胞類型 的各細胞類型。第三組中的多細胞體1'"通常合適地布置成包圍并毗鄰第二組中的多細 胞體1〃的六角形構型。因此，合適的是，第三組中的多細胞體1'"包圍第二組中的多細 胞體1〃和第一組中的多細胞體1'。合適的是，多細胞體1'、1〃、1' 〃共同形成由三層 多細胞體形成的管樣結構261。一個或多個管腔-成型填料體5'沿整個管樣結構261軸 向延伸。如果結構251用于形成工程化血管，合適的是，第一組中的多細胞體1'中的大部 分細胞為內(nèi)皮細胞，合適的是，第二組中的多細胞體1"中的大部分細胞為平滑肌細胞，合 適的是，第三組中的多細胞體1'“中的大部分細胞為成纖維細胞，使得第三組中的多細胞 體1'“中成纖維細胞數(shù)與非成纖維細胞數(shù)的比率高于第一組多細胞體1'或第二組中的 多細胞體1"中成纖維細胞數(shù)與非成纖維細胞數(shù)的比率。然而，多細胞體1'、1"、1'"可 以具有本發(fā)明的范圍內(nèi)的其他主要細胞類型。本發(fā)明的三維結構301的另一實施方案示于圖8中。除了特別指出的內(nèi)容，該結 構301基本上相同于上述的和圖2所示的結構結構101。在該實施方案中，用一組基本上球 形的多細胞體11來代替圖2所示的結構101中所使用的每個細長圓柱形的多細胞體1。合 適的是，球形多細胞體11是根據(jù)上述的用于生產(chǎn)自支撐多細胞體的方法來生產(chǎn)的。當然， 球形多細胞體11的形狀不同于上述多細胞體1，因為它們不具備任何上述多細胞體1的細 長的特性。合適的是，布置球形多細胞體11以形成包圍一個或多個管腔-成型填料體5' 的管樣結構331。為了促進球形多細胞體的融合，每組(例如，行)多細胞體可以偏離相鄰 組的多細胞體，這樣，每個球形多細胞體的中心在軸向方向上與相鄰組中的相毗鄰的球體 之間的距離的中點排成一線。這能夠促進融合，因為這引起了相鄰的球形多細胞體11之間 的接觸區(qū)域的增加。雖然圖8中多細胞體11只有一層包圍一個以上的管腔-成型填料體 5'，但是也可以用球形多細胞體11代替圖7或7A中的多細胞體1'、1"和1'“。關于 不同多細胞體中的細胞類型、細胞類型的組合、以及多細胞體中細胞類型的混合，球形多細 胞體提供了與細長多細胞體相同的選項。在未示出的本發(fā)明的三維結構的另一實施方案中，該結構基本上相同于上述的和 圖2所示的結構結構101。在該實施方案中，圖2所示的結構結構101中所使用的每個細 長圓柱填料體已經(jīng)被一組基本上球形的填料體所代替。合適的是，球形填料體是根據(jù)上述 的用于生產(chǎn)自支撐多細胞體的方法來生產(chǎn)的。當然，球形填料體的形狀不同于上述填料體， 因為它們不具備任何上述填料體的細長的特性。為了促進球形填料體的堆疊，每組(例如， 行)填料體可以偏離相鄰組的填料體，這樣，每個球形填料體的中心在軸向方向上與相鄰 組中的相毗鄰的球體之間的距離的中點排成一線。這能夠促進堆疊，因為這引起了相鄰的 球形填料體之間的接觸區(qū)域的增加。關于材料(例如，瓊脂糖等)，球形填料體提供了與細 長填料體相同的選項。在未示出的本發(fā)明的三維結構的另一實施方案中，該結構基本上相同于圖8所示 的結構，不同之處在于，該結構還包括上述的球形填料體以代替圖8所示的細長填料體的 至少一部分。圖9示出了三維結構的另一實施方案的一部分(其統(tǒng)稱為“401”)。合適的是，該 結構由細長多細胞體1和多個填料體5布置而成，該細長多細胞體1基本上相同于上述的 多細胞體1。圖9中，多細胞體1和填料體5中的一部分被去除以示出多細胞體和填料體的
31內(nèi)部布置。在該結構401中，將一個或多個填料體5布置為管腔-成型填料體5'。如所 示的，布置管腔-成型填料體5'以防止細胞從多細胞體向內(nèi)成長到第一和第二細長空間 411、413。管腔-成型填料體5'基本上由多細胞體1包圍。例如，合適地布置多細胞體以 形成包圍第一細長空間411的第一管樣結構431 ’、和包圍第二細長空間413的第二管樣結 構431"。盡管管樣結構431' ,431"并未完全示出，除了特別指出的內(nèi)容以外，它們與圖 2中的管樣結構31相似。管樣結構431"中的一者具有比另一管樣結構431'的直徑更大的直徑。形成較 小直徑的管樣結構431'的細長多細胞體1的至少一部分與在管狀結構431'的交叉部位 441處形成較大直徑的管樣結構的細長多細胞體1的至少一部分相接觸。此外，合適的是， 至少一個管腔-成型填料體5'在多細胞體1中的間隙451中延伸以將第一細長空間的一 端與第二細長空間相連接，這樣，由管腔-成型體5'形成于管樣結構431' ,431"中的管 腔被相互連接。因此，該結構的成熟可以生產(chǎn)分支管狀工程組織(例如，工程化血管)。圖 9所示的例子生產(chǎn)單一的分支，但是，可以將該技術擴展以生產(chǎn)高次分支結構，所述高次分 支結構包括具有擁有多個不同直徑的結構。并且，可以用圖10中的結構501所示的球形多 細胞體11來代替圖9中的細長多細胞體1。合適的是，可以對由細長多細胞體1 (圖9)或 球形多細胞體(圖10)形成的管樣結構431' ,431"進行改變，從而以與圖7和7A所示的 方式相似的方式包括一個或多個額外組的多細胞體。圖9和10所示的結構401、501也可 應用與關于上述不同多細胞體中的細胞類型、細胞類型的組合、以及多細胞體中細胞類型 的混合的相同的那些選項。圖IC示出本發(fā)明的另一三維結構601。該結構601不必包括任何填料體。相反， 以并列毗鄰關系布置一組細長多細胞體以形成片狀樣結構。雖然在圖IC所示的片狀結構 601中只有兩個多細胞體，但是可以將任意數(shù)量的額外的多細胞體與這些多細胞體并列放 置，這樣每個多細胞體均與至少另一多細胞體相接觸以增加片狀結構的寬度。制備三維結構的方法存在多種不同的方法使用上述多細胞體(包括細長多細胞體1和球形多細胞體 11)來制備(在一些情況下，與填料體5結合)本發(fā)明范圍內(nèi)的上述三維生物構造。例如， 一種方法通常包括按照這樣的圖案布置多個細長多細胞體1，該圖案使得每一個多細胞 體都與至少另一個多細胞體接觸，然后允許至少一個(例如，全部)多細胞體與至少另一個 多細胞體融合，從而產(chǎn)生期望的三維生物工程組織。布置多細胞體不一定包括任何填料體 (例如參見圖1C)。然而，還可以布置多個多細胞體(包括上述細長多細胞體1和球形多細 胞體11)和一個或多個填料體5，以便每一個多細胞體都接觸至少另一個多細胞體、或填料 體，然后允許多細胞體融合，以形成期望的三維生物工程組織。可以采用多種方法以預定的圖案輸送多細胞體，以產(chǎn)生期望的三維結構。例如，可 以手工將多細胞體放置為彼此接觸或與填料體接觸，通過用吸液管、管嘴或針頭擠出將多 細胞體沉積在合適位置，或者通過自動化機器將其接觸定位。如圖11中所示，例如，采用一 種或多種工具(其可合適地包括上述的第一成形裝置51、從上述的模具01中取出多細胞體 的毛細吸管51'、和/或不同工具)來撿拾多細胞體(例如，將它們從上述的模具301中取 出)。工具傳送多細胞體至組裝區(qū)域(例如玻璃表面)，在此處三維構造(例如，如圖1C、2、 7、7A或8-10中任意一個所示)被組裝，并且該工具分配或以其他方式將多細胞體相對于任
32意其他的多細胞體或任何填料體(其已經(jīng)被傳送到組裝區(qū)域并且置于被組裝的構造體內(nèi)) 定位。在將多細胞體置于其位置之后，適當?shù)刂貜蜕鲜鲞^程，以將另一個多細胞體、或填 料體加入到構造體內(nèi)(例如，通過將其與已經(jīng)置于構造體內(nèi)的多細胞體并排放置)。如果待 組裝的構造體包括一個或多個填料體，則適當?shù)夭捎闷渌墓ぞ?其未被示出，但是可以 與成形裝置51或毛細吸管51'相似)撿拾填料體5 (或如上所述的那樣制備填料體)、傳 送填料體至組裝區(qū)域，并且無論何時需要填料體，均可將其分配或以其他方式放置在正在 組裝的構造體內(nèi)的相應位置內(nèi)。通過能夠操作以期望的圖案布置多細胞體和填料體的生物 印刷器或其他自動化機器適當?shù)爻休d用于將將多細胞體傳送至組裝區(qū)域的工具51、51'。 例如，一種合適的生物印刷器在美國專利申請No. 20040253365中公開，其通過引用的方式 并入本文。組織工程領域內(nèi)的技術人員熟悉其他合適的生物印刷器，以及用于將多細胞體 (和填料體，如果它們使用的話)置于合適的構造體內(nèi)的相似裝置。用于將填料體傳送到組 裝區(qū)域內(nèi)的工具可以適當?shù)貫樯镉∷⑵鞯牧硪粋€印刷頭的一部分。生物印刷器可以具有 多個印刷頭，并且/或者可以將用于傳送多細胞體和填料體的多個工具51、51 ‘依次加載 到一個或多個生物印刷器印刷頭內(nèi)。雖然采用生物印刷器或類似的裝置自動地構造體是有 利的，但是本發(fā)明所述的方法可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)手工進行(例如，采用一個或多個毛 細吸管)。如圖11中所示，可以適當?shù)貙⒍嗉毎w1置于(例如，堆疊)到一個或多個填料 體5的上部。可以適當?shù)貙⒍嗉毎w1與其他的多細胞體和/或填料體5相鄰設置。因此， 多細胞體1并不被推入或嵌入任意的填料體5內(nèi)。這可以成為“空氣內(nèi)印刷”，因為多細胞 體并未分配到凝膠或液體內(nèi)。圖12所示的方法基本上類似于圖11所示的方法，不同之處 在于采用球形多細胞體11代替圖11所示的細長多細胞體1。圖11和12分別示出了制備 圖2和8所示的構造體的方法，但是應理解，諸如圖1C、7、7A、8和9以及上述的構造體(以 及其他許多構造體)可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)以相似的方法制備。一旦完成組裝構造體，將組織培養(yǎng)基適當?shù)氐谷霕嬙祗w的上部上。組織培養(yǎng)基可 以進入多細胞體和填料體之間的間隙內(nèi)，以支撐多細胞體內(nèi)的細胞。使三維構造內(nèi)的多細 胞體彼此融合，以制備生物工程組織?！叭诤稀笔侵膏徑拥亩嗉毎w的細胞直接通過細胞表 面蛋白的相互作用或者間接通過細胞與ECM成分或ECM成分的衍生物的相互作用彼此粘 附。在融合之后，將任何包括在構造體內(nèi)的填料體與工程組織分離。在包括管狀結構的構 造體的情況下，例如，可以出去管的外部的任何填料體(例如，通過將它們與由管狀構造形 成的管狀結構剝離)?？梢赃m當?shù)貙⒐軤罱Y構內(nèi)的任何管腔-成型填料體5'從管狀結構 的開口端拉出。如果需要的話，管腔-成型填料體5'可以適當?shù)赜蓳闲圆牧现瞥?，以促進 從管腔內(nèi)拉出填料體，這可能是有用的(例如，如果工程組織是支化管狀結構)。另一個選 擇是由能夠在融合后溶解(例如，通過升溫、光火其他刺激物溶解)的材料制備填料體5和 管腔-成型填料體5'。本發(fā)明還提供通過以下方法使用多細胞體制造具有三維形狀的生物構造體(例 如，組織、血管或器官)，所述方法為在預先選擇的接收環(huán)境內(nèi)根據(jù)預定的三維圖案進一 步輸送多個多細胞體，使得細胞單元可以融合為所需的生物構造體。融合的兩個或多個多 細胞體可以具有相同或不同的形狀或尺寸，并且可以含有相同或不同的細胞類型。多細胞體可以以多種方式用于生物-構造體-工程中。例如，可以制造包含所需結構的上半部和 下半部的兩種不同形狀的多細胞體，并且可以使之接觸，并且允許其融合?；蛘撸梢越M裝 多個多細胞體，并且允許其與填料體組合而融合為所需的形狀。根據(jù)一個實施方案，當多細 胞體與填料體一起使用時，工程化方法可以包括以下步驟:A)以與多個填料體的預定組合 根據(jù)預定圖案輸送多個多細胞體，以形成層化構造體，由此多細胞體和填料體相鄰接，B)將 層化構造體沉積到預選擇的控制環(huán)境內(nèi)以進行熟化，由此多細胞體彼此融合，從而產(chǎn)生融 合構造體；并且C)從融合構造體中除去填料體，從而形成期望的生物構造體。此外，各多細胞體1、11可以由兩種或多種細胞類型構成，從而產(chǎn)生含有兩種或多 種細胞類型的生物構造體。這些細胞類型預期可以根據(jù)其對結構表面的親和力或其他力 (如細胞相互作用)的不同而分離。例如，例如，圓柱形模制的多細胞體可以由平滑肌細胞 和內(nèi)皮細胞的混合物產(chǎn)生，從而產(chǎn)生管狀結構，例如可移植的血管。然后可以將這些多細胞 體定位(如圖12所示的那樣)，并且允許其融合為管狀構造體。在通過構造體的管腔注入 內(nèi)皮細胞后，預期其移動到管狀構造體的中心內(nèi)表面，而平滑肌細胞主要集中于外部。作為 另一個例子，如果多細胞體1包括內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的混合物，預期內(nèi)皮細胞在通過 構造體的管腔注入到構造體內(nèi)后，移動到管狀構造體的中心內(nèi)表面，而成纖維細胞主要集 中于外部。作為又一個例子，如果多細胞體包括內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞的混合 物，則預期內(nèi)皮細胞在通過構造體的管腔注入到構造體內(nèi)后，移動到管狀構造體的中心內(nèi) 表面，預期成纖維細胞移動到構造體的外層，并且可以預期平滑肌細胞移動到介于內(nèi)皮細 胞層和外成纖維細胞層之間的中間層。三維工程化管狀結構本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的方法制造細胞管狀構造體。圖13和14示出了通過本 文所述的方法構建的實際生物構造體。圖13示出在成熟并且除去填料體之后、兩種不同的 管狀生物-構造體的側(cè)面。圖14示出在除去所有填料體之后、管狀構造體的端面。上述構造體的一個實施方案示意性地示于圖15中，并且通常表示為801。三維管 狀結構801包括至少一個填料體5'和多個彼此粘附的活細胞，細胞形成基本上圍繞至少 一個填料體的管狀結構801。填料體5'包含這樣的適應性生物相容性材料，該材料抵抗細 胞遷移和向內(nèi)成長而進入材料內(nèi)，并且抵抗細胞粘連到材料上。生物相容性材料也可滲透 營養(yǎng)物。三維管狀結構的長度合適地為至少約1000微米，長度更合適地為至少約5厘米 (例如，在約5厘米至約30厘米的范圍內(nèi))。在一些情況下，三維管狀結構適合的長度合適 地為小于約30厘米。對于多細胞體，對三維管狀結構的長度沒有理論上限，因此應認識到， 可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)制備長度超過30厘米(或不同于30厘米的任意長度)的三維管狀 結構，只要人們自愿克服與制備長管狀結構相關的困難即可(例如，獲得足量的細胞，處理 可能需要制備上述結構的長多細胞體等)。與單獨的多細胞體一樣，三維管狀結構可以由單獨的細胞類型組成，或者可以包 括多種細胞類型?？梢允褂蒙鲜龅娜我饧毎愋椭苽淙S管狀結構。因此，例如，管狀結構 可以基本上為同型細胞的(即，管狀結構內(nèi)的幾乎所有的活細胞是單一細胞類型的細胞， 對于低含量的雜質(zhì)具有一些耐受性，所述雜質(zhì)包括相對少量的不同細胞類型的細胞，所述 不同細胞類型的細胞對于管狀構造體的成熟產(chǎn)生可忽略不計的影響)。更具體而言，管狀結構的細胞可以合適地基本上由單一細胞類型的細胞組成?；蛘?，管狀結構的細胞可以合適 地包含第一細胞類型的細胞，并且至少約90%的細胞為第一細胞類型的細胞。管狀結構還可以是異型細胞的，其包括兩種或多種不同的細胞類型。如果管狀結 構是血管狀結構，則管狀結構有利地包括細胞類型通常在血管組織內(nèi)存在的細胞(例如， 內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等)。在一個例子中，管狀結構的細胞包括多個第一細 胞類型的活細胞和多個第二細胞類型的活細胞，第二細胞類型不同于第一細胞類型。在另 一例子中，管狀結構的細胞包括多個第一細胞類型的活細胞、多個第二類型的活細胞和多 個第三細胞類型的活細胞。因此，對于血管狀結構而言，細胞可合適地包括(i)內(nèi)皮細胞 和平滑肌細胞；(ii)平滑肌細胞和成纖維細胞；(iii)內(nèi)皮細胞和成纖維細胞；或(iv)內(nèi) 皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞。此外，在血管狀結構中，內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維 細胞可有利地形成模擬自然產(chǎn)生的組織內(nèi)存在的細胞類型層。因此，在一個例子中，在含有 內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的血管狀結構內(nèi)，內(nèi)皮細胞有利地形成基本上圍繞所述至少一種填 料體的內(nèi)層，并且平滑肌細胞有利地形成基本上圍繞所述至少一種填料體層和由內(nèi)皮細胞 形成的內(nèi)層的層。在另一例子中，在含有內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的血管狀結構內(nèi)，內(nèi)皮細胞 有利地形成基本上圍繞所述至少一個填料體的內(nèi)層，并且成纖維細胞有利地形成基本上圍 繞所述至少一個填料體和由內(nèi)皮細胞形成內(nèi)層的層。作為另一個例子，在含有平滑肌細胞 和成纖維細胞的血管狀結構內(nèi)，平滑肌細胞有利地形成基本上圍繞所述至少一個填料體的 內(nèi)層，并且成纖維細胞有利地形成基本上圍繞所述至少一個填料體和由平滑肌細胞形成的 內(nèi)層的層。在另一例子中，在含有內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的血管狀結構內(nèi)，內(nèi) 皮細胞合適地形成基本上圍繞所述至少一個填料體的內(nèi)層，平滑肌細胞合適地形成基本上 圍繞所述至少一個填料體和由內(nèi)皮細胞形成的內(nèi)層的第二層，并且成纖維細胞合適地形成 基本上圍繞所述至少一個填料體、由內(nèi)皮細胞形成的內(nèi)層和由平滑肌細胞形成的第二層的 層。三維支化管狀結構也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在該結構的一個例子中，多個活細胞 形成基本上圍繞作為管腔-成型填料體的一個或多個填料體的支化管狀結構。管腔-成型 填料體被布置，以防止活細胞向內(nèi)成長為第一和第二細長空間，其中第一細長空間的端部 與第二細長空間的端部相鄰。至少一個填料體的適應性生物相容性材料選自由瓊脂糖、瓊脂、透明質(zhì)酸和聚乙 二醇構成的組?？梢酝ㄟ^將填料體從管狀結構中拉出，從而將至少一個填料體與管狀結構 分離。
實施例實施例1 多細胞體的制備以及使用豬平滑肌細胞的組織工程I.豬平滑肌細胞使豬平滑肌細胞(SMC)在以前研究中所用的相同條件下生長。培 養(yǎng)基組成為Dulbecco' s Modified Eagle低糖培養(yǎng)基(DMEM)，其補充有10%豬血清、10% 牛血清、50mg/L of脯氨酸、20mg/L的丙氨酸、50mg/L的甘氨酸、50mg/L的抗壞血酸、12μ g/ L的得自血小板的生長因子BB(PDGF-BB)、12 μ g/L的基礎成纖維細胞生長因子(bFGF)、 3.0 μ g/L的CuS04、0· OlM的HEPES緩沖液和1. OxlO5單位/L的青霉素和鏈霉素。使細胞 在涂敷于IOcm Petri培養(yǎng)皿上的明膠(得自豬皮的明膠)上生長，并且在37°C、5% CO2的條件下孵育。在用于多細胞體(例如，細胞單元)制備之前，將SMC次培養(yǎng)至第7代。需要 18個長滿的Petri (即，細胞培養(yǎng)物)培養(yǎng)皿來制備M個細胞單元和4個管(外徑(OD) 1. 5mm ；內(nèi)徑(ID) :0. 5mm ；長度(L) :5cm)。II.瓊脂糖模具(i) 2%瓊脂糖溶液的制備。將2g超純低熔點(LMP)瓊脂糖溶解于IOOml的超純 水/緩沖溶液(1:1，ν/ν)中。緩沖溶液可以是PBS = Dulbecco' s磷酸鹽緩沖液Ix或 HBSS = Hanks平衡鹽溶液lx。將瓊脂糖溶液置于含有溫水(超過80°C )的燒杯內(nèi)，并且 保持在熱板上，直至瓊脂糖完全溶解為止。只要溫度高于36°C，瓊脂糖溶液就保持為液體。 在低于36°C時，發(fā)生相轉(zhuǎn)變，粘度增加并且最終瓊脂糖形成凝膠。(ii)制備瓊脂糖模具。使用納入Petri培養(yǎng)皿(直徑為IOcm)的Teflon印刷 器(即，Teflon工具)形成瓊脂糖模具(圖5A-5C)。將組件(Teflon印刷器+Petri培養(yǎng) 皿)水平保持，并且將約40ml的預熱的瓊脂糖通過Teflon印刷器的孔倒入至Petri培養(yǎng) 皿內(nèi)。在除去所有起泡之后，將組件置于4°C下至少1小時。在瓊脂糖完全凝膠化之后，除 去Teflon印刷器，并且在瓊脂糖內(nèi)可以看到溝槽(參見圖4D中的溝槽305)。將IOml的培 養(yǎng)基加入模具中。III.多細胞體的制備從長滿的Petri培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基，并且用IOml的HBSS+2mMCaCl2洗滌細胞。 均勻地鋪撒1. 5ml的胰蛋白酶(0. )，以使得細胞從表面上脫離。將5ml的培養(yǎng)基+2mM CaCl2加入到Petri培養(yǎng)皿中。使細胞懸液在900g的速度下離心5分鐘。在除去培養(yǎng)基 (即，上清液)之后，將細胞粒狀沉淀重懸浮在200 μ 1的培養(yǎng)基+2mM CaCl2中，并且上下抽 吸(即，劇烈吸移)幾次，以破壞細胞團聚體，并且獲得單獨細胞的懸液。將溶液轉(zhuǎn)移到置 于15ml離心管內(nèi)的aiil Eppendorf管內(nèi)。通過在1300g的速度下離心2分鐘而形成高密 度細胞糊。除去培養(yǎng)基(即，上清液)，并且通過抽吸將細胞糊轉(zhuǎn)移到毛細管(0D lmm, ID 0.5或0.3mm)內(nèi)，所述毛細管插入到安裝于Iml Eppendorf吸移管管理器上的Iml末端內(nèi)。 將含有細胞糊的毛細管于37°C、5% CO2的條件下在培養(yǎng)基+2mM CaCl2內(nèi)孵育15分鐘。用 柱塞將成形的細胞糊從毛細管內(nèi)擠壓到填充有培養(yǎng)基的瓊脂糖模具的溝槽內(nèi)(圖3C)。將 模具置于孵育器內(nèi)過夜。第二天，將成熟多細胞體人工吸入(即，吸回)到毛細管(圖3D) 內(nèi)，并置于培養(yǎng)基中，直到進一步使用。IV.組織工程.將IOml預熱的2%瓊脂糖溶液沉積在直徑為IOcm的Petri培養(yǎng)皿上，并且均勻 地鋪展，以形成均一的層。在4°C的冰箱內(nèi)制備瓊脂糖凝膠。用瓊脂糖溶液填充毛細管，并 且迅速冷卻(采用吹掃的冷風或冷PBS溶液)，以形成填料體。對于管腔-成型填料體，瓊 脂糖濃度為4%;對于其他任何填料體，瓊脂糖濃度為2%。在雙筒顯微鏡下，使用柱塞或絲 線將填料體從毛細管中擠出，并且將5cm的瓊脂糖棒(即，填料體)直放在瓊脂糖Petri培 養(yǎng)皿內(nèi)的瓊脂糖層上。將第二填料體與第一個并置，諸如類推，直至沉積9個填料體以形成 第一層。按照圖11所示的方式沉積構成第二層的6個填料體。將兩個多細胞體沉積在第 4和第5位置，以形成管的第一層。通過在第3和第5位置沉積5個填料體和2個多細胞 體而形成第三層。第四層由置于第3和第4位置的4個填料體和2個多細胞體組成。第5 層由5個填料體組成(圖幻。在整個沉積過程中，將少量的培養(yǎng)基(此時為10 μ 1)加入到
36構造體的側(cè)面，以避免材料(瓊脂糖和多細胞體)的脫水。將0. 5to Iml液態(tài)瓊脂糖(37°C < T < 40°C )倒入至構造體的周圍和上部，以保持其完整性。在凝膠化后，加入培養(yǎng)基直至 構造體完整地浸入。將構造體置于孵育器內(nèi)。在48小時之后，多細胞體已經(jīng)彼此融合。通 過從管狀結構的外表面剝離瓊脂糖，并且將填充管狀結構的管腔的填料體從管狀結構中取 出，從而除去瓊脂糖。然后將管轉(zhuǎn)移到生物反應器內(nèi)，以進一步熟化?？梢允褂萌魏问惺劭?得的生物反應器進行熟化。實施例2 可供選用的用于制備多細胞體以及進行組織工程的其他過程I.各種類型的細胞的生長條件將用鈣粘蛋白傳染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞在Dulbecco' sModifiedEagle 培養(yǎng)基(DMEM)中生長，所述培養(yǎng)基補充有10%的牛胚胎血清(FBQ、抗生素(100U/mL青霉 素-鏈霉素和25 μ g/mL的慶大霉素)以及400 μ g/ml的遺傳霉素。除了慶大霉素之外，所 有抗生素均購自hvitrogen公司。人臍靜脈平滑肌細胞(HUSMC)和人皮膚成纖維細胞(HSF)購自美國典型培養(yǎng)物 保藏中心(編號分別為CRL-2481和CRL-2522)。使HUSMC在DMEM內(nèi)生長，所述DMEM含有 Ham' sF12(比例為3 1)、10% FBS、抗生素(100U/mL青霉素-鏈霉素和25 μ g/mL的慶 大霉素)、20 μ g/mL內(nèi)皮細胞生長補充物(ECGQ和0. IM的丙酮酸鈉(NaPy)。使人皮膚成 纖維細胞(HSF)在DMEM內(nèi)生長，所述DMEM含有Ham' s F12(比例為3 1),20% FBS、抗 生素(100U/mL青霉素/鏈霉素和25 μ g/mL的慶大霉素)、2mM谷氨酸鹽和0. IM的NaPy。使剛分離的豬大動脈平滑肌細胞(PASMC)在低糖DMEM中生長，所述DMEM含有 10% FBS、10%豬血清、L-抗壞血酸、硫酸銅、HEPES, L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸和青 毒素G0將所有細胞系(除了 CHO之外)在涂敷于培養(yǎng)皿上的0.5%明膠(豬皮明膠)上 培養(yǎng)，并且保持在37°C的含有5% CO2的濕潤氣氛中。II.多細胞體的制備用磷酸鹽緩沖溶液(PBQ洗滌細胞培養(yǎng)基兩次，用0. 胰島素處理10分鐘，并且 將所得細胞懸液在1，500RPM的速度下離心5分鐘。將細胞重懸浮在細1的細胞型特異性 培養(yǎng)基內(nèi)，并且在轉(zhuǎn)動搖床上的10-ml組織培養(yǎng)燒瓶內(nèi)于37°C、5% CO2的條件下孵育1小 時，以進行恢復粘附性，然后在1，500RPM的速度下離心5分鐘。然后，將細胞重懸浮，并且 在200 μ 1的培養(yǎng)基內(nèi)劇烈抽吸，然后于3，500RPM的速度下重新離心2分鐘。所得細胞粒 狀沉淀(細胞糊)轉(zhuǎn)移至內(nèi)徑為300μπι或500μπι的毛細管內(nèi)，并且在37°C、5% CO2的條 件下孵育15分鐘。對于基本上球形的多細胞體，使用HSF或CHO細胞，并且將部分粘附的細胞糊機械 擠出，并且剪切為相等的片段，從而允許其在轉(zhuǎn)動搖床上于37°C、5% CO2的條件下聚集過 夜。根據(jù)毛細管的直徑的不同，該工序提供了具有確定的大小和細胞數(shù)量的規(guī)則球狀體。對于細長多細胞體，使用PASMC、HUSMC或HSF，并且使用生物印刷器將部分粘附的 細胞糊機械擠出到特別制備的非粘附性Teflon或瓊脂糖模具內(nèi)。在模具內(nèi)于37°C、5% CO2 的條件下熟化過夜之后，多細胞體具有足以與填料體一起沉積的粘附力，從而產(chǎn)生實施例1 所述的三維工程組織。III.填料體的制備
為了制備瓊脂糖棒，將液態(tài)瓊脂糖(溫度>40°C)加載到毛細管(300或500μπι ID)中。對于管腔-成型填料體，瓊脂糖濃度為4% ；對于所有其他填料體，瓊脂糖濃度為 2%。將加載的毛細管浸入冷PBS(4°C)中。由于瓊脂糖不粘連毛細管，因此在凝膠化后，通 過生物印刷器使用另一印頭可容易地擠出連續(xù)的棒。IV.免疫組織化學將組織在4%的多聚甲醛內(nèi)固定過夜。在脫水之后，將組織處理，以滲入并且嵌入 石蠟內(nèi)?？傮w而言，將5μπι切片用蘇木精-伊紅染色。對于免疫組織化學法，將切片和下列 抗體孵育抗-分裂半胱天冬酶-3(與小鼠和人分裂半胱天冬酶-31 50反應的兔抗-分 裂半胱天冬酶-3多克隆抗體的1 50稀釋液)、抗-平滑肌肌動蛋白(鼠抗人平滑肌肌 動蛋白(1A4)的1 400稀釋液)。使用DAB(3' - 二氨基對氨基聯(lián)苯四鹽酸鹽)目視觀 察第二抗體(EnVision+，與抗-鼠抗體或抗-兔抗體結合的辣根過氧化酶標記的聚合物)。 將切片用Mayer' s蘇木精逆染色，并且放上蓋玻片，以進行顯微鏡觀察(1X70)。V.使用基本上球形的多細胞體的組織工程為了將基本上球形的多細胞體組裝成具有確定結構的定制管狀結構，通過將填料 體(例如瓊脂糖棒)用作構件，設計無骨架的方法。當瓊脂糖棒與基本上球形和基本上均 勻的多細胞體疊層沉積時，可以對管直徑、壁厚度和分支圖案進行精確控制(圖10)。采用該方法，可以最初根據(jù)圖8所示的圖案手工構建直管。使用由HSF構成的基 本球形的多細胞體組裝最小的管，并且其直徑為900 μ m，壁厚度為300 μ m(圖16A)。在組 裝后，基本上球形多細胞體在5至7天內(nèi)彼此融合，從而產(chǎn)生最終管狀構造體。為了更詳細 地研究融合過程，用綠色或紅色膜染料對CHO細胞染色，從而產(chǎn)生基本上球形的多細胞體， 然后根據(jù)圖6所示的方案進行組裝。綠色和紅色球狀體的交替融合示于圖16B中，并且顯 示出明顯的融合邊界(其中稍微摻雜)，從而證實了早期的發(fā)現(xiàn)。除了管直徑和壁厚度的靈活性之外，作為其獨特的特征，所提出的方法還提供了 構造分支大脈管結構的方式。為此，為了確保正確的腔內(nèi)連接，將血管樹的不同分支同時進 行組裝。使用由HSF構成的直徑為300 μ m的基本上球形的多細胞體構建具有直徑不同的 分支的支化管狀結構(圖16C)。分支的直徑為1. 2mm(實線箭頭)和0. 9mm(破折箭頭) (圖16C)。基本上球形的多細胞體在5至7天內(nèi)彼此融合以形成融合的支化管狀結構(圖 16D)。VI.使用細長多細胞體來形成單層和雙層脈管的組織工程為了提高速度、精密度和重現(xiàn)性、從而適應潛在的臨床應用的方法，特別構建的三 維輸送裝置(即，生物印刷器)適合于沉積填料體(例如，瓊脂糖棒)和細長多細胞體，從 而維持了上述的相同概念方法(圖2)。計算機輔助快速原型設計生物印刷技術允許根據(jù)上述的模板(圖2、受控地同時 沉積填料體(例如，瓊脂糖棒)和細長多細胞體(例如，多細胞圓柱體)。使用裝有兩個垂 直移動的印刷頭的生物印刷器進行沉積，一個用于制備和擠出瓊脂糖棒，另一個用于沉積 多細胞圓柱體。瓊脂糖棒的裝載、凝膠化和擠出以完全自動的循環(huán)進行。與印刷頭相連的 毛細吸管-柱子首先移動到溫熱的液態(tài)瓊脂糖容器，以進行裝載。接著，為了允許瓊脂糖的 快速凝膠化，將裝載的柱子浸入到PBS的冷容器內(nèi)。最終，將所得瓊脂糖棒擠壓到Petri培 養(yǎng)皿內(nèi)。當沉積方案需要輸送多細胞圓柱體時，將一個所述的圓柱體從瓊脂糖模具引入到毛細吸管內(nèi)。然后，將毛細吸管加載入第二印刷頭，并且將多細胞圓柱體類似地擠出到瓊脂 糖棒上。根據(jù)圖2所示的設計印刷簡單的HUSMC直管。兩個印刷頭在計算機輔助下的移動 和協(xié)作確保了預先設計的圖案的重現(xiàn)性。在組裝后，由HUSMC制成的多細胞體在2至4天 內(nèi)融合為最終管狀結構，并且除去支撐用的瓊脂糖棒。兩個不同直徑的融合管(外徑分別 為1200微米和900微米)示于圖13中。接下來，構建類似于具有基質(zhì)和外膜的大脈管系統(tǒng)內(nèi)的血管的雙層脈管。為此，根 據(jù)圖17所示圖案將HUSMC和HSF圓柱體同時用作構件。為了表明所述方法的通用性，還通 過交替沉積由HUSMC和HSF組成的多細胞圓柱體(不具有體內(nèi)等同性的圖案)，從而設計 出管(圖17E)。蘇木精-曙紅(H&E)(圖17B，17F)和HUSMC的平滑肌肌動蛋白染色(圖 17C, 17G)表明在3天融合后的工程化構造中，SMC和成纖維細胞層或區(qū)域之間具有明顯的 邊界。半胱天冬酶3染色顯示出在管狀結構的壁內(nèi)出現(xiàn)一些程序性死亡的細胞(圖17D、 17H)。圖17A-D中示出的更復雜雙層結構需要更多時間來融合。單一和雙層管的外徑在約0. 9mm至約2. 5mm的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的組織工程方法中，工程化的構造體僅由細胞構建，從而獲得了最高可 能的細胞密度。這是重要的，因為天然血管具有細胞相對稠密的基質(zhì)層以及相鄰的重疊 SMC。本發(fā)明的方法采用多細胞三維球狀體或圓柱體作為構件。之前已經(jīng)通過液相系統(tǒng)模 擬將通過細胞-細胞相互作用產(chǎn)生的組織粘附性進行定量，并且報導了 SMC為迄今所觀察 到的最具有自我粘附性的細胞類型之一。多細胞組裝體和液相之間的模擬對本文所用的某 些形態(tài)學發(fā)展過程提供了更好的理解。本研究中所述的多細胞球狀體和圓柱體的整合或融 合與生理理解是一致的在以小時計的時刻表中，由游動的、粘附的細胞構成的組織模擬高 度粘性的不可壓縮的液體，這是一種組織工程之前所采用的概念。實施例3 明膠和/或纖維蛋白在制備多細胞體和三維融合的管狀結構中的用途人大動脈平滑肌細胞(HASMC)購自Cascade Biologies 公司(C-007-5C)。使HASMC 在補充有平滑肌生長補充物(SMGQ的培養(yǎng)基231中生長。使HASMC在未涂覆的細胞培養(yǎng) 皿上生長，并且保持在37°C的含有5% CO2的濕潤氣氛內(nèi)。將HASMC受胰蛋白酶作用，重懸浮于組織培養(yǎng)基內(nèi)，并且按照上述實施例1和2的 方式離心。離心之后，除去組織培養(yǎng)基(即，上清液)，并且將細胞(1個長滿的Petri培養(yǎng) 皿)首先重懸浮于100 μ 1纖維蛋白原(50mg/ml，在0.9%妝(1溶液中)的溶液內(nèi)，然后加 入70 μ 1的明膠溶液(20%，在磷酸緩沖液(PBS)內(nèi))。將細胞懸液再次離心，除去上清液， 并且將含有細胞粒狀沉淀的離心管置于37°C水浴(明膠保持液態(tài)的溫度)中，直到可以將 細胞糊吸入到毛細管中。然后將細胞糊吸入到毛細管中，并置于PBS的冰冷溶液內(nèi)15分鐘。 在該步驟中，明膠凝膠化并且賦予多細胞體足夠的粘附性，使得它們可以立即印刷，而無需 第二成形步驟或第二孵育步驟。將多細胞體與填料體一起沉積在上述實施例1中所述的接 收表面上，從而形成期望的三維生物結構(例如，管狀結構)。在沉積各層以將纖維蛋白原 轉(zhuǎn)化為纖維蛋白之后，加入凝血酶溶液(50U/ml)。然后將三維結構置于孵育器內(nèi)，以按照上 述實施例1的方式進行熟化，以及多細胞體彼此之間的融合。圖18示出使用該方法在沉積12天后產(chǎn)生的管狀結構。圖18A示出在除去瓊脂 糖填料體之前采用上述方法產(chǎn)生的管狀結構，并且圖18B-G示出除去瓊脂糖之后的上述結 構。圖18C和18D示出采用所述方法產(chǎn)生的管狀結構，該結構已經(jīng)沿縱向切開，以示出多細胞體之間的融合程度。圖18E-18G是使用該方法制備的管狀結構的橫斷面視圖。
雖然結合具體的實施方案對本發(fā)明進行了描述，但是應當理解，本發(fā)明的方法能 夠進行各種改變。本專利申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途和改編，其通常采用本發(fā)明 的原理，并且包括用本發(fā)明所述技術領域內(nèi)的已知或慣用手段得到的不同于本發(fā)明公開的 內(nèi)容，并且可以采用之前闡述，并且在后面所附權利要求范圍內(nèi)的基本特征。
權利要求
1.一種包含多個活細胞和組織培養(yǎng)基的細長多細胞體，其中所述細胞彼此粘附，并 且所述多細胞體的長度為至少約1000微米，所述多細胞體沿其長度的平均橫截面積在約 7，850平方微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。
2.一種包含多個活細胞的工程化細長多細胞體，其中所述細胞彼此粘附，并且所述多 細胞體的長度為至少約1000微米，所述多細胞體沿其長度的平均橫截面積在約7，850平方 微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。
3.一種包含多個活細胞的非神經(jīng)支配和非軟骨細長多細胞體，其中所述細胞彼此粘 附，并且所述多細胞體的長度為至少約1000微米，所述多細胞體沿其長度的平均橫截面積 在約7，850平方微米至約360，000平方微米的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體是無管腔的。
5.一種包含多個活細胞和組織培養(yǎng)基的無管腔細長多細胞體，其中所述細胞彼此粘 附，并且所述多細胞體的高寬比為至少約2。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體的長度為至少約 1厘米。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體的長度為至少約 5厘米。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體的長度為小于約 30厘米。
9.根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體的長度在約5厘 米至約30厘米的范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權利要求1至9中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體沿著其長度的平 均橫截面積在約31，400平方微米至約250，000平方微米的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體沿著其長度的 平均橫截面積在約31，400平方微米至約90，000平方微米的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權利要求1至11中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體是基本上圓柱 形的，并且具有基本上圓形橫截面。
13.根據(jù)權利要求1至11中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體基本上由單一 細胞類型的多個活細胞構成。
14.根據(jù)權利要求1至11中任一項所述的多細胞體，其中所述多細胞體包括第一類型 的活細胞，并且至少約90%的所述細胞是所述第一類型的細胞。
15.根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的多細胞體，其中所述多個活細胞包含第一細 胞類型的多個活細胞和第二細胞類型的多個活細胞，并且所述第二細胞類型不同于所述第 一細胞類型。
16.根據(jù)權利要求15所述的多細胞體，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并 且所述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞。
17.根據(jù)權利要求15所述的多細胞體，其中所述第一類型的活細胞是平滑肌細胞并且 所述第二類型的活細胞是成纖維細胞。
18.根據(jù)權利要求15所述的多細胞體，其中所述第一類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所 述第二類型的活細胞是成纖維細胞。
19.根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的多細胞體，其中所述多個活細胞包含第一細 胞類型的多個活細胞、第二細胞類型的多個活細胞、和第三細胞類型的多個活細胞，其中所 述第一、第二和第三細胞類型中的各種和所述第一、第二和第三細胞類型中的其他種是不 同的。
20.根據(jù)權利要求19所述的多細胞體，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞， 所述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞，并且所述第三細胞類型的活細胞是成纖維細 胞。
21.根據(jù)權利要求1至16中任一項所述的多細胞體，還包含一種或多種細胞外基質(zhì)組 分、或者一種或多種細胞外基質(zhì)組分的一種或多種衍生物。
22.根據(jù)權利要求21所述的多細胞體，其中所述一種或多種細胞外基質(zhì)組分的一種或 多種衍生物包含明膠。
23.根據(jù)權利要求21或22所述的多細胞體，其中所述一種或多種細胞外基質(zhì)組分包含 纖維蛋白原或纖維蛋白。
24.根據(jù)權利要求1至23中任一項所述的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞 的粘附足夠強以當所述多細胞體被平坦表面支撐時，允許所述多細胞體保持三維形狀，所 述三維形狀包括寬度和高度，所述高度是所述寬度的至少約一半。
25.根據(jù)權利要求1至M中任一項所述的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞 的粘附足夠強以當所述多細胞體被平坦表面支撐時，允許所述多細胞體保持三維形狀，所 述三維形狀被構造為(i)包括在所述多細胞體的底部上的接觸表面，其中所述多細胞體 接觸所述表面；和(ii)因此所述多細胞體的所述三維形狀在所述平坦表面上的二維凸起 的面積是比所述接觸表面的面積更大的面積。
26.根據(jù)權利要求1至25中任一項所述的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞 的粘附足夠強以當所述其他多細胞體在所述多細胞體的上面時，允許所述多細胞體支撐基 本上相同于所述多細胞體的另一多細胞體的重量。
27.根據(jù)權利要求1至沈中任一項所述的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞 的粘附足夠強以允許所述多細胞體通過工具被撿拾。
28.一種制備包含多個活細胞的細長多細胞體的方法，該方法包括使包含多個活細胞的細胞糊成形為細長形狀；以及在控制環(huán)境中孵育所述成形的細胞糊，以允許所述細胞彼此粘附，從而形成所述細長 多細胞體。
29.一種制備包含多個活細胞的多細胞體的方法，該方法包括使包含多個活細胞的細胞糊在保持所述細胞糊為三維形狀的裝置中成形；以及在控制環(huán)境中孵育所述成形的細胞糊，同時其保持為所述三維形狀足夠的時間以制備 這樣的體，所述體具有足夠的粘附以在平坦表面上支撐自身。
30.根據(jù)權利要求觀或四所述的方法，還包括通過混合多個活細胞和組織培養(yǎng)基來制 備所述細胞糊。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述制備包括壓制所述活細胞。
32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中所述壓制包括離心包含多個活細胞的細胞懸液。
33.根據(jù)權利要求觀至31中任一項所述的方法，其中所述成形包括將所述細胞糊保持 在第一成形裝置中以允許所述細胞在所述第一成形裝置中部分彼此粘附，將所述部分粘附 的細胞糊轉(zhuǎn)移至第二成形裝置，以及將所述部分粘附的細胞糊保持在所述第二成形裝置中 以形成所述多細胞體。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述第一成形裝置包括毛細吸管，并且所述第 二成形裝置包括這樣的裝置，該裝置允許營養(yǎng)物和氧供應至所述細胞，同時它們保持在所 述第二成形裝置中。
35.根據(jù)權利要求33或34所述的方法，其中所述第二成形裝置包含由生物相容性材料 制成的模具，所述生物相容性材料抵抗細胞向其遷移和向內(nèi)成長并且抵抗細胞與其粘連。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述生物相容性材料選自由聚四氟乙烯 (PTFE)、不銹鋼、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、瓊脂和聚乙二醇構成的組。
37.根據(jù)權利要求觀或四所述的方法，還包括通過下列方式來制備所述細胞糊混合 多個活細胞和包含約10至約30%的明膠的溶液以形成細胞懸液；和壓制所述細胞懸液以 形成所述細胞糊。
38.根據(jù)權利要求觀、四或37所述的方法，還包括通過下列方式來制備所述細胞糊 混合多個活細胞和包含約10-80mg/ml的纖維蛋白原的溶液以形成細胞懸液；和壓制所述 細胞懸液以形成所述細胞糊。
39.根據(jù)權利要求觀至38中任一項所述的方法，其中所述細胞糊基本上由單一細胞類 型的多個活細胞構成。
40.根據(jù)權利要求觀至38中任一項所述的方法，其中所述細胞糊包括第一細胞類型的 活細胞，并且至少約90%的所述細胞是所述第一細胞類型的細胞。
41.根據(jù)權利要求觀至38中任一項所述的方法，其中所述細胞糊包含第一細胞類型的 多個活細胞和第二細胞類型的多個活細胞，所述第二細胞類型不同于所述第一細胞類型。
42.根據(jù)權利要求41所述的方法，其中所述細胞糊包含多個內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞。
43.根據(jù)權利要求觀至42中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀沿著其長度的平均橫截面積在約7，850平方微米至約 360, 000平方微米的范圍內(nèi)。
44.根據(jù)權利要求觀至43中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形成為細長形狀，所述細長形狀沿著其長度的平均橫截面積在約31，400平方微米 至約250，000平方微米的范圍內(nèi)。
45.根據(jù)權利要求觀至44中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀沿著其長度的平均橫截面積在約31，400平方微米至 約90，000平方微米的范圍內(nèi)。
46.根據(jù)權利要求觀至45中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀的長度為至少約1000微米。
47.根據(jù)權利要求觀至46中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀的長度為至少約1厘米。
48.根據(jù)權利要求觀至47中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀的長度為至少約5厘米。
49.根據(jù)權利要求觀至48中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀的長度為小于約30厘米。
50.根據(jù)權利要求觀至49中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為細長形狀，所述細長形狀的長度在約5厘米至約30厘米的范圍內(nèi)。
51.根據(jù)權利要求觀至50中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使所述細 胞糊成形為基本上圓柱形狀，所述圓柱形狀具有基本上圓形橫截面。
52.根據(jù)權利要求觀至51中任一項所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使細胞糊 成形，所述細胞糊包含多個活細胞、和一種或多種細胞外基質(zhì)組分或者一種或多種細胞外 基質(zhì)組分的一種或多種衍生物。
53.根據(jù)權利要求52所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使包含多個活細胞和明 膠的細胞糊成形。
54.根據(jù)權利要求52或53所述的方法，其中使所述細胞糊成形包括使包含多個活細胞 和纖維蛋白原的細胞糊成形。
55.根據(jù)權利要求52至M中任一項所述的方法，其中所述成形包括使所述細胞糊保持 在單一成形裝置中以形成所述多細胞體。
56.根據(jù)權利要求53至55中任一項所述的方法，其中所述孵育包括在單一控制環(huán)境中 孵育所述成形的細胞糊以允許所述細胞彼此粘附，從而形成所述多細胞體。
57.一種包含多個非神經(jīng)支配細長多細胞體的三維結構，各多細胞體包含彼此粘附的 多個活細胞，其中所述多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其他多細胞體， 并且所述多細胞體不彼此粘附。
58.一種包含多個工程化細長多細胞體的三維結構，各多細胞體包含彼此粘附的多個 活細胞，其中所述多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其他多細胞體，并且 所述多細胞體不彼此粘附。
59.一種包含多個細長多細胞體的三維結構，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞 和組織培養(yǎng)基，其中所述多細胞體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其他多細胞 體，并且所述多細胞體不彼此粘附。
60.一種三維結構包含多個非神經(jīng)支配多細胞體，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞；其中所述多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米的接觸區(qū)域所述多 細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。
61.一種三維結構，包含多個工程化多細胞體，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞；其中所述多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米的接觸區(qū)域所述多 細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。
62.一種三維結構，包含多個多細胞體，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞和組織培養(yǎng)基；其中所述多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1000微米的接觸區(qū)域所述多 細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。
63.根據(jù)權利要求57或60所述的三維結構，還包含一種或多種填料體，各填料體包含 生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自所述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所 述填料體中，并且抵抗所述多細胞體中的細胞與所述填料體粘連，其中所述填料體和所述 多細胞體布置成圖案，因此各填料體接觸至少一種多細胞體或另一填料體。
64.一種三維結構，包含多個多細胞體，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞；以及多個離散的填料體，各填料體包含生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自所 述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述填料體中，并且抵抗所述多細胞體中的細胞與所 述填料體粘連，其中所述多細胞體和所述填料體布置成圖案，其中各多細胞體接觸至少一種其他多細 胞體或至少一種填料體。
65.一種三維結構，包含多個多細胞體，各多細胞體包含彼此粘附的多個活細胞；以及多個填料體，各填料體包含生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自所述多細 胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述填料體中，并且抵抗所述多細胞體中的細胞與所述填料 體粘連，其中所述多細胞體和所述填料體布置以在所述三維結構中形成多個空間，所述空間不 被所述多細胞體占據(jù)并且不被所述填料體占據(jù)。
66.根據(jù)權利要求65所述的結構，其中所述三維結構中的多個空間的至少一些填充組織培養(yǎng)基。
67.根據(jù)權利要求57至65中任一項所述的結構，其中所述多細胞體沿著它們的縱軸各 自具有約7，850平方微米至約360，000平方微米范圍內(nèi)的平均橫截面積。
68.根據(jù)權利要求57至67中任一項所述的結構，其中所述多細胞體的長度均為至少約 1000微米。
69.根據(jù)權利要求57至68中任一項所述的結構，其中所述多細胞體的長度均為小于約 30厘米。
70.根據(jù)權利要求57至69中任一項所述的結構，其中所述多細胞體均基本上由單一細 胞類型的細胞構成。
71.根據(jù)權利要求57至69中任一項所述的結構，其中多細胞體均包括第一類型的活細 胞，并且在各多細胞體中至少約90%的所述細胞是所述第一細胞類型的細胞。
72.根據(jù)權利要求57至69中任一項所述的結構，其中一種或多種所述多細胞體包含第 一細胞類型的多個活細胞和第二細胞類型的多個活細胞，所述第二細胞類型不同于所述第 一細胞類型。
73.根據(jù)權利要求72所述的結構，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所 述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞。
74.根據(jù)權利要求72所述的結構，其中所述第一類型的活細胞是平滑肌細胞并且所述 第二類型的活細胞是成纖維細胞。
75.根據(jù)權利要求72所述的結構，其中所述第一類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所述第 二類型的活細胞是成纖維細胞。
76.根據(jù)權利要求57至69中任一項所述的結構，其中一種或多種所述多細胞體包含第 一細胞類型的多個活細胞、第二類型的多個活細胞、和第三細胞類型的多個活細胞，其中所 述第一、第二和第三細胞類型中的各種和所述第一、第二和第三細胞類型中的其他種是不 同的。
77.根據(jù)權利要求76所述的結構，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞，所述 第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞，并且所述第三細胞類型的活細胞是成纖維細胞。
78.根據(jù)權利要求57至69中任一項所述的結構，其中所述一種或多種多細胞體中的各 種的大部分細胞是第一細胞類型的細胞，并且一種或多種其他多細胞體中的各種的大部分 細胞是第二細胞類型的細胞，所述第二細胞類型不同于所述第一細胞類型。
79.根據(jù)權利要求78所述的結構，其中所述第一細胞類型的細胞是內(nèi)皮細胞并且所述 第二細胞類型的細胞是平滑肌細胞。
80.根據(jù)權利要求57至79中任一項所述的結構，其中所述多細胞體具有基本上均勻的 形狀。
81.根據(jù)權利要求63至80中任一項所述的結構，其中所述填料體具有基本上均勻的的 形狀。
82.根據(jù)權利要求63至81中任一項所述的結構，其中所述填料體和多細胞體具有基本 上相同的形狀。
83.根據(jù)權利要求63至82中任一項所述的結構，其中所述填料體具有細長形狀。
84.根據(jù)權利要求63至83中任一項所述的結構，其中所述多個多細胞體中的至少一些 布置以形成管樣結構，并且所述填料體中的至少一種在所述管樣結構內(nèi)部。
85.根據(jù)權利要求84所述的結構，其中所述多細胞體中的至少一些布置成圍繞所述至 少一種填料體的六邊形構造以形成所述管樣結構。
86.根據(jù)權利要求84或85所述的結構，其中圍繞所述至少一種填料體的所述多細胞體 均包含多個內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞。
87.根據(jù)權利要求86所述的結構，其中圍繞所述至少一種填料體的所述多細胞體均還 包含多個成纖維細胞。
88.根據(jù)權利要求84或85所述的結構，其中所述多細胞體包括第一和第二組多細胞 體，所述第一組中的各多細胞體包含內(nèi)皮細胞，所述第二組中的各多細胞體包含平滑肌細 胞，所述第一組的所述多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的內(nèi)層，所述 第二組的所述多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的第二層并且所述內(nèi) 層由所述第一組的多細胞體形成，其中所述第一組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的 比大于所述第二組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比。
89.根據(jù)權利要求88所述的結構，其中所述第二組中的平滑肌細胞數(shù)量和非平滑肌細 胞的細胞數(shù)量的比大于所述第一組中的平滑肌細胞數(shù)量和非平滑肌細胞的細胞數(shù)量的比。
90.根據(jù)權利要求88或89所述的結構，其中所述多細胞體還包括第三組多細胞體，所 述第三組中的各多細胞體包含成纖維細胞，所述第三組的多細胞體布置以形成基本上圍繞 所述至少一種填料體的層，所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成，并且所述第二層由所 述第二組的多細胞體形成，其中所述第三組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比 大于所述第一組或第二組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比。
91.根據(jù)權利要求84或85所述的結構，其中所述多細胞體包括第一和第二組多細胞 體，所述第一組中的各多細胞體包含多個內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞，所述第二組中的各 多細胞體包含成纖維細胞，所述第一組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填 料體的內(nèi)層，所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的層并且 所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成，其中所述第二組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維 細胞數(shù)量的比大于所述第一組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比。
92.根據(jù)權利要求84或85所述的結構，其中所述多細胞體包括第一和第二組多細胞 體，所述第一組中的各多細胞體包含內(nèi)皮細胞，所述第二組中的各多細胞體包含多個平滑 肌細胞和多個成纖維細胞，所述第一組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填 料體的內(nèi)層，所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的層并且 所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成，其中所述第一組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞 數(shù)量的比大于所述第二組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比。
93.根據(jù)權利要求63至83中任一項所述的結構，其中一種或多種所述填料體是管 腔-成型填料體，所述管腔-成型填料體布置以防止來自所述多細胞體的細胞向內(nèi)成長到 第一和第二細長空間，其中所述第一細長空間的端部相鄰所述第二細長空間的側(cè)面，所述 管腔-成型填料體基本上被所述多細胞體圍繞，因此所述多細胞體可以融合以形成分支管 狀結構。
94.根據(jù)權利要求93所述的結構，其中所述多細胞體均包含內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。
95.根據(jù)權利要求93所述的結構，其中所述多細胞體包括第一和第二組多細胞體，所 述第一組中的各多細胞體包含大部分內(nèi)皮細胞，所述第二組中的各多細胞體包含大部分平 滑肌細胞，所述第一組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述管腔-成型填料體的內(nèi)層， 所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述管腔-成型填料體的層并且所述內(nèi)層 由所述第一組的多細胞體形成。
96.根據(jù)權利要求93至95中任一項所述的結構，其中多個多細胞體包括第一和第二組 多細胞體，所述第一組中的多細胞體具有縱軸，并且通常彼此并排定位以圍繞所述第一細 長空間，所述第一組中的多細胞體的縱軸通常和所述第一細長空間對齊，以及所述第二組 中的多細胞體具有縱軸，并且通常彼此并排定位以圍繞所述第二細長空間，所述第二組中 的多細胞體的縱軸通常和所述第二細長空間對齊。
97.根據(jù)權利要求57至83中任一項所述的結構，其中所述多細胞體中的至少一些布置 以形成片狀。
98.根據(jù)權利要求57至97中任一項所述的結構，其中所述多細胞體是基本上圓柱形， 并且具有基本上圓形橫截面。
99.根據(jù)權利要求57至98中任一項所述的結構，其中所述多細胞體布置成圖案，其中 沿著長度為至少約1厘米的接觸區(qū)域所述多細胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。
100.根據(jù)權利要求57至99中任一項所述的結構，其中所述多細胞體布置成圖案，其中 沿著長度在約1厘米至約30厘米范圍內(nèi)的接觸區(qū)域所述多細胞體中的至少一種接觸所述 多細胞體中的另一種。
101.根據(jù)權利要求57至100中任一項所述的三維結構，其中所述多細胞體中的至少一些的高寬比在約20至約2000的范圍內(nèi)。
102.根據(jù)權利要求57至101中任一項所述的三維結構，其中所述多細胞體的長度均在 約1厘米至約30厘米的范圍內(nèi)。
103.根據(jù)權利要求57至102中任一項所述的三維結構，其中在所述多細胞體中所述細 胞的粘附足夠強以當所述多細胞體被平坦表面支撐時，允許所述多細胞體保持三維形狀， 所述三維形狀包括寬度和高度，所述高度是所述寬度的至少約一半。
104.根據(jù)權利要求57至103中任一項所述的三維結構，其中在所述多細胞體中所述細 胞的粘附足夠強以當所述多細胞體被平坦表面支撐時，允許所述多細胞體保持三維形狀， 所述三維形狀被構造為(i)包括在各所述多細胞體的底部上的接觸表面，其中所述多細 胞體接觸所述表面；和(ii)因此所述多細胞體的所述三維形狀在所述平坦表面上的二維 凸起的面積大于所述接觸表面的面積。
105.根據(jù)權利要求57至104中任一項所述的三維結構，其中在各所述多細胞體中所述 細胞的粘附足夠強以當所述其他多細胞體在所述多細胞體的上面時，允許各所述多細胞體 支撐基本上相同于所述多細胞體的另一多細胞體的重量。
106.根據(jù)權利要求57至105中任一項所述的三維結構，其中在各所述多細胞體中所述 細胞的粘附足夠強以允許各所述多細胞體通過工具被撿拾。
107.一種制備三維生物工程組織的方法，該方法包括根據(jù)圖案布置多個細長多細胞體，使得所述多細胞體中的各種接觸至少一種其他多細 胞體，其中各多細胞體包含多個活細胞；允許所述多細胞體中的至少一種和至少一種其他多細胞體融合。
108.根據(jù)權利要求107的方法，還包括使一種或多種填料體和所述多細胞體布置成圖 案，使得各填料體接觸至少一種多細胞體或另一填料體，各填料體包含生物相容性材料，所 述生物相容性材料抵抗來自所述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到所述填料體中，并且抵 抗所述多細胞體中的細胞與所述填料體粘連。
109.一種制備三維生物工程組織的方法，該方法包括根據(jù)圖案布置多個多細胞體和多個填料體，使得所述多細胞體中的各種接觸至少一種 (i)另一多細胞體或(ii)填料體，其中各多細胞體包含多個活細胞，以及其中各填料體包 含生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自所述多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長到 所述生物相容性材料中，并且抵抗所述多細胞體中的細胞與所述填料體粘連，以及允許所述多細胞體中的至少一種和至少一種其他多細胞體融合。
110.根據(jù)權利要求108或109所述的方法，其中所述布置包括布置所述多細胞體和所 述填料體以形成具有多個空間的三維結構，所述空間不被所述多細胞體占據(jù)并且不被所述 填料體占據(jù)。
111.根據(jù)權利要求110所述的方法，還包括使用組織培養(yǎng)基填充多個空間的至少一些。
112.根據(jù)權利要求107至111中任一項所述的方法，其中所述布置導致沿著程度為至 少約1000微米的接觸區(qū)域所述多細胞體中的至少兩種彼此接觸。
113.根據(jù)權利要求108至112中任一項所述的方法，還包括從所述融合多細胞體分離 所述填料體以獲得所述工程組織。
114.根據(jù)權利要求108至113中任一項所述的方法，其中布置所述填料體包括布置可 滲透營養(yǎng)物的填料體。
115.根據(jù)權利要求107至114中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體沿著它們的縱軸各自具有約7，850平方微米至約360，000 平方微米范圍內(nèi)的平均橫截面積。
116.根據(jù)權利要求107至115中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體的長度為至少約1000微米。
117.根據(jù)權利要求107至116中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體的長度為小于約30厘米。
118.根據(jù)權利要求107至117中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體基本上由單一細胞類型的細胞構成。
119.根據(jù)權利要求107至117中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布 置這樣的多細胞體，其中多細胞體均包括第一類型的活細胞，并且在各多細胞體中至少約 90%的所述細胞是所述第一細胞類型的細胞。
120.根據(jù)權利要求107至117中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 一種或多種多細胞體，所述一種或多種多細胞體包含第一細胞類型的多個活細胞和第二細 胞類型的多個活細胞，所述第二細胞類型不同于所述第一細胞類型。
121.根據(jù)權利要求120所述的方法，其中所述第一類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所述 第二類型的活細胞是平滑肌細胞。
122.根據(jù)權利要求120所述的方法，其中所述第一類型的活細胞是平滑肌細胞并且所 述第二類型的活細胞是成纖維細胞。
123.根據(jù)權利要求120所述的方法，其中所述第一類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所述 第二類型的活細胞是成纖維細胞。
124.根據(jù)權利要求107至117中任一項所述的方法，其中一種或多種所述多細胞體包 含第一細胞類型的多個活細胞、第二類型的多個活細胞、和第三細胞類型的多個活細胞，其 中所述第一、第二和第三細胞類型中的各種和所述第一、第二和第三細胞類型中的其他種 是不同的。
125.根據(jù)權利要求IM所述的方法，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞，所 述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞，并且所述第三細胞類型的活細胞是成纖維細胞。
126.根據(jù)權利要求107至121中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體具有基本上均勻的形狀。
127.根據(jù)權利要求108至126中任一項所述的方法，其中布置所述填料體包括布置這 樣的填料體，所述填料體具有基本上均勻的形狀。
128.根據(jù)權利要求108至127中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體和所述填 料體包括布置這樣的多細胞體和填料體，所述多細胞體和所述填料體具有基本上相同的形 狀。
129.根據(jù)權利要求108至128中任一項所述的方法，其中布置所述填料體包括布置這 樣的填料體，所述填料體具有細長形狀。
130.根據(jù)權利要求108至129中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體和所述填料體包括布置多個多細胞體中的至少一些以形成管樣結構，所述管樣結構內(nèi)部具有所述填 料體中的至少一種。
131.根據(jù)權利要求130所述的方法，其中布置所述多細胞體包括使所述多細胞體中的 至少一些布置成圍繞所述至少一種填料體的六邊形構造以形成所述管樣結構。
132.根據(jù)權利要求130至131中任一項所述的方法，其中圍繞所述至少一種填料體的 所述多細胞體均包含多個內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞。
133.根據(jù)權利要求132所述的方法，其中圍繞所述至少一種填料體的所述多細胞體均 還包含多個成纖維細胞。
134.根據(jù)權利要求130至131中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多個多細胞體，所述多細胞體包括第一和第二組多細胞體，所述第一組中的各多細 胞體包含內(nèi)皮細胞，所述第二組中的各多細胞體包含平滑肌細胞，所述第一組的所述多細 胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的內(nèi)層，所述第二組的所述多細胞體布置 以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的第二層并且所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體 形成，其中所述第一組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比大于所述第二組中的內(nèi)皮 細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比。
135.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所述第二組中的平滑肌細胞數(shù)量和非平滑肌 細胞的細胞數(shù)量的比大于所述第一組中的平滑肌細胞數(shù)量和非平滑肌細胞的細胞數(shù)量的 比。
136.根據(jù)權利要求134或135所述的方法，其中布置所述多細胞體還包括布置這樣的 多個多細胞體，所述多細胞體包括第三組多細胞體，所述第三組中的各多細胞體包含成纖 維細胞，所述第三組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料體的層，所述內(nèi) 層由所述第一組的多細胞體形成，并且所述第二層由所述第二組的多細胞體形成，其中所 述第三組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比大于所述第一組或第二組中的成 纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比。
137.根據(jù)權利要求130或131所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置第一和第 二組多細胞體，所述第一組中的各多細胞體包含多個內(nèi)皮細胞和多個平滑肌細胞，所述第 二組中的各多細胞體包含成纖維細胞，所述第一組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述 至少一種填料體的內(nèi)層，所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料 體的層并且所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成，其中所述第二組中的成纖維細胞數(shù)量 和非成纖維細胞數(shù)量的比大于所述第一組中的成纖維細胞數(shù)量和非成纖維細胞數(shù)量的比。
138.根據(jù)權利要求130或131所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置第一和第 二組多細胞體，所述第一組中的各多細胞體包含內(nèi)皮細胞，所述第二組中的各多細胞體包 含多個平滑肌細胞和多個成纖維細胞，所述第一組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述 至少一種填料體的內(nèi)層，所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍繞所述至少一種填料 體的層并且所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成，其中所述第一組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和 非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比大于所述第二組中的內(nèi)皮細胞數(shù)量和非內(nèi)皮細胞數(shù)量的比。
139.根據(jù)權利要求130至138中任一項所述的方法，其中所述分離包括將所述至少一 種填料體從所述管樣結構的內(nèi)部拉出。
140.根據(jù)權利要求108至129中任一項所述的方法，其中布置所述填料體包括布置一種或多種填料體，所述一種或多種填料體是管腔-成型填料體，所述管腔-成型填料體布 置以防止來自所述多細胞體的細胞向內(nèi)成長到第一和第二細長空間，其中所述第一細長空 間的端部相鄰所述第二細長空間的側(cè)面，所述管腔-成型填料體基本上被所述多細胞體圍 繞，因此所述多細胞體可以融合以形成分支管狀結構。
141.根據(jù)權利要求140所述的方法，其中所述多細胞體均包含內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。
142.根據(jù)權利要求140所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置多個多細胞體， 所述多細胞體包括第一和第二組多細胞體，所述第一組中的各多細胞體包含大部分內(nèi)皮細 胞，所述第二組中的各多細胞體包含大部分平滑肌細胞，所述第一組的多細胞體布置以形 成基本上圍繞所述管腔-成型填料體的內(nèi)層，所述第二組的多細胞體布置以形成基本上圍 繞所述管腔-成型填料體的層并且所述內(nèi)層由所述第一組的多細胞體形成。
143.根據(jù)權利要求140至142中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 多個多細胞體，所述多細胞體包括第一和第二組多細胞體，所述第一組中的多細胞體具有縱軸，并且通常彼此并排定位以圍繞所述第一細長空 間，所述第一組中的多細胞體的縱軸通常和所述第一細長空間對齊，以及所述第二組中的多細胞體具有縱軸，并且通常彼此并排定位以圍繞所述第二細長空 間，所述第二組中的多細胞體的縱軸通常和所述第二細長空間對齊。
144.根據(jù)權利要求107至129中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 所述多細胞體中的至少一些以形成片狀。
145.根據(jù)權利要求107至144中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，所述多細胞體是基本上圓柱形，并且具有基本上圓形橫截面。
146.根據(jù)權利要求107至145中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括使所 述多細胞體布置成圖案，其中沿著長度為至少約1厘米的接觸區(qū)域所述多細胞體中的至少 一種接觸所述多細胞體中的另一種。
147.根據(jù)權利要求132至146中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括使所 述多細胞體布置成圖案，其中沿著長度在約1厘米至約30厘米范圍內(nèi)的接觸區(qū)域所述多細 胞體中的至少一種接觸所述多細胞體中的另一種。
148.根據(jù)權利要求107至147中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括步驟 所述多細胞體中的至少一些的高寬比在約20至約2000的范圍內(nèi)。
149.根據(jù)權利要求107至148中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 所述多細胞體的長度均在約1厘米至約30厘米的范圍內(nèi)。
150.根據(jù)權利要求107至149中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞的粘附足夠強以允許當所述多細胞體在 平坦表面上支撐自身時保持三維形狀，所述三維形狀包括寬度和高度，所述高度是所述寬 度的至少50%。
151.根據(jù)權利要求107至150中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞的粘附足夠強以當所述多細胞體被平坦 表面支撐時，允許所述多細胞體保持三維形狀，所述三維形狀被構造為(i)包括在所述多 細胞體的底部上的接觸表面，其中所述多細胞體接觸所述表面；和(ii)因此所述多細胞體的所述三維形狀在所述平坦表面上的二維凸起的面積是比所述接觸表面的面積更大的面 積。
152.根據(jù)權利要求107至151中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞的粘附足夠強以當所述其他多細胞體在 所述多細胞體的上面時，允許所述多細胞體支撐基本上相同于所述多細胞體的另一多細胞體的重量。
153.根據(jù)權利要求107至152中任一項所述的方法，其中布置所述多細胞體包括布置 這樣的多細胞體，其中在所述多細胞體中所述細胞的粘附足夠強以允許所述多細胞體通過 工具被撿拾。
154.根據(jù)權利要求107至153中任一項所述的方法，其中所述布置是自動的。
155.—種包含至少一種填料體和彼此粘附的多個活細胞的三維結構，所述細胞形成基 本上圍繞所述至少一種填料體的管狀結構，其中所述填料體包含適應性生物相容性材料， 所述生物相容性材料抵抗細胞向所述材料遷移和向內(nèi)成長并且抵抗細胞與所述材料粘連。
156.根據(jù)權利要求155所述的結構，其中所述生物相容性材料可滲透營養(yǎng)物。
157.根據(jù)權利要求155或156所述的結構，其中所述管狀結構的長度為至少約1000微米。
158.根據(jù)權利要求155至157中任一項所述的結構，其中所述管狀結構的長度為小于 約30厘米。
159.根據(jù)權利要求155至158中任一項所述的結構，其中所述管狀結構的長度在約5 厘米至約30厘米的范圍內(nèi)。
160.根據(jù)權利要求155至159中任一項所述的結構，其中多個活細胞基本上由單一細 胞類型的細胞構成。
161.根據(jù)權利要求155至159中任一項所述的結構，其中多個活細胞包括第一細胞類 型的活細胞，并且至少約90%的所述細胞是所述第一細胞類型的細胞。
162.根據(jù)權利要求155至159中任一項所述的結構，其中多個活細胞包含第一細胞類 型的多個活細胞和第二細胞類型的多個活細胞，所述第二細胞類型不同于所述第一細胞類 型。
163.根據(jù)權利要求162所述的結構，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且 所述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞。
164.根據(jù)權利要求162所述的結構，其中所述第一類型的活細胞是平滑肌細胞并且所 述第二類型的活細胞是成纖維細胞。
165.根據(jù)權利要求162所述的結構，其中所述第一類型的活細胞是內(nèi)皮細胞并且所述 第二類型的活細胞是成纖維細胞。
166.根據(jù)權利要求155至159中任一項所述的結構，其中多個活細胞包含第一細胞類 型的多個活細胞、第二類型的多個活細胞、和第三細胞類型的多個活細胞，其中所述第一、 第二和第三細胞類型中的各種和所述第一、第二和第三細胞類型中的其他種是不同的。
167.根據(jù)權利要求166所述的結構，其中所述第一細胞類型的活細胞是內(nèi)皮細胞，所 述第二細胞類型的活細胞是平滑肌細胞，并且所述第三細胞類型的活細胞是成纖維細胞。
168.根據(jù)權利要求163所述的結構，其中所述內(nèi)皮細胞形成基本上圍繞所述至少一種填料體的內(nèi)層，以及所述平滑肌細胞形成基本上圍繞所述至少一種填料體的層并且所述內(nèi) 層由所述內(nèi)皮細胞形成。
169.根據(jù)權利要求166所述的結構，其中所述內(nèi)皮細胞形成基本上圍繞所述至少一種 填料體的內(nèi)層，所述平滑肌細胞形成基本上圍繞所述至少一種填料體的第二層并且所述內(nèi) 層由所述內(nèi)皮細胞形成，以及所述成纖維細胞形成基本上圍繞所述至少一種填料體的第三 層并且所述內(nèi)層由所述內(nèi)皮細胞形成和所述第二層由所述平滑肌細胞形成。
170.根據(jù)權利要求155至168中任一項所述的結構，其中所述活細胞形成基本上圍繞 一種或多種所述填料體的分支管狀結構，所述一種或多種填料體是管腔-成型填料體，所 述管腔-成型填料體布置以防止所述活細胞向內(nèi)成長到第一和第二細長空間，其中所述第 一細長空間的端部相鄰所述第二細長空間的側(cè)面。
171.根據(jù)權利要求155至170中任一項所述的結構，其中所述適應性生物相容性材料 選自由瓊脂糖、瓊脂、透明質(zhì)酸和聚乙二醇構成的組。
172.根據(jù)權利要求155至171中任一項所述的結構，其中所述至少一種填料體可通過 將所述填料體從所述管狀結構中拉出而從所述管狀結構分離。
173.一種制備包含彼此粘附的多個活細胞的多細胞體的模具，所述模具包括生物相容 性基底，所述生物相容性基底抵抗細胞遷移和向內(nèi)成長到所述基底中，并且抵抗所述細胞 與所述基底粘連，所述基底被成形以接收包含多個細胞的組合物，所述細胞具有相對低的 粘附性，并且在成熟期過程中保持所述組合物為期望形狀，在所述成熟期過程中所述粘附 性增加以形成所述多細胞體，所述多細胞體的期望形狀具有至少約1000微米的長度，并且 被構造使得所述多細胞體內(nèi)的每個細胞從所述體的外部不超過約250微米。
174.—種制備適于制備多個多細胞體的模具的工具，其中各體包含彼此粘附的多個活 細胞，所述工具包含具有頂部和底部的主體；和從所述主體的底部延伸的多個葉片，其中所述葉片的寬度均在約100微米至約800微 米的范圍內(nèi)以在生物相容性凝膠基底中形成溝槽，所述生物相容性凝膠基底被構造用于使 置于所述溝槽中的活細胞成型為細長多細胞體，其中所述葉片具有縱軸，并且所述葉片中 的至少一個與所述葉片的另一個的縱軸側(cè)向間隔。
全文摘要
用于組織工程的結構和方法包括多細胞體，所述多細胞體包括多個活細胞。多個多細胞體可以布置成圖案，并允許融合以形成工程組織。所述布置可包括填料體，所述填料體包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗來自多細胞體的細胞遷移和向內(nèi)成長，并且抵抗細胞與其粘連。三維構造可以通過下列方式來組裝合適地沿著具有實質(zhì)長度的接觸區(qū)域印刷或者堆疊多細胞體和填料體，使得毗鄰多細胞體之間存在直接接觸。多細胞體之間的直接接觸促進高效和可靠的融合。毗鄰多細胞體之間增加的接觸區(qū)域也促進高效和可靠的融合。還提供具有促進三維構造的組裝的特性的多細胞體的制備方法。
文檔編號G01N33/00GK102124331SQ200980131924
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權日2008年6月24日
發(fā)明者C·諾羅特, F·S·馬爾加, G·福加克斯 申請人:密蘇里大學