專利名稱：識別天然的膜聯(lián)蛋白a3的新抗體的制作方法
識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的新抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的新抗體。這些抗體適宜于診斷性及治療性應(yīng)用。
背景技術(shù)：
之前的研究顯示，ANXA3顯著相關(guān)于前列腺疾病及前列腺癌的進(jìn)展及各階段。尚且，對人前列腺中ANXA3的作用及生物學(xué)知之甚少。迄今已顯示，ANXA3所謂的外來體的部分，從各種上皮釋放的小囊泡。有跡象表明此現(xiàn)象(其是ANXA3的診斷性表現(xiàn)的基礎(chǔ))是由于前列腺癌中自身免疫的復(fù)雜的調(diào)節(jié)。用于治療或診斷前列腺癌及其他泌尿生殖道上皮癌的蛋白生物標(biāo)記描述于US 2005 130 876，WO 03 086 461，WO 2005 078 124，EP 05011 042. 8 及 EP 05 026 092.6。 將這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過弓I用并入本文。US 60/812，089及US 60/859，489公開了癌的診斷，其中用高度特異性單克隆抗體分析樣品中膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或量。將這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用并入本文。盡管ANXA3已知為前列腺癌的標(biāo)記物，及有關(guān)組織切片中良性，惡變前及惡性病情之間的差異診斷的方法的特異性抗體可用，但通過這些抗體測量尿及壓出尿中的ANXA3 遇到驚人的困難。尿中"天然的"ANXA3的構(gòu)象使得目前可用的在蛋白印跡或組織染色中高度特異性的抗體僅檢測蛋白級分。此可能是由于外來體/前列腺小體中ANXA3的折疊導(dǎo)致對于特異性蛋白識別重要的表位非-接近性。已探究這些表位及詳細(xì)描述于之前專利申請。

發(fā)明內(nèi)容本研究的目的旨在研究體液(例如尿及壓出尿)中天然的ANXA3的定量豐度。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用之前描述的具有預(yù)后關(guān)聯(lián)性的抗ANXA3-抗體的尿中ANXA3的有效檢測僅在采用變性條件及蛋白印跡技術(shù)中才可能。無這些之前描述的抗體在基于ELISA 的測試中工作良好，其中壓出尿在"天然的"條件下測試。意外地，我們接著組成ANXA3的完全特異性"抗體-反應(yīng)性表面"及之前描述的表位，發(fā)現(xiàn)，在尿，壓出尿及其他體液(如血漿或血清)中識別"天然的"ANXA3的抗體具有特異性識別天然的ANXA3的額外的表位。在第一方面，本發(fā)明涉及識別天然的膜聯(lián)蛋白A3 (尤其是天然的人膜聯(lián)蛋白A3) 的抗體。這些抗體能在非-變性條件下(即在體液(例如尿及壓出尿)中)與ANXA3特異性結(jié)合。在第一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列59 67中的表位EYQAAYGKE(SEQ ID NO :1)，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。所述抗體之特定例選自
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(i)抗體· TGC42、參TGC43、或· TGC49,(ii)與來自⑴的抗體具有相同的抗原結(jié)合位點的抗體，及(iii)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。還優(yōu)選的實施方式涉及識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列1 106中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。例如，此抗體可針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列1 34中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。或者，此抗體可針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列35 106中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。所述抗體的特定例選自(i)抗體· TGC44、或· TGC48,(ii)與來自(i)的抗體具有相同的抗原-結(jié)合位點的抗體，及(iii)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。在又一實施方式中，本發(fā)明的抗體選自(i)抗體 TGC42，TGC43, TGC44, TGC45, TGC46, TGC47, TGC48 或 TGC49，(ii)與來自(i)的抗體具有相同的結(jié)合位點的抗體，及(iii)與來自(i)或(ii)的抗體識別天然的人膜聯(lián)蛋白A3上相同的表位的抗體， 及(iv)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。將產(chǎn)生抗體TGC42 (DSM ACC 2972)，TGC43 (DSM ACC 2970)，TGC44 (DSM ACC 2976)，TGC45(DSM ACC 2974)，TGC46(DSMACC 2975)，TGC47(DSM ACC 2977)，TGC48(DSM ACC 2971)及TGC49(DSM ACC 2973)的雜交瘤細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2008年9月17日保藏在DSMZ(德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig。本發(fā)明的抗體可為單克隆抗體，嵌合抗體，人源化的抗體，人抗體或重組抗體，例如單鏈抗體或所述抗體的抗原-結(jié)合片段(例如蛋白水解片段或重組單鏈抗體片段)?？贵w在醫(yī)學(xué)中有用，尤其是用于人醫(yī)學(xué)。更具體而言，抗體可用于診斷性或治療性應(yīng)用。最優(yōu)選，抗體用于診斷癌，例如前列腺癌。有利地，本發(fā)明的抗體用于在天然的條件下進(jìn)行的診斷性測定，例如捕獲測定，例如ELISA，其中測定天然的膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或量。對于治療性及診斷性應(yīng)用，可將本發(fā)明的抗體綴合于如本領(lǐng)域所知的效應(yīng)基團(tuán)或標(biāo)記基團(tuán)。效應(yīng)基團(tuán)可例如選自細(xì)胞毒性基團(tuán)或化合物，例如化學(xué)治療劑或放射性核素。標(biāo)記基團(tuán)可選自任何已知的標(biāo)記基團(tuán)，例如熒光基團(tuán)，發(fā)光基團(tuán)，酶標(biāo)記物，放射性標(biāo)記物等。 效應(yīng)子或標(biāo)記基團(tuán)與抗體的偶聯(lián)可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行。在其他方面，本發(fā)明涉及診斷癌(優(yōu)選前列腺癌)的方法，其中分析體液樣品中天然的膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或量。
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優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷性方法涉及通過與如上所述的抗體反應(yīng)來檢測天然的膜聯(lián)蛋白A3，尤其是天然的人膜聯(lián)蛋白A3。樣品優(yōu)選是體液，例如尿或壓出尿?？筛鶕?jù)本發(fā)明診斷的癌優(yōu)選是泌尿生殖和/或胃腸道癌，例如前列腺癌，膀胱癌， 腎癌，尿道癌，卵巢癌，子宮癌或結(jié)腸癌。尤其是，癌是上皮癌。在尤其優(yōu)選的實施方式中， 癌是前列腺癌。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明包括疾病階段和/或預(yù)后評估的差異診斷。例如，本發(fā)明允許選自下列的疾病階段的差異診斷⑴良性病情，尤其是良性前列腺病情，例如良性前列腺增生(BPH)，纖維化及慢性前列腺炎，(ii)惡變前病情，例如各階段(PIN-1 3)的前列腺上皮內(nèi)瘤形成，包括高度前列腺上皮內(nèi)瘤形成(HGPIN)，和/或(iii)惡性病情，例如前列腺癌，尤其是通過Gleason等級評定指定的進(jìn)展的狀態(tài)中的晚期前列腺癌。更優(yōu)選地，本發(fā)明允許一方面良性或惡變前病情與另一方面惡性病情之間的差異診斷。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，測定樣品(其可為體液或組織樣品)中天然的ANXA3 的存在，量和/或分布。需知，可對單個組織樣品或?qū)Σ煌臉悠?例如來自相同的受試者的體液樣品及組織樣品)測定存在，量及細(xì)胞內(nèi)定位。樣品中高量的天然的ANXA3 (例如對應(yīng)于組織樣品的強染色)主要指示良性病情。 中等/低量的天然的ANXA3 (例如對應(yīng)于組織樣品的弱/中等染色)指示惡變前病情或到惡性病情的早期/立即早期階段。樣品中天然的ANXA3的缺乏指示惡性病情，主要指示進(jìn)展的狀態(tài)(例如立即或晚期階段)中的惡性病情。囊泡(例如外來體和/或前列腺小體)中有天然的ANXA3主要指示良性或惡變前病情。這些囊泡可從尿或其他體液通過差異離心得到，因此本發(fā)明涉及檢測所述體液的任何級分中的天然的ANXA3。而且，本發(fā)明的方法可含蓋測定針對膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體。有針對ANXA3的自身免疫應(yīng)答(例如有針對ANXA3的自身抗體)主要指示惡性病情，尤其指示進(jìn)展的狀態(tài)中的惡性病情。本發(fā)明含蓋測定樣品中的多肽。優(yōu)選地，此測定包括免疫學(xué)方法，其中所述樣品中成分的存在，量和/或定位使用免疫學(xué)測試試劑測定。測定樣品中天然的ANXA3的試劑優(yōu)選是特異于天然的ANXA3的抗體，例如如上所述的多克隆或單克隆抗體。用于測定樣品中ANXA3自身抗體的試劑優(yōu)選是包括對于識別重要的特異性表位的ANXA3多肽，或者它們的片段。更優(yōu)選地，ANXA3多肽是重組ANXA3多肽，再折疊為天然的狀態(tài)，或從人或其他哺乳動物來源分離的天然的ANXA3。本發(fā)明的方法可以適宜于免疫學(xué)測定的任何測試形式(包括適宜于自動化的裝置的測試形式)進(jìn)行。在一些測試形式中，可優(yōu)選使用帶標(biāo)記基團(tuán)(例如視覺標(biāo)記物(例如膠乳或金珠)，熒光標(biāo)記基團(tuán)，酶促標(biāo)記基團(tuán)等)的試劑?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生試劑和標(biāo)記基團(tuán)的綴合物，例如通過用標(biāo)記基團(tuán)(例如經(jīng)雙官能間隔物分子)共價偶聯(lián)于試劑的反應(yīng)性氨基酸側(cè)基(例如羧基，氨基和/或硫醇基)。優(yōu)選從人受試者得到樣品。在一些實施方式中，方法是非-侵襲性診斷性方法，其中所述樣品可為，例如尿樣品，尤其是尿樣品，壓出尿樣品或糞便樣品。如果需要，可使樣品經(jīng)歷預(yù)處理過程，例如凝膠過濾。在進(jìn)一步實施方式中，方法可為組織化學(xué)方法，其中所述樣品可為組織樣品，尤其是活組織檢查，例如鉆取活組織檢查。在組織化學(xué)方法中，可通過測定樣品中ANXA3的定位進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外ANXA3的選擇性測定。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明包括半-定量或定量測定天然的ANXA3。此半-定量或定量測定可涉及基于預(yù)定截止值及將評估結(jié)果與疾病階段相關(guān)聯(lián)來評估測試結(jié)果。截止值可根據(jù)已知的方法通過測定來自健康人和/或處于預(yù)定疾病階段的人的樣品中的天然的ANXA3來測定。而且，樣品中天然的ANXA3的量也可通過評估染色的組織樣品及關(guān)聯(lián)評估結(jié)果與疾病階段來測定?？墒箻悠方?jīng)歷分級分離過程，其使例如在外來體中分開測定天然的ANXA3。例如， 可將樣品離心，以便獲得細(xì)胞沉淀及上清，其中在細(xì)胞沉淀中測定細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3，及在上清中測定細(xì)胞外膜聯(lián)蛋白A3。在尤其優(yōu)選的實施方式中，方法包括選擇性測定細(xì)胞外 ANXA3。在其他尤其優(yōu)選的實施方式中，方法包括選擇性測定細(xì)胞內(nèi)ANXA3。本發(fā)明的方法可附加地包括測定其他癌標(biāo)記物，例如癌標(biāo)記物。其他標(biāo)記物的測定可在相同的樣品(其中測定天然的ANXA;3)或在不同的樣品(例如血，血清和/或血漿樣品)中進(jìn)行。尤其優(yōu)選的是測定血，血清或血漿標(biāo)記物，尤其激肽釋放酶蛋白酶家族的至少一個成員(例如前列腺特異性抗原(PSA))和/或至少一種上皮細(xì)胞標(biāo)記物(尤其是前列腺特異性膜抗原(PSMA))。本發(fā)明可為篩選方法，其中測試個體或一組個體的癌，尤其前列腺癌。另一方面， 方法也可包括預(yù)后評估或治療性追蹤測試，其中使已診斷癌(尤其前列腺癌或其前體階段)陽性的個體經(jīng)歷預(yù)后評估和/或治療控制監(jiān)控。在尤其優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及疾病進(jìn)展的預(yù)后評估，其是在任何診斷性評定(尤其治療控制)中有價值的工具。預(yù)后評估可基于天然的ANXA3單獨或與確實與前列腺癌相關(guān)的其他標(biāo)記物(例如PSA，PCA3(Loeb S. Does PCA3 Help Identify Clinically SignificantProstate Cancer ？ Eur Urol. 2008 Jul 16.)， PCADM-I(Ohkia A, HuY, Wang M,Garcia FU,Stearns ME. Clin Cancer Res. 2004 Apr 1 ；10(7) :2452-8. Links Evidence for prostate cancer-associateddiagnostic marker-1 :immunohistochemistry and in situ hybridizationstudies.),EPCA-2(Katz MD,Kibel AS. Words of wisdom. Re :EPCA_2 : a highly specific serum marker for prostate cancer. Eur Urol. 2008 Jan ；53 (1) 210), (Diamandis EP. POINT EPCA-2 :a promisingnew serum biomarker for prostatic carcinoma ？ Clin Biochem. 2007Dec ；40 (18) :1437-9. Epub 2007 Sep 19.), (Leman ES, Cannon GW，Track BJ,Sokoll LJ,Chan DW，Mangold L,Partin AW,GetzenbergRH. EPCA-2 a highly specific serum marker for prostate cancer. Urology. 2007 Apr ；69 (4) 714-20))組合的測定。例如，通過組織評估和/或通過測量PSA或其他癌標(biāo)記物的水平， 可將患者分類為低風(fēng)險組(例如PSA水平彡lOng/ml)，立即風(fēng)險組(例如PSA水平> 10 及< 20ng/ml)及高風(fēng)險組(例如PSA水平彡20ng/ml)。這些患者組中ANXA3的測定可產(chǎn)生進(jìn)一步有價值的信息，尤其在已分類為立即風(fēng)險組的患者中。如果這些立即風(fēng)險患者是ANXA3陽性，無PSA存活的百分率顯著高于已測定為ANXA3陰性的患者。由此，本發(fā)明允許個體患者組的其他風(fēng)險層次。優(yōu)選地，原初被分類為立即風(fēng)險組的組中的患者可基于ANXA3 測定結(jié)果重分類。ANXA3陽性患者可重分類為在低風(fēng)險組，及ANXA3-陰性患者(及任選具有針對ANXA3的自身免疫應(yīng)答)分類為高風(fēng)險組。而且，將通過以下圖及實施例更詳細(xì)闡述本發(fā)明。
實施例將小鼠用重組人膜聯(lián)蛋白A3免疫。由此，產(chǎn)生單克隆抗體，其能在與多克隆抗血清Petros組合的捕獲ELISA中識別天然的膜聯(lián)蛋白A3(W0Zny W，Schroer K， Schwall GP, Poznanovic s, Stegmannff, Dietz K, Rogatsch H, Schaefer G, Huebl H, Klocker H, Schrattenholz A, Cahill MA. Differential radioactive quantification ofprotein abundance ratios between benign and malignant prostatetissues :cancer association of annexin A3. Proteomics. 2007 Jan ；7 (2) :313-22)。得到的抗體命名如下TGC43 = DSM ACC2970TGC48 = DSM ACC2971TGC42 = DSM ACC2972TGC49 = DSM ACC2973TGC45 = DSM ACC2974TGC46 = DSM ACC2975TGC44 = DSM ACC2976TGC47 = DSM ACC2971.蛋白印跡中結(jié)合位點的定位在第一組實驗中，在蛋白印跡中用重組膜聯(lián)蛋白3片段vANAl，vANA4, vANA5, vANA7 及 vANA8 測試雜交瘤細(xì)胞 16C12 (TGC42)，14B10 (TGC49)，15D6 (TGC46)，18E9 (TGC43)， 17D9 (TGC48)，17F12 (TGC44)，13H5 (TGC47)及 16A7 (TGC45)的細(xì)胞培養(yǎng)上清。膜聯(lián)蛋白 3 的這些片段代表以重疊片段形式的完整膜聯(lián)蛋白3 (cf.

圖1)。全部抗體上清識別片段vANAl 及，由此，全長膜聯(lián)蛋白A3蛋白。而且，全部所測抗體檢測代表膜聯(lián)蛋白3的N-端區(qū)的片段vANA7(cf.圖1)。由此，所測抗體的結(jié)合位點在膜聯(lián)蛋白3的N-端106aa之內(nèi)。為了進(jìn)一步定位單克隆抗體的結(jié)合位點，就與膜聯(lián)蛋白3的片段VANA2及VANA3 的反應(yīng)性測試蛋白印跡中第二組實驗的細(xì)胞培養(yǎng)上清。vANA3除了 N-端區(qū)34aa之外對應(yīng)于片段vANA2。2種單克隆抗體-17D9 (TGC48)及17F12 (TGC44)-僅識別片段vANA2，其余抗體識別膜聯(lián)蛋白3片段(圖1)。這些實驗顯示，產(chǎn)生的抗體中有至少2種不同的反應(yīng)性。 然而，在單克隆抗體17D9(TGC48)及17F12 (TGC44)中，反應(yīng)性相關(guān)于N-端34aa，其余抗體的結(jié)合位點在膜聯(lián)蛋白3序列的氨基酸35和106之間。2.用肽掃描的選定的抗體的表位定位通過肽掃描測定單克隆抗體16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)，17F12 (TGC44)， 14B10 (TGC49)，17D9 (TGC48)的表位以及各抗體上清的表位。[2. 1.抗體 16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)及 14B10 (TGC49)的表位定位
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以未稀釋的形式使用單克隆抗體16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)及14B10 (TGC49)的細(xì)胞培養(yǎng)上清用于表征它們的表位。這3種抗體在肽掃描中顯示相同的結(jié)果。肽片段顯影的代表性的結(jié)果顯示于圖2。單克隆抗體16C12(TGC42)，18E9(TGC43)及14B10(TGC49)識別肽片段的肽斑點18 20。肽片段顯影的分析
權(quán)利要求
1.識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列59 67中的表位EYQAAYGKE(SEQ ID NO :1)，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
2.權(quán)利要求1的抗體，其選自 ⑴抗體 TGC42、 TGC43、或 TGC49,( )與來自(i)的抗體具有相同的抗原結(jié)合位點的抗體，及 (iii)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
3.識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列1 106中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
4.權(quán)利要求3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列1 34中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
5.權(quán)利要求3的抗體，其針對人膜聯(lián)蛋白A3的氨基酸序列35 106中的構(gòu)象表位，或所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求的3，4，或5的抗體，其選自 ⑴抗體 TGC44、或 TGC48,( )與來自(i)的抗體具有相同的抗原-結(jié)合位點的抗體，及 (iii)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
7.識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的抗體，其選自(i)抗體 TGC42，TGC43, TGC44, TGC45, TGC46, TGC47, TGC48 或 TGC49， ( )與來自(i)的抗體具有相同的結(jié)合位點的抗體，及(iii)與來自⑴或(ii)的抗體識別天然的人膜聯(lián)蛋白A3上相同的表位的抗體，及(iv)所述抗體的抗原-結(jié)合片段。
8.權(quán)利要求1 7中任一項的抗體，其是單克隆抗體，二聚體抗體，人源化抗體，人抗體或重組抗體，或者它們的片段。
9.權(quán)利要求1 8中任一項的抗體，其用于醫(yī)學(xué)，特別用于人醫(yī)學(xué)。
10.權(quán)利要求9的抗體，其用于診斷或治療。
11.權(quán)利要求9或10中任一項的抗體，其用于診斷癌，特別是前列腺癌。
12.權(quán)利要求9，10或11中任一項的抗體，其用于在天然的條件下進(jìn)行的診斷性測定。
13.權(quán)利要求12中任一項的抗體，其用于ELISA。
14.診斷癌的方法，其中分析樣品中天然的膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述天然的膜聯(lián)蛋白A3通過與權(quán)利要求1 8中任一項的抗體反應(yīng)來檢測。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述樣品是體液，特別是尿或壓出尿。
全文摘要
本發(fā)明涉及識別天然的膜聯(lián)蛋白A3的新抗體。這些抗體適宜于診斷性及治療性應(yīng)用。
文檔編號G01N33/574GK102164964SQ200980137547
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者G·施瓦爾, S·珀茲納諾維克 申請人:普羅迪奧塞斯股份公司