專利名稱：蛋白篩選方法
蛋白篩選方法相關(guān)申請本申請要求2008年7月25日提交的美國臨時申請第61/083813號、2008年8 月19日提交的美國臨時申請第61/090111號和2009年4月16日提交的美國臨時申請第 61/170029號的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請的內(nèi)容通過引用并入本文。背景充分了解的是，在展示和選擇技術(shù)的應(yīng)用中，較高的多樣性的獲得容許更有效地選擇具有最高親和力、特異性、穩(wěn)定性和/或其他期望特征的分子。過去已開發(fā)的方法包括噬菌體展示、核糖體展示、CIS展示和mRNA展示。最近，在使用體內(nèi)篩選鑒定分子方面存在增加的興趣(J Control Release. 2003 Aug 28 ；91 (1-2) 183-6)。使用噬菌體展示已使這種方法成為可能，但是這種方法具有噬菌體展示技術(shù)所提供的有限的多樣性。由于RNA物質(zhì)的不穩(wěn)定性，核糖體展示或mRNA展示將無法用于這種應(yīng)用。因此，DNA-蛋白融合體的開發(fā)由于該物質(zhì)的增加的穩(wěn)定性而將是高度期望的。已經(jīng)描述了三種類型的DNA-蛋白融合體。CIS展示是一種使用偶聯(lián)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯來在DNA被轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生與DNA共價結(jié)合的dsDNA結(jié)合蛋白的方法(PNAS， 101 (9) =2806-2810) 0然而，該技術(shù)的主要局限之一是在轉(zhuǎn)錄/翻譯過程中合成的蛋白可以與附近任何鄰近的DNA結(jié)合，從而導(dǎo)致錯誤標(biāo)記的融合體。第二種方法是Kurz和Lohse 的方法(Chembiochem. 2001年9月3日；2(9) :666-72)。此方法涉及使用多官能物質(zhì)形成與mRNA的共價加成物，該多官能物質(zhì)可以與翻譯的蛋白共價鍵合，而在共價加成物處產(chǎn)生 RNA上的核糖體停頓，并充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄的引物。這種方法的局限是使用補骨脂素與RNA的共價交聯(lián)步驟是低效的。第三種方法是^nezawa等人的方法(Nucleic Acids Res. 2003年10 月1日；31 (19) :ell8.)。在此方法中，將編碼鏈霉抗生物素和多種肽的區(qū)域的DNA生物素化，置于具有翻譯機制的合成微球中并進(jìn)行翻譯使得鏈霉抗生物素(四聚體)結(jié)合在生物素化的DNA上。這種方法的局限是所得物質(zhì)是四聚體，這對于親和力選擇可能是麻煩的，因為在一個粒子上會有多種結(jié)合物質(zhì)(再結(jié)合作用)。本文描述一種用于產(chǎn)生需要的核酸蛋白融合體的簡單有效的方法，該方法可以采用核酸與蛋白之間的非共價連接并且將容許DNA-蛋白融合體形成。發(fā)明概述本發(fā)明提供了選擇和進(jìn)化蛋白和核酸的期望特性的組合物和方法。在多個實施方案中，本發(fā)明包括與核酸或修飾的核酸連接的小分子。其他實施方案包括制備多肽的方法，所述多肽包括具有修飾的氨基酸的肽；實現(xiàn)選擇群體中具有期望特性的個別成員的測定；和用于產(chǎn)生具有改良特性的多肽的新變異的方法。在一個方面，本發(fā)明提供異雙功能復(fù)合體，所述異雙功能復(fù)合體包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽編碼序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子編碼；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含與所述第一核酸分子的部分互補的核酸序列，
其中所述第一核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，并且其中所述第二核酸分子與所述多肽非共價結(jié)合。在一些實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體還包含(a)高親和力配體，所述高親和力配體與第二核酸分子共價結(jié)合；和(b)配體受體，所述配體受體與肽受體結(jié)合，其中所述高親和力配體與所述配體受體結(jié)合并且所述肽受體與多肽共價結(jié)合。在一些實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體還包含第二高親和力配體，其中所述第二高親和力配體與肽受體共價結(jié)合，并且其中所述第二高親和力配體與配體受體結(jié)合。在一些實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體中的肽受體通過連接物與第二高親和力配體結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方案中，連接物包括聚乙二醇。在另一優(yōu)選的實施方案中，連接物還包括多聚唾液酸連接物。在一些實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體中的配體受體與肽受體共價結(jié)合。在一些實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體還包含(a)配體受體，所述配體受體與第二核酸分子共價結(jié)合；和(b)高親和力配體，所述高親和力配體與肽受體結(jié)合，其中所述配體受體與所述高親和力配體結(jié)合并且所述肽受體與多肽的C端共價
纟口口。在其他實施方案中，這種異雙功能復(fù)合體還包含第三核酸分子，所述第三核酸分子包含與第二核酸分子的部分互補的核酸序列，其中所述第三核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，其中所述第三核酸分子與肽受體共價結(jié)合，并且其中所述肽受體與多肽共價結(jié)合。在一些實施方案中，上述復(fù)合體中的第二核酸分子是分支的核酸分子。在一些實施方案中，上述復(fù)合體中的第二核酸分子能夠充當(dāng)?shù)谝缓怂岱肿臃崔D(zhuǎn)錄的引物。在另一方面，本發(fā)明提供X-展示復(fù)合體(例如，核酸多肽復(fù)合體)，該X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，該核酸分子與第一高親和力配體共價結(jié)合；(b)多肽，所述多肽由所述核酸分子編碼；(c)配體受體，所述配體受體與肽受體結(jié)合，其中所述高親和力配體與所述配體受體結(jié)合并且所述肽受體與所述多肽的C端共價結(jié)合。在一些實施方案中，這種X-展示復(fù)合體中的配體受體與肽受體共價結(jié)合。在一些實施方案中，這種X-展示復(fù)合體還包含第二高親和力配體，其中所述第二高親和力配體與肽受體共價結(jié)合，并且其中所述第二高親和力配體與配體受體結(jié)合。在另一方面，本發(fā)明提供X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，該核酸分子與第一高親和力配體共價結(jié)合；(b)第一配體受體，所述第一配體受體與第二高親和力配體共價結(jié)合；和(c)多肽，所述多肽由第一核酸分子編碼，其中所述多肽包含第二配體受體，其中所述第一高親和力配體與所述第一配體受體結(jié)合，并且所述第二高親和力配體與所述第二配體受體結(jié)合。在一些實施方案中，與上述復(fù)合體結(jié)合的第一高親和力配體或第二高親和力配體是生物素。在一些實施方案中，與上述復(fù)合體結(jié)合的第一高親和力配體或第二高親和力配體選自包括下列的組^(506、氨甲喋呤、？ 1-2458、生物素、蛭素、2 ￥ (0汗、熒光素-生物素、 ABD (白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烴、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白Α。在一些實施方案中，上述復(fù)合體中的第一配體受體或第二配體受體選自包括下列的組FKBP12、二氫葉酸還原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚鏈霉抗生物素、鏈霉抗生物素四聚體、凝血酶、羧肽酶、單價抗體、HSA(白蛋白)、鋅指、hRI (RNA酶抑制劑)、突變的鹵代烷烴脫鹵素酶、haloTag和分選酶。在一些實施方案中，上述復(fù)合體中的第一配體受體或第二配體受體是鏈霉抗生物
ο在一些實施方案中，上述多肽選自包括下列的組抗體、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、Fab 片段、單鏈抗體、納米抗體(nanobody)、unibody、adnectin、親和體(affibody)、DARPin、 anticalin、avimer、10Fn3 結(jié)構(gòu)域禾口 versabody。在另一方面，本發(fā)明提供X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，該核酸分子與配體共價連接；和(b)多肽，所述多肽由第一核酸分子編碼，其中所述多肽包含配體受體，其中所述配體與所述配體受體結(jié)合。在一些實施方案中，與X-展示復(fù)合體結(jié)合的配體是Π(506并且核酸-多肽復(fù)合體中的配體受體是FKBP的Π(506-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，與上述復(fù)合體結(jié)合的第一核酸分子選自由下列組成的組 ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA 雜交 dsDNA 和 dsDNA/RNA 雜交體。在一些實施方案中，與上述復(fù)合體結(jié)合的第一核酸分子的多肽編碼序列不含有框內(nèi)終止密碼子。在一些實施方案中，上述多肽是結(jié)合蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合蛋白是抗體的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，上述核酸-多肽復(fù)合體不含有核糖體。在另一方面，本發(fā)明還提供包含多種上述X-展示復(fù)合體的文庫，其中所述復(fù)合體的至少一部分含有不同的多肽編碼序列。在另一方面，本發(fā)明還提供制備核酸-多肽復(fù)合體的文庫的方法，所述方法包括下列步驟-提供mRNA序列的文庫，所述mRNA序列包含與第一核酸連接物互補的序列元件；-提供第一核酸連接物，所述第一核酸連接物與第一高親和力配體可操作地連接以便使所述第一核酸連接物通過互補的核酸堿基配對與mRNA結(jié)合；-提供第二高親和力配體，所述第二高親和力配體與肽受體可操作地連接；-提供具有至少兩個結(jié)合位點的配體受體或提供至少以便使所述配體受體與所述第一高親和力配體和所述第二高親和力配體結(jié)合；-容許mRNA翻譯進(jìn)行以便使肽受體與翻譯的蛋白結(jié)合，從而形成連接mRNA與蛋白的核酸-多肽復(fù)合體。在一些實施方案中，所述方法還包括-容許使用X-展示復(fù)合體中的第一核酸連接物作為引物進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄以便形成DNA/RNA雜交體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括-降解mRNA并合成互補的DNA鏈，從而形成核酸-多肽復(fù)合體中的DNA/DNA雜交體。在一些實施方案中，文庫中的mRNA還包含TMV增強子。在一些實施方案中，文庫中的mRNA還包含C μ序列。在一些實施方案中，文庫中的mRNA還包含F(xiàn)LAG標(biāo)簽。在一些實施方案中，文庫中的mRNA還包含SA展示序列。在一些實施方案中，文庫中的mRNA還包含A20尾。在另一方面，本發(fā)明還提供由本發(fā)明中所描述的方法制備的核酸-多肽復(fù)合體的文庫。在另一方面，本發(fā)明還提供選擇分離的核酸分子的方法，所述分離的核酸分子編碼能夠與感興趣的抗原結(jié)合的多肽，所述方法包括下列步驟(a)提供本發(fā)明中所述的X-展示復(fù)合體的文庫；(b)使所述文庫接觸感興趣的抗原；(c)從所述文庫中選擇與感興趣的抗原結(jié)合的至少一種X-展示復(fù)合體；和(d)分離所選擇的X-展示復(fù)合體的多肽編碼序列。在另一方面，本發(fā)明還提供制備多肽的方法，所述多肽能夠結(jié)合感興趣的抗原，所述方法包括將通過本發(fā)明中所述的方法鑒定的多肽編碼序列引入表達(dá)環(huán)境中以便產(chǎn)生所編碼的多肽。在另一方面，本發(fā)明還提供編碼多肽的分離的核酸分子，所述多肽能夠與感興趣的抗原結(jié)合，所述分離的核酸分子通過本發(fā)明所述的方法選擇。在另一方面，本發(fā)明還提供X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽編碼序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子編碼；(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含與所述第一核酸分子的部分互補的核酸序列；(d)第一高親和力配體，所述第一高親和力配體與所述第二核酸分子共價結(jié)合；(e)第一配體受體；禾口(f)第二高親和力配體，所述第二高親和力配體經(jīng)由一個或多個連接分子與肽受體共價結(jié)合，其中所述第一核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，其中所述第一高親和力配體與所述配體受體在第一結(jié)合位點非共價結(jié)合，其中所述第二配體與所述配體受體在第二結(jié)合位點非共價結(jié)合，并且其中所述一種或多種連接分子是聚乙二醇分子。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第一高親和力配體是生物素并且配體受體選自包括下列的組鏈霉抗生物素、二聚鏈霉抗生物素和四聚鏈霉抗生物素。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第二高親和力配體是生物素并且配體受體選自包括下列的組鏈霉抗生物素、二聚鏈霉抗生物素和四聚鏈霉抗生物素。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第一高親和力配體或第二高親和力配體選自包括下列的組Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp (0) F、熒光素-生物素、 ABD (白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烴、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白Α。在一些實施方案中，這種復(fù)合體還包含第二配體受體。在一些實施方案中，上述復(fù)合體中的第二配體受體選自包括下列的組FKBP12、二氫葉酸還原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚鏈霉抗生物素、鏈霉抗生物素四聚體、凝血酶、羧肽酶、單價抗體、HSA(白蛋白)、鋅指、hRI (RNA酶抑制劑)、突變的鹵代烷烴脫鹵素酶、haloTag 和分選酶。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的肽受體是嘌呤霉素。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第一核酸分子或第二核酸分子還包括補骨脂
ο在一些實施方案中，多肽選自包括下列的組抗體、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、Fab片段、單鏈抗體、納米抗體、unibody、adnectin、親和體、DARPin, anticalin、avimer,10Fn3 結(jié)構(gòu)域禾口 versabody。在另一方面，本發(fā)明提供異雙功能復(fù)合體，所述異雙功能復(fù)合體包含(a)第一高親和力配體，所述第一高親和力配體與核酸分子共價結(jié)合；(b)第二高親和力配體，所述第二高親和力配體與肽受體共價結(jié)合；和(c)配體受體，所述配體受體包含兩個或更多個配體結(jié)合位點；其中所述第一高親和力配體和第二高親和力配體在不同的配體結(jié)合位點與配體受體結(jié)合。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第一高親和力配體和第二高親和力配體是相同的。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的第一高親和力配體和第二高親和力配體是生物素。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的核酸分子包含補骨脂素部分。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的肽受體是嘌呤霉素。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的配體受體是多聚蛋白。在一些實施方案中，這種復(fù)合體中的配體受體是鏈霉抗生物素。附圖簡述

圖1圖解了本文所述方法的一個實施方案。圖2圖解了使用先進(jìn)引物的這種實施方案，所述先進(jìn)引物是具有兩個3’末端的倒轉(zhuǎn)極性引物(inverted polarity primer)，該引物可以方便地引發(fā)cDNA并且在相對的末端攜帶嘌呤霉素或衍生物或小分子。圖3圖解使用先進(jìn)引物的這種實施方案，所述先進(jìn)引物是莖環(huán)變體并且可以回折且方便地引發(fā)cDNA。圖4圖解用于改善或進(jìn)化抗體重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)/功能的方法的一個實施方案，其中多肽與Πα2ΒΡ蛋白融合，Π(12ΒΡ蛋白可以與核酸連接的Π(506小分子非共價結(jié)合，從而連接改善的(進(jìn)化的)表型(多肽)與其編碼基因型(核酸)。圖5圖解體外展示方法的一個實施方案，該實施方案使用分支的寡核苷酸連接物和互補的寡核苷酸，該互補的寡核苷酸包含共價連接的肽受體。圖6圖解體外展示方法的一個實施方案，該體外展示方法使用與肽受體共價連接的分支的寡核苷酸連接物。圖7圖解體外展示方法的一個實施方案，該體外展示方法使用高親和力配體和配體受體。圖8圖解體外展示方法的一個實施方案，該體外展示方法使用高親和力配體和配體受體，其中所述配體受體與肽受體共價連接。圖9圖解體外展示方法的一個實施方案，該體外展示方法使用高親和力配體和配體受體，其中所述配體受體與肽受體非共價連接。圖10圖解體外展示方法的一個實施方案，該體外展示方法使用高親和力配體和配體受體，其中第一配體受體分子與第二(非關(guān)聯(lián)的)高親和力配體共價連接，其中所述第一配體受體分子可以與共價連接至核酸的關(guān)聯(lián)的第一高親和力配體結(jié)合，并且其中所述第二高親和力配體可以與關(guān)聯(lián)的第二配體受體結(jié)合，所述關(guān)聯(lián)的第二配體受體與所述核酸所編碼的多肽融合。圖11圖解用于使用高親和力配體和配體受體的體外展示方法的一個實施方案中的單獨組分的非限制性實例。圖12圖解用于使用高親和力配體和配體受體的體外展示方法的一個實施方案的核酸/蛋白復(fù)合體的非限制性裝配順序。圖13圖解優(yōu)選的X-展示復(fù)合體的設(shè)計。圖14圖解制備VH文庫、裝配展示復(fù)合體、選擇和純化所述展示復(fù)合體的示例性方案。圖15圖解VH文庫的樣品單克隆。圖例顯示了轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、VH序列、Cu 序列、FLAG標(biāo)簽序列、與連接物(例如，NA連接物)互補的DNA區(qū)段。圖16圖解展示方法的優(yōu)選實施方案的步驟。圖16A首先描繪包含mRNA分子(含有適當(dāng)?shù)倪B接物、標(biāo)簽、互補區(qū)和多聚A尾)的X-展示復(fù)合體，所述mRNA分子經(jīng)由互補的鏈配對和補骨脂素連接而與連接物/RT引物(NA連接物)連接。NA連接物還與生物素(B) 分子共價結(jié)合，生物素分子與鏈霉抗生物素分子締合。鏈霉抗生物素與第二生物素分子締合，該第二生物素分子本身與被連接至翻譯的蛋白的嘌呤霉素共價結(jié)合。圖16A描繪反轉(zhuǎn)錄(步驟1)和RNA降解(步驟2)。圖16B描繪產(chǎn)生DNA/RNA雜交體的第二鏈合成(步驟 4)。16B最后描繪的是最終的dsDNAX-展示復(fù)合體(即，X-展示復(fù)合體)。圖17描繪潛在的文庫成員以及在一些實施方案中引物如何用于4M測序。圖18描繪VH文庫成員的示例性區(qū)段。圖19描繪展示文庫成員的實例性區(qū)段并且還展示遠(yuǎn)離引物的末端序列(參見圖 17)。圖20描繪展示文庫成員的示例性區(qū)段并且還提供遠(yuǎn)離引物的TMVUTR和C-mu區(qū)的示例性序列。
圖21描繪用于擴(kuò)增被選擇用于測序的克隆的引物的可能排列。圖22圖解從文庫中選擇的本發(fā)明的一個實施方案的過程，說明該方法可能是迭代的以便使在第一輪中所選擇的核酸/蛋白可用于產(chǎn)生用于后續(xù)輪的X-展示復(fù)合體形成和選擇的文庫。圖23圖解本發(fā)明的一個實施方案，其中采用幾輪的選擇而不再生文庫或擴(kuò)增選擇產(chǎn)物。圖M圖解由mRNA設(shè)計VH和VL文庫的一種方法。圖25圖解選擇方法的一個示例性實施方案，其中將用于親和力選擇的靶分子固定在固體支撐物上。圖沈圖解選擇方法的一個示例性實施方案，其中在細(xì)胞表面上表達(dá)用于親和力選擇的靶分子。在這種實施方案中，對不表達(dá)展示復(fù)合體的細(xì)胞選擇所述復(fù)合體(例如，為了移除與細(xì)胞結(jié)合但是不與感興趣的靶結(jié)合的復(fù)合體)并且然后對表達(dá)感興趣的靶的細(xì)胞選擇所述復(fù)合體(即，鑒定特異性結(jié)合物)。圖27圖解DNA X-展示復(fù)合體(即，DNA-蛋白融合體)，其中來源標(biāo)簽已被摻入到核酸中(例如，以鑒定編碼DNA的來源)并且使用恒定來源編碼來標(biāo)簽自不同輪選擇的核酸(例如，在從一次測序運行的不同輪選擇匯集核酸時是有用的)。圖觀圖解DNA X-展示復(fù)合體(即，DNA-蛋白融合體)和N6引物的添加。圖四描繪顯示序列分析方案的一個實施方案的流程圖。圖30圖解mRNA轉(zhuǎn)錄、純化和交聯(lián)過程的示例性結(jié)果。圖31圖解mRNA轉(zhuǎn)錄、純化和鏈霉抗生物素加載過程的示例性結(jié)果。圖32圖解在RNA酶H處理和洗脫過程之后的示例性結(jié)果。圖33圖解在RNA酶H處理和洗脫過程之后的示例性結(jié)果。圖34圖解在RT-PCR和第二鏈合成過程之后的示例性結(jié)果。圖35圖解可用于文庫設(shè)計以容許將多輪選擇匯集為一次測序運行的匯集物標(biāo)記 (pool tagging)。圖36圖解用于制備VH文庫的示例性供體細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了選擇和進(jìn)化蛋白和核酸的期望特性的組合物和方法。所述方法在本文中可以稱為“X-展示”或者在采用鏈霉抗生物素的一些實施方案中稱為“SA展示”。在多個實施方案中，本發(fā)明包括與核酸或修飾的核酸連接的小分子。其他實施方案包括制備多肽的方法，所述多肽包括具有修飾的氨基酸的肽；實現(xiàn)選擇群體中具有期望特性的個別成員的測定；和用于產(chǎn)生具有改良特性的多肽的新變異的方法?！斑x擇”意指基本上將群體中的一種分子與其他分子分開。如本文所用的“選擇” 步驟在選擇步驟之后提供與群體中不期望的分子相比至少2-倍，在一些實施方案中3-倍、 5-倍、10-倍、20-倍、優(yōu)選30-倍、更優(yōu)選100-倍并且最優(yōu)選1000-倍富集的期望分子?？梢灾貜?fù)任何次數(shù)的選擇步驟并且可以在給定的方法中組合不同類型的選擇步驟?！暗鞍住币庵竿ㄟ^一個或多個肽鍵連接的任何兩種或多種天然存在的或修飾的氨基酸?！暗鞍住焙汀半摹痹诒疚闹锌苫Q使用?！癛NA”意指兩種或更多種共價鍵合的天然存在的或修飾的核糖核苷酸的序列。此術(shù)語中所包括的修飾的RNA的一個實例是硫代磷酸RNA?！癉NA”意指兩種或更多種共價鍵合的天然存在的或修飾的脫氧核糖核苷酸的序列?！昂怂帷币庵溉魏蝺煞N或更多種共價鍵合的核苷酸或核苷酸類似物或衍生物。如本文所用的這個術(shù)語包括但不限于DNA、RNA和PNA。術(shù)語“核酸”可以包括修飾的核酸并且因此核酸和修飾的核酸可以互換使用。如本文所用的術(shù)語“核苷酸類似物”或“核苷酸衍生物”或“修飾的核酸”是指修飾的或非天然存在的核苷酸，例如5-丙炔基嘧啶(即，5-丙炔基-dTTP和5-丙炔基-dTCP)、 7-脫氮嘌呤(即，7-脫氮-dATP和7-脫氮-dGTP)。核苷酸類似物包括堿基類似物并且包括修飾形式的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸?！半氖荏w”意指能夠通過核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶功能的催化活性被添加到生長的蛋白鏈的C端的任何分子。通常，這種分子含有(i)核苷酸或核苷酸樣部分(例如，腺苷或腺苷類似物(在N-6氨基位置的二甲基化是可接受的))、(ii)氨基酸或氨基酸樣部分(例如， 20種D-氨基酸或L-氨基酸的任一種或它們的任何氨基酸類似物(例如0-甲基酪氨酸或 Ellman等人，Meth. Enzymol. 202 :301，1991所述的任何類似物)、和(iii)這兩者之間的連接(例如，在3’位置的酯、酰胺或酮連接，不太優(yōu)選的是在2’位置)；優(yōu)選地，這種連接不顯著地打亂來自天然核糖核苷酸構(gòu)象的環(huán)褶皺。肽受體還可以具有親核體，該親核體可以是但不限于氨基、羥基或巰基。此外，肽受體可以由核苷酸模擬物、氨基酸模擬物或組合的核苷酸-氨基酸結(jié)構(gòu)的模擬物構(gòu)成。如本文所用術(shù)語“X-展示復(fù)合體”、“核酸-多肽復(fù)合體”和“核酸-蛋白融合體” 是可互換的，并且意思是指由核酸和該核酸所編碼的蛋白(或肽或其片段)的直接或間接相互作用形成的復(fù)合體。在一些情況下，X-展示復(fù)合體可以稱為“展示復(fù)合體”或“展示融合體”，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將通過這種用途的內(nèi)容理解它不應(yīng)與本文可能引用的其他類型的展示系統(tǒng)混淆。在一些實施方案中，核酸是RNA，例如，mRNA。在其他優(yōu)選的實施方案中，核酸是DNA或cDNA。因此，在目標(biāo)是展示含有DNA的復(fù)合體的一些實施方案中，X-展示復(fù)合體可以稱為“DNA-蛋白融合體”或“DNA-展示融合體”。重要的是注意術(shù)語“融合”的使用不暗示或表示核酸與肽或蛋白共價連接。在一些實施方案中，RNA或DNA可以是修飾的或改變的。在優(yōu)選的實施方案中，核酸與蛋白之間的相互作用是非共價的(例如，相互作用可以通過生物素/鏈霉抗生物素相互作用、連接物分子和本文所述的類似物介導(dǎo))。在優(yōu)選的實施方案中，核酸是mRNA或修飾的mRNA?！案淖兊墓δ堋币庵阜肿庸δ芊矫娴娜魏钨|(zhì)的或量的改變。如本文所用的“結(jié)合配偶體”意指對期望的DNA-蛋白融合體的部分具有特異性的共價或非共價親和力的任何分子。結(jié)合配偶體的實例包括但不限于下列的成員抗原/抗體對、蛋白/抑制劑對、受體/配體對(例如細(xì)胞表面受體/配體對，如激素受體/肽激素對)、酶/底物對(例如，激酶/底物對)、凝集素/碳水化合物對、寡聚或異源寡聚蛋白聚集體、DNA結(jié)合蛋白/DNA結(jié)合位點對、RNA/蛋白對和核酸雙鏈體、異源雙鏈體或連接的鏈以及能夠與X-展示復(fù)合體的任一部分形成一種或多種共價或非共價鍵(例如，二硫鍵)的任何分子?！肮腆w支撐物”意指但不限于親和復(fù)合體可以直接或間接結(jié)合(例如，通過其他結(jié)合配偶中間物，如其他抗體或蛋白A)或親和復(fù)合體可以包埋于其中(例如，通過受體或通道)的任何柱(或柱材料)、珠子、試管、微量滴定皿、固體粒子(例如，瓊脂糖(agarose或 s印harose))、微芯片(例如，硅、硅-玻璃或金芯片)或膜(例如，脂質(zhì)體或囊泡的膜)。介導(dǎo)X-廳始側(cè)_連擁___連擁在本發(fā)明的一個方面，核酸(天然mRNA或修飾的mRNA)可以通過使用在核酸3’ 端雜交的核酸連接物或修飾的核酸連接物(“NA連接物”)與其編碼的蛋白在翻譯結(jié)尾時連接。在這種實施方案中，NA連接物在連接物中具有倒轉(zhuǎn)的極性使得它有效地具有兩個3’ 端，這兩個3’末端的非雜交化末端將其連接至能夠與多肽蛋白以高親和力共價或非共價結(jié)合的嘌呤霉素或相關(guān)類似物或小分子。因此，在一些實施方案中，χ-展示復(fù)合體是通過蛋白和核酸與NA連接物的相互作用形成的。在一些實施方案中，NA連接物是補骨脂素連接物。在一些優(yōu)選的實施方案中，連接物是XB-PBI。在一些實施方案中，可以使用XB-DDB。在一些優(yōu)選的實施方案中，連接物 (例如，PBI連接物或DDB連接物)與高親和力配體(例如，生物素)連接，即，連接物包括高親和力配體。在一些實施方案中，核酸(例如，天然mRNA或修飾的mRNA)可以與NA連接物交聯(lián)， 該NA連接物還與肽受體或高親和力配體連接。這種交聯(lián)可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來完成。例如，通過整體引用并入本文的美國專利第6416950號描述了進(jìn)行這種交聯(lián)的方法(參見，例如，美國專利第6416950號的圖9-13)。在又一實施方案中，本發(fā)明包括在連接物中具有倒轉(zhuǎn)的5’ -3’極性的雙功能NA 連接物以便使其能夠與核酸如mRNA或修飾的mRNA模板雜交，其中所述雜交在編碼區(qū)外的 mRNA的3’端發(fā)生，并且其中所述核酸/修飾的連接物在其另一 3’端攜帶肽受體，如嘌呤霉素或其功能類似物(例如，但不限于吡唑嘧啶)或能夠與多肽蛋白共價結(jié)合或高親和力地結(jié)合的小分子。在幾個實施方案中，核酸，優(yōu)選mRNA或修飾的mRNA在3’端與NA連接物雜交，該 NA連接物本身通過共價鍵或通過高親和力非共價鍵與多肽(或修飾的多肽)共價結(jié)合或高親和力地結(jié)合。在其他實施方案中，NA連接物能夠充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄mRNA的引物。另一實施方案包括與NA連接物可操作地連接的編碼核酸，該編碼核酸在其“5’ 端”攜帶反轉(zhuǎn)極性的核酸部分(在引號中，如同有效地具有指導(dǎo)聚合的3’極性一樣)，使得其除了經(jīng)由莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合在NA連接物上的能力之外可以充當(dāng)編碼核酸模板聚合的引物， 該NA連接物在其3’端攜帶嘌呤霉素或相關(guān)類似物或小分子(參見圖2和3)。在一些實施方案中，編碼核酸與分支的NA連接物可操作地連接，其中NA連接物的部分與編碼核酸的3’端互補(參見圖幻。設(shè)想產(chǎn)生分支的NA連接物的任何本領(lǐng)域公認(rèn)的手段。分支點可以在NA連接物內(nèi)的任何位置出現(xiàn)。這種分支的NA連接物還可以充當(dāng)它們所結(jié)合的編碼核酸如mRNA反轉(zhuǎn)錄的引物。在一些實施方案中，編碼核酸與分支的NA連接物可操作地連接，其中所述連接物與肽受體共價連接(參見圖6)。在一些實施方案中，NA連接物包含鎖核酸(LNA)，例如，二環(huán)核酸，其中核糖核苷在2’ -氧和4’ -碳原子之間由亞甲基單元連接。在具體的實施方案中，NA連接物與編碼核酸互補的區(qū)域包含至少一部分LNA以增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性(參見Kaur等人(2006). Biochemistry 45(23) :7347_55。配體/警體連接在另一方面，X-展示復(fù)合體(例如，編碼核酸和編碼的多肽)通過高親和力配體與其關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體(配體受體)之間的高親和力結(jié)合或共價結(jié)合而形成。在這種實施方案中，核酸可以與高親和力配體共價或非共價連接，所述高親和力配體繼而與配體受體非共價或共價結(jié)合。在優(yōu)選的實施方案中，相互作用是非共價的。在一些實施方案中，配體受體還與第二高親和力配體締合，所述第二高親和力配體繼而與肽受體連接。高親和力配體/配體受體對的非限制性實例包括但不限于H(506/FKBP12、氨甲喋呤/ 二氫葉酸還原酶、和PPI-M58/甲硫氨酸氨基肽酶2。配體/配體受體對的其他非限制性實例示于表1中。在一些實施方案中，配體/配體受體對是生物素/鏈霉抗生物素。被考慮用于本發(fā)明方法的任何形式的鏈霉抗生物素包括但不限于單體鏈霉抗生物素、二聚鏈霉抗生物素、四聚鏈霉抗生物素和它們的化學(xué)修飾的或遺傳修飾的變體。在一些實施方案中，配體受體是四聚鏈霉抗生物素。在具體的實施方案中，四聚鏈霉抗生物素被化學(xué)交聯(lián)以增加穩(wěn)定性。表1.高親和力配體/配體受體對的非限制性實例
高親和力配體配體大小配體受體受體大小Kd 或 Ki參考文獻(xiàn)生物素小分子鏈霉抗生物素四聚體53kDa1-20 fM蛭素65aa的肽凝血醇36kDa20 fMZFVp(O)F三肽羧肽酶10-27 fMBiochemistry 1991， 30:8165-70熒光素-生物素單價抗體48 fMPNAS 2000, 97:10701-5ABD (白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)46 aaHSA (白蛋白)50-500 fMProt. Eng. Des. Select. 2008, 21:515-2718 bp DNA辭指6個鋅指2fMPNAS 1998’
權(quán)利要求
1.一種X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽編碼序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子編碼；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含與所述第一核酸分子的部分互補的核酸序列，其中所述第一核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，并且其中所述第二核酸分子與所述多肽非共價結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含(a)高親和力配體，所述高親和力配體與所述第二核酸分子共價結(jié)合；和(b)配體受體，所述配體受體與肽受體結(jié)合，其中所述高親和力配體與所述配體受體結(jié)合并且所述肽受體與所述多肽共價結(jié)合。
3.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含第二高親和力配體，其中所述第二高親和力配體與所述肽受體共價結(jié)合，并且其中所述第二高親和力配體與所述配體受體結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合體，其中所述肽受體通過連接物與所述第二高親和力配體
5.如權(quán)利要求4所述的復(fù)合體，其中所述連接物包括聚乙二醇。
6.如權(quán)利要求4所述的復(fù)合體，其中所述連接物包括多聚唾液酸連接物。
7.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合體，其中所述配體受體與所述肽受體共價結(jié)合。
8.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含(a)配體受體，所述配體受體與所述第二核酸分子共價結(jié)合；和(b)高親和力配體，所述高親和力配體與肽受體結(jié)合，其中所述配體受體與所述高親和力配體結(jié)合并且所述肽受體與所述多肽的C端共價纟口口。
9.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含第三核酸分子，所述第三核酸分子包含與所述第二核酸分子的部分互補的核酸序列，其中所述第三核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，其中所述第三核酸分子與肽受體共價結(jié)合，并且其中所述肽受體與所述多肽共價結(jié)合。
10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的復(fù)合體，其中所述第二核酸分子是分支的核酸分子。
11.如權(quán)利要求1-9任一項所述的復(fù)合體，其中所述第二核酸分子能夠充當(dāng)所述第一核酸分子反轉(zhuǎn)錄的引物。
12.—種X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，所述核酸分子與第一高親和力配體共價結(jié)合；(b)多肽，所述多肽由所述核酸分子編碼；(c)配體受體，所述配體受體與肽受體結(jié)合，其中所述高親和力配體與所述配體受體結(jié)合并且所述肽受體與所述多肽的C端共價
13.如權(quán)利要求12所述的復(fù)合體，其中所述配體受體與所述肽受體共價結(jié)合。
14.如權(quán)利要求12所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含第二高親和力配體，其中所述第二高親和力配體與所述肽受體共價結(jié)合，并且其中所述第二高親和力配體與所述配體受體纟口口。
15.一種X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，所述核酸分子與第一高親和力配體共價結(jié)合；(b)第一配體受體，所述第一配體受體與第二高親和力配體共價結(jié)合；和(c)多肽，所述多肽由第一核酸分子編碼，其中所述多肽包含第二配體受體，其中所述第一高親和力配體與所述第一配體受體結(jié)合，并且所述第二高親和力配體與所述第二配體受體結(jié)合。
16.如前述權(quán)利要求任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體或所述第二高親和力配體是生物素。
17.如前述權(quán)利要求任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體或所述第二高親和力配體選自包括下列的組Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、熒光素-生物素、ABD(白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烴、芳基(β-氨基乙基) 酮和蛋白Α。
18.如前述權(quán)利要求任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一配體受體或所述第二配體受體選自包括下列的組FKBP12、二氫葉酸還原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚鏈霉抗生物素、鏈霉抗生物素四聚體、凝血酶、羧肽酶、單價抗體、HSA(白蛋白)、鋅指、hRI (RNA酶抑制劑)、突變的鹵代烷烴脫鹵素酶、haloTag和分選酶。
19.如前述權(quán)利要求任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一配體受體或所述第二配體受體是鏈霉抗生物素。
20.如前述權(quán)利要求任一項所述的復(fù)合體，其中所述多肽選自包括下列的組抗體、VH 結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、Fab片段、單鏈抗體、納米抗體、unibody、adnectin、親和體、DARPin, anticalin、avimer、10Fn3 結(jié)構(gòu)域禾口 versabody。
21.一種X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)核酸分子，所述核酸分子包含多肽編碼序列，所述核酸分子與高親和力配體共價連接；和(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子編碼，其中所述多肽包含配體受體，其中所述配體與所述配體受體結(jié)合。
22.如權(quán)利要求21所述的復(fù)合體，其中所述配體是Π(506并且所述配體受體是FKBP的 FK506結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
23.如權(quán)利要求1-22任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一核酸分子選自由下列組成的組ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA 雜交 dsDNA 和 dsDNA/RNA 雜交體。
24.如權(quán)利要求1-22任一項所述的復(fù)合體，其中所述第一核酸分子的所述多肽編碼序列不含有框內(nèi)終止密碼子。
25.如權(quán)利要求1-22任一項所述的復(fù)合體，其中所述多肽是結(jié)合蛋白。
26.如權(quán)利要求1-25任一項所述的復(fù)合體，其中所述結(jié)合蛋白是抗體的VH結(jié)構(gòu)域或 VL結(jié)構(gòu)域。
27.如權(quán)利要求1-22任一項所述的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體不含有核糖體。
28.一種文庫，所述文庫包含多種前述權(quán)利要求任一項所述的X-展示復(fù)合體，其中所述復(fù)合體的至少一部分含有不同的多肽編碼序列。
29.一種制備X-展示復(fù)合體的文庫的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供mRNA序列的文庫，所述mRNA序列包含與第一核酸連接物互補的序列元件；(b)提供第一核酸連接物，所述第一核酸連接物與第一高親和力配體可操作地連接以便使所述第一核酸連接物通過互補的核酸堿基配對與所述mRNA結(jié)合；(c)提供第二高親和力配體，所述第二高親和力配體與肽受體可操作地連接；(d)提供具有至少兩個結(jié)合位點的配體受體或提供至少以便使所述配體受體與所述第一高親和力配體和所述第二高親和力配體結(jié)合；(e)容許mRNA翻譯進(jìn)行以便使所述肽受體與翻譯的蛋白結(jié)合，從而形成連接所述mRNA 與所述蛋白的核酸-多肽復(fù)合體。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，所述方法還包括容許使用所述核酸-多肽復(fù)合體中的所述第一核酸連接物作為引物進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄以便形成DNA/RNA雜交體。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，所述方法還包括降解所述mRNA并合成互補的DNA鏈， 從而形成所述核酸-多肽復(fù)合體中的DNA/DNA雜交體。
32.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述mRNA還包含TMV增強子。
33.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述mRNA還包含Cμ序列。
34.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述mRNA還包含F(xiàn)LAG標(biāo)簽。
35.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述mRNA還包含SA展示序列。
36.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述mRNA還包含A20尾。
37.一種核酸-多肽復(fù)合體的文庫，所述核酸-多肽復(fù)合體的文庫通過權(quán)利要求四-35 任一項所述的方法制備。
38.一種選擇分離的核酸分子的方法，所述分離的核酸分子編碼能夠與感興趣的抗原結(jié)合的多肽，所述方法包括下列步驟(a)提供權(quán)利要求四所述的核酸-多肽復(fù)合體的文庫；(b)使所述文庫與感興趣的抗原接觸；(c)從所述文庫中選擇與所述感興趣的抗原結(jié)合的至少一種核酸-多肽復(fù)合體；和(d)分離所選擇的核酸-多肽復(fù)合體的多肽編碼序列。
39.一種制備能夠與感興趣的抗原結(jié)合的多肽的方法，所述方法包括(a)提供使用權(quán)利要求38所述的方法選擇的多肽編碼序列；和(b)表達(dá)所述多肽編碼序列所編碼的多肽。
40.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼通過權(quán)利要求四所述的方法選擇的能夠與感興趣的抗原結(jié)合的多肽。
41.一種X-展示復(fù)合體，所述X-展示復(fù)合體包含(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽編碼序列；(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子編碼；和(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含與所述第一核酸分子的部分互補的核酸序列；(d)第一高親和力配體，所述第一高親和力配體與所述第二核酸分子共價結(jié)合；(e)第一配體受體；(f)第二高親和力配體，所述第二高親和力配體經(jīng)由一個或多個連接分子與肽受體共價結(jié)合，其中所述第一核酸分子通過互補的核酸堿基配對與所述第二核酸分子結(jié)合，其中所述第一高親和力配體與所述配體受體在第一結(jié)合位點非共價結(jié)合，其中所述第二配體與所述配體受體在第二結(jié)合位點非共價結(jié)合，并且其中所述一個或多個連接分子是聚乙二醇分子。
42.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體是生物素并且所述配體受體選自包括下列的組鏈霉抗生物素、二聚鏈霉抗生物素和四聚鏈霉抗生物素。
43.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述第二高親和力配體是生物素并且所述配體受體選自包括下列的組鏈霉抗生物素、二聚鏈霉抗生物素和四聚鏈霉抗生物素。
44.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體或所述第二高親和力配體選自包括下列的組Π(506、氨甲喋呤、ΡΡΙ-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、熒光素-生物素、ABD(白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、18bp DNA、RNA酶Α、氯烷烴、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白 A0
45.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，所述復(fù)合體還包含第二配體受體。
46.如權(quán)利要求45所述的復(fù)合體，其中所述第二配體受體選自包括下列的組FKBP12、 二氫葉酸還原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚鏈霉抗生物素、鏈霉抗生物素四聚體、凝血酶、 羧肽酶、單價抗體、HSA (白蛋白)、鋅指、hRI (RNA酶抑制劑)、突變的鹵代烷烴脫鹵素酶、 haloTag和分選酶。
47.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述肽受體是嘌呤霉素。
48.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述第一核酸分子或所述第二核酸分子還包括補骨脂素。
49.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述多肽選自包括下列的組抗體、VH結(jié)構(gòu)域、 VL結(jié)構(gòu)域、Fab片段、單鏈抗體、納米抗體、unibody、adnectin、親和體、DARPin、anticalin、 avimer、10Fn3 結(jié)構(gòu)域禾口 versabody。
50.一種異雙功能復(fù)合體，所述異雙功能復(fù)合體包含(a)第一高親和力配體，所述第一高親和力配體與核酸分子共價結(jié)合；(b)第二高親和力配體，所述第二高親和力配體與肽受體共價結(jié)合；和(c)配體受體，所述配體受體包含兩個或更多個配體結(jié)合位點；其中所述第一高親和力配體和所述第二高親和力配體在不同的配體結(jié)合位點與所述配體受體結(jié)合。
51.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體與所述第二高親和力配體是相同的。
52.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述第一高親和力配體與所述第二高親和力配體是生物素。
53.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述核酸分子包含補骨脂素部分。
54.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述肽受體是嘌呤霉素。
55.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述配體受體是多聚蛋白。
56.如權(quán)利要求50所述的復(fù)合體，其中所述配體受體是鏈霉抗生物素。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于在體外鑒定具有期望特征的多肽的方法和組合物。
文檔編號G01N33/50GK102177438SQ200980137939
公開日2011年9月7日 申請日期2009年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者亞歷山大·利托維奇克, 理查德·W·瓦格納 申請人:X博迪生物科學(xué)公司, 理查德·W·瓦格納