突觸小泡循環(huán)的測(cè)定和系統(tǒng)的制作方法

文檔序號(hào)：5865569閱讀：1204來源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>測(cè)量裝置的制造及其應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：突觸小泡循環(huán)的測(cè)定和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定突觸傳遞調(diào)節(jié)劑的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
突觸小泡循環(huán)在神經(jīng)傳遞中處于中心地位。該過程通常在神經(jīng)末梢發(fā)生并涉及以下步驟伴隨神經(jīng)遞質(zhì)釋放的小泡胞吐、空小泡胞吞以及小泡的再循環(huán)和再利用。包含在突觸小泡中的神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將神經(jīng)遞質(zhì)裝載到小泡中。經(jīng)裝載的小泡轉(zhuǎn)位至末梢的細(xì)胞質(zhì)膜，在那里它們選擇性地停靠在活性區(qū)附近并成為可融合狀態(tài)(fusion competent)。通常，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高引發(fā)小泡融合以及引發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙。而后神經(jīng)遞質(zhì)可結(jié)合并活化受體。融合后，小泡蛋白質(zhì)和膜通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用回收，重新裝填神經(jīng)遞質(zhì)，并再循環(huán)用于隨后的釋放。因此，神經(jīng)傳遞涉及通過重復(fù)的胞吐作用和胞吞作用進(jìn)行的正常突觸小泡循環(huán)。突觸小泡循環(huán)的破壞可導(dǎo)致多種精神和神經(jīng)疾病。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于對(duì)能刺激神經(jīng)元細(xì)胞的動(dòng)作電位以及并行檢測(cè)多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中突觸傳遞方面的新平臺(tái)和方法的開發(fā)。在一些方面，本發(fā)明克服了與以高通量形式分析突觸傳遞相關(guān)的長(zhǎng)久以來的挑戰(zhàn)。因此在一些方面，本發(fā)明提供以高通量方式鑒定突觸傳遞調(diào)節(jié)劑的平臺(tái)和方法。本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即采用本文公開的新平臺(tái)和方法，在一些情況下，可采用低數(shù)值孔徑的空氣物鏡陣列，以高通量方式高度靈敏地檢測(cè)突觸小泡循環(huán)的方面。因此，在一些方面，本發(fā)明提供以高通量方式分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)和方法。在另一些方面，本發(fā)明提供在多個(gè)平行培養(yǎng)物中分析突觸小泡循環(huán)的方面的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)。本發(fā)明提供了用于鑒定突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的平臺(tái)、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可鑒定用于表征突觸小泡循環(huán)通路的試劑和工具以及用于監(jiān)測(cè)和/或調(diào)節(jié)該通路的診斷劑和/或治療劑等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于例如突觸小泡循環(huán)活性的至少一個(gè)方面的突觸小泡循環(huán)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)測(cè)定監(jiān)測(cè)突觸小泡循環(huán)的動(dòng)態(tài)、效率和/或其他特征(如頻率、持續(xù)時(shí)間和/或突觸疲勞)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過采用本發(fā)明的突觸小泡循環(huán)測(cè)定來鑒定調(diào)節(jié)(如刺激和/或抑制)突觸小泡循環(huán)之試劑的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以是任何種類的化學(xué)實(shí)體(例如，多肽、核酸、抗體、小分子、碳水化合物、脂質(zhì)、微生物等)。本發(fā)明所用的突觸小泡循環(huán)測(cè)定通常包括多個(gè)細(xì)胞(例如，包含至少一個(gè)具有突觸前末梢的細(xì)胞，所述突觸前末梢顯示功能性突觸小泡循環(huán)或者至少一種突觸小泡循環(huán)活性)、報(bào)告物(如，可用于跟蹤突觸小泡循環(huán)或至少一種突觸小泡循環(huán)活性的報(bào)告物)、刺激系統(tǒng)(如，電、聲、超聲或光學(xué)刺激系統(tǒng)以引發(fā)突觸小泡循環(huán)，例如，通過引發(fā)動(dòng)作電位) 以及檢測(cè)系統(tǒng)(例如，捕獲由報(bào)告物產(chǎn)生的信號(hào)的成像系統(tǒng))。在一些實(shí)施方案中，以高通量形式安排和/或?qū)嵤┩挥|小泡循環(huán)測(cè)定。例如，本發(fā)明的方法可包括使用單個(gè)儀器同時(shí)測(cè)量多個(gè)突觸小泡循環(huán)測(cè)定(例如，至少4、16或更多個(gè)突觸小泡循環(huán)測(cè)定)的步驟。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包括在單個(gè)儀器上每小時(shí)測(cè)量至少M(fèi)(例如，至少48、96、384或更多個(gè))個(gè)突觸小泡循環(huán)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所用儀器適于篩選多孔板(例如，24、48、96或384孔板)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)。所述平臺(tái)包含 a)多個(gè)孔；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為(i)放置在孔中和(ii)產(chǎn)生適于在孔內(nèi)的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸前蛋白相連，并且其中發(fā)光信號(hào)的存在指示神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)孔含有多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞在 10至1，000，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在 1000至4000個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞是原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元是大鼠原代神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)電極對(duì)中的電極均為基本同心的圓柱體，并且其中同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料分隔。在一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其設(shè)置為將多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與所述多個(gè)電極有效連接的電源。在一些實(shí)施方案中，將所述電源設(shè)置為對(duì)每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定電壓。在一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為IV至400V。在一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為5V至20V。在一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與所述電源和所述多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中將所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率提供多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為0. 2Hz至100Hz。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。在一些實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)間為最多 2分鐘。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多10毫秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0.1毫秒至2毫秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖起始之間的持續(xù)時(shí)間為0. 1至5毫秒。在一些實(shí)施方案中，脈沖數(shù)的范圍為 1至1000。在一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器均包含光學(xué)傳感器。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，將所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0. 2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0. 4至1. 4。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與每個(gè)檢測(cè)器有效連接的電荷耦合器件(charge-coupled device，CCD) 照相機(jī)。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)多個(gè)孔中的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素 (synaptophysin)、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)具有腔部分(lumenal portion)的突觸小泡蛋白，其中所述突觸小泡蛋白與報(bào)告分子連接。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子與突觸小泡蛋白的腔部分相連。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為PH敏感的熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為pHluorin。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子包含SEQ ID NO 1 (hSyn-SypHy)所示的序列。在一些實(shí)施方案中，在7. 0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的pH下發(fā)出的熒光。在一些實(shí)施方案中，在5. 0至6. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0 范圍的PH下發(fā)出的熒光。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)。所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；和c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的至少一個(gè)亞組的發(fā)光信號(hào)，其中所述發(fā)光信號(hào)指示突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包含與突觸小泡蛋白連接的報(bào)告分子。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，并且其中多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包含與突觸小泡蛋白連接的報(bào)告分子；b)刺激器系統(tǒng)，其設(shè)置為誘導(dǎo)所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡循環(huán)；和c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自孔中存在的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的至少一個(gè)亞組的發(fā)光信號(hào)，其中所述發(fā)光信號(hào)指示突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白包含腔部分。在上述任何方面的一些實(shí)施方案中，所述刺激器系統(tǒng)包含多個(gè)電極對(duì)，其中將每個(gè)電極對(duì)放置在多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)。在任何上述方面的一些實(shí)施方案中，孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至100，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000 至4000個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞是原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元是大鼠原代神經(jīng)元。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞包含表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白具有腔部分。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)電極對(duì)中的電極均為基本同心的圓柱體，并且其中同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料所分隔。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其設(shè)置為將多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與多個(gè)電極有效連接的電源。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，將所述電源設(shè)置為對(duì)每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為IV至400V。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為5V至20V。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與電源和多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓脈沖。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率提供多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為0. 2Hz至100Hz。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)間最多2 分鐘。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多10毫秒。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0. 1毫秒至2毫秒。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖起始之間的持續(xù)時(shí)間為0. 1至5毫秒。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，脈沖數(shù)的范圍為1至1000。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中將所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器均包含光學(xué)傳感器。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，將所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0. 2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0. 4至1. 4。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述物鏡的數(shù)值孔徑為0. 5。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與每個(gè)檢測(cè)器有效連接的電荷耦合器件照相機(jī)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與所述檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子與突觸小泡蛋白的腔部分相連。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為PH敏感的熒光蛋白。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為pHluorin。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子包含SEQ ID N0:l(hSyn-SypHy)所示序列。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，在7. 0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，在5. 0至 6. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。在任何上述平臺(tái)的一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。在本發(fā)明另一方面中，提供了分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)。所述平臺(tái)包含a) 多個(gè)孔；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為⑴放置在孔中，并且(ii)產(chǎn)生適于在孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示了神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)所述孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分析突觸小泡循環(huán)的方面的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)。所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在孔中的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示了神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，并且其中多個(gè)所述神經(jīng)元細(xì)胞包含與小泡蛋白相連的報(bào)告分子；b)設(shè)置為誘導(dǎo)所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡循環(huán)的刺激器系統(tǒng)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示了神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述刺激器系統(tǒng)包含多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)被放置在多個(gè)孔中的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白包含腔部分。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡是油鏡或水鏡(oil or water objective len)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡是空氣物鏡。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡與光學(xué)檢測(cè)器有效連接。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述光學(xué)檢測(cè)器是電荷耦合器件照相機(jī)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)被設(shè)置為檢測(cè)來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，所述神經(jīng)元細(xì)胞已被刺激產(chǎn)生至少5個(gè)動(dòng)作電位。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含多個(gè)物鏡。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至100，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000至4000個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元為大鼠原代神經(jīng)元。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞包含表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白具有腔部分。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，每個(gè)電極對(duì)中的電極均為基本同心的圓柱體，并且其中同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料分隔。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其設(shè)置為將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與多個(gè)電極有效連接的電源。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，將所述電源設(shè)置為對(duì)每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為IV至400V。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為5V 至20V。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與電源和多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓脈沖。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率提供多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為0. 2Hz至100Hz。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz 至50Hz。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)間最多2分鐘。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為0. 1至20秒。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多10毫秒。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0. 1毫秒至2毫秒。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖起始之間的時(shí)間為0. 1至5毫秒。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，脈沖數(shù)的范圍為1至1000。在任何上述本發(fā)明方案的一些實(shí)施方案中，所述平臺(tái)還包含與脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中將所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含光學(xué)傳感器。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡設(shè)置為從收集來自范圍為0. 2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0. 4至1. 4。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡的數(shù)值孔徑為0. 5。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含多個(gè)檢測(cè)器，所述多個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)多個(gè)孔中的信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，將每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，將每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、J L茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子與突觸小泡蛋白的腔部分相連。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為PH敏感的熒光蛋白。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子為pHluorin。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告分子包含SEQ ID NO=KhSyn-SypHy)中所示序列。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，在7. 0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的PH下所發(fā)出的熒光。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，在5. 0至6. 0范圍的 PH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。在任何上述本發(fā)明方面的一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在多個(gè)細(xì)胞中測(cè)量突觸小泡循環(huán)的方面的方法。所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供電極對(duì)和多個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子；b)用所述電極對(duì)在多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)的一系列動(dòng)作電位；以及c)在所述多個(gè)孔中檢測(cè)所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)是對(duì)突觸小泡循環(huán)的方面的度量。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至100000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000至2000個(gè)細(xì)胞/mm2 孔底面積的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元為大鼠原代神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)所述神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白。在一些實(shí)施方案中，電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)電極對(duì)中的電極均為基本同心的圓柱體，并且其中同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料分隔。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括采用電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)放置在多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，與多個(gè)電極有效連接的電源誘導(dǎo)所述動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，通過向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定電壓誘導(dǎo)所述動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為IV至400V。在一些實(shí)施方案中，所述電壓的范圍為5V 至20V。在一些實(shí)施方案中，脈沖發(fā)生器與電源和多個(gè)電極對(duì)有效連接，其中所述脈沖發(fā)生器向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定的電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，所述脈沖發(fā)生器在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率提供多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為0. 2Hz至 IOOHz0在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。在一些實(shí)施方案中，預(yù)定時(shí)間小于或等于2分鐘。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多10毫秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0. 1毫秒至2毫秒。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)脈沖起始之間的時(shí)間為0.1至5毫秒。在一些實(shí)施方案中，脈沖數(shù)的范圍為1至1000。在一些實(shí)施方案中，所述電壓脈沖由與脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)控制，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)由檢測(cè)器檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)器包含光學(xué)傳感器。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)用多個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)，其中每個(gè)檢測(cè)器與電荷耦合器件照相機(jī)有效連接。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0. 2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0. 4至1. 4。在一些實(shí)施方案中，所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)與所述多個(gè)檢測(cè)器有效連接并將來自檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡蛋白具有腔部分。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光報(bào)告分子與腔部分相連。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光報(bào)告分子為PH敏感的報(bào)告分子。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光報(bào)告分子為pHluorin。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光報(bào)告分子包含SEQ ID NO =KhSyn-SypHy)所示序列。在一些實(shí)施方案中，在7. 0至8. 0范圍的 PH下，所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于在5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。在一些實(shí)施方案中，在7. 0至8. 0范圍的pH下，所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于在7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括d)使所述多個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)在細(xì)胞中誘導(dǎo)第二系列的動(dòng)作電位，其足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；f)檢測(cè)所述多個(gè)孔中的報(bào)告分子的第二發(fā)光信號(hào)；其中在步驟(c)中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在步驟(f)中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括，在步驟(b)之前，使所述多個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力，其中在步驟(c) 中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與對(duì)照發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種對(duì)照劑相接觸；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在具有對(duì)照劑的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述檢測(cè)器待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在具有陰性對(duì)照的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使陰性對(duì)照孔中的多個(gè)細(xì)胞與不調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的對(duì)照劑相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述檢測(cè)器待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在具有陽性對(duì)照的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間無顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使陽性對(duì)照孔中的多個(gè)細(xì)胞與調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的對(duì)照劑相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物為小分子。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物為多肽。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物是抗體。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物是核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸是選定的DNA、RNA、DNA/RNA雜交體、短干擾RNA、短發(fā)夾RNA、小RNA(microRNA)、核酶或適體(aptamer)。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物是碳水化合物。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試物是脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)是磷脂、甘油三酯或留類。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在體內(nèi)模型中監(jiān)測(cè)被鑒定為突觸小泡循環(huán)方面之調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的毒性。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在體內(nèi)模型中監(jiān)測(cè)被鑒定為突觸小泡循環(huán)方面的調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的效力。在一些實(shí)施方案中，所述方法是高通量的篩選方法。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是熒光水平。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是在預(yù)定時(shí)間內(nèi)獲得的多個(gè)熒光水平。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是熒光增加速率。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光信號(hào)是熒光減少速率。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定作為突觸小泡循環(huán)方面之調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的方法。所述方法包括a)提供多個(gè)孔，每個(gè)孔包含電極對(duì)以及表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)的第一系列動(dòng)作電位；c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的第一發(fā)光信號(hào)；d)使所述多個(gè)孔中的所述多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)在細(xì)胞中誘導(dǎo)第二系列動(dòng)作電位，其足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；以及f)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的第二發(fā)光信號(hào)；其中第一和第二報(bào)告分子熒光水平之間的顯著差異將測(cè)試物鑒定為突觸小泡循環(huán)的方面的調(diào)節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在多個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)突觸小泡循環(huán)的方面的方法。所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供電極對(duì)和表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)用所述電極對(duì)在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列動(dòng)作電位，所述動(dòng)作電位足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)；其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)是突觸小泡循環(huán)的方面的度量；以及d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)和在對(duì)照孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的比較鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面的方法。所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供刺激器和表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)用刺激器在多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列動(dòng)作電位，其足以在細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；以及c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)；其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)是突觸小泡循環(huán)的方面的度量。

圖1，突觸小泡循環(huán)的示意圖，顯示了一些突觸前蛋白質(zhì)被認(rèn)為發(fā)揮功能的位置。圖2，可用于在神經(jīng)元細(xì)胞中刺激突觸小泡循環(huán)的電極對(duì)的立視圖。(A)所述電極對(duì)包含內(nèi)部的棒狀電極102和外部的圓環(huán)形電極104。所述電極對(duì)可與神經(jīng)元細(xì)胞接觸放置或放置在其附近。(B)(A)中顯示的電極對(duì)的頂視圖。圖3，(A)-(D)可應(yīng)用于圖2A-B的電極的電壓波形的幾個(gè)實(shí)施方案。
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圖4，(A)可應(yīng)答于施加到電極的電壓而在圖2A-B的電極之間產(chǎn)生的瞬時(shí)電場(chǎng)E ；(B)可在神經(jīng)元細(xì)胞周圍產(chǎn)生的瞬時(shí)電場(chǎng)E。圖5，可用于刺激突觸小泡循環(huán)的電極設(shè)置的多個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖6，(A)-(B)電極組件的一個(gè)實(shí)施方案。電極102、104由盤503支撐，通過導(dǎo)線路510、512與電極電接觸。(C)電極組件的立視圖。圖7，(A)-(C)可用于基本同時(shí)地刺激多孔板中突觸小泡循環(huán)的多電極組件的示意圖。㈧頂視圖；⑶立視圖；(C)底視圖。圖8，(A)多電極組件的一個(gè)實(shí)施方案，其中可單獨(dú)地刺激電極對(duì)的行或排。⑶分離的導(dǎo)線路610的局部電接觸722A-722L。圖9，可用于對(duì)一個(gè)或更多電極對(duì)施加電壓波形的電路的實(shí)施方案的框圖。圖10，描述突觸小泡循環(huán)平臺(tái)的一個(gè)實(shí)施方案的立視圖。所述平臺(tái)包含多孔板 915，倒置顯微鏡910，放置裝置945以及多電極組件600。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述顯微鏡 910對(duì)孔908中發(fā)生的突觸小泡循環(huán)活性的至少一部分成像。圖11，描述突觸小泡循環(huán)平臺(tái)的一個(gè)實(shí)施方案的立視圖。所述平臺(tái)包含多孔板 915，多電極組件600，透鏡陣列1070，光檢測(cè)器陣列1080。在多個(gè)實(shí)施方案中，透鏡1072收集孔中突觸小泡循環(huán)過程中所發(fā)出的至少部分熒光輻射，并導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的光檢測(cè)器1082。突觸小泡循環(huán)平臺(tái)的該實(shí)施方案提供了在獨(dú)立的容器(如包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔)中對(duì)突觸小泡循環(huán)的平行監(jiān)測(cè)。所述孔可以為多孔板中的分離的孔。圖 12，Cypher5E(GE Healthcare)為在 pH5. 5 發(fā)出熒光并在 pH7. 4 淬滅的 pH 敏感染料。由于其在pH5.5(右)時(shí)具有與PH7.4(左)時(shí)不同的結(jié)構(gòu)，因此在不同的pH下 Cypher5E產(chǎn)生不同的熒光。圖13，顯示在倒置顯微鏡上測(cè)量的原代神經(jīng)元中整孔水平的突觸小泡循環(huán)的示例性結(jié)果，所述神經(jīng)元被表達(dá)synaptopHluorin的腺相關(guān)病毒感染。圖14。顯示在平板顯示(plate: :vision)讀板器上測(cè)量的原代神經(jīng)元中整孔水平的突觸小泡循環(huán)的示例性結(jié)果，所述神經(jīng)元被表達(dá)synaptopHluorin的腺相關(guān)病毒感染。圖15，包含外徑為6mm的外部鉬環(huán)電極的示例性定制電極，其適合裝入96孔板的孔中。圖16，顯示了示例性結(jié)果(熒光圖像和熒光信號(hào)記錄)。在原代神經(jīng)元中誘發(fā)動(dòng)作電位從而獲得該數(shù)據(jù)。所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，采用經(jīng)改裝的市售電穿孔系統(tǒng)(Cellaxess , CX3，Cellectricon AB, Moldnal, Sweden)進(jìn)行刺激。該結(jié)果證明 Cellectricon系統(tǒng)可在原代神經(jīng)元中誘發(fā)動(dòng)作電位，所述動(dòng)作電位通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)物的Ca++成像來測(cè)量。該圖中的比例尺為ΙΟΟμπι。圖17，顯示了實(shí)驗(yàn)的示例性結(jié)果(熒光圖像和熒光信號(hào)記錄)，所述實(shí)驗(yàn)中在96 孔板中誘發(fā)突觸小泡循環(huán)。所述電刺激系統(tǒng)與在圖16的試驗(yàn)中所用的相同。該圖證明 Cellectricon系統(tǒng)可在原代神經(jīng)元中誘發(fā)突觸小泡循環(huán)，所述突觸小泡循環(huán)通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)物的synaptopHluorin成像測(cè)量。圖18，顯示了示例性結(jié)果，其說明當(dāng)神經(jīng)元被定制Cellectricon電極刺激時(shí)，平板可視讀板器可利用synaptophysin-pHluorin報(bào)告子檢測(cè)突觸小泡循環(huán)。圖19，顯示了示例性結(jié)果，其說明平板可視讀板器系統(tǒng)可成功地檢測(cè)應(yīng)答于少量動(dòng)作電位的 synaptophysin-pHluorin。圖20，示例性高含量篩選系統(tǒng)的示意圖。圖21，突觸前HTS平臺(tái)儀器的示例。(上)突觸前HTS平臺(tái)儀器的上室，顯示了 Tecan液體處理機(jī)械手端部的位置，電刺激端部模塊和平板可視讀板器的iCCD照相機(jī)。 (下)下室，顯示了脈沖發(fā)生器、讀板器、讀板器燈和多個(gè)電源的位置。圖22，采用突觸前HTS平臺(tái)的96平行突觸前測(cè)定的結(jié)果，其中將記錄相對(duì)于其應(yīng)
答峰值歸一化。圖23，突觸前HTS平臺(tái)電刺激系統(tǒng)的一致性分析的示例性結(jié)果。(A)顯示單個(gè)孔中應(yīng)答于刺激系列(紅色條)的sypHy熒光。(B)顯示作為刺激電壓函數(shù)的sypHy熒光峰值幅度以及EV50測(cè)量的推導(dǎo)。(C)顯示作為96孔板孔的函數(shù)的EV50。所述電刺激系統(tǒng)為整個(gè)96孔板提供均一的電流密度。圖24，突觸前HTS平臺(tái)靈敏性分析的示例性結(jié)果。圖25，用突觸前HTS平臺(tái)檢測(cè)突觸小泡循環(huán)中由化合物誘導(dǎo)的變化。圖沈，采用高含量成像系統(tǒng)對(duì)突觸小泡循環(huán)的測(cè)量。圖27，采用Fluoroskan Ascent FL讀板器對(duì)突觸小泡循環(huán)的分析的示例性結(jié)果。定義試劑如本文所用，術(shù)語“試劑”(也稱為“測(cè)試物”或“候選試劑”)是指可被檢測(cè)為潛在的調(diào)節(jié)劑的任何化合物或組合物。可采用的試劑的實(shí)例包括但不限于小分子、抗體、抗體片段、siRNA、shRNA、核酸分子(RNA、DNA、或DNA/RNA雜交體)、反義寡核苷酸、核酶、肽、肽模擬物、碳水化合物、脂質(zhì)、微生物、天然產(chǎn)物等。在一些實(shí)施方案中，試劑可為分離的或未分離的。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，試劑可為試劑文庫。如果發(fā)現(xiàn)試劑的混合物為調(diào)節(jié)劑，則可進(jìn)一步將混合物純化成分離的組分以確定哪個(gè)組分是靶標(biāo)活性的實(shí)際調(diào)節(jié)劑。氨基酸如本文所用，術(shù)語“氨基酸”以其最廣泛的意義表示可并入多肽鏈的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，氨基酸具有&N-C(H) (R)-COOH的一般結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，氨基酸是天然的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些實(shí)施方案中，氨基酸為D-氨基酸；在一些實(shí)施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“標(biāo)準(zhǔn)氨基酸” 是指在天然肽中通常發(fā)現(xiàn)的20種標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸中的任意種。“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”是指除標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外的任何氨基酸，不管其是合成制備而成還是從天然來源獲得。如本文所用，“合成的氨基酸”涵蓋化學(xué)修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代。氨基酸(包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可通過甲基化、酰胺化、乙?；? 或用其它化學(xué)基團(tuán)取代進(jìn)行修飾，這可改變肽的循環(huán)半衰期而不對(duì)它們的活性產(chǎn)生不利影響。氨基酸可參與二硫鍵。術(shù)語“氨基酸”可與“氨基酸殘基”互換使用，并可指代游離氨基酸和/或肽的氨基酸殘基。根據(jù)采用該術(shù)語的上下文，其是指代游離氨基酸還是肽的殘基會(huì)顯而易見。動(dòng)物如本文所用，術(shù)語“動(dòng)物”是指動(dòng)物界的任何成員。在一些實(shí)施方案中，“動(dòng)物”是指在任何發(fā)育階段的人。在一些實(shí)施方案中，“動(dòng)物”是指在任何發(fā)育階段的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(例如，嚙齒類動(dòng)物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和/或豬)。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物包括但不限于哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類、昆蟲類和/或蠕蟲類。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物可為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、遺傳改造動(dòng)物和/或克隆。抗體如本文所用，術(shù)語“抗體”是指任何免疫球蛋白，不管其是天然或者完全或部分合成產(chǎn)生的。本術(shù)語中也包括保留其特異結(jié)合活性的所有其衍生物。該術(shù)語還涵蓋具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或大部分同源。這些蛋白質(zhì)可來自天然來源，或者部分或全部合成產(chǎn)生?？贵w可為單克隆或多克隆。抗體可為任何免疫球蛋白類型的成員，所述類型包括任何人的類型IgG、IgM、IgA、IgD和 IgE。如本文所用，術(shù)語“抗體片段”或“抗體的特征性區(qū)域”互換使用并指代短于全長(zhǎng)的任何抗體衍生物。一般地，抗體片段至少保留全長(zhǎng)抗體的特異結(jié)合能力的顯著部分?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab，、F (ab，)2、scFv、Fv、dsFv雙抗體(diabody)和Fd片段。抗體片段可通過任何方式產(chǎn)生。例如，抗體片段可通過完整抗體的片段化從而酶法或化學(xué)法產(chǎn)生和/或其可從編碼部分抗體序列的基因重組地生成。作為替代地或另外地，抗體片段可被完全或部分地合成產(chǎn)生。抗體片段可以任選地包含單鏈抗體片段。作為替代地或另外地，抗體片段可以包含連接在一起的多條鏈，例如通過二硫鍵連接?？贵w片段可以任選地包含多分子復(fù)合體。功能性抗體片段通常包含至少約50個(gè)氨基酸，并更通常地包含至少 200個(gè)氨基酸。約如本文所用，術(shù)語“約”或“大約”當(dāng)用于一個(gè)或更多個(gè)目的值時(shí)表示與指出的參照值相似的值。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“約”或“大約”表示在指出的參照值兩邊(大于或小于)25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、 7^^6^^5^3^^3^^2^^1%或更小范圍內(nèi)的值，除非另外指明或從上下文中顯而易見 (不含該數(shù)值會(huì)超過可能值的100%的情況)。相關(guān)聯(lián)如本文所用，當(dāng)用于指代兩個(gè)或更多部分時(shí)，術(shù)語“相關(guān)聯(lián)”、“綴合”、“連接”、“相連”、“附著”是指所述部分彼此物理地相關(guān)聯(lián)或相連接以形成足夠穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使得所述部分在使用所述結(jié)構(gòu)的條件下(例如生理?xiàng)l件)保持物理相連，所述相關(guān)聯(lián)或相連接為直接相連或通過作為連接劑的一個(gè)或更多個(gè)額外部分相連。在一些實(shí)施方案中，所述部分通過一個(gè)或更多個(gè)共價(jià)鍵彼此連接。在一些實(shí)施方案中，所述部分通過涉及非共價(jià)結(jié)合的機(jī)制(例如氫鍵、親和相互作用、靜電相互作用、范德華力等)彼此連接。在一些實(shí)施方案中，足夠量的弱相互作用可提供使部分保持物理相連的足夠穩(wěn)定性。生物相容的如本文所用，術(shù)語“生物相容的”是指對(duì)細(xì)胞無毒性的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，如果將物質(zhì)在體內(nèi)添加到細(xì)胞而不誘導(dǎo)炎性和/或其他體內(nèi)不利作用，則認(rèn)為所述物質(zhì)是“生物相容的”。在一些實(shí)施方案中，如果將物質(zhì)體外或體內(nèi)添加到細(xì)胞導(dǎo)致小于或等于約50%、約45%、約40%、約；35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或少于約5%的細(xì)胞死亡，則認(rèn)為所述物質(zhì)為“生物相容的”。生物可降解的如本文所用，術(shù)語“可生物降解的”是指在生理?xiàng)l件下降解的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可生物降解的物質(zhì)是通過細(xì)胞作用分解的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可生物降解的物質(zhì)是通過化學(xué)過程分解的物質(zhì)。對(duì)照如本文所用，術(shù)語“對(duì)照”具有其在本領(lǐng)域所理解的作為對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品的意義。通常，對(duì)照在實(shí)驗(yàn)中用于通過分離變量來提高實(shí)驗(yàn)的完整性，從而得出有關(guān)該變量的結(jié)論。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是與檢測(cè)反應(yīng)或測(cè)定同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)或測(cè)定，以提供比較。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，施加“測(cè)試物”(即待測(cè)變量)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，施加“對(duì)照”，而不施加所測(cè)試的變量。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是歷史對(duì)照(即之前進(jìn)行的檢測(cè)或測(cè)定，或之前已知的量或結(jié)果)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是打印的或以其他方式儲(chǔ)存的記錄，或包含這些記錄。對(duì)照可為陽性對(duì)照或陰性對(duì)照。檢測(cè)系統(tǒng)本文所用的檢測(cè)系統(tǒng)是用于監(jiān)測(cè)突觸小泡循環(huán)的方面的系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)通常提供對(duì)來自包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔中至少一個(gè)區(qū)域的發(fā)光信號(hào)的監(jiān)測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)可提供對(duì)發(fā)光信號(hào)的同時(shí)監(jiān)測(cè)，每個(gè)發(fā)光信號(hào)來自多個(gè)孔中的包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔內(nèi)的至少一個(gè)區(qū)域。檢測(cè)系統(tǒng)可包含檢測(cè)器，如光學(xué)傳感器、物鏡、光電倍增管等，其設(shè)置為檢測(cè)來自孔中神經(jīng)元細(xì)胞的報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。檢測(cè)系統(tǒng)可包括多個(gè)檢測(cè)器，如光學(xué)傳感器、物鏡等，其每個(gè)都設(shè)置為檢測(cè)來自孔中神經(jīng)元細(xì)胞的報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。檢測(cè)系統(tǒng)通常包含光敏組件，其設(shè)置為將發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字電信號(hào)。例如，檢測(cè)系統(tǒng)可包含與檢測(cè)器有效連接的電荷耦合系統(tǒng)照相機(jī)。檢測(cè)系統(tǒng)可與計(jì)算機(jī)有效連接，所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)。去磷蛋白如本文所用，術(shù)語“去磷蛋白(cbphosphin) ”是指在去磷酸化時(shí)調(diào)節(jié)突觸小泡胞吞作用(例如，增強(qiáng)其效力)的蛋白質(zhì)。通常，當(dāng)去磷酸化時(shí)，所述去磷蛋白組裝成蛋白質(zhì)復(fù)合體中。在一些實(shí)施方案中，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)將去磷蛋白去磷酸化。功能異常如本文所用，術(shù)語“功能異?！笔侵阜肿踊蜻^程的功能異常。分子(例如，蛋白質(zhì))的功能異?？捎膳c該分子相關(guān)的活性的增強(qiáng)或減弱所導(dǎo)致。分子的功能異?？捎膳c該分子自身相關(guān)的缺陷所導(dǎo)致，或者與和該分子直接或間接相互作用或?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)控的其他分子相關(guān)的缺陷導(dǎo)致。過程(例如突觸小泡循環(huán))的功能異常可由與直接參與該過程的任何分子相關(guān)的活性的增強(qiáng)或減弱所導(dǎo)致，或者由與直接或間接與所述分子相互作用或調(diào)節(jié)所述分子的其他分子或過程相關(guān)的活性的增強(qiáng)或減弱所導(dǎo)致。電刺激系統(tǒng)如本文所用，術(shù)語“電刺激系統(tǒng)”是指包含至少一個(gè)電極組件的裝置，其可與神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物、懸液和/或制備物相接觸放置或放置在其附近。所述電刺激系統(tǒng)可任選地另外包含產(chǎn)生電壓或電流波形的電裝置。電極組件如本文所用，術(shù)語“電極組件”是指支持和包含電極對(duì)的裝置。所述裝置可另外包含與電極對(duì)中每個(gè)電極相連的導(dǎo)線或線路。電極對(duì)如本文所用，術(shù)語“電極對(duì)”通常是指兩個(gè)導(dǎo)電元件，其設(shè)置為一個(gè)元件用作陰極而一個(gè)元件用作陽極。在一些實(shí)施方案中，例如參見圖5H，術(shù)語“電極對(duì)”可用于多于兩個(gè)的導(dǎo)電元件，其中所述元件中的一些設(shè)置為用作陰極，所述元件中的一些設(shè)置為用作陽極。激發(fā)區(qū)如本文所用，術(shù)語“激發(fā)區(qū)”是指細(xì)胞培養(yǎng)物、懸液和/或制備物中接受刺激波形的區(qū)域。所述刺激波形可在該區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞中激發(fā)突觸小泡循環(huán)。功能性如本文所用，“功能性”生物分子或過程是一定形式的生物分子或過程，在所述形式中其顯示其特征性性質(zhì)和/或活性。瞬時(shí)電場(chǎng)如本文所用，采用術(shù)語“瞬時(shí)電場(chǎng)”描述隨時(shí)間變化的電場(chǎng)的瞬間狀態(tài)。例如，瞬時(shí)電場(chǎng)是隨時(shí)間變化的電場(chǎng)某一瞬間的表現(xiàn)。體外如本文所用，術(shù)語“體外”是指在人造環(huán)境中(例如在試管或反應(yīng)容器，細(xì)胞培養(yǎng)物中等)而不是在多細(xì)胞生物體中發(fā)生的事件。體內(nèi)如本文所用，術(shù)語“體內(nèi)”是指在多細(xì)胞生物體(例如非人動(dòng)物)中發(fā)生的事件。分離的如本文所用，術(shù)語“分離的”是指以下物質(zhì)和/或?qū)嶓w，(1)與最初產(chǎn)生時(shí)(在天然環(huán)境中和/或在試驗(yàn)設(shè)置中)和其相關(guān)聯(lián)的至少一些組分相分離和/或(2)通過人工生產(chǎn)、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與至少約10%、約20%、約30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98%、約 99%、基本 100% 或100%的其初始相關(guān)聯(lián)的其他組分相分離。在一些實(shí)施方案中，分離的試劑的純度大于約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98 %、約99 %、基本100 %或100 %。如本文所用，如果基本無其他組分，則物質(zhì)是“純，，的。如本文所用，術(shù)語“分離的細(xì)胞”是指不包含在多細(xì)胞生物體中的細(xì)胞。應(yīng)理解分離的細(xì)胞之前可能存在于體內(nèi)，例如，原代細(xì)胞。發(fā)光信號(hào)如本文所用，術(shù)語“發(fā)光信號(hào)”是指從至少一個(gè)報(bào)告分子發(fā)出的光的量，或代表從至少一個(gè)報(bào)告分子發(fā)出的光的量的電信號(hào)，例如，數(shù)字電信號(hào)。發(fā)光信號(hào)可為來自至少一個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光強(qiáng)度(例如熒光強(qiáng)度)的水平，例如最大強(qiáng)度水平。發(fā)光信號(hào)可為在預(yù)定時(shí)間中來自至少一個(gè)報(bào)告分子的多個(gè)發(fā)光強(qiáng)度(例如，熒光強(qiáng)度)水平。發(fā)光信號(hào)可為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)來自至少一個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光(例如熒光)強(qiáng)度水平的增強(qiáng)或減弱速率。調(diào)節(jié)劑如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”是指改變或引發(fā)活性的試劑，如化合物。例如，調(diào)節(jié)劑的存在可導(dǎo)致與無調(diào)節(jié)劑時(shí)的活性量相比某活性的量升高或降低。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是降低一種或更多種活性的量的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，抑制劑完全阻止一種或更多種生物活性。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是提高至少一種活性的量的激活劑。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑的存在產(chǎn)生在無調(diào)節(jié)劑的情況下不存在的活性。多電極組件如本文所用，術(shù)語“多電極組件”是指支持并包括多個(gè)電極對(duì)的裝置。所述裝置可以任選地另外包含連接多電極組件中每個(gè)電極的導(dǎo)線或線路。神經(jīng)元細(xì)胞如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)元細(xì)胞”(也稱為“神經(jīng)元”)是指經(jīng)歷突觸小泡循環(huán)或者突觸小泡循環(huán)的一個(gè)或多個(gè)方面的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞具有或可形成突觸前末梢，其中所述突觸前末梢具有功能性的突觸小泡循環(huán)或經(jīng)歷突觸小泡循環(huán)的一種或更多種活性。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在體外。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞是生長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、與表面相連(例如在其上生長(zhǎng)、貼附或附著等)的多個(gè)細(xì)胞、從體內(nèi)來源(例如，采集自動(dòng)物)基本純化的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞和/或細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在活動(dòng)物中(例如嚙齒動(dòng)物、人等)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞是原代神經(jīng)元細(xì)胞和/或干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為原代大鼠前腦神經(jīng)元。神經(jīng)元細(xì)胞可包括經(jīng)歷一種或更多種突觸前小泡循環(huán)要素的細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染和 /或以其他方式誘導(dǎo)攝取用于跟蹤突觸小泡循環(huán)或其一種或更多種活性的所需報(bào)告物。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可用于本發(fā)明的突觸小泡循環(huán)測(cè)定中。神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)”(也稱為“神經(jīng)系統(tǒng)”)是指經(jīng)歷突觸小泡循環(huán)或突觸小泡循環(huán)的一種或更多種活性的系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)系統(tǒng)包含具有或可形成突觸前末梢的至少一個(gè)細(xì)胞，其中所述突觸前末梢具有功能性的突觸小泡循環(huán)或經(jīng)歷一種或更多種突觸小泡循環(huán)活性。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)為體外系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)為體內(nèi)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)是包含以下的體外系統(tǒng)生長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、與表面相連(例如在其上生長(zhǎng)、貼附或附著等)的多個(gè)細(xì)胞、從體內(nèi)來源(例如，采集自動(dòng)物)基本純化的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞和/或細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)包含在活動(dòng)物中(例如嚙齒動(dòng)物、人等)的神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)包含原代神經(jīng)元細(xì)胞和/ 或干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)可包含原代大鼠前腦神經(jīng)元。神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)可包含經(jīng)歷一種或更多種突觸前小泡循環(huán)要素的細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)中的細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染和/或以其他方式誘導(dǎo)以攝取用于跟蹤突觸小泡循環(huán)或其一種或更多種活性的所需報(bào)告物。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)可用于本發(fā)明的突觸小泡循環(huán)測(cè)定中。核酸如本文所用，術(shù)語“核酸”在其最廣泛的意義上表示可并入寡核苷酸鏈的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，核酸是通過或可通過磷酸二酯鍵并入寡核苷酸鏈的化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，“核酸”是指?jìng)€(gè)體核酸殘基(例如，核苷酸和/ 或核苷)。在一些實(shí)施方案中，“核酸”是指含有個(gè)體核酸殘基的寡核苷酸鏈。如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”以及“多核苷酸”可互換使用。在一些實(shí)施方案中，“核酸”涵蓋RNA以及單和/或雙鏈DNA和/或cDNA。而且，術(shù)語“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或類似術(shù)語包括核酸類似物，即不具有磷酸二酯鍵骨架的類似物。例如，認(rèn)為所謂的“肽核酸”在本發(fā)明范圍內(nèi)，其是本領(lǐng)域已知的，其在骨架中具有肽鍵而不是磷酸二酯鍵。術(shù)語“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此簡(jiǎn)并形式和/或編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列可包含內(nèi)含子。核酸可從天然來源中純化，采用重組表達(dá)系統(tǒng)生成并任選地被純化，化學(xué)合成等。在適當(dāng)時(shí)，例如在化學(xué)合成分子的情況下，核酸可包含核苷類似物，如具有化學(xué)修飾的堿基或糖，骨架修飾等的類似物。核酸序列以5’至3’方向顯示，除非另外指明。本文所用術(shù)語“核酸區(qū)段”表示作為更長(zhǎng)核酸序列的一部分的核酸序列。在很多實(shí)施方案中，核酸區(qū)段包含至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少 9、至少10或更多個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5-丙炔基-胞苷、C-5-丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴代尿苷、C5-氟代尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、 C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥苷和2-硫代胞苷)；化學(xué)修飾堿基；生物修飾堿基(如甲基化堿基)；內(nèi)部插入堿基；經(jīng)修飾的糖(例如2’ -氟代核糖、核糖、2’ -脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或經(jīng)修飾的磷酸基團(tuán)(例如，硫代磷酸酯和5’ -N-亞磷酰胺連接)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可特別地涉及“未修飾核酸”，意為為了便于或達(dá)成遞送而未被化學(xué)修飾的核酸 (例如，多核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)。突觸前蛋白質(zhì)如本文所用，術(shù)語“突觸前蛋白質(zhì)”是指優(yōu)選地位于突觸前末梢的蛋白質(zhì)。通常，突觸前蛋白質(zhì)參與突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，突觸前蛋白質(zhì)包括突觸蛋白、去磷蛋白和其它鈣調(diào)磷酸酶底物。示例性的突觸前蛋白質(zhì)包括但不限于突觸小泡蛋白，本文中也稱為內(nèi)在小泡蛋白(intrinsic vesicle protein) (例如突觸小泡蛋白2(SV2)、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、突觸素(synaptophysin)、突觸結(jié)合蛋白(synaptotagmin)、小泡相關(guān)膜多肽 (vesicle-associated membrane polypeptide, VAMP)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、突觸循環(huán)蛋白(synaptogyrin)、質(zhì)子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸鏈蛋白(cystine string protein，CSP)、突觸質(zhì)膜蛋白(如鈣通道、25kDa突觸體相關(guān)蛋白 (synaptosome-associated protein of 25kDa, SNAP—25)、突角蟲|蟲合蛋白(syntaxin)) 漿蛋白(如SNAP、n-kcl)、突觸蛋白(synapsin)(例如，突觸蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)I,PIP5Kly和突觸小泡磷酸酶I (synapto janin I)。多個(gè)如本文所用，術(shù)語“多個(gè)”是指多于一個(gè)。蛋白質(zhì)如本文所用術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指多肽(即通過肽鍵彼此連接的至少兩個(gè)氨基酸的鏈)。蛋白質(zhì)可包含除氨基酸外的結(jié)構(gòu)(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可通過其他形式加工或修飾。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)理解“蛋白質(zhì)”可為細(xì)胞產(chǎn)生的完整多肽鏈(具有或不具有信號(hào)序列)，或者可以是其特征性部分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)理解蛋白質(zhì)有時(shí)可包含多于一條的多肽鏈，例如所述多肽鏈通過一個(gè)或更多個(gè)二硫鍵連接或通過其它方式相連。多肽可包含L-氨基酸、D-氨基酸或這兩者，并且可含有任何多種本領(lǐng)域已知的氨基酸修飾或類似物。可用的修飾包括，例如末端乙?；?、酰胺化等。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其組合。術(shù)語“肽”通常用于表示長(zhǎng)度小于約100個(gè)氨基酸的多肽。報(bào)告物如本文所用，術(shù)語“報(bào)告物”(本文中也稱為報(bào)告分子)是指當(dāng)包含在神經(jīng)元細(xì)胞中時(shí)，提供指示至少一種突觸小泡循環(huán)活性的可檢測(cè)信號(hào)(例如，發(fā)光信號(hào)如熒光信號(hào))的任何物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，通過病毒感染將報(bào)告物引入神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，將報(bào)告物外部施加于神經(jīng)培養(yǎng)物、懸液和/或制備物。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞源自表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物是熒光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物是染料。小分子一般地，本領(lǐng)域認(rèn)為“小分子”為大小小于約5千道爾頓(Kd)的有機(jī)分子。在一些實(shí)施方案中，所述小分子小于約4Kd、約Id、約2Kd或約lKd。在一些實(shí)施方案中，所述小分子小于約800道爾頓(D)、約600D、約500D、約400D、約300D、約200D或約IOOD0 在一些實(shí)施方案中，小分子小于約2000g/mol、小于約1500g/mol、小于約1000g/mol、小于約800g/mol或小于約500g/mol。在一些實(shí)施方案中，小分子是非聚合的。在一些實(shí)施方案中，小分子不是蛋白質(zhì)、肽或氨基酸。在一些實(shí)施方案中，小分子不是核酸或核苷酸。在一些實(shí)施方案中，小分子不是糖類或多糖。刺激系統(tǒng)如本文所用，術(shù)語“刺激系統(tǒng)”是指引發(fā)突觸小泡循環(huán)的任何系統(tǒng)或組合物。通常地，刺激系統(tǒng)通過在神經(jīng)元細(xì)胞中起始動(dòng)作電位來引發(fā)突觸小泡循環(huán)。適于本發(fā)明的刺激系統(tǒng)可為電刺激系統(tǒng)、聲或超聲刺激系統(tǒng)、光刺激系統(tǒng)或生物化學(xué)刺激系統(tǒng)。刺激波形如本文所用，術(shù)語“刺激波形”通常表示施加到培養(yǎng)物、懸液和/或以其它方式制備的神經(jīng)元細(xì)胞的隨時(shí)間變化的刺激。例如，所述刺激可以是特征為大小和方向都可隨時(shí)間變化的電場(chǎng)。刺激波形可通過在電刺激系統(tǒng)中施加到電極的一種或更多種電壓波形或電流波形產(chǎn)生。對(duì)象如本文所用，術(shù)語“對(duì)象”或“患者”是指本發(fā)明組合物可施用的任何生物，例如，為了實(shí)驗(yàn)、診斷、預(yù)防和/或治療目的。典型的對(duì)象包括動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物以及人；昆蟲；蠕蟲等)?；旧先绫疚乃茫g(shù)語“基本上”是指顯示目的特征或性質(zhì)的完全或近乎完全的范圍或程度的定性情況。生物領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解生物和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果有的話)達(dá)到完成和/或進(jìn)行完全或者實(shí)現(xiàn)或避免絕對(duì)的結(jié)果。因此本文采用術(shù)語“基本上” 來表示在許多生物和化學(xué)現(xiàn)象中所固有的完全性的潛在缺乏。易感對(duì)疾病、異常和/或病癥“易感”的個(gè)體未被診斷為患所述疾病、異常和/或病癥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)疾病、異常和/或病癥易感的個(gè)體可不顯示所述疾病、異常和/ 或病癥的癥狀。在一些實(shí)施方案中，對(duì)疾病、異常和/或病癥易感的個(gè)體會(huì)發(fā)生所述疾病、異常和/或病癥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)疾病、異常和/或病癥易感的個(gè)體不會(huì)發(fā)生所述疾病、異常和/或病癥。突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑如本文所用，術(shù)語“突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑”是指改變突觸小泡循環(huán)的任何活性的任何物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡循環(huán)的相關(guān)活性包括突觸小泡移動(dòng)到突觸前膜、停靠在突觸前膜、準(zhǔn)備與突觸前膜的融合、感受Ca2+、與突觸前膜融合、將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙、通過胞吞作用在突觸前末梢回收突觸小泡(其涉及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的成核、突觸前膜的內(nèi)陷、突觸小泡從突觸前膜的分裂以及從胞吞的突觸小泡去除網(wǎng)格蛋白的步驟)、突觸前末梢中突觸小泡的轉(zhuǎn)位、突觸前末梢中突觸小泡的分選以及在突觸小泡腔中裝載神經(jīng)遞質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)突觸小泡循環(huán)的一種或更多種活性。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑抑制突觸小泡循環(huán)的一種或更多種活性。示例性的突觸小泡循環(huán)蛋白質(zhì)包括，如突觸小泡蛋白質(zhì)2 (SV2)、小泡GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、突觸素、突觸結(jié)合蛋白、小泡相關(guān)膜多肽 (VAMP)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、突觸循環(huán)蛋白和質(zhì)子泵。其它突觸小泡循環(huán)蛋白質(zhì)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。突觸小泡循環(huán)平臺(tái)如本文所用，術(shù)語“突觸小泡循環(huán)平臺(tái)”是指至少包含刺激系統(tǒng)(例如電刺激系統(tǒng))和檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，所述電刺激系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)物、懸液和/或以其它方式制備的神經(jīng)元細(xì)胞遞送刺激波形。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)與突觸小泡循環(huán)相關(guān)的活性。在一些實(shí)施方案中，采用突觸小泡循環(huán)平臺(tái)進(jìn)行突觸小泡循環(huán)測(cè)定(例如，鑒定突觸小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑的測(cè)定)。在一些實(shí)施方案中，所述突觸小泡循環(huán)平臺(tái)可由單個(gè)操作人員來操作。突觸小泡蛋白質(zhì)突觸小泡蛋白質(zhì)為與突觸小泡相關(guān)的突觸前蛋白質(zhì)。突觸小泡蛋白質(zhì)通常具有跨膜部分，并且可具有腔部分和/或胞質(zhì)部分。突觸前蛋白質(zhì)的腔部分是暴露于突觸小泡腔的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。應(yīng)理解當(dāng)突觸小泡與突觸膜融合時(shí)(例如在突觸小泡循環(huán)的胞吐過程中)，突觸小泡蛋白質(zhì)的腔部分可變成暴露于細(xì)胞外空間。突觸前蛋白質(zhì)的胞質(zhì)部分是暴露于突觸小泡所存在之細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。應(yīng)理解當(dāng)突觸小泡與突觸膜融合時(shí)(例如在突觸小泡循環(huán)的胞吐過程中)，突觸小泡蛋白質(zhì)的腔部分可保持暴露于細(xì)胞質(zhì)。突觸前蛋白質(zhì)的跨膜部分是包埋在小泡膜中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。應(yīng)理解當(dāng)突觸小泡與突觸膜融合時(shí)(例如在突觸小泡循環(huán)的胞吐過程中)，突觸小泡蛋白質(zhì)的跨膜部分變?yōu)榘裨诩?xì)胞膜中。治療劑如本文所用，詞語“治療劑”是指當(dāng)施用給對(duì)象時(shí)具有治療作用和/或引發(fā)所需的生物和/或藥理作用的任何藥劑。
隨時(shí)間變化的電場(chǎng)如本文所用，術(shù)語“隨時(shí)間變化的電場(chǎng)”用于描述具有隨時(shí)間變化的大小和方向的電場(chǎng)。波形如本文所用，術(shù)語“波形”通常用于表示多種隨時(shí)間變化的物理量，例如，隨時(shí)間變化的電壓、隨時(shí)間變化的電流、隨時(shí)間變化的電場(chǎng)、隨時(shí)間變化的熒光發(fā)射等。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供用于鑒定突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明提供了突觸小泡循環(huán)測(cè)定等。在一些實(shí)施方案中，采用突觸小泡循環(huán)測(cè)定監(jiān)測(cè)突觸小泡循環(huán)的動(dòng)態(tài)、效力和 /或其它特性。在一些實(shí)施方案中，采用突觸小泡循環(huán)測(cè)定鑒定影響(例如刺激和/或抑制)突觸小泡循環(huán)至少一個(gè)方面的物質(zhì)。突觸小泡循環(huán)測(cè)定通常包含細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物包含顯示功能性突觸小泡循環(huán)或其至少一種活性的突觸前末梢，所述測(cè)定還包含報(bào)告物(例如，用于跟蹤突觸小泡循環(huán)或其至少一種活性的報(bào)告物)、刺激系統(tǒng)(例如，電、聲、超聲、光刺激系統(tǒng)以引發(fā)突觸小泡循環(huán)，例如，通過起始動(dòng)作電位)以及檢測(cè)系統(tǒng)(例如，成像裝置以捕獲由報(bào)告物產(chǎn)生的信號(hào))。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)測(cè)定可以高通量形式構(gòu)建和/ 或?qū)嵤?。突觸小泡循環(huán)當(dāng)神經(jīng)元激發(fā)時(shí)，動(dòng)作電位的到達(dá)引發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，其通過胞吐作用發(fā)生。在突觸前神經(jīng)末梢中，含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡移動(dòng)到突觸前膜，在那里它們?？坎?zhǔn)備感受鈣離子，最終，其與突觸前膜融合。到達(dá)的動(dòng)作電位產(chǎn)生鈣離子流入，其是在動(dòng)作電位的下行程(down stroke)(尾電流)時(shí)通過電壓依賴的鈣選擇性離子通道流入。而后鈣離子引發(fā)生物化學(xué)級(jí)聯(lián)，其導(dǎo)致突觸小泡與突觸前膜融合并將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙。突觸小泡的融合由突觸前末梢的一組稱為SNARE的蛋白質(zhì)驅(qū)動(dòng)。通過該融合加入的膜隨后通過胞吞作用回收，所述胞吞作用包括下列步驟網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的成核、突觸前膜的內(nèi)陷、突觸小泡從突觸前膜的分裂以及從胞吞的突觸小泡去除網(wǎng)格蛋白。胞吞的突觸小泡在突觸前末梢中轉(zhuǎn)位和分選，它們的腔重新裝載神經(jīng)遞質(zhì)。已知鈣調(diào)磷酸酶參與突觸小泡循環(huán)。例如，鈣調(diào)磷酸酶將參與調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的多種突觸小泡循環(huán)蛋白質(zhì)(包括但不限于突觸蛋白和去磷蛋白)去磷酸化。所述突觸蛋白是調(diào)節(jié)突觸小泡運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)在突觸釋放的蛋白質(zhì)家族。具體而言，認(rèn)為突觸蛋白參與調(diào)節(jié)在任何給定時(shí)間內(nèi)可通過胞吐作用釋放的突觸小泡的數(shù)量。例如，認(rèn)為鈣調(diào)磷酸酶對(duì)突觸蛋白I的去磷酸化在強(qiáng)刺激中增強(qiáng)突觸小泡的運(yùn)動(dòng)。去磷蛋白調(diào)節(jié)已釋放其神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡的胞吞作用。示例性的去磷蛋白包括但不限于發(fā)動(dòng)蛋白I、PIP5K1 Y、突觸小泡磷酸酶^ 8153 &11、4 2、4 180。圖1顯示了突觸小泡循環(huán)的示意圖，其顯示了認(rèn)為的一些突觸前蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的位置。據(jù)報(bào)道突觸小泡在突觸前末梢的內(nèi)化能力是有限的(如Balaji，J.，等，(2008). JNeurosci, 28 (26) :6742-6749所述，其通過引用并入本文)。在低強(qiáng)度的刺激中(例如，以小于IOHz引發(fā)少于100個(gè)動(dòng)作電位)，所述能力并未飽和并且在該范圍內(nèi)增強(qiáng)刺激強(qiáng)度不改變胞吞作用的動(dòng)態(tài)。在高強(qiáng)度刺激下(例如，以大于IOHz引發(fā)大于100個(gè)動(dòng)作電位)，所述能力飽和，導(dǎo)致突觸小泡的平均胞吞率降低。還認(rèn)為突觸小泡胞吞能力由突觸前末梢細(xì)胞內(nèi)的Ca++濃度調(diào)節(jié)。升高的細(xì)胞內(nèi)Ca++水平導(dǎo)致突觸小泡胞吞作用新位點(diǎn)的裝配，其可能由鈣調(diào)磷酸酶的激活和去磷蛋白的去磷酸化引起。斜口 / ■棚制勿白脾辯口誠(chéng)本發(fā)明提供用于鑒定調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)之物質(zhì)的系統(tǒng)和方法。這些方法通常涉及包含突觸前末梢的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物(所述突觸前末梢顯示功能性突觸小泡循環(huán)或突觸小泡循環(huán)的至少一個(gè)方面)、報(bào)告物(例如，用于跟蹤突觸小泡循環(huán)或至少一種突觸小泡循環(huán)活性的報(bào)告物)、刺激系統(tǒng)(例如電、聲、超聲、光或生物化學(xué)刺激系統(tǒng)以引發(fā)突觸小泡循環(huán)，例如，通過起始動(dòng)作電位)以及檢測(cè)系統(tǒng)(例如，成像裝置以捕獲由報(bào)告物產(chǎn)生的信號(hào))。提供了分析突觸小泡循環(huán)的平臺(tái)(本文中可稱為突觸小泡循環(huán)平臺(tái))。本文公開的一些平臺(tái)適于以高通量方式分析突觸小泡循環(huán)。通常將平臺(tái)設(shè)置為在多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的每一個(gè)中檢測(cè)突觸小泡循環(huán)的至少一個(gè)方面?？蓪⑦@些平臺(tái)設(shè)置為同時(shí)誘導(dǎo)多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物之每一個(gè)的動(dòng)作電位，同時(shí)檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)物的突觸小泡循環(huán)的方面?；蛘?，可將這些平臺(tái)設(shè)置為在多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的每一個(gè)中依次誘導(dǎo)動(dòng)作電位，并依次檢測(cè)每個(gè)培養(yǎng)物的突觸小泡循環(huán)的方面。在一些本發(fā)明實(shí)施方案中，誘導(dǎo)動(dòng)作電位與檢測(cè)指示突觸小泡循環(huán)的方面的發(fā)光信號(hào)平行地進(jìn)行。平臺(tái)可包含適于培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的多個(gè)容器(例如，孔、管等)以及多個(gè)刺激器 (例如，電極對(duì)、發(fā)聲裝置等)，所述刺激器設(shè)置為用于引發(fā)或誘導(dǎo)容器(例如孔)中神經(jīng)元細(xì)胞的動(dòng)作電位。通常將刺激器設(shè)置為放置在容器中或在其附近，并誘導(dǎo)容器中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡循環(huán)。例如，可將電極對(duì)設(shè)置為放置在孔中并產(chǎn)生誘導(dǎo)孔中多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡循環(huán)的一個(gè)或更多個(gè)電壓脈沖。平臺(tái)還可包含含有多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)。通常將每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。發(fā)光信號(hào)通常從與神經(jīng)元細(xì)胞突觸前蛋白質(zhì)相連的報(bào)告分子發(fā)出，并且其指示神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。平臺(tái)中的每個(gè)容器(例如孔)通常包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)元細(xì)胞用于鑒定調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)之物質(zhì)的系統(tǒng)和方法通常涉及神經(jīng)元細(xì)胞的使用。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞具有突觸前末梢，其中所述突觸前末梢形成功能性突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞不具有突觸前末梢，但是可被誘導(dǎo)以形成突觸前末梢，其中所述突觸前末梢具有功能性的突觸小泡循環(huán)?？赏ㄟ^在特定條件下培養(yǎng)和/或孵育細(xì)胞，來誘導(dǎo)細(xì)胞形成突觸前末梢，其中所述突觸前末梢具有功能性的突觸小泡循環(huán)。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物可包含經(jīng)歷突觸前小泡循環(huán)之一個(gè)或多個(gè)要素的細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)的相關(guān)活性包括突觸小泡移動(dòng)到突觸前膜、在突觸前膜的?？俊?zhǔn)備與突觸前膜的融合、感受Ca2+、與突觸前膜融合、將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙、通過胞吞作用回收突觸前末梢的突觸小泡(其涉及下列步驟網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的成核、突觸前膜的內(nèi)陷、突觸小泡從突觸前膜的分裂以及從胞吞的突觸小泡去除網(wǎng)格蛋白)、突觸前末梢中突觸小泡的轉(zhuǎn)位、突觸前末梢中突觸小泡的分選以及將突觸小泡腔中裝載神經(jīng)遞質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的成員彼此基本上類似。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的成員彼此基本上不類似。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在活細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞系統(tǒng)在細(xì)胞體外懸液(例如，在含有緩沖液、鹽、電解質(zhì)、去污劑等中一種或多種的基質(zhì)中)中。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在包含與表面相連(例如，生長(zhǎng)、固定、連系其上等)的多個(gè)細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在包含基本上從體內(nèi)來源(例如，采集自動(dòng)物)純化的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可源自人或動(dòng)物供體的皮質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為穩(wěn)定細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞存在于活動(dòng)物(例如，嚙齒類動(dòng)物、人等)體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物為原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物可源自來自下列的原代神經(jīng)元嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠等)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人、猴等)、哺乳動(dòng)物(例如貓、狗等)和/或無脊椎動(dòng)物(例如蒼蠅、蠕蟲等)。在一些實(shí)施方案中，原代神經(jīng)培養(yǎng)物可源自動(dòng)物前腦、海馬、紋狀體、小腦、神經(jīng)調(diào)節(jié)區(qū)(例如，藍(lán)斑核、腹側(cè)被蓋、黑質(zhì)、中縫核、邁內(nèi)特基底核、隔核)、脊髓或小腦。在一些實(shí)施方案中，適合的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物可包括原代大鼠前腦神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞源自嚙齒類動(dòng)物 (例如，小鼠、大鼠等)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人、猴等)、哺乳動(dòng)物(例如貓、狗等)和/或無脊椎動(dòng)物(例如蒼蠅、蠕蟲等)。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)元，并且分化的神經(jīng)元包含具有功能性突觸小泡循環(huán)的突觸前末梢。參見Fico等，Stem Cells Dev, 17(3) :573-584。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞為細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，可采用的細(xì)胞系包括PC12細(xì)胞、皮質(zhì)細(xì)胞系和/或永生化神經(jīng)元細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物可包含這樣的細(xì)胞，其在某些培養(yǎng)條件下不形成顯示功能性突觸小泡循環(huán)的突觸前末梢，但在不同培養(yǎng)條件下形成顯示功能性突觸小泡循環(huán)的突觸前末梢。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可包含在所有培養(yǎng)條件下具有或形成顯示功能性突觸小泡循環(huán)的突觸前末梢的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)測(cè)定包含培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，從待在突觸小泡循環(huán)測(cè)定中采用的細(xì)胞中移除培養(yǎng)基，并用適于電刺激(例如，具有所需電導(dǎo)性的溶液)的基質(zhì)(例如，含有緩沖液、鹽、電解質(zhì)、去污劑等中一種或多種)進(jìn)行替換。在一些實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染和/或以其它方式誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞以使其攝取所需的突觸小泡循環(huán)報(bào)告物。在一些實(shí)施方案中，用表達(dá)報(bào)告物的病毒(例如表達(dá) synaptopHluorin的病毒)感染細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用驅(qū)動(dòng)報(bào)告物表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用驅(qū)動(dòng)報(bào)告物表達(dá)的表達(dá)盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物的表達(dá)是可誘導(dǎo)的(例如，通過向培養(yǎng)基中添加一些代謝物)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞自身不表達(dá)報(bào)告物，而是將報(bào)告物直接施用給細(xì)胞(例如，通過向培養(yǎng)基和/或懸浮基質(zhì)添加報(bào)告物)。平臺(tái)中的每個(gè)容器(例如孔、管等)通常含有多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。容器(例如孔)中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍可為2至100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、100至1000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、1000 至10，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、10，000至100，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、100，000至1，000, 000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞或1，000，000至10，000，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。容器(例如孔)中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞可為約2個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約10個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約1000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約10，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約100，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約1，000, 000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞、約 10，000, 000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞或更多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞?；诒竟_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了其它適合的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目?；蛘?，可相對(duì)于細(xì)胞貼壁區(qū)域的大小(例如孔底面積)來確定多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。例如，所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍可為10至100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、100至1000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、1000至2000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、2000至3000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、3000至4000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、4000至5000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、5000至6000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、6000至7000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/ mm2貼壁面積、7000至8000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、8000至9000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2 貼壁面積或9000至10000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積。多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞可為約10個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、約100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mmW貼壁面積、約1000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積、約10，000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mmW貼壁面積或更多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞/mm2貼壁面積?；诒竟_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了其它適合的每貼壁面積的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目。所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞可包括單個(gè)細(xì)胞類型，或者至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。所述神經(jīng)元細(xì)胞可為分離自任何本文公開的動(dòng)物的原代神經(jīng)元，例如大鼠原代神經(jīng)元。所述神經(jīng)元細(xì)胞可選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。本文公開了其它示例性神經(jīng)元細(xì)胞，并且本領(lǐng)域已知其它神經(jīng)元細(xì)胞。報(bào)告物適于本發(fā)明的報(bào)告物(在本文中也稱為報(bào)告分子)包括能產(chǎn)生或生成指示一種或更多種突觸小泡循環(huán)活性的信號(hào)的任何報(bào)告蛋白質(zhì)、基因、化合物或其它分子或物質(zhì)。例如，F(xiàn)M染料(例如，F(xiàn)Ml-43、FM2-10、FM4-64等)以及帶熒光標(biāo)簽的抗突觸小泡蛋白質(zhì)腔結(jié)構(gòu)域抗體(例如，突觸結(jié)合蛋白抗體)可用于跟蹤突觸小泡循環(huán)。FM1-43是苯乙烯基吡啶分子(也稱為苯乙烯基分子或苯乙烯基染料)，其是具有親水和疏水區(qū)域的兩親分子。含有吡啶基團(tuán)的親水區(qū)域(通常稱為頭部)由具有雙鍵橋的兩個(gè)芳香環(huán)構(gòu)成，其間是染料分子的熒光團(tuán)部分。該熒光團(tuán)基團(tuán)的激發(fā)光在約500納米，發(fā)射光在約625納米。FM1-43分子的疏水區(qū)域(也稱為尾部)允許染料進(jìn)入細(xì)胞或突觸小泡的質(zhì)膜。烴尾部的相互作用也可導(dǎo)致信號(hào)亮度的變化。然而，這些報(bào)告物通常需要大量的清洗來降低背景。因此，這些報(bào)告物對(duì)于基于細(xì)胞的均一測(cè)定(homogenous cell-based assay)來說可能不理想。如本文所用，“基于細(xì)胞的均一測(cè)定”是指使用在其施加到細(xì)胞后不需要清洗的報(bào)告物的測(cè)定。此外，由于需要清洗，這些報(bào)告物通常不能跟蹤胞吞的動(dòng)態(tài)過程，因?yàn)榘掏ǔＴ谇逑粗昂推陂g發(fā)生。清洗步驟也使高通量篩選更加困難、成本高并耗時(shí)。在一些實(shí)施方案中，在突觸小泡循環(huán)測(cè)定中可采用的報(bào)告物為pH敏感報(bào)告物。通常地，這些報(bào)告物可在特定pH或pH范圍具有特定的特征，而在不同的pH或pH范圍具有其它特性。例如，PH敏感報(bào)告物在細(xì)胞外環(huán)境(約pH7.4)和突觸小泡腔中(約pH5. 5)可具有不同的熒光特征。例如，適用于本發(fā)明的PH敏感熒光報(bào)告物可在約pH7. 4發(fā)出熒光，而在pH5. 5不發(fā)出熒光。適用于本發(fā)明的pH敏感熒光報(bào)告物還可在約pH5. 5發(fā)出熒光，而在 PH7. 4不發(fā)出熒光。以這種方式發(fā)揮功能的PH敏感報(bào)告物是有用的，因?yàn)槲幢话痰膱?bào)告物不需要被清洗掉。因此，通常pH敏感報(bào)告物不需要清洗步驟，這使測(cè)定均一化并且允許直接測(cè)量胞吞。這種報(bào)告物的實(shí)例包括1)作為標(biāo)簽與突觸小泡蛋白質(zhì)腔結(jié)構(gòu)域連接的pHluorin;和 2)作為標(biāo)簽與突觸小泡蛋白質(zhì)腔結(jié)構(gòu)域連接(例如，pHrodo和CypHerfE)或制備成插入突觸小泡膜(類似于FM1-43)的pH敏感染料。pHluorin是pH敏感綠色熒光蛋白(GFP)。其可通過作為標(biāo)簽與突觸小泡蛋白質(zhì)的腔結(jié)構(gòu)域相連用來跟蹤突觸小泡循環(huán)。所述腔結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽有助于使pHluorin靶向到突觸小泡的內(nèi)部。pHluorin在 pH7. 4發(fā)出熒光；熒光在 pH5. 5淬滅。pHluorin可作為標(biāo)簽連接到VAMP2、vGlutl、突觸小泡蛋白和突觸小泡磷酸酶(見Miesenbock等(1998) Nature， 394(6689) :192-5 ；Fernandez-Alfonso 等(2OO6)Neuron，51 (2) :179-86 ；Granseth 等 (2006) Neuron, 51 (6) :773-86 ；Voglmaier 等(2006) Neuron, 51 (1) :71-86)?？赏ㄟ^多種方法將pHluorin遞送到神經(jīng)元(例如在多孔板中)，包括用表達(dá)帶有pHluorin標(biāo)簽的突觸小泡蛋白質(zhì)的病毒進(jìn)行感染，用驅(qū)動(dòng)帶有pHluorin標(biāo)簽的突觸小泡蛋白質(zhì)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化或者生成表達(dá)帶有pHluorin標(biāo)簽的突觸小泡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)。突觸小泡蛋白質(zhì)是與突觸小泡相關(guān)聯(lián)的突觸前蛋白質(zhì)。突觸小泡蛋白質(zhì)通常具有跨膜區(qū)域并可具有腔部分和/或胞質(zhì)部分。所述突觸小泡蛋白可選自VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。通常，突觸小泡蛋白質(zhì)連接報(bào)告分子。例如，所述報(bào)告分子可連接到突觸小泡蛋白質(zhì)的腔部分。通常，報(bào)告分子是PH敏感報(bào)告分子。例如，報(bào)告分子可為pH敏感熒光蛋白質(zhì)，如pHluorin。pH敏感報(bào)告分子(例如，pH敏感熒光蛋白質(zhì)如pHluorin)可在4. 5至5. 0、5. 0至 5. 5,6. 5至7. 0、7. 0至7. 5、7. 5至8. 0或8. 0至8. 5的pH范圍具有發(fā)射強(qiáng)度峰值。pH敏感報(bào)告分子可在最高約4. 5,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0、8. 5或更高(包括系列數(shù)字之間的所有值)的PH具有最大發(fā)射強(qiáng)度。pH敏感報(bào)告分子可在6. 5至8. 5范圍的pH 下發(fā)出熒光，與4. 5至6. 5范圍的pH相比，前者強(qiáng)度顯著更大，例如，高2倍、高5倍、高10 倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。pH敏感報(bào)告分子可在6. 5至7. 5范圍的pH下發(fā)出熒光，與5. 0至6. 0范圍的pH相比，前者強(qiáng)度顯著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高 20倍、高30倍、高40倍或更多?；蛘?，pH敏感報(bào)告分子可在4. 5至6. 5范圍的pH下發(fā)出熒光，與6. 5至8. 5范圍的pH相比，前者強(qiáng)度顯著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高 20倍、高30倍、高40倍或更多。pH敏感報(bào)告分子可在5. 5至6. 0范圍的pH下發(fā)出熒光，與6. 5至7. 5范圍的pH相比，前者強(qiáng)度顯著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。參照本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它pH敏感報(bào)告分子的發(fā)射強(qiáng)度峰值的適合PH值。pH 敏感報(bào)告分子可在 350nm 至 400nm、400nm 至 450nm、450nm 至 500nm、500nm 至 550nm、550nm至600nm或600nm至650nm的范圍具有發(fā)射波長(zhǎng)峰值。pH敏感報(bào)告物可在約 300nm、約 350nm、約 400nm、約 450nm、約 500nm、約 550nm、約 600nm、約 650nm 或更大具有發(fā)
射波長(zhǎng)峰值。參照本公開內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員將明確其它PH敏感報(bào)告分子的適合發(fā)射波長(zhǎng)峰值。在一些實(shí)施方案中，可在本文公開的平臺(tái)和方法中采用的報(bào)告分子pHluorin具有的氨基酸序列為
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQ CFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYN DHQVYIMADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLFTTSTLSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITHGMDELYK (SEQ ID NO 1 ；gi | 45479290 | gb | AAS66682. 11 超黃道 pHluorin)。參照本公開內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的pHluorin。在一些實(shí)施方案中，pHluorin與突觸素(synaptophysin)融合?？捎糜诒疚墓_的平臺(tái)和方法的基于突觸素的pHluorin由以下核酸序列編碼 ATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTG AAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGT GGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGT ACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAA TTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAA GTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGGACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTT CATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATG TGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATT AGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCC TTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAA TGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGA AAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTA ATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAAC GATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGA AGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACA ACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTT GTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGA ACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCA ACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAA CCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGG GCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATG GGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCCACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(SEQ ID NO 2 ；突觸小泡蛋白-pHluorin)。在一些實(shí)施方案中，pHluorin與VAMP2融合。在另一些實(shí)施方案中，pHluorin與 vGlut融合?？稍诒疚墓_的平臺(tái)和方法中采用的基于vGlut的pHluorin的實(shí)例由以下核酸序列編碼ATGGAGTTCAGACAGGAGGAGTTCCGAAAACTTGCAGGCCGAGCACTGGGTCGACTGCATCGCTTGCTG GAGAAGCGGCAGGAGGGAGCAGAAACACTGGAGCTCAGCGCTGACGGCCGGCCCGTCACAACCCACACTAGAGACCC ACCTGTGGTAGACTGTACCTGCTTTGGCCTGCCTAGAAGGTATATCATTGCAATCATGTCTGGGCTTGGCTTCTGCA TCAGTTTTGGAATTAGATGTAACCTGGGGGTTGCGATTGTGAGTATGGTCAATAACTCAACGACACACAGAGGAAGC ACCTCCGGTGGATCCGGGGGGACTGGGGGAAGCATGTCCAAAGGCGAAGAACTGTTACAGGCGTGGTGCCAATACTC GTGGAACTCGACGGCGATGTTAACGGACATAAGTTTTCCGTGTCCGGCGAGGGTGAGGGAGATGCTACATATGGAAAACTGACTCTGAAATTTATTTGTACCACCGGGAAACTGCCCGTGCCATGGCCTACCCTCGTCACTACACTGACGTATG GGGTTCAATGTTTCAGTAGGTATCCGGACCACATGAAAAGACACGATTTCTTCAAAAGCGCAATGCCCGAAGGCTAC GTACAAGAACGCACTATATTCTTCAAGGACGACGGCAACTATAAAACCCGCGCAGAGGTTAAATTTGAGGGGGACAC ACTGGTAAATCGGATCGAGCTGAAGGGTATCGACTTTAAAGAAGACGGAAACATATTGGGCCATAAGCTGGAATACA ACTATAATGATCATCAGGTGTATATCATGGCCGATAAGCAGAAAAATGGAATCAAGGCAAACTTCAAAATTAGGCAC AATATTGAGGATGGGGGCGTCCAGCTGGCCGACCATTACCAGCAGAATACTCCAATAGGCGATGGACCGGTGTTGCT TCCTGATAATCACTACTTGTTTACCACTAGCACCCTCAGTAAGGATCCCAATGAGAAGCGGGACCACATGGTCCTGC TGGAGTTCGTGACTGCCGCTGGCATAACTCATGGGATGGATGAGCTCTACAAAGGAGGGACAGGGGGTACCGGTGGT AGTGGTGGAACCGGCGGCCATGTAGTGGTGCAGAAGGCCCAGTTCAATTGGGACCCAGAGACAGTGGGCTTGATCCA CGGCTCTTTCTTTTGGGGTTATATCGTTACTCAAATCCCAGGCGGTTTCATTTGTCAGAAGTTCGCCGCCAACAGAG TGTTCGGCTTCGCAATAGTAGCCACCTCCACACTGAACATGCTGATTCCGTCTGCAGCCCGAGTGCACTATGGCTGT GTGATATTCGTGAGAATCCTGCAAGGTCTTGTCGAGGGCGTGACCTACCCAGCCTGTCACGGGATCTGGTCCAAATG GGCTCCACCACTGGAGCGATCCAGACTGGCGACCACTGCATTCTGTGGCAGTTACGCCGGCGCTGTCGTGGCTATGC CCCTGGCTGGTGTGCTGGTGCAGTACAGCGGATGGAGCAGCGTGTTCTACGTTTATGGCTCTTTCGGGATCTTTTGG TACCTCTTCTGGCTGCTCGTCAGCTACGAATCCCCCGCTCTGCACCCTTCCATCAGCGAGGAGGAGCGGAAATACAT TGAAGACGCAATCGGTGAATCAGCAAAGCTGATGAACCCCGTGACGAAATTCAATACACCGTGGAGACGGTTTTTTA CCTCCATGCCCGTGTACGCGATAATTGTTGCAAATTTCTGCCGGAGCTGGACATTCTATCTCCTCCTGATTAGCCAA CCTGCCTACTTCGAAGAGGTCTTCGGGTTCGAGATCTCTAAAGTGGGTCTTGTGTCTGCGCTCCCTCACCTCGTTAT GACCATTATTGTTCCTATCGGCGGGCAGATCGCTGATTTTCTTCGGTCAAGACATATTATGTCCACTACTAATGTGA GGAAGCTGATGAATTGCGGTGGGTTTGGCATGGAGGCGACCCTGCTTCTGGTGGTGGGTTACTCTCATTCCAAGGGA GTGGCGATCAGTTTCCTGGTCCTGGCCGTGGGATTTAGCGGCTTTGCCATAAGCGGTTTTAACGTTAATCACCTTGA TATTGCTCCCCGCTACGCATCCATTCTCATGGGGATCAGCAACGGAGTCGGGACTCTGAGTGGAATGGTTTGCCCAA TAATAGTCGGAGCGATGACTAAACATAAGACCCGAGAAGAATGGCAGTACGTGTTCCTGATTGCTAGTCTGGTCCAT TACGGAGGCGTCATCTTCTATGGCGTCTTCGCCTCTGGGGAAAAACAACCATGGGCAGAGCCTGAAGAAATGTCCGA GGAAAAATGTGGGTTCGTCGGGCACGATCAGCTTGCCGGTTCTGATGAGTCCGAGATGGAGGACGAGGTTGAGCCCC CTGGGGCGCCTCCTGCACCGCCCCCAAGCTACGGCGCAACCCATAGCACTGTGCAGCCTCCTCGGCCACCTCCTCCA GTGCGGGATTACTAA. (SEQ ID NO 3 ；vGlut-pHluorin).。以下給出可在本文公開的平臺(tái)和方法中用于控制報(bào)告分子(例如pHluorin)表達(dá)的人突觸蛋白I啟動(dòng)子序列。ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTC GTGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACC GAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTA CCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAG GGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCC GCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCC CCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGG GGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGG AGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG (SEQ ID NO 4 ；人突觸蛋白 I 啟動(dòng)子)?？刹捎闷渌m合的啟動(dòng)子。例如，對(duì)于一般表達(dá)，可采用CMV或雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子?；蛘撸瑢?duì)于神經(jīng)元特異性表達(dá)，可采用神經(jīng)元特異性烯醇酶或突觸蛋白I啟動(dòng)子。對(duì)于谷氨酸能特異性表達(dá)可采用vGlul啟動(dòng)子。對(duì)于GABA能特異性表達(dá)可采用GAD65、GAD67、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子(somatostatin)或GABA小泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的啟動(dòng)子。以下是可用于本文公開的平臺(tái)和方法的表達(dá)盒的實(shí)例，其具有與人突觸蛋白I啟動(dòng)子有效連接的突觸素-pHlurin。ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTCG TGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACCGA GTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTG ACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAG GGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCG GCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGC CACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCG CGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCC TGAGAGCGCAGTCGAGAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTG GCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGC CTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCA ACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGC ACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCT CTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGG ACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTTCATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTG AAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGTGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAA AGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTG TCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCT GTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACG GCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACT ACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAA GAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACGATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACA AAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATC AACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCG AAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGA TGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACA CCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGG GCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAACCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGG CTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGC AGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCC ACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(SEQ ID NO 5 ；hSyn-SypHy 表達(dá)盒序列)。示例性pH 敏感性染料(Cypher5E (GE Healthcare)和 pHrodo (Invitrogen))為小分子熒光團(tuán)，其在 PH5. 5發(fā)出熒光并在 pH7. 4淬滅。例如，Cypher5E在不同的pH發(fā)出不同熒光是由于其在PH5. 5和pH7. 4時(shí)具有不同的結(jié)構(gòu)(圖12)。在一些實(shí)施方案中，可采用PH敏感性染料跟蹤小泡胞吐、胞吞和/或重酸化。通常，pH敏感性染料可透過細(xì)胞膜。通常，pH敏感染料可與一種或更多種靶向部分連接，所述部分引導(dǎo)pH敏感性染料轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡并防止其擴(kuò)散出突觸小泡。在一些實(shí)施方案中，所述連接是共價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，所述連接是非共價(jià)的(例如，通過氫鍵、靜電相互作用、親和相互作用、范德華力等)。作為一小部分例子，PH敏感性染料可與下列相連膜插入物(類似于FM1-43)；識(shí)別突觸小泡蛋白的腔結(jié)構(gòu)域的抗體；識(shí)別蛋白質(zhì)標(biāo)簽的抗體，所述標(biāo)簽在突觸小泡腔中的存在水平高于突觸小泡腔外的存在水平。PH敏感染料還可結(jié)合大的不透過膜的非特異性分子，如葡聚糖。它們?cè)谛∨萏幱诩?xì)胞表面時(shí)通過擴(kuò)散進(jìn)入突觸小泡。電刺激系統(tǒng)本發(fā)明用于鑒定和/或表征調(diào)節(jié)物的測(cè)定通常涉及電刺激系統(tǒng)。弓丨發(fā)動(dòng)作電位的場(chǎng)刺激基于外部電場(chǎng)和細(xì)胞的細(xì)胞膜相對(duì)簡(jiǎn)單的電阻特性之間的物理相互作用。如果將典型的細(xì)胞體作為具有高電阻外殼(質(zhì)膜)和相對(duì)低電阻內(nèi)部(細(xì)胞質(zhì))的物體，則簡(jiǎn)單的靜電理論表明，如果放置在電場(chǎng)中，細(xì)胞會(huì)有電壓降，其由電場(chǎng)強(qiáng)度E與細(xì)胞體的大小d的乘積得到。例如，可認(rèn)為電壓降在一系列電阻上產(chǎn)生，兩個(gè)對(duì)應(yīng)于質(zhì)膜，一個(gè)對(duì)應(yīng)于細(xì)胞質(zhì)。考慮到質(zhì)膜的電阻與細(xì)胞質(zhì)相比高很多，這表明基本上所有電壓降發(fā)生在質(zhì)膜上。在細(xì)胞的一面膜會(huì)去極化 (Ε χ d)/2，而在相反面其會(huì)以相同的量超極化。對(duì)于神經(jīng)元，預(yù)計(jì)如果一面足夠去極化則會(huì)起始動(dòng)作電位。電位刺激通常涉及電極對(duì)，其間有電壓降(例如 10V/cm)以產(chǎn)生電場(chǎng)。作為非限制性實(shí)例，對(duì)于典型的直徑為50 μ m的細(xì)胞體，每個(gè)細(xì)胞膜上的電壓降為約25mV。在多個(gè)實(shí)施方案中，采用電刺激系統(tǒng)在神經(jīng)元細(xì)胞中刺激動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，電刺激系統(tǒng)提供細(xì)胞跨膜電位，其足以在神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，可將電刺激系統(tǒng)調(diào)整為基本上同時(shí)在含有神經(jīng)元細(xì)胞的多個(gè)獨(dú)立孔(例如在多孔板的多個(gè)孔中)中激發(fā)動(dòng)作電位。電刺激系統(tǒng)可調(diào)整為對(duì)含有活神經(jīng)元細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)孔提供多種或定制的刺激波形。刺激波形可包含隨時(shí)間變化的電場(chǎng)。電極對(duì)中的電極可具有基本呈曲線形的表面。例如，電極對(duì)中的電極可制成同心圓柱體的形狀。電極對(duì)中具有不同直徑的電極可以同心圓柱排布，將更小直徑的電極基本上放置在更大直徑電極的腔部分內(nèi)；任選地，兩個(gè)同心環(huán)柱體電極可被環(huán)形絕緣材料分隔。本文公開的平臺(tái)可包含放置裝置，例如，設(shè)置為將多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在多個(gè)孔的一個(gè)孔中的電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。例如，市售多孔板自動(dòng)化儀器可被改造用作電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，例如，biomek. 實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化儀器。含有電刺激系統(tǒng)的平臺(tái)可包含與多個(gè)電極對(duì)有效連接的電源。所述電源通常被設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定電壓(如電壓脈沖)。電壓的范圍可為IV至400V、1V至300V、 IV至200V、1V至100V、5V至100V、5V至50V、5V至20V或5V至10V。電壓脈沖可最高為IV、約 2V、約 3V、約 4V、約 5V、約 6V、約 7V、約 8V、約 9V、約 10V、約 20V、約 30V、約 40V、約 50V、約 60V、約70V、約80V、約90V、約100V、約200V、約300V、約400V或更高。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的電壓。平臺(tái)還可包含與電源和多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器。所述脈沖發(fā)生器通常被設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)提供預(yù)定電壓脈沖。所述脈沖發(fā)生器可設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率提供多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。因此，所述脈沖發(fā)生器可設(shè)置為提供特定的電壓波形。本文公開了示例性的波形。計(jì)算機(jī)可與所述脈沖發(fā)生器有效連接，并設(shè)置為控制所述電壓脈沖的多個(gè)方面，例如每個(gè)脈沖的大小、與多個(gè)脈沖相關(guān)的波形、脈沖的持續(xù)時(shí)間、脈沖的頻率、每個(gè)脈沖起始之間的持續(xù)時(shí)間等。由脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的預(yù)定頻率的范圍可為0. 2Hz至200Hz、0. 2Hz至100Hz、0. 2Hz 至 50Hz、0. 2Hz 至 40Hz、0. 2Hz 至 30Hz、0. 2Hz 至 20Hz、0. 2Hz 至 IOHz、IOHz 至 20Hz、10Hz 至 30Hz、10Hz至40Hz、10Hz至50Hz或IOHz至100Hz。預(yù)定頻率可最高為0. 2Hz、約1Hz、約 2Hz、約 3Hz、約 4Hz、約 4Hz、約 5Hz、約 IOHz、約 15Hz、約 20Hz、約 30Hz、約 40Hz、約 50Hz、約 60Hz、約70Hz、約80Hz、約90Hz、約IOOHz或更高。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的頻率。脈沖發(fā)生器產(chǎn)生電壓或多個(gè)電壓的預(yù)定時(shí)間的范圍可為0. 1秒至2分鐘、0. 1秒至1分鐘、0. 1秒至45秒、0. 1秒至30秒、0. 1秒至20秒、0. 1秒至15秒、0. 1秒至10秒、 0. 1秒至5秒或0. 1秒至1秒。所述預(yù)定時(shí)間可為約0. 1秒、約0. 5秒、約1秒、約2秒、約 3秒、約4秒、約5秒、約10秒、約20秒、約30秒、約40秒、約50秒、約1分鐘、約2分鐘或更多。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員能明確其它適合的時(shí)間。由電壓發(fā)生器產(chǎn)生的脈沖的持續(xù)時(shí)間可有所不同。例如，多個(gè)脈沖中每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間可基本上相同，或者與多個(gè)中的其它脈沖具有不同的持續(xù)時(shí)間。脈沖持續(xù)時(shí)間的范圍可為 0. 1 毫秒(msec)至 10msec、0. Imsec 至 5smec、0. Imsec 至 4smec、0. Imsec 至 3smec、0. Imsec 至 2smec、0. Imsec 至 Ismec 或 0. Imsec 至 0. 5smec。脈沖的持續(xù)時(shí)間可為約 0. 1msec、約 0. 2msec、約 0. 3msec、約 0. 4msec、約 0. 5msec、約 0. 6msec、約 0. 7msec、約 0. 8msec、約 0. 9msec、約 1msec、約 2msec、約 3msec、約 4msec、約 5msec、約 10msec、約 20msec 或更多。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的持續(xù)時(shí)間。脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的脈沖的數(shù)量(例如在多個(gè)脈沖中)也可有所不同。脈沖的數(shù)量的范圍可為 1 至 5000、1 至 2000、1 至 1000、1 至 500、1 至 400、1 至 300、1 至 200、1 至 100、 1至50、1至40、1至30、1至20、1至10或1至5。脈沖的數(shù)量可為約1、約2、約3、約4、約 5、約 10、約 20、約 30、約 40、約 50、約 100、約 200、約 300、約 400、約 500、約 1000、約 2000、約3000、約4000、約5000或更多。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的脈沖數(shù)。多個(gè)脈沖中每個(gè)脈沖的起始之間的時(shí)間可有所不同。多個(gè)脈沖中每個(gè)脈沖的起始之間的時(shí)間范圍可為 0. Imsec 至 20msec、0. Imsec 至 10msec、0. Imsec 至 5msec、0. Imsec 至 4msec、0. Imsec 至 3msec、0. Imsec 至 2msec、0. Imsec 至 Imsec 或 0. Imsec 至 0. 5msec。多個(gè)脈沖中每個(gè)脈沖的起始之間的時(shí)間可為約0. 1msec、約0. 2msec、約0. 3msec、約0. 4msec、約 0. 5msec、約 0. 6msec、約 0. 7msec、約 0. 8msec、約 0. 9msec、約 1msec、約 2msec、約 3msec、約 4msec、約 5msec、約 6msec、約 7msec、約 8msec、約 9msec、約 10msec、約 20msec 或更多。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的持續(xù)時(shí)間。在多個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)神經(jīng)元施用的刺激波形誘導(dǎo)突觸小泡的胞吐和胞吞作用，以使可在受控的實(shí)驗(yàn)條件下研究突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，通過將電壓或電流波形施加到位于與神經(jīng)元細(xì)胞接觸或在其附近的電極對(duì)來產(chǎn)生刺激波形。將電壓或電流波形施加到電極可在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生隨時(shí)間變化的電場(chǎng)和/或隨時(shí)間變化的電流密度，并且這些電場(chǎng)和/或電流密度可改變細(xì)胞的跨膜電位并在神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)動(dòng)作電位。如Ryan 和 Smith (1995，Neuron，14 :983 ；通過引用并入本文)以及 Ryan 等(1996， Proc. Natl. Acad. Sci. ,93 :5567 ；通過引用并入本文)所述，可通過施加激發(fā)波形來刺激培養(yǎng)物、懸液和/或其它制備物中的神經(jīng)元細(xì)胞。一個(gè)重要的因素是將電極與含有神經(jīng)元的浸液的接觸區(qū)域最大化(并減少接觸電阻)同時(shí)增加細(xì)胞周圍的浸液的電阻。維度1(長(zhǎng)) 和截面積A的鹽溶液塊的電阻如下R= tXp/A，其中P為鹽溶液的導(dǎo)電性(對(duì)于哺乳動(dòng)物鹽溶液來說 60Ω)。對(duì)于多孔板中的單孔，t約為孔的直徑(例如，對(duì)于96孔板 5mm)?？赏ㄟ^盡可能減少溶液的深度來降低A的值。例如，可將孔設(shè)計(jì)為將深度最小化(因而增加R)。在一些實(shí)施方案中，可采用 0.5mm的總厚度。在一些實(shí)施方案中，可制作裝備入孔中的嵌片，以使兩個(gè)電極片位于孔的兩邊而它們之間有所需的溶液深度(例如， 0. 5mm)ο在圖2A-B中顯示了用于電刺激系統(tǒng)的電極對(duì)100的一個(gè)具體實(shí)例。在顯示的實(shí)例中，電極組件包含兩個(gè)電極，內(nèi)電極102和外電極104。在多個(gè)實(shí)施方案中，電極102、104 是導(dǎo)電的。電極可由金屬、半金屬、半導(dǎo)體、導(dǎo)電聚合物、不導(dǎo)電聚合物和/或其任何組合制成。當(dāng)采用不導(dǎo)電材料制成時(shí)，可用導(dǎo)電材料包被電極。電極可由生物相容性金屬或?qū)щ姴牧?例如，金、銀、多種不銹鋼合金、鈦、鉬、導(dǎo)電聚合物、銦錫氧化物(ΙΤ0)、其組合等)形成或包被。內(nèi)電極102可為固體棒狀組件、電線，或?yàn)榭招膱A柱狀。如在圖2A-B所示內(nèi)電極的特征可為高Hi和直徑D”在多個(gè)實(shí)施方案中，外電極104至少在與神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物接觸或緊鄰的遠(yuǎn)端190為圓柱狀或環(huán)狀。外電極可為導(dǎo)線環(huán)、由導(dǎo)電材料的細(xì)帶形成的環(huán)狀帶，或圓柱形的導(dǎo)電管。如圖2A-B所示，外電極104的特征可為高H。和直徑D。。在一些實(shí)施方案中，Hi ^ H0并且Di < D。。在一些實(shí)施方案中，Hi < H0并且Di < D。。在一些實(shí)施方案中，Hi > H。并且Di <D。。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)電極102作為陰極并且外電極104為陽極。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)電極102作為陽性并且外電極104為陰極。在多個(gè)實(shí)施方案中，激發(fā)區(qū)域150位于內(nèi)電極102和外電極104之間。電線110、112或它們的導(dǎo)電等同物(例如電路板上的導(dǎo)線路、二相同軸電纜等) 可連接到內(nèi)電極102和外電極104。在多個(gè)實(shí)施方案中，電線110、112或它們的等同物可具有低歐姆的電阻或阻抗，例如小于約100歐姆。在一些實(shí)施方案中，電線或它們的等同物可具有大于約100歐姆的歐姆電阻或阻抗。電線或它們的等同物可具有遠(yuǎn)距離的連接器120，其將電壓或電流波形施加到電線。在多個(gè)實(shí)施方案中，電線或它們的等同物為一個(gè)或更多個(gè)電極對(duì)以及一個(gè)或更多個(gè)連接器提供電連接。在一些實(shí)施方案中，對(duì)電線或它們的等同物施加電壓波形VpV2。在多個(gè)實(shí)施方案中，施加到連接器120的電壓波形V1J2由電極102、104傳導(dǎo)并在電極之間的激發(fā)區(qū)150產(chǎn)生電場(chǎng)。電壓波形V1J2或電流波形I1U2可源自電學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種類型的電裝置，例如，它們可產(chǎn)生自函數(shù)發(fā)生器、波形發(fā)生器、可編程波形發(fā)生器、與數(shù)據(jù)獲取硬件相組合的計(jì)算機(jī)、與模擬數(shù)字(A/D)板(其可將計(jì)算機(jī)處理器的數(shù)字輸入轉(zhuǎn)化成模擬輸出)組合的計(jì)算機(jī)。在一些實(shí)施方案中，電壓波BV1J2中的一個(gè)或兩個(gè)會(huì)隨時(shí)間變化，并且它們的形狀可由使用者選擇或編程。圖3A-D顯示了可施加到連接器 120并傳導(dǎo)至電極102、104的電壓波形的實(shí)例。施加的波形Vp V2的特征可為一個(gè)或更多個(gè)電壓峰Vlpl、V2pl、V2p2，電壓偏移、波形的形狀、電壓變化速率以及周期的重復(fù)率。在一些實(shí)施方案中，V1或V2波形中的一個(gè)可基本維持在參照電位不變，例如0伏特、0. 5伏特、-1伏特，如在圖3A-B所示。在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)波形均可隨時(shí)間變化，如圖3C-D所示。應(yīng)理解，具有可對(duì)電極對(duì)100施加具有不同的電壓偏移、幅度、形狀、變化速率和周期的多種波形中的任何一種。在多個(gè)實(shí)施方案中，將電壓波形施加到電極對(duì)在基本上位于電極102、104之間的激發(fā)區(qū)域150中產(chǎn)生隨時(shí)間變化的電場(chǎng)。當(dāng)電極接觸或緊鄰含有在基質(zhì)中的神經(jīng)元細(xì)胞的孔時(shí)，電場(chǎng)可耦合入基質(zhì)中并影響基質(zhì)中、細(xì)胞中、跨細(xì)胞膜的或任何其組合的離子運(yùn)動(dòng)。任何區(qū)域中電場(chǎng)的存在伴隨著該區(qū)域中的電位梯度。含有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的孔中隨時(shí)間變化的電位梯度和/或離子運(yùn)動(dòng)可改變神經(jīng)元細(xì)胞的跨膜電位并刺激軸突的激活和相應(yīng)的突觸小泡循環(huán)。在多個(gè)實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)的刺激由施加到電極對(duì)100的電壓或電流波形控制?？蓪?duì)電極對(duì)施加多種的電壓或電流波形。一般地，可在本發(fā)明中采用的電壓或電流波形在這樣的范圍內(nèi)，即在刺激引發(fā)動(dòng)作電位和對(duì)細(xì)胞造成電穿孔或者以其他形式對(duì)細(xì)胞有毒性之間。在一些實(shí)施方案中，電極對(duì)100在含有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的孔中產(chǎn)生的電場(chǎng)f的大小可在宏觀區(qū)域的空間上有變化，而在微觀區(qū)域上基本均勻，如在圖4A-B中所示。圖4A-B表示瞬時(shí)電場(chǎng)。在圖4A-B中，線300代表在某時(shí)刻電場(chǎng)f的方向，線的密度代表在所述時(shí)刻電場(chǎng)的大小。如在圖4A所示，電場(chǎng)大小可在激發(fā)區(qū)中宏觀區(qū)域的空間上有變化。例如，外部導(dǎo)體104附近線的密度比中央導(dǎo)體附近的低，從而外部導(dǎo)體附近的電場(chǎng)比中央導(dǎo)體附近的弱。如在圖4B中所示，在單個(gè)細(xì)胞附近微觀區(qū)域的空間上電場(chǎng)的大小可為基本相同的。在本發(fā)明中可采用多種電極。在圖2A-B和圖5A-H中顯示了示例性電極設(shè)計(jì)。例如，可采用圓形電極設(shè)計(jì)，因?yàn)槠湟子跇?gòu)建和應(yīng)用。圖2A-B所示的圓形電極對(duì)的一個(gè)有用特點(diǎn)是可同時(shí)觀察激發(fā)區(qū)150中一定范圍的電場(chǎng)值對(duì)細(xì)胞的作用。對(duì)于在某時(shí)刻施加到電極102、104的給定電壓值Vp V2,電場(chǎng)在激發(fā)區(qū)150中會(huì)具有一定范圍的值，所述值在中央導(dǎo)體102附近最高，而在外部導(dǎo)體104附近最低，如圖4A所示。通過記錄激發(fā)區(qū)150中多個(gè)環(huán)形區(qū)305的數(shù)據(jù)，可以同時(shí)觀察不同電場(chǎng)值下電場(chǎng)激發(fā)對(duì)細(xì)胞的作用。在多個(gè)實(shí)施方案中，含有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的孔中或位于激發(fā)區(qū)150的環(huán)形區(qū) 305中的神經(jīng)元細(xì)胞附近的瞬時(shí)電場(chǎng)大小f可隨時(shí)間在約0伏特每厘米(V/cm)和約5v/cm 之間變化。如本文所用，將電場(chǎng)的瞬時(shí)大小定義為在某時(shí)刻電場(chǎng)的絕對(duì)值。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約lOv/cm之間隨時(shí)間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約20v/cm之間隨時(shí)間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約30v/cm之間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約50v/cm之間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約75v/cm之間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約lOOv/cm之間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約150v/cm之間變化。在一些實(shí)施方案中，瞬時(shí)大小可在約OV/cm和約200v/cm之間瞬時(shí)地變化。一般地，孔中給定位置的電場(chǎng)的瞬間大小部分地取決于以下方面，即電極的幾何構(gòu)造、神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基以及附近的物質(zhì)的電特性。在多個(gè)實(shí)施方案中，控制施加到電極102、 104的電壓或電流波形以在包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔中產(chǎn)生所需的電場(chǎng)的瞬時(shí)大小和對(duì)時(shí)間的變化譜。
在一些實(shí)施方案中，施加到電極的波形峰值(例如電壓峰、多個(gè)電壓峰、電流峰、多個(gè)電流峰)可根據(jù)儀器的性能和待檢測(cè)的突觸小泡循環(huán)參數(shù)來確定。例如，本發(fā)明中可使用方波。合適的方波可具有O至100V范圍的幅度峰值、0至IOOmA范圍的電流峰值、0至 IOOHz范圍的重復(fù)率、0至1分鐘范圍的電刺激持續(xù)時(shí)間。表1中顯示了適用于本發(fā)明的示例性參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，可采用熒光顯微鏡確定軸突中動(dòng)作電位的刺激(Ryan和 Smith, 1995,Neuron, 14 :983 ；通過引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，可增加施加到電極對(duì)中的電極上的峰值直至觀察到預(yù)期生物物理結(jié)果，例如，觀察到指示神經(jīng)元細(xì)胞中動(dòng)作電位引發(fā)的熒光信號(hào)。對(duì)于圖2A-B中所示的電極對(duì)，所需的結(jié)果可能首先在電極102附近出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，可增加峰值直到在激發(fā)區(qū)150的預(yù)期部分檢測(cè)到預(yù)期結(jié)果，并且將所述峰值選為隨后的操作值。在一些實(shí)施方案中，可增加峰值到“臨界值”(即首次觀察到預(yù)期生物結(jié)果時(shí)的值)外的過量值，并且采用該峰值作為隨后的操作值。應(yīng)理解可以多種幾何構(gòu)造形成電極。在圖5A-H中顯示了多種電極對(duì)設(shè)計(jì)的實(shí)例，其中電極具有遠(yuǎn)端490和插入激發(fā)區(qū)450。在圖示中省略了導(dǎo)線和連接器以簡(jiǎn)化視圖。在多個(gè)實(shí)施方案中，電極對(duì)(例如電極40加、404幻可浸入包含細(xì)胞和基質(zhì)的孔中。在一些實(shí)施方案中，電極40加、40如可包含針或棒。在一些實(shí)施方案中，電極對(duì)可包含棒402c和薄板4(Mc，或平行板4(^e、404e。如在圖5G-H所示，電極對(duì)可包含多個(gè)電極元件402g、404h，例如，多個(gè)針、棒或板，或任何其組合。在多個(gè)實(shí)施方案中，如圖6A-B所示，至少一個(gè)電極對(duì)被整合入電極組件500?？蓪㈦姌O102、104固定或由固體材料503支撐。在一些實(shí)施方案中，固體材料503是不導(dǎo)電的，例如聚合物或塑料。在一些實(shí)施方案中，材料503是透明的，使得可從頂部501觀察電極的放置。在一些實(shí)施方案中，材料503是不透明的，以使其阻擋光線?？赏ㄟ^膠、熱連接、壓配或任何其組合將電極102、104固定在材料503上。在多個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)線510、512可排布在材料503上，并與電極102、104電連接?？赏ㄟ^焊接、導(dǎo)電膠或壓力接觸在導(dǎo)線和電極之間建立電連接513。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)線510、512在材料503相對(duì)的面上。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)線510、512可位于材料503的同一面。例如，對(duì)于在圖2A-B中所示的電極組件，在圖6A中顯示的線路510、512的排布對(duì)制造來講可能更加實(shí)用。對(duì)于在圖5A-H中所示的電極布局，導(dǎo)線可位于支持材料503的同一面或相反面。在圖6C的照片中顯示了電極組件的一個(gè)具體示例性實(shí)施方案。所述組件具有位于其遠(yuǎn)端190的電極對(duì)，與在圖2A-B中所示的類似。在照片中可見外電極104。圓柱狀固體材料503支撐內(nèi)電極102和外電極104。電線110和112分別與內(nèi)電極和外電極連接。在照片中一條電線的末端可見連接器120。對(duì)于圖7A-C，在多個(gè)實(shí)施方案中，在多電極組件600中排布了多個(gè)電極對(duì)602、 604，所述組件適于在多孔板中使用，例如M孔板、96孔板、384孔板。在一些實(shí)施方案中，多電極組件包含對(duì)應(yīng)多孔板每個(gè)孔的電極對(duì)。在一些實(shí)施方案中，多電極組件包含的電極對(duì)少于對(duì)應(yīng)多孔板的孔數(shù)。電極602、604可由非導(dǎo)電材料的板603支撐。導(dǎo)線610可分布在板603的上表面并對(duì)每對(duì)電極的一個(gè)電極602提供電接觸。可對(duì)所有線路610進(jìn)行電連接并進(jìn)一步連接到連接固定裝置622 (如接觸板、插座、BNC插座)，使得對(duì)固定裝置622施加波形提供將所述波形基本上同時(shí)施加到所有電極602。導(dǎo)線612可布置在板603的下表面并對(duì)每對(duì)電極的配對(duì)電極604提供電接觸。可對(duì)所有線路612進(jìn)行電連接并進(jìn)一步連接到連接固定裝置624(如接觸板、插座、BNC插座)，使得對(duì)固定裝置6M施加波形提供將所述波形基本上同時(shí)施加到所有電極604。在一些實(shí)施方案中，可采用地線層或?qū)щ姴牧蠈咏⑴c每個(gè)電極對(duì)中電極602或 604之一的接觸，而不是采用單獨(dú)的線路。例如，板603的一面可具有沉積于其上的薄金屬或?qū)щ娔?，電極602或604之一可焊接在所述薄膜上。在一些實(shí)施方案中，薄金屬或?qū)щ娔た沙练e在板603的兩面，其中一面的膜與每個(gè)內(nèi)電極602電連接，而相對(duì)面的膜與每個(gè)外電極604電連接。在這樣的安排中，可能需要去除板603 —面每個(gè)內(nèi)電極周圍的膜區(qū)域以使內(nèi)部和外電極不會(huì)被所述膜短路，例如通過鉆孔或加工。在多個(gè)實(shí)施方案中，電極對(duì)602、604可布置成使得它們中的所有均可同時(shí)浸入到包含細(xì)胞和基質(zhì)的多孔板的孔中。例如，電極對(duì)的中心到中心的間距與多孔板中孔的中心到中心的間距基本匹配。在多個(gè)實(shí)施方案中，電極602、604超出板603下表面的延長(zhǎng)L允許電極對(duì)的遠(yuǎn)端690接觸多孔板每個(gè)孔的底部或與之接近。在多個(gè)實(shí)施方案中，外電極604 的直徑D。的大小基本與多孔板中孔的內(nèi)直徑匹配或更小。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)電極的直徑Di可為約1mm，并且外電極的直徑D?？蔀榧s6mm。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)電極的直徑Di可為約1mm，外電極的直徑D?？蔀榧s3mm。在一些實(shí)施方案中，每列電極對(duì)可獨(dú)立于其它列被單獨(dú)地激活。在圖8A中所示的多電極組件700表示為單獨(dú)刺激電極對(duì)列而提供的實(shí)施方案。對(duì)該實(shí)施方案，通過對(duì)連接固定裝置722A-722L中的一個(gè)施加波形可單獨(dú)地激活每列電極對(duì)。應(yīng)理解線路610可沿行排列而不是沿列，以使每行電極對(duì)獨(dú)立于其它行地被激活。在一些實(shí)施方案中，連接固定裝置722A-722L可分布在支持板603的至少一部分上。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)線610的模式可使得連接固定裝置722A-722L位于圖8B所示的位置。在一些實(shí)施方案中，放置的連接固定裝置可與標(biāo)準(zhǔn)化的電連接器(例如多針的外凸或內(nèi)孔連接器)電連接，所述連接器牢固地裝配在支持板603上。采用標(biāo)準(zhǔn)連接器可減少準(zhǔn)備時(shí)間并便于多電極組件600、700的相互替換。在一些實(shí)施方案中，多電極組件600、700和多孔板可裝配在放置裝置上。所述放置裝置可將多電極組件和多孔板放置在所選位置以使數(shù)據(jù)依次從一個(gè)或更多個(gè)孔中被記錄。在一些實(shí)施方案中，所述放置裝置包含運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，放置裝置由例如計(jì)算機(jī)、微處理器或微控制器自動(dòng)控制。圖9的框圖中顯示了用于操作多電極組件600、700的電控制系統(tǒng)800的一個(gè)具體示例性實(shí)施方案。在多個(gè)實(shí)施方案中，電控制系統(tǒng)包含波形發(fā)生器810。波形發(fā)生器810產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)波形信號(hào)818，其可被傳輸?shù)椒糯髥卧?70。放大單元可接受一個(gè)或更多個(gè)波形信號(hào)，并增加每個(gè)波形信號(hào)的幅度或電流或其兩者。而后放大單元870可將放大信號(hào) 878傳輸至多電極組件600、700。進(jìn)入放大單元870的信號(hào)818可向多個(gè)分離的電線提供，可通過無線傳輸提供，或可通過多芯電纜束提供。從放大單元870傳輸?shù)男盘?hào)878可向多個(gè)分離的電線提供，可通過無線傳輸提供或可通過多芯電纜束提供?？稍诜糯髥卧?70的輸入處或在信號(hào)放大后提供針對(duì)每個(gè)信號(hào)的電隔離。在多個(gè)實(shí)施方案中，電隔離防止所施加的電信號(hào)反射傳遞回波形發(fā)生器810。波形發(fā)生器810可接受來自外部來源的輸入控制電信號(hào)802，例如起始一個(gè)或更多波形的施加的計(jì)時(shí)信號(hào)、幅度控制信號(hào)、重復(fù)率控制信號(hào)、波形形狀控制信號(hào)。波形發(fā)生器810可向外部?jī)x器提供輸出控制電信號(hào)816，例如計(jì)時(shí)信號(hào)、引發(fā)信號(hào)、同步信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，波形發(fā)生器810可為計(jì)算機(jī)或個(gè)人電腦或筆記本電腦。在一些實(shí)施方案中，波形發(fā)生器810可為獨(dú)立的功能發(fā)生器、可編程波形發(fā)生器、微處理器、微控制器或脈沖發(fā)生器。在一些實(shí)施方案中，波形可在計(jì)算機(jī)、微處理器或微控制器上執(zhí)行的軟件中產(chǎn)生，其控制計(jì)算機(jī)、微處理器或微控制器的一個(gè)或更多個(gè)輸出端的電壓或電流。在一些實(shí)施方案中，波形發(fā)生器810可包含與多端口數(shù)據(jù)獲取裝置或多端口模擬數(shù)字板組合的計(jì)算機(jī)、微處理器或微控制器。在一些實(shí)施方案中，電刺激系統(tǒng)包含經(jīng)改造的市售電穿孔系統(tǒng)。例如，從 Cellectricon(Moldnal，Sweden)購(gòu)得的CellAxessHT系統(tǒng)可改造成適合在多孔板孔中的神經(jīng)元細(xì)胞中激發(fā)動(dòng)作電位。CellAxessHT系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于對(duì)在384孔板的孔中培養(yǎng)、懸浮和 /或以其它方式包含的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。對(duì)于細(xì)胞的電穿孔，在細(xì)胞附近施加電場(chǎng)，其中電場(chǎng)的大小足以穿過細(xì)胞膜產(chǎn)生水化通道。CellAxessHT系統(tǒng)具有可對(duì)384孔板中96個(gè)孔的細(xì)胞同時(shí)電穿孔的多電極組件。在一些實(shí)施方案中，CellAxessHT多電極組件不經(jīng)改造地用于向384孔板測(cè)定孔中的神經(jīng)元細(xì)胞提供刺激波形。在一些實(shí)施方案中，將CellAxessHT 進(jìn)行改造(例如，電極大小、間隔和/或排布的改變)以向96孔板測(cè)定孔中的神經(jīng)元細(xì)胞提供刺激波形。在一些實(shí)施方案中并作為一個(gè)額外的實(shí)例，從Cellictricon AB購(gòu)得的改造的 CellAxess CX3電穿孔系統(tǒng)可用于對(duì)孔中的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行電刺激。在多個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)改造的CX3系統(tǒng)包含三對(duì)經(jīng)改造的電極和低自發(fā)熒光的塑料組件。所述電極可在它們的激發(fā)區(qū)域提供基本一致的場(chǎng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，將電極進(jìn)行改造以裝配在96孔板中，并能基本同時(shí)地刺激孔中神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡循環(huán)。CX3系統(tǒng)可提供電壓峰值在約1伏特至約100伏特的激發(fā)電壓波形。替代性刺激系統(tǒng)在一些實(shí)施方案中，采用聲或超聲刺激來激發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，聲刺激包含施加到多孔板孔中(一個(gè)或多個(gè))神經(jīng)元細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)聲或超聲脈沖。在一些實(shí)施方案中，可將聲能轉(zhuǎn)換器與包含(一個(gè)或多個(gè))神經(jīng)元細(xì)胞的孔接觸或置于其附近。在一些實(shí)施方案中，聲能轉(zhuǎn)換器的陣列可與包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的陣列在空間上相匹配，并且將轉(zhuǎn)換器的陣列與包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的陣列接觸或置于其附近。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)換器的陣列不需要與包含神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的孔的陣列在空間上匹配。例如，轉(zhuǎn)換器陣列中的轉(zhuǎn)換器可與包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的陣列中每逢第二、第三或第四個(gè)孔在空間上匹配。在一些實(shí)施方案中，聲能轉(zhuǎn)換器可以線性陣列排布，例如，對(duì)應(yīng)多孔板行或列的陣列。在多個(gè)實(shí)施方案中，超聲脈沖起始神經(jīng)元中動(dòng)作電位的引發(fā)?？稍诰W(wǎng)站 arraytherapeutic. com/research/index ΦW在一些實(shí)施方案中，通過光學(xué)方法激發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，可在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)光門控離子通道，如光敏感通道(charmelrhodopsin)。而后光脈沖可用于激活光門控離子通道，將神經(jīng)元去極化并起始動(dòng)作電位。在一些實(shí)施方案中，通過將具有光門控離子通道的培養(yǎng)、懸浮和/或以其它方式制備的神經(jīng)元暴露在快速的光脈沖系列中來以高重復(fù)率進(jìn)行動(dòng)作電位的引發(fā)?？赏ㄟ^一個(gè)或更多光系統(tǒng)(發(fā)光二極管、二極管激光器、白熾燈、氖燈)提供光脈沖。在多個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或更多發(fā)光系統(tǒng)的輻射提供光門控離子通道有應(yīng)答性的波長(zhǎng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或更多發(fā)光系統(tǒng)發(fā)出的輻射導(dǎo)向一個(gè)或更多神經(jīng)元細(xì)胞。透鏡、光過濾器、鏡子或其它光學(xué)組件可將發(fā)出的輻射匯聚和 /或?qū)蛞粋€(gè)或更多神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，發(fā)光設(shè)備的陣列以及所附的光學(xué)組件可與包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔陣列在空間上匹配，并且發(fā)光設(shè)備的陣列適于照射包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的陣列。在一些實(shí)施方案中，發(fā)光設(shè)備的陣列不需要與包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的陣列在空間上匹配。例如，發(fā)光設(shè)備可在空間上與包含神經(jīng)元細(xì)胞的每第二、第三或第四個(gè)孔匹配。在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光設(shè)備可以線性陣列排布，例如對(duì)應(yīng)多孔板行或列的陣列。在多個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)光設(shè)備的光脈沖起始神經(jīng)元細(xì)胞中神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏募ぐl(fā)。在一些實(shí)施方案中，采用光激活谷氨酸受體LiGluR起始動(dòng)作電位的激發(fā)。在多個(gè)方面，神經(jīng)元細(xì)胞包含具有細(xì)胞外半胱氨酸的修飾的紅藻氨酸受體，光激活配體可結(jié)合其上。以所選波長(zhǎng)對(duì)相連的配體進(jìn)行照射可翻轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)換配體的構(gòu)象。在光轉(zhuǎn)換時(shí)，谷氨酸被置于受體的結(jié)合穴，其可起始動(dòng)作電位的激發(fā)。在多個(gè)實(shí)施方案中，采用一個(gè)或多個(gè)發(fā)光設(shè)備來對(duì)光激活配體進(jìn)行光轉(zhuǎn)換。發(fā)光設(shè)備可在陣列中排布并包含另外的光組件，如在以上對(duì)采用光門控離子通道的實(shí)施方案的描述中所述的。在一些實(shí)施方案中，采用LiGliR和光轉(zhuǎn)換活化來誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞動(dòng)作電位的高頻率引發(fā)。在一些實(shí)施方案中，可采用光傳導(dǎo)刺激來誘導(dǎo)神經(jīng)元的動(dòng)作電位。光傳導(dǎo)是允許使可興奮細(xì)胞(如神經(jīng)元)快速、非侵入性去極化的技術(shù)。通常地，光傳導(dǎo)刺激可用于在神經(jīng)元中誘導(dǎo)動(dòng)作電位，所述神經(jīng)元包括在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的。細(xì)胞可在工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的多孔板中生長(zhǎng)，和/或隨后被放置在可重復(fù)使用的皿中在顯微鏡下進(jìn)行活體觀察。提供的電子可在使用者可設(shè)定的頻率和強(qiáng)度下將細(xì)胞去極化。通常，光傳導(dǎo)刺激不涉及對(duì)細(xì)胞的直接物理相連(如電極或晶體管接觸)?？稍诰W(wǎng)站membrasys. com/techynology. asp中找到光傳導(dǎo)的實(shí)例。檢測(cè)技術(shù)在多個(gè)實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)平臺(tái)包含用于監(jiān)測(cè)突觸小泡循環(huán)相關(guān)活性的檢測(cè)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)提供神經(jīng)元細(xì)胞(例如，在多個(gè)孔中)的成像。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)提供對(duì)從包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的至少一個(gè)區(qū)域發(fā)出的光的監(jiān)測(cè)。在多個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)與電刺激系統(tǒng)交換信息，以使突觸小泡循環(huán)的刺激和檢測(cè)基本同步。在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)測(cè)定具有一個(gè)或更多個(gè)以下特征(a)所述測(cè)定是基于熒光的動(dòng)態(tài)測(cè)定，例如在突觸小泡循環(huán)活動(dòng)期間包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔中的熒光量可隨時(shí)間變化；(b)來自報(bào)告物的信號(hào)未被放大，其與通常用于高通量篩選測(cè)定的相比可提供更弱的信號(hào)；以及(c)突觸小泡循環(huán)由受控的刺激系統(tǒng)激活。在多個(gè)實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)系統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng)能夠檢測(cè)來自一個(gè)或更多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的低水平、隨時(shí)間變化的熒光信號(hào)，并且作為系統(tǒng)的一部分被物理性整合，使得其可與電激發(fā)系統(tǒng)聯(lián)合運(yùn)作。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)可提供對(duì)檢測(cè)信號(hào)的捕獲、傳送和/或分析。檢測(cè)信號(hào)的分析在一些實(shí)施方案中可在約1分鐘內(nèi)完成。平臺(tái)還可包含含有至少一個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)。通常檢測(cè)器包含設(shè)置為從孔中檢
46測(cè)發(fā)光信號(hào)的光學(xué)傳感器。檢測(cè)器還可包含設(shè)置為從孔中收集發(fā)光信號(hào)的物鏡。物鏡可與光學(xué)傳感器(如電荷耦合器件照相機(jī)等)有效連接。物鏡可為空氣物鏡。或者，物鏡可為浸水或浸油透鏡。通常，空氣物鏡與浸水或浸油透鏡相比具有更低的數(shù)值孔徑(numerical apertune,NA)0因?yàn)镹A直接控制由物鏡收集的發(fā)出光子的分?jǐn)?shù)，通?？諝馕镧R與浸水或浸油透鏡相比收集更少的光子。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)一些應(yīng)用(例如可包含使用一個(gè)或更多個(gè)空氣物鏡的高通量平臺(tái))，與物鏡相關(guān)的低收集效率可以多種方式進(jìn)行補(bǔ)償。例如，與空氣物鏡相關(guān)的低收集效率可通過增加視野中被拍照的突觸數(shù)(例如通過增加神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，通過增加視野區(qū)域大小等)和/或通過增加報(bào)告蛋白質(zhì)表達(dá)的效率和特異性來補(bǔ)償。因此，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)可采用一個(gè)或更多個(gè)低數(shù)值孔徑空氣物鏡以高通量方式以高敏感性檢測(cè)突觸小泡循環(huán)的方面，例如可檢測(cè)到神經(jīng)元細(xì)胞中應(yīng)答于低至5至10個(gè)動(dòng)作電位的突觸小泡循環(huán)的方面。物鏡可具有的放大倍數(shù)為&、10χ、20χ、40χ、60χ或ΙΟΟχ。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的放大倍數(shù)。物鏡可具有的數(shù)值孔徑范圍為0. INA至 1. 4NA、0. INA 至 1. 3NA、0. INA 至 1. 2NA、0. INA 至 1. 1NA、0. INA 至 1. 0ΝΑ,0. INA 至 0. 9NA、 0. INA 至 0. 85NA、0. INA 至 0. 8NA、0. INA 至 0. 75NA、0. INA 至 0. 7NA、0. INA 至 0. 65NA、0. INA 至 0. 6NA、0. INA 至 0. 55NA、0. INA 至 0. 5NA、0. INA 至 0. 45NA、0. INA 至 0. 4NA、0. INA 至 0. 35NA.0. INA 至 0. 3NA、0. INA 至 0. 25NA、0. INA 至 0. 2NA 或 0. INA 至 0. 5NA。物鏡可具有的數(shù)值孔徑為約 0. 1NA、約 0. 15NA、約 0. 2NA、約 0. 25NA、約 0. 3NA、約 0. !35NA、約 0. 4NA、約 0. 45NA、約 0. 5NA、約 0. 55NA、約 0. 6NA、0. 65NA、約 0. 7NA、約 0. 75NA、約 0. 8NA、約 0. 85NA、約 0. 9NA、約0. 95NA、約1NA、約1. 1NA、約1. 2NA、約1. 3NA、約1. 4NA或更大。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的數(shù)值孔徑。檢測(cè)器可設(shè)置為檢測(cè)多種視野面積的發(fā)光信號(hào)。所述檢測(cè)器可設(shè)置為檢測(cè)范圍為 0. Imm 至 10mm>0. Imm 至 9mm>0. Imm 至 8mm>0. Imm 至 7mm>0. Imm 至 6mm>0. Imm 至 5mm>0. Imm 至4mm、0. Imm至3mm、0. Imm至2mm、0. Imm至Imm或0. Imm至0. 5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。物鏡可設(shè)置為從約 0. lmm、0. 2mm>0. 3mm、0. 4mm>0. 5mm、0. 6mm>0. 7mm、0. 8mm、0. 9mm、1mm、 2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、IOmm或更大的視野區(qū)域收集發(fā)光信號(hào)。根據(jù)本公開內(nèi)容的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明確其它適合的視野區(qū)域。檢測(cè)系統(tǒng)可包含與檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中計(jì)算機(jī)設(shè)置為將所述檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化為表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。在檢測(cè)系統(tǒng)的一些實(shí)施方案中，可采用光學(xué)組件(例如透鏡和濾鏡)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的活性進(jìn)行成像，在電荷耦合器件(CCD)檢測(cè)器陣列上捕獲熒光發(fā)射信號(hào)或熒光發(fā)射物的圖像。成像系統(tǒng)可檢測(cè)從報(bào)告熒光團(tuán)(例如與突觸小泡蛋白質(zhì)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的GFP)發(fā)出的熒光放射。捕獲的圖像可為多孔板孔的一部分。一旦在CCD陣列上電子化地捕獲了圖像，隨后可在執(zhí)行數(shù)據(jù)處理軟件的計(jì)算機(jī)中處理信號(hào)?？梢来蔚夭东@圖像或信號(hào)以提供突觸小泡循環(huán)期間熒光的動(dòng)態(tài)分析。在圖10中描述了可提供多孔板孔中突觸小泡循環(huán)相關(guān)活性圖像的檢測(cè)系統(tǒng)的非限制性實(shí)例。在多個(gè)實(shí)施方案中，倒置落射熒光顯微鏡910用于對(duì)含有神經(jīng)元細(xì)胞的孔中的熒光發(fā)射進(jìn)行成像。例如，具有物鏡920(例如，10X，0.45NA的空氣物鏡)的ZeissAxiovert Zl可對(duì)孔908的至少部分中的突觸小泡循環(huán)活性成像。在多個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)孔906的底部的至少一部分是透明的，以使孔中的神經(jīng)元細(xì)胞可通過孔底部進(jìn)行光學(xué)觀察。圖像可在與顯微鏡耦合的C⑶陣列930上捕獲。CXD陣列可與計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息交換，以使圖像可被轉(zhuǎn)移到并任選地儲(chǔ)存入計(jì)算機(jī)的存儲(chǔ)器中。隨后可通過計(jì)算機(jī)加工圖像以提取涉及突觸小泡循環(huán)的相關(guān)信息。在多個(gè)實(shí)施方案中，成像系統(tǒng)(例如顯微鏡910)允許開放性地到達(dá)多孔板915的孔908，以使多電極組件600可從平板上方放置入孔中，如圖所示。在多個(gè)實(shí)施方案中，多孔板915裝在放置裝置945上以對(duì)多孔板的每個(gè)孔依次進(jìn)行檢查。放置裝置945可方便地是自動(dòng)化的和/或用計(jì)算機(jī)控制，并任選地與電激發(fā)系統(tǒng)、圖像捕獲裝置和/或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)同步。對(duì)于數(shù)據(jù)的自動(dòng)捕獲和處理，CXD陣列930、顯微鏡910、放置裝置945和多電極組件 600可通過有線或無線連接962、964、966、968與中央控制器(例如計(jì)算機(jī)、微控制器、微處理器)交換信息。在一些應(yīng)用中，低速率的分析可能對(duì)實(shí)驗(yàn)者或使用者的需要已經(jīng)足夠，并且圖10 所示的突觸小泡循環(huán)系統(tǒng)的實(shí)施方案的元件對(duì)特定應(yīng)用可能是足夠的。例如，在一些實(shí)施方案中，突觸小泡循環(huán)的持續(xù)時(shí)間為約30秒至約150秒，例如約30秒、約40秒、約50秒、約 60秒、約70秒、約80秒、約90秒、約100秒、約110秒、約120秒、約130秒、約140秒或約 150秒。因此，每個(gè)孔可以任何這些持續(xù)時(shí)間成像。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)孔可以短于這些持續(xù)時(shí)間的時(shí)間成像，例如，約5秒、約10秒、約20秒、約30秒或約40秒。采用單個(gè)顯微鏡每次檢測(cè)一個(gè)孔，并假設(shè)與成像時(shí)間相比數(shù)據(jù)處理時(shí)間是可忽略的，對(duì)96孔板來說數(shù)據(jù)捕獲和處理時(shí)間可在約1小時(shí)至約4小時(shí)之間，例如，約1小時(shí)、約1. 5小時(shí)、約2小時(shí)、約2. 5小時(shí)、約3小時(shí)、約3. 5小時(shí)或約4小時(shí)。如果需要更高速的分析，可采用平行檢測(cè)系統(tǒng)。圖11顯示了可用于高通量突觸小泡循環(huán)系統(tǒng)的實(shí)施方案的平行檢測(cè)系統(tǒng)1000。在多個(gè)實(shí)施方案中，平行檢測(cè)系統(tǒng)1000包含透鏡陣列1070和檢測(cè)器陣列1080。透鏡陣列 1070可包含透鏡1072的陣列，所述透鏡可在一個(gè)維度上分布(例如以對(duì)應(yīng)孔906的行或列的多個(gè)孔的布局)，或可在兩個(gè)維度上分布(例如以對(duì)應(yīng)孔的行和列的多個(gè)孔的布局)。在一些實(shí)施方案中，透鏡陣列1070的透鏡可與多孔板中每個(gè)孔的位置在空間上匹配。透鏡陣列1070不需要與行和/或列中的每個(gè)孔在空間上匹配。例如，透鏡可與行和/或列的每隔一個(gè)孔匹配，或每第三個(gè)孔、每第四個(gè)孔、每第五個(gè)孔或每第六個(gè)孔。當(dāng)透鏡未與每個(gè)孔匹配時(shí)，可將多孔板915在讀板時(shí)移動(dòng)到未讀的相鄰孔。檢測(cè)器陣列1080可包含光檢測(cè)器1082的陣列。光檢測(cè)器1082可為高敏感檢測(cè)器，例如光電倍增管、雪崩光電二極管、硅漂移檢測(cè)器等。濾光鏡可放置在檢測(cè)器以上，例如，為了減少與孔906中熒光團(tuán)標(biāo)記樣本的熒光發(fā)射的波長(zhǎng)不同的波長(zhǎng)的放射。在一些實(shí)施方案中，光檢測(cè)器陣列1080中的檢測(cè)器可與多孔板每個(gè)孔的位置在空間上匹配。在一些實(shí)施方案中，光檢測(cè)器1082的分布布局可與透鏡陣列1070中的透鏡1072匹配。在多個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)透鏡1072收集從孔906的至少一部分發(fā)出的熒光，并將收集的光導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的光檢測(cè)器1082。來自每個(gè)光檢測(cè)器1082的信號(hào)可通過有線或無線連接1062傳導(dǎo)入中央控制器(例如計(jì)算機(jī)、微處理器、微控制器等)以進(jìn)行隨后的處理。在一些實(shí)施方案中，可采用光隔板或不透明材料將每個(gè)光檢測(cè)器1082與鄰接或附近的孔進(jìn)行光分離，以使每個(gè)光檢測(cè)器只接收從直接與其對(duì)應(yīng)收集透鏡1072相對(duì)的孔的熒光。在多個(gè)實(shí)施方案中，透鏡 1072可包被有抗反射涂層和/或通帶涂層。在一些實(shí)施方案中，可在本系統(tǒng)中采用能平行地對(duì)多個(gè)孔(例如，4、16、對(duì)、48、 96、384孔)成像的讀板器。例如，可采用市售讀板器(例如，從Perkin Elmer,ffaltham,MA 購(gòu)得的平板顯示(plate: vision)系統(tǒng))作為平行檢測(cè)系統(tǒng)。該讀板器能進(jìn)行基于動(dòng)態(tài)的熒光分析，并允許接近多孔板上方以整合多電極組件。平板顯示(plate: vision)系統(tǒng)具有高收集效率的光學(xué)系統(tǒng)并具有為平行分析96孔而設(shè)計(jì)的特殊光學(xué)系統(tǒng)。發(fā)明人評(píng)價(jià)了平板可見系統(tǒng)平行記錄多孔中突觸小泡循環(huán)的能力并在實(shí)施例部分進(jìn)行了詳細(xì)描述。另外的適合的平行讀板器包括但不限于FLIPRTETRA (Molecular Devices, Union City, CA)、 FDSS7000(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)禾口 CellLux(Perkin Elmer, ffaltham, MA)。在多個(gè)實(shí)施方案中，處理從圖10所示的成像系統(tǒng)或圖11所示的平行檢測(cè)系統(tǒng)收集的信號(hào)以評(píng)價(jià)作為時(shí)間的函數(shù)的突觸小泡循環(huán)或突觸小泡活性。在一些實(shí)施方案中，將代表突觸小泡循環(huán)的信號(hào)(例如熒光信號(hào))作為時(shí)間的函數(shù)記錄。可記錄信號(hào)的強(qiáng)度和/ 或重復(fù)率。對(duì)于包含成像系統(tǒng)的實(shí)施方案，對(duì)于一個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物可記錄多個(gè)信號(hào)，其中每個(gè)信號(hào)對(duì)應(yīng)培養(yǎng)物中的特定位置或神經(jīng)元。對(duì)于包含成像系統(tǒng)的實(shí)施方案，可組合多個(gè)孔的信號(hào)以獲得包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔的總信號(hào)或平均信號(hào)。在多個(gè)實(shí)施方案中，代表突觸小泡循環(huán)或神經(jīng)活性的信號(hào)可作為本發(fā)明突觸小泡循環(huán)測(cè)定的讀數(shù)來評(píng)價(jià)。在一些實(shí)施方案中，突觸傳遞的電生理分析可用作本發(fā)明測(cè)定的讀數(shù)。例如，代表突觸疲勞的信號(hào)可用作鑒定影響突觸傳遞的化合物的本發(fā)明測(cè)定的讀數(shù)。在一些實(shí)施方案中，代表突觸小泡循環(huán)或神經(jīng)活性的信號(hào)(例如熒光信號(hào))可顯示振動(dòng)、波動(dòng)、某些波形形狀、指數(shù)軌道(例如，飽和或恢復(fù))、增加速率(例如熒光增加速率)、減少速率(例如熒光減少速率)和/或噪聲樣特征。在多個(gè)實(shí)施方案中，可分析信號(hào)以定量觀察到的特性。例如，代表突觸小泡循環(huán)或神經(jīng)活性的信號(hào)可顯示指數(shù)衰減。對(duì)于這種信號(hào)，可將觀察到的信號(hào)對(duì)包含指數(shù)衰減的數(shù)學(xué)表達(dá)式(如，exp(-t/τ))進(jìn)行擬合以獲得τ的值，其中t表示時(shí)間，τ表示特征性衰減常數(shù)。刺激和檢測(cè)系統(tǒng)的相互連接在多個(gè)實(shí)施方案中，電刺激系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)相互連接并整合入突觸小泡循環(huán)檢測(cè)系統(tǒng)，如圖10(低通量平臺(tái)的示例性描述)和圖11 (高通量平臺(tái)的示例性描述)所示。多電極組件600、其相關(guān)電子設(shè)備以及檢測(cè)系統(tǒng)可通過通信連接966、962、964、968、1062與中央控制器(例如，計(jì)算機(jī)、微處理器、微控制器等)相連接，使得實(shí)驗(yàn)步驟、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理可基本上自動(dòng)化或半自動(dòng)化。在多個(gè)實(shí)施方案中，多電極組件600的電極602、604可從多孔板上方方向與多孔板915孔906中的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物相接觸，并且檢測(cè)系統(tǒng)位于孔下方。電刺激系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)與中央計(jì)算機(jī)相互連接的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)步驟的例子為，計(jì)算機(jī)可執(zhí)行以下步驟(a)發(fā)出讓放置裝置945將第一個(gè)孔放置在顯微鏡物鏡920上方的電子命令，(b)發(fā)出初始化顯微鏡操作參數(shù)的命令，例如選擇透鏡、濾鏡設(shè)置，(c)初始化CCD 陣列，例如電源設(shè)置、增益設(shè)置、電子快門速度等，(d)開始從C⑶陣列獲取數(shù)據(jù)，(e)向電子刺激系統(tǒng)發(fā)出電子命令以將一個(gè)或更多個(gè)波形施加到第一個(gè)孔中的電極，(f)發(fā)出終止波形施加的命令，(g)終止從CCD陣列接收數(shù)據(jù)，并且(h)向放置裝置945發(fā)出移動(dòng)到另一個(gè)孔的命令并重復(fù)(b-h)的循環(huán)。
在一些方面，可采用連接系統(tǒng)評(píng)價(jià)多種電極設(shè)計(jì)引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的能力，例如，如在實(shí)施例部分中示例的。一個(gè)非限制性實(shí)施例是，用表達(dá) synaptopHluorin、vGlutl-pHluorin-或 synaptophysin-pHluorin-腺相關(guān)病毒感染 96 孔板培養(yǎng)物中的原代神經(jīng)元。在培養(yǎng)階段后，可用測(cè)定緩沖液替換培養(yǎng)基。而后可將平板放置在突觸小泡循環(huán)系統(tǒng)中，并且將電極放置入孔中。施加電壓波形，至少部分由 synaptopHluorin產(chǎn)生的熒光被導(dǎo)入檢測(cè)裝置并記錄(例如，作為圖象、一系列圖像、強(qiáng)度水平和/或一系列強(qiáng)度值的形式)。如圖10所示，可用倒置顯微鏡進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中與突觸小泡循環(huán)相關(guān)的活性的成像。如圖11所示，隨時(shí)間變化的熒光信號(hào)的檢測(cè)可用倒置顯微鏡或透鏡和光檢測(cè)組件進(jìn)行。針對(duì)不同電極設(shè)計(jì)可進(jìn)行重復(fù)刺激，比較得到的數(shù)據(jù)以評(píng)價(jià)多種電極設(shè)計(jì)的效率。平臺(tái)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突觸小泡循環(huán)測(cè)定在低通量平臺(tái)上進(jìn)行。通常，低通量測(cè)定系統(tǒng)采用更好的光學(xué)設(shè)備(例如，落射熒光顯微鏡)，提供更好的分辨率。因此在一些實(shí)施方案中，低通量平臺(tái)能表征單個(gè)突觸。通常，低通量平臺(tái)對(duì)定性單個(gè)化合物的作用尤其有效。例如，可采用低通量平臺(tái)分析治療特定疾病的已知藥物以確定其是否影響突觸小泡循環(huán)。圖10中描述了示例性低通量平臺(tái)。高通量平臺(tái)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突觸小泡循環(huán)測(cè)定可在高通量平臺(tái)上進(jìn)行。高通量平臺(tái)對(duì)從大量候選物或測(cè)試物中鑒定突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑(例如刺激物和/或抑制物)的盲篩尤其有效。在一些實(shí)施方案中，高通量篩選測(cè)定可包括以下步驟(a)提供本文所述的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，(b)提供多個(gè)測(cè)試物以使多個(gè)測(cè)試物的成員與多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的每個(gè)接觸，(c)如本文所述進(jìn)行突觸小泡循環(huán)測(cè)定，以及⑷確定與對(duì)照相比多個(gè)測(cè)試物的任何成員是否調(diào)節(jié)與突觸小泡循環(huán)相關(guān)的一種或更多種活性。在一些實(shí)施方案中，在多個(gè)孔中提供多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。例如，可采用多孔板(例如 24,48,96或384孔板)進(jìn)行高通量測(cè)定。圖11描述了示例性高通量篩選系統(tǒng)。為了在多孔板中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)，高通量平臺(tái)通常包括刺激系統(tǒng)以在孔中產(chǎn)生場(chǎng)電位。在一些實(shí)施方案中，從上方可達(dá)到平板的孔以將刺激技術(shù)整合入測(cè)定系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，可采用定制開發(fā)的多孔電刺激器。在一些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的多孔電刺激器包含可放置在含有多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的孔中的多個(gè)電極對(duì)。電極可包含內(nèi)部的棒狀導(dǎo)電電極，其被外部的圓柱狀導(dǎo)電電極包圍。刺激步驟可包含對(duì)電極施加一個(gè)或更多個(gè)激發(fā)電壓波形，以在孔中電極對(duì)的電極之間的激發(fā)區(qū)產(chǎn)生電場(chǎng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，刺激步驟包括通過施加刺激波形誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，可將多孔板電穿孔系統(tǒng)改造為適合的刺激系統(tǒng)。例如，可優(yōu)化市售高通量電穿孔器(例如，設(shè)計(jì)為遞送siRNA的Cellectricon提供的CellAxessHT)以將多孔板孔的電場(chǎng)電位覆蓋最大化，從而用作本發(fā)明高通量突觸小泡循環(huán)的刺激系統(tǒng)。在實(shí)施例部分詳細(xì)地描述了市售高通量電穿孔器的定制改造的非限制性實(shí)例。本文描述了其它適于高通量平臺(tái)的刺激系統(tǒng)。通常，本發(fā)明的高通量測(cè)定是基于熒光的動(dòng)態(tài)測(cè)定。通常，報(bào)告物的信號(hào)在突觸小泡循環(huán)測(cè)定中未放大，因此導(dǎo)致信號(hào)弱。適合的成像系統(tǒng)具有高光子收集效率。高收集效率導(dǎo)致信噪比增加并減少動(dòng)態(tài)讀數(shù)時(shí)的曝光過度，因?yàn)闇y(cè)量性地激發(fā)熒光團(tuán)所需的光較少。在多個(gè)實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的成像/監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能夠平行地監(jiān)測(cè)含有多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的多個(gè)孔的指示突觸小泡循環(huán)的信號(hào)(例如，熒光發(fā)光)。在一些實(shí)施方案中，適合的成像系統(tǒng)對(duì)含有神經(jīng)元細(xì)胞的孔的至少一部分成像，并收集含有神經(jīng)元細(xì)胞的孔的至少一部分的圖像或一系列圖像。在一些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的成像/測(cè)系統(tǒng)平行地收集并檢測(cè)含有多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的多個(gè)孔的信號(hào)量(例如熒光發(fā)光)。在一些實(shí)施方案中，適合的監(jiān)測(cè) /成像系統(tǒng)能進(jìn)一步處理任何代表突觸小泡循環(huán)一個(gè)或更多個(gè)方面的數(shù)據(jù)，例如，多種突觸小泡循環(huán)過程的動(dòng)態(tài)(例如胞吞、成核、內(nèi)陷等)。通常，適合的成像系統(tǒng)能夠在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)(例如1分鐘)進(jìn)行熒光、動(dòng)態(tài)分析。在一些實(shí)施方案中，可采用定制或市售高含量篩選系統(tǒng)(例如，Pathway, Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ ；ImageXpress MICRO(Molecular Devices,Union City,CA ； Opera,Perkin Elmer,ffaltham,MA ；ArrayScan,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。預(yù)計(jì)這些高含量篩選系統(tǒng)每小時(shí)能夠進(jìn)行至少12個(gè)突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，采用多孔板閱讀器以通過提高篩選輸出使系統(tǒng)適于化合物開發(fā)。適合的多孔板閱讀器能夠平行地對(duì)多孔板的多個(gè)孔成像。適合的讀板器包括市售的讀板器(例如，Perkin Elmer提供的plate: vision)。通常，適合的讀板器能夠進(jìn)行動(dòng)態(tài)、熒光分析，允許進(jìn)入平板的上方，以整合刺激系統(tǒng)，具有高收集效率的光學(xué)設(shè)備和/或設(shè)計(jì)為平行地分析多個(gè)孔的特別光學(xué)設(shè)備。在檢測(cè)系統(tǒng)部分描述了其他適合的成像系統(tǒng)。通常，高通量平臺(tái)涉及采用單個(gè)儀器同時(shí)測(cè)量多個(gè)突觸小泡循環(huán)測(cè)定。對(duì)高通量平臺(tái)來說，具有在盡可能多的突觸小泡循環(huán)模式中檢測(cè)盡可能多的突觸小泡循環(huán)的組分的能力是理想的。為了能夠在不同模式的胞吞(例如，飽和和不飽和)中研究突觸小泡循環(huán)，重要的是測(cè)定系統(tǒng)能夠在高和低強(qiáng)度刺激系列之中和之后測(cè)量突觸小泡循環(huán)報(bào)告信號(hào)。低強(qiáng)度刺激系列(例如，小于10Hz，小于100個(gè)動(dòng)作電位)誘導(dǎo)不飽和胞吞模式，而高強(qiáng)度刺激系列(例如，大于10Hz，大于100個(gè)動(dòng)作電位)誘導(dǎo)飽和胞吞模式。在一些實(shí)施方案中，采用能夠檢測(cè)應(yīng)答于以至少IOHz遞送的至少50個(gè)動(dòng)作電位的突觸小泡循環(huán)(例如胞吐作用)的儀器。該刺激范圍允許在不飽和和飽和兩種胞吞模式下分析突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，適合的儀器具有能夠檢測(cè)應(yīng)答于以至少10、20、30、40或50Hz遞送的至少50、 100、200、300或更多個(gè)動(dòng)作電位的突觸小泡循環(huán)的能力。在一些實(shí)施方案中，可通過使每孔反應(yīng)熒光團(tuán)的數(shù)目最大化來增加本發(fā)明測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度。例如，可通過神經(jīng)元高密度鋪板來獲得更高的突觸密度，從而增加信號(hào)強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，每孔可鋪至少20，000個(gè)神經(jīng)元/cm2。在一些實(shí)施方案中，可同時(shí)監(jiān)測(cè)至少 50(例如，至少 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950、1000或更多)個(gè)突觸。在一些實(shí)施方案中，可通過增加表達(dá)指示突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物(例如，突觸小泡蛋白-PHluorin)的神經(jīng)元的百分比來增加本發(fā)明測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的至少 90% (例如，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 100%)的神經(jīng)元表達(dá)指示突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物?？刹捎枚喾N方法將神經(jīng)元高效地用報(bào)告物標(biāo)記。例如，可采用病毒感染。適于本發(fā)明的一個(gè)示例性病毒表達(dá)系統(tǒng)是基于腺相關(guān)病毒的表達(dá)系統(tǒng)。通常，采用腺相關(guān)病毒表達(dá)系統(tǒng)可獲得大于 90%的感染率。在一些實(shí)
51施方案中，采用可在興奮性和抑制性神經(jīng)元兩者中表達(dá)報(bào)告物的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，報(bào)告物標(biāo)記的神經(jīng)元可獲得自攜帶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (例如小鼠)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法生成表達(dá)所需報(bào)告基因(例如，突觸小泡蛋白-pHluorin)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供可靠和高重復(fù)率的標(biāo)記和信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，可通過增加標(biāo)記有指示突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物(例如 vGlutl-pHluorin)的功能性突觸小泡的級(jí)分來增加信號(hào)強(qiáng)度。例如，可基于對(duì)再循環(huán)(例如可采用用V型ATP酶抑制劑巴佛洛霉素進(jìn)行的堿性陷阱)的小泡總數(shù)的計(jì)數(shù)來評(píng)估 PHluorin標(biāo)記的功能性突觸小泡的級(jí)分。用幾百個(gè)動(dòng)作電位刺激可導(dǎo)致所有可與質(zhì)膜融合的小泡融合至少一次。在巴佛洛霉素的存在下，PHluorin熒光限制在升高狀態(tài)下。最大熒光除以量子大小得到在每個(gè)突觸中標(biāo)記vGlutl-pHluorin的小泡數(shù)。可將該數(shù)字與用FM1-43標(biāo)記獲得的值進(jìn)行比較。FM1-43為有機(jī)雙親熒光跟蹤物，其在突觸小泡進(jìn)行胞吞時(shí)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記?？赏ㄟ^對(duì)標(biāo)記FM1-43的小泡計(jì)數(shù)來測(cè)量小泡集合的總大小(Ryan等， Nature (1997) Jul 31 ；388 (6641) :478_82，其通過引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，至少 40% (例如至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100% ) 的功能性突觸小泡被指示本發(fā)明突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解改變儀器靈敏度、報(bào)告物信號(hào)強(qiáng)度和其它參數(shù)可增加本發(fā)明測(cè)定的信噪比。增加的信噪比能測(cè)量應(yīng)答于至少10、20、30、40或50Hz的更少的動(dòng)作電位(例如，40、20、10、5個(gè)或更少的動(dòng)作電位)的突觸小泡循環(huán)，并能測(cè)量除總突觸小泡循環(huán)外其它的突觸小泡循環(huán)過程(例如，釋放的概率)。這些本文所述的測(cè)定的修改和變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。測(cè)試物可檢測(cè)用作突觸小泡循環(huán)潛在調(diào)節(jié)劑(例如，抑制劑或刺激劑)的多種候選試齊U。示例性的測(cè)試物包括但不限于化學(xué)化合物、小分子、蛋白質(zhì)或肽、抗體、共晶、納米晶體、微生物(例如病毒、細(xì)菌、真菌等)、核酸(例如，DNA、RNA、DNA/RNA雜交體、siRNA、shRNA、 miRNA、核酶、適體等)、碳水化合物(例如單、雙或多糖)、脂質(zhì)(例如磷脂、甘油三酯、留族化合物等)、天然產(chǎn)物、其任何組合。還可采用基于計(jì)算機(jī)的推理性藥物設(shè)計(jì)法來設(shè)計(jì)候選試齊U。通常，在篩選測(cè)定中檢測(cè)多個(gè)測(cè)試物(例如，候選試劑文庫)以篩選潛在調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試物為生物可降解和/或生物相容性的。肽在一些實(shí)施方案中，可通過篩選由重組噬菌體產(chǎn)生的隨機(jī)肽文庫或化學(xué)文庫來獲得突觸小泡循環(huán)的潛在調(diào)節(jié)劑，例如，Scott和Smith, Science，249 :386-390(1990)； Cwirla Proc. Natl. Acad. Sci. , 87 :6378-6382 (1990) ；Devlin Science, 249 404-406(1990)。采用“噬菌體法”可構(gòu)建非常大的文庫(IO6-IO8化學(xué)實(shí)體)。第二種途徑主要采用化學(xué)方法，例如 Geysen 法(Geysen 等，Molecular Immunology 23:709-715(1986)； Geysen 等 J. Immunologic Method 102 :259-274(1987))以及 Fodor 等(Science 251 767-773 (1991))的方法。Furka 等，14th International Congress of Biochemistry, ^ 5, Abstract FR :013(1988) ；Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37 :487-493(1991), Houghton(美國(guó)專利No. 4，631，211，公布于1986年12月)以及Rutter等(美國(guó)專利 No. 5，010, 175，公布于1991年4月23)描述了生成肽混合物的方法，可檢測(cè)所述肽混合物能否作為涉及突觸小泡循環(huán)活性的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，可采用合成文庫(Needels等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 10700-4(1993 ；Ohlmeyer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926(1993) ；Lam 等，國(guó)際專利公開No. WO 92/00252 ;Kocis等，國(guó)際專利公開No. WO 94280 ,其中每個(gè)通過全文引用并入本文)等來篩選本發(fā)明突觸小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑。一旦鑒定到潛在的調(diào)節(jié)劑，可從化學(xué)物文庫篩選或者重新合成化學(xué)類似物，所述化學(xué)文庫如可購(gòu)自供應(yīng)商(如 ChemBridge Libraries (chembridge. com)、BIOMOL International、ASINEX> ChemDiν> ChemDB、ICCB-Longwood)的。小分子在一些實(shí)施方案中，篩選作為突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的小分子文庫、其類似物。在一些實(shí)施方案中，可篩選重新合成的化合物文庫以鑒定具有突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)功能的新化合物。在一些實(shí)施方案中，可篩選包含藥物(包括FDA批準(zhǔn)藥物)的公共文庫以鑒定之前未知是否具有突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)活性的現(xiàn)有化合物。在一些實(shí)施方案中，可采用本領(lǐng)域公知方法合成含有現(xiàn)有化合物的衍生物或類似物的經(jīng)改造文庫以鑒定新的或改善的突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑。適合的小分子化合物文庫可從供應(yīng)商(如ChemBridge Libraries (chembridge. com) ,BI0M0L International、ASINEX、ChemDiv、ChemDB、ICCB-Longwood)獲得。在一些實(shí)施方案中，適合的小分子文庫含有大量(如，> 100，000種化合物)為了多樣性和良好“藥物樣”特性而選擇的商業(yè)化合物。反義RNA和核酶在一些實(shí)施方案中，可篩選作為突觸小泡循環(huán)潛在調(diào)節(jié)劑的反義分子。反義分子為具有與指定的mRNA互補(bǔ)的核苷酸序列的RNA或單鏈DNA分子。當(dāng)將實(shí)驗(yàn)室制備的反義分子注入含有所研究基因轉(zhuǎn)錄的正常mRNA的細(xì)胞中時(shí)，反義分子可與mRNA堿基配對(duì)，防止mRNA轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)。所得的雙鏈RNA或RNA/DNA被與這些分子特異結(jié)合的酶消化。因此，發(fā)生mRNA耗盡，阻止了基因產(chǎn)物的翻譯，使得反義分子可用于阻止有害蛋白質(zhì)產(chǎn)生的藥物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知生成和利用反義RNA的方法(參見，例如， C. Lichtenstein禾口W. Nellen(編)，Antisense Technology :A Practical Approach,Oxford University Press (December，1997) ；S· Agrawal 禾口 S· T· Crooke，Antisense Research and Application(Handbook of Experimental Pharmacology，卷 131)，Springer Verlag(1998 年 4 月)；I.Gibson, Antisense and Ribozyme Methodology !Laboratory Companion, Chapman & Hall(1997 ^6^ ) ；J.N· M· Mol and A. R. Van Der Kro 1, Antisense Nucleic Acids and Proteins，Marcel Dekker ;B. Weiss，Antisense Oligonodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents，CRC Press (1997 年 6 月)；Stanley 等，Antisense Research and Applications，CRC Press (1993 年 6 月)； C. A. Stein 禾口 A.M.Krieg，Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 年 4 月))。在一些實(shí)施方案中，可基于參與突觸小泡循環(huán)的蛋白質(zhì)和基因序列信息設(shè)計(jì)適于調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)通路的反義分子和核酶。例如，可將反義分子和核酶設(shè)計(jì)為靶向突觸前蛋白質(zhì)，其包括但不限于內(nèi)在小泡蛋白(例如突觸小泡蛋白2(SV2)、突觸素、突觸結(jié)合蛋白、小泡相關(guān)膜多肽(VAMP)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、突觸循環(huán)蛋白、質(zhì)子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸鏈蛋白(cystine string protein，CSP)、突觸蛋白)、突觸質(zhì)膜蛋白(如鈣通道、25kDa突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-25)、突觸融合蛋白)以及胞漿蛋白 (如SNAP、n-kcl)、突觸蛋白(例如，突觸蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，發(fā)動(dòng)蛋白Ι、ΡΙΡ5Κ1 γ和突觸小泡磷酸酶I)。可通過本領(lǐng)域已知的任何用于合成核酸分子的方法制備反義分子和核酶。這些包括用于化學(xué)合成寡核苷酸的技術(shù)，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成?；蛘?，可通過編碼UGGT的 DNA序列的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成RNA分子。這些DNA序列可整合入具有適合的RNA聚合酶啟動(dòng)子(如Τ7或SP6)的多種載體中?；蛘撸蓪⑦@些組成型或可誘導(dǎo)地合成反義RNA的 cDNA構(gòu)建體引入細(xì)胞系或組織?？尚揎桼NA分子以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期?？捎玫男揎棸ǖ幌抻谠诜肿拥?’和/或3’末端添加側(cè)翼序列或在分子的骨架內(nèi)采用硫代磷酸酯或2’ 0-甲基而不是磷酸二酯鍵連接。該概念可擴(kuò)展為加入非常規(guī)堿基，如肌苷、辮苷(queosine)和懷丁苷，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰_、甲基_、硫代_、類似修飾形式，其不易于被內(nèi)源核酸內(nèi)切酶識(shí)別。干擾RNARNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA (dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其與上述的基于反義和核酶的方法不同。認(rèn)為dsRNA分子在多種品系的細(xì)胞中首先被稱為 DICER (Bernstein 等，Nature 409 :363,2001)的 RNaseIII 樣酶加工成更小的 dsRNA 分子后指導(dǎo)mRNA的序列特異性降解，所述更小的dsRNA分子由兩條21nt的鏈構(gòu)成，其中每條具有5’磷酸基團(tuán)和3’羥基，并包含與另一條鏈精確互補(bǔ)的19nt區(qū)，因而其中具有側(cè)翼為2nt 3’突出的19nt雙鏈體區(qū)域。因此RNAi由短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)，其通常包含約19個(gè)核苷酸長(zhǎng)的雙鏈區(qū)域，并通常在每條鏈上具有1-2個(gè)核苷酸的3’突出，得到的總長(zhǎng)通常為約 21至23個(gè)核苷酸。還應(yīng)理解siRNA可具有一定長(zhǎng)度范圍，例如，雙鏈部分的范圍可為15- 個(gè)核苷酸。應(yīng)理解siRNA在任一個(gè)或兩個(gè)末端可具有平末端或3’突出。如果存在該3’突出，其長(zhǎng)度通常為1-5個(gè)核苷酸。當(dāng)通過如轉(zhuǎn)染、電穿孔或微注射的方法轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或通過多種基于質(zhì)粒的方法的任何一種在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，siRNA顯示出下調(diào)基因表達(dá)。在如Tuschl，Τ.，Nat. Biotechnol.，20 :446-448, May 2002 中綜述了用 siRNA 進(jìn)行的 RNA 干擾，也參見 Yu， J.等，Proc. Natl. Acad. Sci.，99 (9) ,6047-6052(2002) ；Sui, G.等，Proc. Nail. Acad. Sci. ,99(8) ,5515-5520 (2002) ；Paddison, P.等，Genes and Dev. , 16,948-958 (2002)； Brummelkamp, Τ.等，Science，296，550—553 (2002) ；Miyagashi, Μ.禾口 Taira， K. ， Nat. Biotech. ,20,497-500(2002) ；Paul, C.等，Nat. Biotech. ,20,505-508(2002) 事實(shí)上，已經(jīng)在包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物中實(shí)現(xiàn)了通過RNAi進(jìn)行的體內(nèi)特異性基因表達(dá)抑制。例如，Song等，Nature Medicine，9 :347-351 (2003)公開了將i^as siRNA化合物靜脈注射入患自身免疫性肝炎的實(shí)驗(yàn)室小鼠特異性地降低了小鼠肝細(xì)胞中 Fas mRNA水平和Fas蛋白質(zhì)的表達(dá)。也已證明其它幾種將siRNA遞送入動(dòng)物的方法是成功的。參見，如 McCaffery 等，Nature，418 :38-39(2002) ；Lewis 等，Nature Genetics, 32 107-108(2002)；和 Xia 等，Nature Biotech. ,20 :1006-1010(2002)
SiRNA可包含兩條單獨(dú)的核酸鏈或具有能形成發(fā)夾(莖環(huán))結(jié)構(gòu)的自身互補(bǔ)區(qū)的單鏈。結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度、錯(cuò)配數(shù)、環(huán)的大小、突出處的核苷酸特性等多種變化與有效的siRNA引發(fā)的基因沉默相關(guān)。不希望局限于任何理論，認(rèn)為多種不同前體的細(xì)胞內(nèi)加工(例如，通過 DICER)導(dǎo)致能有效介導(dǎo)基因沉默的siRNA的產(chǎn)生。通常應(yīng)該靶向外顯子而不是內(nèi)含子，并且還尤其需要選擇與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本3’部分中的區(qū)域互補(bǔ)的序列。通常優(yōu)選的是選擇包含約等摩爾比例的不同核苷酸的序列并且避免一段單殘基多個(gè)重復(fù)。因此siRNA可包含通常具有約19個(gè)核苷酸長(zhǎng)的雙鏈區(qū)域的RNA分子，所述RNA分子通常在每條鏈上具有1-2個(gè)核苷酸的3’突出，得到的總長(zhǎng)通常為約21至23個(gè)核苷酸。如本文所用，siRNA還包括可在體內(nèi)加工以產(chǎn)生這種分子的多種RNA結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)包括含有兩個(gè)互補(bǔ)元件的RNA鏈，所述互補(bǔ)元件彼此雜交形成莖、環(huán)或任選地形成突出(優(yōu)選3’ 突出)。通常，莖約19bp長(zhǎng)，環(huán)約1-20、優(yōu)選約4-10、更優(yōu)選約6-8個(gè)核苷酸長(zhǎng)和/或突出通常約1-20、并優(yōu)選約2-15個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，莖最小19個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并可多達(dá)約四個(gè)核苷酸長(zhǎng)。4個(gè)核苷酸或更大的環(huán)與更短的環(huán)相比更不易于產(chǎn)生空間束縛，因而被優(yōu)選。懸掛可包含5’磷酸和3’羥基。懸掛可包含多個(gè)U殘基(例如1至 5個(gè)U殘基)，但不必須。在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)參與突觸小泡循環(huán)的蛋白質(zhì)和基因序列信息設(shè)計(jì) siRNA。例如，可將siRNA設(shè)計(jì)為靶向編碼突觸前蛋白質(zhì)的基因，所述突觸前蛋白質(zhì)包括但不限于內(nèi)在小泡蛋白(例如突觸小泡蛋白2(SV2)、突觸素、突觸結(jié)合蛋白、小泡相關(guān)膜多肽 (VAMP)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、突觸循環(huán)蛋白、質(zhì)子泵)、外周小泡蛋白(例如， Rab、胱氨酸鏈蛋白(cystine string protein，CSP)、突觸蛋白)、突觸質(zhì)膜蛋白(如鈣通道、突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-25)、突觸融合蛋白)以及胞漿蛋白(如SNAP、n-Secl)、突觸蛋白(例如，突觸蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，發(fā)動(dòng)蛋白Ι、ΡΙΡ5Κ1γ和突觸小泡磷酸酶I)?？刹捎贸Ｒ?guī)RNA合成方法合成適合的siRNA。例如，它們可采用恰當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常用的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成。在如^man等，J. Am. Chem. Soc., 109 :7845-7854(1987)和 Scaringe 等，Nucleic Acids Res. ,18 :5433-5441 (1990)中公開了 RNA合成的多種可用方法。從供應(yīng)商(Ambion (Austin，Tex.，USA)、Dharmacon Research (Lafayette, Co Ιο. , USA)、Pierce Chemical(Rockford, 111. , USA)、 ChemGenes(Ashland, Mass. , USA)、Proligo(Hamburg,Germany)禾口 Cruachem(Glasgow,UK)) 可獲得定制siRNA合成服務(wù)。發(fā)明siRNA可全部由天然RNA核苷酸構(gòu)成，或可包含一個(gè)或更多個(gè)對(duì)以上反義分子提及的核苷酸類似物和/或修飾?？衫缤ㄟ^在一個(gè)或更多個(gè)游離鏈末端引入核苷酸類似物以減少降解(例如，核酸外切酶的降解)來穩(wěn)定siRNA結(jié)構(gòu)。或者，可通過編碼相關(guān)分子的DNA序列的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA分子。這種DNA序列可被整合入具有適合RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T7、T3或SP6)的多種載體中?？贵w
在一些實(shí)施方案中，可篩選作為潛在的突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的抗體。例如，可根據(jù)參與突觸小泡循環(huán)的蛋白質(zhì)和基因序列信息設(shè)計(jì)抗體。例如，可將抗體設(shè)計(jì)為靶向突觸前蛋白質(zhì)，其包括但不限于內(nèi)在小泡蛋白(例如突觸小泡蛋白2 (SV2)、突觸素、突觸結(jié)合蛋白、小泡相關(guān)膜多肽(VAMP)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、突觸循環(huán)蛋白、質(zhì)子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸鏈蛋白(cystine string protein，CSP)、突觸蛋白)、突觸質(zhì)膜蛋白(如鈣通道、25kDa突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-25)、突觸融合蛋白)以及胞漿蛋白 (如SNAP、n-kcl)、突觸蛋白(例如，突觸蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，發(fā)動(dòng)蛋白I、PIP5K1 γ和突觸小泡磷酸酶I)。還可將抗體設(shè)計(jì)為靶向鈣調(diào)磷酸酶、鈣調(diào)磷酸酶激活劑、抑制劑和/或底物?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知方法生成抗體。例如，在Harlow和Lane，Antibodies :A Laboratory Manual, (1988)中描述了抗體生成的方案。通常，抗體可在小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、駱駝、羊駝、鯊魚或其它適合的宿主中產(chǎn)生?；蛘?，抗體可在雞中制成，產(chǎn)生IgY分子 (khade等，(1996)ALTEX 13(5) :80-85)。在一些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的抗體是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物抗體。例如，在狒狒中產(chǎn)生治療有效抗體的一般技術(shù)可見于如Goldenberg等，國(guó)際專利公開 No. WO 91/11465(1991)和 Losman 等，Int. J. Cancer 46:310(1990)中。在一些實(shí)施方案中，可使用雜交瘤方法制備單克隆抗體(Milstein and Cuello, (1983)Nature 305(5934) :537-40)。在一些實(shí)施方案中，也可通過重組方法產(chǎn)生單克隆抗體(美國(guó)專利 No. 4，166，452，1979)。在一些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的抗體可包括人源化或人抗體。非人抗體的人源化形式為包含最短的源自非人Ig序列的嵌合Ig、Ig鏈或片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2 或其它抗體的抗原結(jié)合序列)。一般地，人源化抗體具有自非人來源引入的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸通常被稱為“輸入”殘基，其通常獲取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。通過用嚙齒類動(dòng)物的CDR或CDR序列替換對(duì)應(yīng)的人抗體序列來進(jìn)行人源化(Riechmarm等， Nature 332(6162) :323_7，1988 ;Verhoeyen 等，Science. 239(4847) :1534-6,1988) 這種“人源化”抗體為嵌合抗體(美國(guó)專利No. 4，816，567，1989)，其中基本上少于完整人可變區(qū)結(jié)構(gòu)域被對(duì)應(yīng)的非人物種的序列所替換。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體通常是一些 CDR殘基以及可能一些FR殘基被嚙齒類動(dòng)物抗體類似位點(diǎn)的殘基替換的人抗體。人源化抗體包括人Ig(受體抗體)，其中受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(如小鼠、大鼠或兔)(供體抗體)的CDR的殘基所替換。在一些情況下，對(duì)應(yīng)的非人殘基替換人Ig的Fv構(gòu)架殘基。人源化抗體可包含不存在于受體抗體或輸入的⑶R或構(gòu)架序列的殘基。一般地，人源化抗體包含基本上至少一個(gè)、通常兩個(gè)全部的可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中大部分(如果不是全部的)CDR區(qū)域?qū)?yīng)非人Ig，大部分(如果不是全部的)FR區(qū)域是人Ig共有序列的。人源化抗體還任選地包含至少一部分Ig恒定區(qū) (Fe)，通常是人 Ig 的恒定區(qū)(Riechmann 等，Nature 332(6162) :323-7，1988 ；Verhoeyen 等，Science. 239 (4847) 1534-6，1988)。人抗體還可采用多種技術(shù)生成，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom等，Mol Immunol. (1991)28(9) :1027-37 ；Marks 等，J Mol Biol. (1991)222(3) :581-97)和人單克隆抗體的制備(Reisfeld 和 Sell，1985，Cancer Surv. 4(1) :271-90)。類似地，可采用將人Ig基因引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來合成人抗體，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中內(nèi)源Ig基因部分或全部失活。在攻擊后，觀察到人抗體的生成(其在所有方面都非常類似于在人體中所見的)，包括基因重排、組裝和抗體庫(Fistiwild等，High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice, NatBiotechnol. 1996July ； 14 (7) :845-51 ；Lonberg Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 1994April 28 ； 368 (6474);Lonberg 禾口 Huszar，Human antibodies from transgenic mice, Int.
Rev. Immunol. 1995 ； 13(1) :65-93 ；Marks 等，By-passing immunization :building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology (NY)· 1992 July ； 10(7) :779-83)。

其它

在一些實(shí)施方案中，可采用本發(fā)明測(cè)定篩選天然產(chǎn)物文庫。在一些實(shí)施方案中，可在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激(例如，電刺激)之前在選定的時(shí)間內(nèi)將神經(jīng)元細(xì)胞與測(cè)試物一起孵育。在多個(gè)實(shí)施方案中，將選定量的測(cè)試物加入含有神經(jīng)元細(xì)胞的孔。在多個(gè)實(shí)施方案中，將不同量和/或類型的測(cè)試物加入含有神經(jīng)元細(xì)胞的不同孔中。在多個(gè)實(shí)施方案中，將基本相同量和/或類型的測(cè)試物加入含有神經(jīng)元細(xì)胞的不同孔中。在多個(gè)實(shí)施方案中，可將測(cè)試物的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照比較以確定是否任何試劑成員調(diào)節(jié)一種或更多種突觸小泡循環(huán)活性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是在除未被測(cè)試物處理外其它都相同的神經(jīng)元細(xì)胞中檢測(cè)到的相同的一種或更多種突觸小泡循環(huán)活性。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞在不被測(cè)試物處理時(shí)可顯示正常的突觸小泡循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，未處理的神經(jīng)元細(xì)胞可顯示缺陷的突觸小泡循環(huán)(例如，從患有神經(jīng)疾病的動(dòng)物或人中分離的神經(jīng)元細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，如果與未處理的對(duì)照相比，測(cè)試物引起突觸小泡循環(huán)的增強(qiáng)，則認(rèn)為所述測(cè)試物為潛在的突觸小泡循環(huán)增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，如果與未處理的對(duì)照相比，測(cè)試物引起突觸小泡循環(huán)的抑制，則認(rèn)為所述測(cè)試物為潛在的突觸小泡循環(huán)抑制劑。在一些實(shí)施方案中，可采用本發(fā)明的方法測(cè)量突觸小泡循環(huán)的特定活性。特別地，可測(cè)量突觸小泡循環(huán)的多階段(例如，胞吐、胞吞、再循環(huán)等)的活性。在一些實(shí)施方案中，可采用以下參數(shù)測(cè)量胞吐作用，所述參數(shù)包括但不限于釋放概率、釋放系列、?？康男∨?、集合大小。在一些實(shí)施方案中，胞吞作用可采用指示如未飽和、飽和或穩(wěn)定狀態(tài)的參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。如本文所用，未飽和表示小泡內(nèi)化位點(diǎn)不限制的胞吞作用。飽和表示小泡內(nèi)化位點(diǎn)被限制的胞吞作用。在一些實(shí)施方案中，可通過檢測(cè)相對(duì)于第一次應(yīng)答在休息階段(如1分鐘)后再刺激的應(yīng)答大小來檢測(cè)再循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)高頻率引發(fā)。如本文所用，術(shù)語“高頻率引發(fā)”通常表示在IOHz或高于其的頻率的引發(fā)。通常，導(dǎo)致突觸小泡釋放的持續(xù)高頻率引發(fā)的時(shí)間與引發(fā)頻率呈反比。在一些條件下，在高頻率引發(fā)中可發(fā)生突觸疲勞。例如，認(rèn)為預(yù)備好可釋放突觸小泡集合是有限的(例如，10個(gè)小泡)。因此，在IOHz 或高于其的引發(fā)頻率下，當(dāng)引發(fā)在預(yù)備好可釋放的集合被消耗后(例如，超過多于10個(gè)動(dòng)作電位)持續(xù)，則會(huì)發(fā)生突觸疲勞?？刹捎秒娚韺W(xué)(例如，細(xì)胞外場(chǎng)記錄(extracellular field recording))或成像分析(例如，采用 synaptopHluorin)。可采用本文所述的適合的突觸小泡循環(huán)測(cè)定進(jìn)一步檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑以確定調(diào)節(jié)作用和/或預(yù)測(cè)效率。還可采用其它測(cè)定檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑以確定它們對(duì)突觸小泡循環(huán)或神經(jīng)傳遞信號(hào)通路的作用。在一些實(shí)施方案中，可采用磷酸簽名(phosphosignature)測(cè)定檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑以確定它們調(diào)節(jié)鈣調(diào)磷酸酶和/或去磷蛋白或其它突觸蛋白磷酸化
57狀態(tài)的能力。在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)一步檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑治療神經(jīng)或精神疾病的能力，特別是與突觸小泡循環(huán)功能異常相關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方案中，可在動(dòng)物模型中檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑。例如，可在神經(jīng)或精神疾病的動(dòng)物模型(例如，小鼠精神分裂癥模型)中檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，可在與突觸小泡循環(huán)相關(guān)(例如，突觸疲勞、突觸疲勞的恢復(fù))的電生理測(cè)定中檢測(cè)可能的調(diào)節(jié)劑。按照本發(fā)明鑒定的突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑可參與調(diào)節(jié)多種直接或間接參與突觸小泡循環(huán)的步驟、過程和/或生物通路。例如，鈣調(diào)磷酸酶的激活(例如，通過直接激活或抑制鈣調(diào)磷酸酶與抑制劑(即DSCRl或cabin)的相互作用或者抑制抑制酶)可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)和胞吞作用。抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶5 (CDI^)可增強(qiáng)突觸小泡循環(huán)。抑制雙特異酪氨酸磷酸化禾口調(diào)節(jié)激酶 IA (dual-specificity tyrosine-phosphorylated and regulated kinase 1A，DyrklA)或蛋白激酶C(I3KC)也可增強(qiáng)突觸小泡胞吞作用。抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal-regulated kinase,ERK)(例如ERK1)可增強(qiáng)突觸小泡胞吞作用和 /或運(yùn)動(dòng)。調(diào)節(jié)Ca++通道(包括調(diào)節(jié)Ca++外流蛋白(effluxer)或其它去除或螯合Ca++的蛋白質(zhì))可調(diào)節(jié)該過程的任何部分。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR) (包括毒蕈堿型乙酰膽堿受體)調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的所有步驟；因此，這些受體的激動(dòng)劑和拮抗劑可被鑒定為突觸小泡循環(huán)多個(gè)方面的調(diào)節(jié)劑。在表1中顯示了可被調(diào)節(jié)劑影響的突觸小泡循環(huán)的示例性方面和鑒定這些調(diào)節(jié)劑的測(cè)定參數(shù)。治療性應(yīng)用本發(fā)明涵蓋了以下認(rèn)識(shí)對(duì)調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的物質(zhì)可用于治療一些疾病(例如，與突觸小泡功能失常相關(guān)的疾病)，等等。在一些實(shí)施方案中，本文鑒定的突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑可用于治療(例如，緩解、改善、減輕、抑制、預(yù)防、延緩發(fā)作、降低嚴(yán)重性和/或降低發(fā)病)與突觸小泡循環(huán)功能失常相關(guān)的疾病、障礙和/或病癥的一種或更多種癥狀或特征。例如，本發(fā)明涵蓋以下認(rèn)識(shí)突觸小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑可用于治療精神障礙、疾病或病癥(包括但不限于精神分裂癥、雙相型障礙、癲癇)；神經(jīng)疾病、障礙或病癥(包括但不限于阿爾茲海默氏病、酒精性Korsakoff疾病(KS)、多發(fā)性硬化和帕金森氏病)和/或其它疾病、障礙或病癥(包括但不限于唐氏綜合征、威廉斯氏綜合征、特定性語言障礙和注意力缺乏多動(dòng)障礙(ADHD))。一個(gè)非限制性實(shí)例是，抑制突觸小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑(例如，在抑制興奮型突觸傳遞或增強(qiáng)突觸小泡循環(huán)的抑制)可用于治療癲癇。調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng)或穩(wěn)定)5-羥色胺能突觸小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑可用于治療抑郁。調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng)或穩(wěn)定)多巴胺能小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑可用于治療帕金森氏病。調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng))膽堿能小泡循環(huán)的調(diào)節(jié)劑可用于治療阿爾茲海默病。調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng)或穩(wěn)定)谷氨酰胺能或非谷氨酰胺能的小泡循環(huán)可用于治療焦慮癥?？墒褂萌魏斡行е委熂膊　⒄系K和/或病癥(涉及突觸小泡循環(huán)功能失常的疾病、障礙和/或病癥)的量將突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物施用給對(duì)象。任何特定患者或生物體的具體治療有效劑量水平取決于多種因素，所述因素包括醫(yī)療領(lǐng)域公知的待治療的疾病和疾病的嚴(yán)重性；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用時(shí)間、施用途徑以及所采用的具體化合物的排泄率；治療的持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體化合物組合或同時(shí)使用的藥物等因素。
在一些實(shí)施方案中，可一天一次或多次以足以遞送約0.001mg/kg至約IOOmg/ kg、約 0. 01mg/kg 至約 50mg/kg、約 0. lmg/kg 至約 40mg/kg、約 0. 5mg/kg 至約 30mg/kg、約 0. 0lmg/kg 至約 10mg/kg、約 0. lmg/kg 至約 10mg/kg 或約 lmg/kg 至約 25mg/kg (每天每對(duì)象體重)的劑量水平施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其組合物以獲得所需的治療作用。所需的劑量可以一天三次、一天兩次、一天一次、每?jī)商煲淮?、每三天一次、每周一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次或每四周一次遞送。在一些實(shí)施方案中，所需的劑量可采用多次施用遞送 (例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)。藥物組合物本發(fā)明還提供含有一種或更多種突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑以及一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。這種藥物組合物可任選地包含一種或更多種另外的治療活性物質(zhì)。盡管本文提供的藥物組合物的描述主要針對(duì)適于對(duì)人倫理性施用的藥物組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這些組合物普遍性適于施用給所有類型的動(dòng)物。為使組合物適于施用給多種動(dòng)物而對(duì)適于施用給人的藥物組合物進(jìn)行的改變已經(jīng)很成熟，并且普通的獸藥理學(xué)技術(shù)人員只需要通過普通試驗(yàn)(如果需要)來設(shè)計(jì)和/或?qū)嵤┻@種改變。所包括的施用藥物組合物的對(duì)象包括但不限于人和/或其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物；哺乳動(dòng)物(包括市售哺乳動(dòng)物如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠)；和/或鳥類(包括市售鳥類如雞、鴨、鵝和/或火雞)。本文所述的藥物組合物的制備可通過任何已知或在此之后在藥理領(lǐng)域開發(fā)的方法制備。一般地，這種制備方法包括以下步驟，將活性成分與賦形劑和/或一種或更多種附加成分相結(jié)合，然后，如果必要和/或需要，將產(chǎn)物成形和/或包裝成所需的單或多劑量單位。本發(fā)明的藥物組合物可以單個(gè)單位劑量和/或多個(gè)單個(gè)單位劑量被成批制備、包裝和/或銷售。如本文所用，“單位劑量”是包含預(yù)定活性成分量的藥物組合物的分離的量。活性成分的量通常等于將施用給對(duì)象的活性成分的劑量和/或這種劑量的方便化部分(例如，這種劑量的二分之一或三分之一)。本發(fā)明藥物組合物中活性成分、可藥用賦形劑和/或任何額外成分的相關(guān)量根據(jù)待治療對(duì)象的特性、體型和/或狀態(tài)而異，并且還取決于待施用組合物的施用途徑。例如，所述組合物可包含0. 至100% (w/w)的活性成分。藥物制劑可另外地包含可藥用賦形劑，本文所用的藥物賦形劑包括適于所需的具體劑型的任何和所有溶劑、分散基質(zhì)、稀釋液或其它液體載體、助分散劑或助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑等。Remington的The Science and Practice of Pharmacy,21 版，A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 ；其通過引用并入本文)公開了用于制備藥物組合物的多種賦形劑以及制備它們的已知技術(shù)。除了迄今為止任何與物質(zhì)或其衍生物不相容的傳統(tǒng)賦形劑基質(zhì) (如通過產(chǎn)生任何不需要的生物作用或以其他有害方式與任何其它藥物組合物成分相互作用)，其應(yīng)用包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可藥用賦形劑的純度至少為95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%。在一些實(shí)施方案中，賦形劑被批準(zhǔn)用于人或獸用。在一些實(shí)施方案中，賦形劑被美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，賦形劑為藥用級(jí)別。在一些實(shí)施方案中，賦形劑符合美國(guó)藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國(guó)藥典和/或國(guó)際藥典的標(biāo)準(zhǔn)。用于藥物組合物制造的可藥用賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑、分散和/或?；瘎?、表面活性劑和/或乳化劑、崩解劑、結(jié)合劑、防腐劑、緩沖劑、潤(rùn)滑劑和/或油。這些賦形劑可被任選地包含在藥物制劑中。根據(jù)制備者的判斷，如可可油和栓劑蠟的賦形劑、著色劑、包被劑、甜味劑、調(diào)味劑和/或香味劑可存在于組合物中。在如 Remington 的 The Science and Practice of Pharmacy, 21 IK, A. R. Gennaro, Lippincott, ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD，2005 (通過引用并入本文)中有制備和 / 或制造藥劑中的一般考慮事項(xiàng)。施用可通過任何途徑施用本發(fā)明突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，可通過多種途徑的一種或更多種途經(jīng)施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物，所述途徑包括經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、腦室內(nèi)、透皮、皮內(nèi)、經(jīng)直腸、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、外用(例如，通過粉末、軟膏、乳膏、凝膠、洗液和/或滴液)、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、口含、腸內(nèi)、經(jīng)玻璃體、瘤內(nèi)、舌下；通過氣管內(nèi)滴注、支氣管滴注和/或吸入；作為口腔噴劑、鼻噴劑和/或氣溶膠，和/或通過門靜脈導(dǎo)管。在一些實(shí)施方案中，可通過全身靜脈內(nèi)注射施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物。在一些特定實(shí)施方案中，可靜脈內(nèi)和/或經(jīng)口施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物。在一些特定實(shí)施方案中，可采用允許突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑穿過血腦屏障的方式施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物。有許多穿過血腦屏障的策略，包括但不限于增加分子的疏水特性；將分子作為輟合物引入靶向血腦屏障受體的載體(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可腦內(nèi)(更優(yōu)選地腦室內(nèi))施用分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可滲透性破壞血腦屏障以有效地將活性劑遞送到腦(Neuwelt 等，1995，Proc. Natl. Acad. ki. USA “Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption, ”O(jiān)ct. 10，1995)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可在靶向血腦屏障的脂質(zhì)體中施用藥劑。已知脂質(zhì)體中藥劑的施用(參見Langer，1990，Science 249 1527-1533 ;Treat等， Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(編)，Liss，New York，353-365 頁(1989) ；Lopez—Berestein，同上，317—327 頁；一般性地參見上文)。所有這些方法均在本發(fā)明的預(yù)想中。在特定的實(shí)施方案中，可通過門靜脈導(dǎo)管施用突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物。然而，本發(fā)明涵蓋通過任何恰當(dāng)途徑的突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物的遞送，所述途徑考慮到藥物遞送技術(shù)的可能進(jìn)展。一般地，最適合的施用途徑取決于多種因素，包括突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的性質(zhì) (例如，它們?cè)谖改c道、血流等環(huán)境中的穩(wěn)定性)、患者的情況(例如，患者是否能夠耐受特定的施用途徑)等。本發(fā)明涵蓋通過任何恰當(dāng)途徑的藥物組合物的遞送，所述途徑考慮到藥物遞送技術(shù)的可能進(jìn)展。試劑盒本發(fā)明提供方便地和/或有效地實(shí)施本發(fā)明方法的多種試劑盒。通常試劑盒會(huì)包含足夠量和/或數(shù)量的組分以使使用者對(duì)對(duì)象進(jìn)行多個(gè)處理和/或?qū)嵤┒鄠€(gè)試驗(yàn)。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或更多種(i)跟蹤突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物； (ii)適于培養(yǎng)多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的多個(gè)孔；(iii)刺激系統(tǒng)；(iv)檢測(cè)系統(tǒng)；以及(ν) —種或更多種測(cè)試物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可任選地包含一種或更多種(vi)已知調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的陽性對(duì)照物質(zhì)；(vii)已知不調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的陰性對(duì)照；以及(viii) 使用說明。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含如本文所述采用突觸小泡循環(huán)測(cè)定鑒定的一種或更多種突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，這種試劑盒用于治療、診斷和/或預(yù)防患有和/或?qū)膊　⒉“Y和/或障礙(例如，與突觸小泡循環(huán)功能異常相關(guān))易感的對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，這種試劑盒包含下列一種或更多種(i)至少一種突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑或其藥物組合物；(ii)用于施用給對(duì)象的注射器、針、敷貼器等；以及(iii)使用說明。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含不同報(bào)告物的集合；細(xì)胞類型；測(cè)試物質(zhì)；突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑和/或其藥物組合物等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包含另外的組分或試劑。例如，試劑盒可包含細(xì)胞培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)基、緩沖液等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包含使用說明。例如，說明可指導(dǎo)使用者如何進(jìn)行鑒定突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的篩選。說明可指導(dǎo)使用者制備包含調(diào)節(jié)劑的藥物組合物的正確步驟和/或向?qū)ο笫┯盟幬锝M合物的正確步驟。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含含有突觸小泡循環(huán)調(diào)節(jié)劑的藥物組合物的多個(gè)單位劑量?？商峁﹤渫洠缫詳?shù)字、字母和/或其它標(biāo)記和/或帶有日歷插頁，標(biāo)示可施用劑量的治療時(shí)間表中的天/次數(shù)。可包含與藥物組合物劑量類似或不同形式的安慰劑劑量和/或膳食鈣添加物以提供每天攝取劑量的試劑盒。試劑盒可包含一個(gè)或更多個(gè)容器或包裝物以使單獨(dú)的組分或試劑分別放置。試劑盒可包含用于開啟為銷售目的相對(duì)密封的包裝物的工具(例如，封裝有說明、包裝材料(如泡沫聚苯乙烯等)的塑料盒)。實(shí)施例實(shí)施例1 :pHluorin報(bào)告物在本實(shí)施例中，采用稱為pHluorin的pH敏感性GFP研究突觸小泡循環(huán)，pHluorin 靶向突觸小泡蛋白質(zhì)的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域。以這樣的方式使用的小泡蛋白質(zhì)包括VAMP、突觸結(jié)合蛋白、vGlutl和突觸素。當(dāng)突觸靜息時(shí)，這些蛋白質(zhì)將pHluorin放入突觸小泡腔，腔的內(nèi)部 PH維持在5. 5。在該酸性pH下，熒光淬滅。當(dāng)受到刺激時(shí)，突觸小泡被胞吐并釋放質(zhì)子，導(dǎo)致 pH升高，pHluorin發(fā)出熒光。而后，小泡重新內(nèi)化并酸化，熒光再次淬滅。以該方式，在單個(gè)突觸檢測(cè)的熒光變化被用來跟蹤突觸小泡循環(huán)。在本實(shí)施例中，采用synaptopHluorin(小泡蛋白質(zhì)VAMP2與融合了 vGlutl的pH敏感GFP的融合)。通過在孔中引入以高濃度鋪板的高百分比神經(jīng)元細(xì)胞，采用synaptopHluorin測(cè)量整個(gè)孔細(xì)胞群水平的突觸小泡循環(huán)。一種將synaptopHluorin引入神經(jīng)元的方式是通過病毒感染。采用synaptopHluorin的病毒遞送來確認(rèn)在細(xì)胞群水平檢測(cè)突觸小泡循環(huán)的能力。采用腺相關(guān)病毒(Μ0Ι = 1000)在體外將synaptopHluorin遞送入生長(zhǎng)11天的鋪在96 孔透明塑料底平板(Nunc)的大鼠胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元中。在體外的21天時(shí)，Axiovert Zl倒置落射熒光顯微鏡采用不足以分辨單個(gè)突觸的低放大倍數(shù)光學(xué)設(shè)備(10X，0. 45NA物鏡)對(duì)神經(jīng)元成像。在存在或不存在外部Ca++的情況下用離子霉素處理神經(jīng)元，離子霉素是引發(fā)突觸小泡胞吐作用并導(dǎo)致synaptopHluorin發(fā)出熒光的鈣離子載體(calcium ionophore)。在外部Ca++的存在下用離子霉素處理培養(yǎng)物顯示synaptopHluorin信號(hào)升高約20%，而無外部Ca++時(shí)培養(yǎng)物的應(yīng)答顯著減弱(約3%)。因此，本實(shí)施例證明可在細(xì)胞群水平用低放大倍數(shù)光學(xué)設(shè)備采用synaptopHluorin作為報(bào)告物測(cè)量突觸小泡循環(huán)。作為替代地或另外地，通過生成在腦中表達(dá)報(bào)告物(例如，突觸小泡蛋白-pHlurin)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)將基于pHlurin的突觸小泡循環(huán)報(bào)告物引入以大百分比培養(yǎng)的神經(jīng)元中?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。實(shí)施例2 :pH敏感性染料報(bào)告物用于測(cè)量突觸小泡循環(huán)的第二種示例性報(bào)告物利用小泡內(nèi)酸性pH和酸感受染料?？少?gòu)得當(dāng)PH從細(xì)胞外的7. 4升到泡內(nèi)的5. 5時(shí)熒光增強(qiáng)的胞吞報(bào)告物。這些染料包括CypHer5E(GE Healthcare)和pHrodo Qnvitrogen)。這些染料通過在神經(jīng)元被刺激時(shí)進(jìn)入突觸小泡作為突觸小泡循環(huán)的報(bào)告物發(fā)揮作用。當(dāng)小泡被胞吞并重新酸化時(shí)，報(bào)告物發(fā)出熒光。以該方式，通過熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)測(cè)量胞吞作用，隨后的胞吐作用通過熒光強(qiáng)度的降低測(cè)量。采用任何方法將pH敏感性染料遞送到突觸小泡。將pH敏感性染料直接綴合到識(shí)別突觸小泡蛋白質(zhì)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域的抗體(例如，識(shí)別突觸結(jié)合蛋白腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體；突觸系統(tǒng)(Synaptic Systems) )0作為替換地或另外地，將染料與膜插入物質(zhì)相綴合 (例如，苯乙烯染料，如FM1-43)。在單獨(dú)使用pH敏感性染料時(shí)，當(dāng)刺激神經(jīng)元，則突觸小泡胞吐，使染料進(jìn)入突觸小泡。而后突觸小泡被胞吞，通常通過幾次清洗步驟洗掉殘留的表面染料。通過將PH敏感性染料與例如FM1-43染料的插入組分相綴合，產(chǎn)生無需清洗步驟的跟蹤突觸小泡循環(huán)的突觸小泡循環(huán)報(bào)告物。為了使用染料，通常將細(xì)胞在測(cè)定緩沖液中孵育。將pH敏感性染料(例如與抗體、膜插入物等綴合的)加入測(cè)定緩沖液。用一系列的電壓刺激細(xì)胞，導(dǎo)致突觸小泡胞吐作用并使染料進(jìn)入突觸小泡。當(dāng)突觸小泡胞吞時(shí)，在重新形成的小泡中跟蹤染料。當(dāng)突觸小泡重新酸化時(shí)，當(dāng)由恰當(dāng)?shù)墓獠ㄩL(zhǎng)刺激時(shí)，染料發(fā)出熒光。實(shí)施例3 成像系統(tǒng)在感染有表達(dá)synaptopHluorin的腺相關(guān)病毒的原代神經(jīng)元中采用具有10X， 0.45NA物鏡的kiss Axiovert Zl以全孔水平對(duì)突觸小泡循環(huán)成像(見圖13)。此外，采用該顯微鏡，平板的孔是開放可到達(dá)的，以操作刺激系統(tǒng)。所述刺激系統(tǒng)用于檢測(cè)單個(gè)化合物對(duì)突觸小泡循環(huán)的作用。采用落射顯微鏡對(duì)突觸小泡循環(huán)成像的過程通常需要2分鐘，因此，在此配置下通常需要約2-3小時(shí)對(duì)96孔板的所有孔成像。所使用的替代性成像系統(tǒng)為市售的讀板器plate: =Vision (Perkin Elmer)。該讀板器能進(jìn)行基于動(dòng)態(tài)的熒光分析，可從板上方接近板以使刺激系統(tǒng)整合，具有高收集效率的光學(xué)設(shè)備，并具有為平行分析96孔板設(shè)計(jì)的特有光學(xué)設(shè)備。評(píng)價(jià)了 plate: :vision讀板器平行記錄多個(gè)孔中的突觸小泡循環(huán)的能力。采用 synaptopHluorin腺相關(guān)病毒在體外感染生長(zhǎng)12天的鋪在96孔板的原代大鼠神經(jīng)培養(yǎng)物。用有或無外部Ca++的Tyrode溶液替換培養(yǎng)基。在plate: :vision讀板器上測(cè)量整板的熒光基線記錄。然后，向所有孔加入離子霉素，測(cè)量1分鐘內(nèi)每2秒鐘的熒光變化。結(jié)果顯示在Ca++的存在下用離子霉素刺激的孔熒光升高約20%，而Ca++的缺少極大地消除了熒光增加(< 5% )。這些變化與在kiss倒置落射顯微鏡上進(jìn)行相似試驗(yàn)時(shí)觀察到的變化相似。這些數(shù)據(jù)表明plate: :vision讀板器平行地測(cè)量96孔板多孔中的突觸小泡循環(huán)(圖14)。實(shí)施例4 電刺激系統(tǒng)為了將突觸小泡循環(huán)可視化，刺激神經(jīng)元以誘導(dǎo)突觸小泡的胞吐作用和胞吞作用。通過施加電場(chǎng)電位刺激培養(yǎng)物中的原代神經(jīng)元，其部分地描述于Ryan和Smith(1995， Neuron, 14 :983 ；通過引用并入本文)和 Ryan 等(1996，Proc. Natl. Acad. Sci. ,93 :5567 ；通過引用并入本文)。在這些實(shí)施例中，以96孔形式將場(chǎng)電位施加到原代神經(jīng)元上。96孔的電刺激器為定制的并用于在包含神經(jīng)元細(xì)胞的孔中產(chǎn)生隨時(shí)間變化的電場(chǎng)。在檢測(cè)設(shè)備上檢測(cè)電極設(shè)計(jì)觸發(fā)突觸小泡循環(huán)的能力，所述檢測(cè)系統(tǒng)為上述kiss Axiovert Zl倒置落射熒光顯微鏡或plate: ivision讀板器。定制開發(fā)的96孔電刺激器在本實(shí)施例中，采用定制的電極對(duì)刺激突觸小泡循環(huán)。定制電極對(duì)具有外直徑為約6mm的外部鉬環(huán)電極，其適合裝入96孔板的孔中。在孔中央放置Imm直徑的金線(圖 6C)。中央金線作為陰極，外部鉬環(huán)作為陽極，它們被塑料裝置固定。將電極放置入96孔板的孔中并與刺激分離器連接，所述刺激分離器與脈沖發(fā)生器連接。為了平行刺激96個(gè)孔，將96個(gè)這樣的電極對(duì)連接形成8x12的陣列。多孔板電穿孔系統(tǒng)的定制改造CellAxessHT (從 Cellectricon AB，Gothenburg，Sweden 購(gòu)得)為設(shè)計(jì)用于向 384 孔板中的細(xì)胞遞送siRNA的高通量電穿孔器。其具有96孔電穿孔端部，每個(gè)電極對(duì)設(shè)計(jì)為裝備入384孔板的孔中。為了在本實(shí)施例中作為突觸小泡循環(huán)測(cè)定的刺激組件，對(duì)該系統(tǒng)的電極進(jìn)行改造和/或優(yōu)化以將96孔板孔的電場(chǎng)電位覆蓋最大化。實(shí)施例5 定制的Cellectricon CX3電極系統(tǒng)在本實(shí)施例中，用改造的市售電穿孔系統(tǒng)證明動(dòng)作電位引發(fā)的刺激。為進(jìn)行本試驗(yàn)從Cellectricon AB購(gòu)得了定制改造的CellAxess CX3電穿孔系統(tǒng)。該系統(tǒng)提供了三對(duì)電極，其能基本上同時(shí)地對(duì)96孔板3個(gè)孔中三個(gè)獨(dú)立的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行電刺激。儀器的電極被改造為在電極激發(fā)區(qū)中提供基本均勻的電場(chǎng)和/或電流密度。此外，用于安裝電極的塑料組件被改造為包含低熒光材料，這使得數(shù)據(jù)獲取時(shí)的背景熒光最小化。測(cè)試定制的CX3在培養(yǎng)于96孔板的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)動(dòng)作電位的能力。對(duì)于本實(shí)施例，向神經(jīng)元細(xì)胞中加入Flu0-4Ca++指示劑并用CX3系統(tǒng)刺激。以20Hz進(jìn)行10秒鐘的電刺激，同時(shí)用具有10X，0. 3數(shù)值孔徑物鏡Wkiss Axiovert Zl獲取隨時(shí)間變化圖像。刺激電壓在約2伏特至約100伏特變化。一些實(shí)驗(yàn)條件在圖16A中顯示。較低的線表示用 Axiovert Zl系統(tǒng)對(duì)包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的孔區(qū)域的成像持續(xù)時(shí)間。成像階段為約1分鐘。方框表示激發(fā)階段。當(dāng)電刺激以IOV進(jìn)行時(shí)，在獲得的神經(jīng)元細(xì)胞圖像中觀察到由于電場(chǎng)刺激Ca++流入的大量增加。圖16B顯示了 Ca++流入的增加。在t = O秒獲取的圖像表明在施加電刺激之前神經(jīng)元細(xì)胞的熒光放射基線。在t= 15秒獲取的圖像顯示在激發(fā)階段結(jié)束時(shí)熒光發(fā)射的增加。該增加的熒光發(fā)射是由于神經(jīng)元中Ca++流入的增加并指示了動(dòng)作電位的觸發(fā)。然后在一定范圍的電壓值內(nèi)進(jìn)行幾個(gè)系列的電刺激以研究含有神經(jīng)元細(xì)胞的孔中熒光的動(dòng)態(tài)表現(xiàn)。在圖16C中將作為時(shí)間的函數(shù)的不同激發(fā)電壓下記錄的相對(duì)Fluo-4 信號(hào)痕跡作圖。結(jié)果顯示大范圍激發(fā)電壓(約5伏特至約25伏特之間)的刺激引發(fā)強(qiáng)Ca++ 流入，隨后在電刺激結(jié)束后回歸到基線。在更高的電壓下(高于約50伏特)，Ca++信號(hào)不回歸基線，這指示這些高電壓的毒性。在另外的電刺激神經(jīng)元細(xì)胞的生物動(dòng)態(tài)測(cè)試中，向幾個(gè)孔系統(tǒng)中加入TTX，而后將所述孔系統(tǒng)進(jìn)行與圖16C所報(bào)告的相同的電刺激。圖16D顯示了該測(cè)試的結(jié)果。TTX(電壓門控鈉離子通道阻斷劑)的加入阻斷了神經(jīng)元對(duì)低電壓的應(yīng)答，這表明這些頻率處的Ca++ 流是由于CX3電極刺激所產(chǎn)生的動(dòng)作電位。檢測(cè)定制的CX3電極系統(tǒng)在96孔板的神經(jīng)元中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的能力。用表達(dá)synaptopHluorin的腺相關(guān)病毒感染神經(jīng)元。用CX3電極系統(tǒng)以約30Hz和約10伏特刺激細(xì)胞，同時(shí)用具有40x、0. 6數(shù)值孔徑的空氣物鏡Wkiss Axiovert Zl獲取隨時(shí)間變化圖像。一些實(shí)驗(yàn)條件在圖17A中報(bào)告。成像階段為約120秒，電刺激階段為約10秒。如在圖17B中所示，對(duì)于單個(gè)突觸觀察到熒光增加而后回歸到基線。在電刺激階段的大約結(jié)束時(shí)熒光峰值產(chǎn)生，其后熒光信號(hào)返回至約基線。圖17C顯示了圖17B所示的突觸的電密度測(cè)量，并顯示了所述突觸的熒光動(dòng)態(tài)表現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)表明CX3電極可在96孔板的神經(jīng)突觸中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)。實(shí)施例6 技術(shù)整合所選的刺激和檢測(cè)系統(tǒng)可整合入單個(gè)突觸小泡篩選系統(tǒng)。例如，已經(jīng)開發(fā)了平行檢測(cè)96孔板中突觸小泡循環(huán)的系統(tǒng)。可在體外第12天用表達(dá)突觸素-pHlurin的腺相關(guān)病毒感染96孔板中的原代神經(jīng)元。在體外第21天，用測(cè)定緩沖液替換培養(yǎng)基，并將電極放入孔中。以lOV/lOHz對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞施加隨時(shí)間變化的電場(chǎng)30秒。在這段時(shí)間中，由檢測(cè)裝置記錄熒光(如，由synaptopHluorin產(chǎn)生的)。在本具體實(shí)施例中，我們證明plate: vision讀板器、定制的Cellectricon CX3 電極和突觸素-pHlurin報(bào)告物可被成功整合。在7DIV用突觸小泡蛋白-pHlurin AAV (Μ0Ι 2000)感染96孔板中的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元。在30DIV，將培養(yǎng)物裝載入plate: =Vision 讀板器，將定制的Cellectricon CX3電極放入這些孔的兩個(gè)中。以2秒/圖像進(jìn)行熒光動(dòng)態(tài)讀數(shù)20分鐘，用30Hz、20V的脈沖系列刺激神經(jīng)元10秒。以5分鐘間隔施加該刺激3次 (紅箭頭)。圖18顯示了這些孔的結(jié)果。將熒光的變化(dF)針對(duì)每個(gè)孔中的峰值熒光讀數(shù)進(jìn)行歸一化。這些結(jié)果顯示當(dāng)神經(jīng)元被定制的Cellectricon電極刺激時(shí)，plate vision 讀板器可使用突觸素-pHlurin報(bào)告物測(cè)量突觸小泡循環(huán)。我們還證明該系統(tǒng)可成功地檢測(cè)突觸素-pHlurin對(duì)不同數(shù)量的經(jīng)刺激動(dòng)作電位的應(yīng)答。如上所述在7DIV用突觸小泡蛋白-pHlurin AAV(Μ0Ι 2000)感染96孔板中的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元。在30DIV，將培養(yǎng)物裝載入plate: vision讀板器，將定制的 Cellectricon CX3電極放入這些孔的兩個(gè)中。以2秒/圖像進(jìn)行熒光動(dòng)態(tài)讀數(shù)20分鐘，用30Hz、20V的脈沖系列對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行50 (箭頭1)、100 (箭頭2) ,200 (箭頭3)或300 (箭頭4)的刺激(見圖19)。將熒光的變化(dF)針對(duì)每孔中的熒光峰值讀數(shù)歸一化。這些數(shù)據(jù)表明Plate: vision讀板器的靈敏度以及其測(cè)量小量的動(dòng)作電位的能力。預(yù)計(jì)由于 plate: vision系統(tǒng)的高信噪比以及刺激系列中動(dòng)作電位應(yīng)答的總和，plate: :vision能夠檢測(cè)應(yīng)答于以IOHz或更低頻率遞送的50個(gè)或更少動(dòng)作電位的突觸素-pHlurin。
實(shí)施例7 測(cè)量突觸小泡循環(huán)的多個(gè)參數(shù)通過改變刺激方式測(cè)量突觸小泡循環(huán)的多種參數(shù)。表1提供了示例性參數(shù)和刺激范例。表 權(quán)利要求
1.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置成(i)用于放置在孔中，以及( )產(chǎn)生適于在所述孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置成檢測(cè)來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸前蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示所述神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。
2.權(quán)利要求1的平臺(tái)，其中多個(gè)所述孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞在10至1，000,000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。
4.權(quán)利要求2或3的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞在1000至4000個(gè)細(xì)胞/ mm2孔底面積的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞為原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元為大鼠原代神經(jīng)元。
7.權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、 GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)電極對(duì)中的所述電極為基本同心的圓柱體，并且其中所述同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料所分隔。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)設(shè)置為將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效地放置在所述多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述多個(gè)電極有效連接的電源。
12.權(quán)利要求11的平臺(tái)，其中所述電源設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定的電壓。
13.權(quán)利要求12的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍是IV至400V。
14.權(quán)利要求12的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍是5V至20V。
15.權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述電源和所述多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定的電壓脈沖。
16.權(quán)利要求15的平臺(tái)，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率施加多個(gè)預(yù)定的電壓脈沖。
17.權(quán)利要求16的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為0.2Hz至100Hz。
18.權(quán)利要求16或17的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。
19.權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間為最多2分鐘。
20.權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。
21.權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。
22.權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)脈沖的所述持續(xù)時(shí)間的范圍最多10毫秒。
23.權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)脈沖的所述持續(xù)時(shí)間的范圍為0.1毫秒至2毫秒。
24.權(quán)利要求16至23中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)脈沖所述起始之間的時(shí)間為0.1至5毫秒。
25.權(quán)利要求16至M中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述脈沖數(shù)的范圍為1至1000。
26.權(quán)利要求16至25中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。
27.權(quán)利要求16至沈中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器包含光學(xué)傳感器。
28.權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器都包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。
29.權(quán)利要求觀的平臺(tái)，其中所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0.2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。
30.權(quán)利要求28或四的平臺(tái)，其中所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0.4至1. 4。
31.權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。
32.權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。
33.權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與每個(gè)檢測(cè)器有效連接的電荷耦合器件照相機(jī)。
34.權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述多個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。
35.權(quán)利要求1至34中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與所述檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自所述檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。
36.權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。
37.權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。
38.權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。
39.權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、J L茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。
40.權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中多個(gè)所述神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)具有腔部分的突觸小泡蛋白，其中所述突觸小泡蛋白與報(bào)告分子連接。
41.權(quán)利要求40的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子與所述突觸小泡蛋白的腔部分連接。
42.權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pH敏感的熒光蛋白。
43.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pHluorin。
44.權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子包含SEQID NO 1 (hSyn-SypHy)所示序列。
45.權(quán)利要求42的平臺(tái)，其中，在7.0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
46.權(quán)利要求42的平臺(tái)，其中，在5.0至6. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
47.權(quán)利要求46的平臺(tái)，其中所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。
48.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在所述多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；和c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置成檢測(cè)來自所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中至少一個(gè)亞組的發(fā)光信號(hào)，其中所述發(fā)光信號(hào)指示突觸小泡循環(huán)的方面。
49.權(quán)利要求48的平臺(tái)，其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包含與突觸小泡蛋白連接的報(bào)告分子。
50.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，并且其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包含與突觸小泡蛋白連接的報(bào)告分子；b)刺激器系統(tǒng)，其設(shè)置為誘導(dǎo)所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中的突觸小泡循環(huán)；和c)包含多個(gè)檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自孔中存在的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞至少一個(gè)亞組的發(fā)光信號(hào)，其中所述發(fā)光信號(hào)指示突觸小泡循環(huán)的方面。
51.權(quán)利要求50的平臺(tái)，其中所述突觸小泡蛋白包含腔部分。
52.權(quán)利要求50或51的平臺(tái)，其中所述刺激器系統(tǒng)包含多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在所述多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)。
53.權(quán)利要求48至52中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至 100, 000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。
54.權(quán)利要求48至53中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000至 4000個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。
55.權(quán)利要求48至M中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。
56.權(quán)利要求48至55中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞為原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元為大鼠原代神經(jīng)元。
57.權(quán)利要求48至56中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。
58.權(quán)利要求48至57中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞包含表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白具有腔部分。
59.權(quán)利要求48和52至58中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。
60.權(quán)利要求48和52至59中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)電極對(duì)中的電極為基本同心的圓柱體，并且其中所述同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料所分隔。
61.權(quán)利要求48和52至60中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)設(shè)置為將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在所述多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。
62.權(quán)利要求48和52至61中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述多個(gè)電極有效連接的電源。
63.權(quán)利要求62的平臺(tái)，其中所述電源設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定電壓。
64.權(quán)利要求63的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍為IV至400V。
65.權(quán)利要求63的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍為5V至20V。
66.權(quán)利要求62至65中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述電源和所述多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定的電壓脈沖。
67.權(quán)利要求66的平臺(tái)，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率施加多個(gè)預(yù)定的電壓脈沖。
68.權(quán)利要求67的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為0.2Hz至IOOHz。
69.權(quán)利要求67或68的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。
70.權(quán)利要求67至69中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間最多2分鐘。
71.權(quán)利要求67至70中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。
72.權(quán)利要求67至71中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。
73.權(quán)利要求67至72中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多10 毫秒。
74.權(quán)利要求67至73中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0.1毫秒至2毫秒。
75.權(quán)利要求67至74中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖起始之間的時(shí)間為0.1至5毫秒。
76.權(quán)利要求67至75中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述脈沖數(shù)的范圍為1至1000。
77.權(quán)利要求66至75中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。
78.權(quán)利要求48至77中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器包含光學(xué)傳感器。
79.權(quán)利要求48至78中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。
80.權(quán)利要求79的平臺(tái)，其中所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0.2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。
81.權(quán)利要求79或80的平臺(tái)，其中所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0.4至1. 4。
82.權(quán)利要求79的平臺(tái)，其中所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。
83.權(quán)利要求79至82中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。
84.權(quán)利要求48至83中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與每個(gè)檢測(cè)器有效連接的電荷耦合器件照相機(jī)。
85.權(quán)利要求48至84中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述多個(gè)檢測(cè)器被設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。
86.權(quán)利要求48至85中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與所述檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自所述檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。
87.權(quán)利要求48至86中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。
88.權(quán)利要求48至87中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。
89.權(quán)利要求48至88中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。
90.權(quán)利要求49至89中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、J L茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。
91.權(quán)利要求49至90中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子與所述突觸小泡蛋白的腔部分相連。
92.權(quán)利要求49至91中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pH敏感的熒光蛋白。
93.權(quán)利要求49至92中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pHluorin。
94.權(quán)利要求50至93中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子包含SEQID NO 1 (hSyn-SypHy)所示序列。
95.權(quán)利要求92至94中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中，在7.0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
96.權(quán)利要求92至95中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中，在5.0至6. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
97.權(quán)利要求48至96中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。
98.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為(i)用于放置在孔中，并且( )產(chǎn)生適于在所述孔中的多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示所述神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。
99.權(quán)利要求98的平臺(tái)，其中多個(gè)所述孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。
100.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞；b)多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在所述多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示所述神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。
101.用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，所述平臺(tái)包含a)多個(gè)孔，其中每個(gè)孔包含多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，并且其中多個(gè)所述神經(jīng)元細(xì)胞包含與小泡蛋白相連的報(bào)告分子；b)刺激器系統(tǒng)，設(shè)置為誘導(dǎo)所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)；以及c)包含物鏡的檢測(cè)系統(tǒng)，所述物鏡設(shè)置為收集來自報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述報(bào)告分子與所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連，并且其中所述發(fā)光信號(hào)的存在指示所述神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面。
102.權(quán)利要求101的平臺(tái)，其中所述刺激器系統(tǒng)包含多個(gè)電極對(duì)，其中每個(gè)電極對(duì)放置在所述多個(gè)孔的一個(gè)中，并且其中每個(gè)電極對(duì)設(shè)置為產(chǎn)生足以在所述孔中存在的神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)突觸小泡循環(huán)的電場(chǎng)。
103.權(quán)利要求98至102中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述突觸小泡蛋白包含腔部分。
104.權(quán)利要求98至102中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡是油鏡或水鏡。
105.權(quán)利要求98至102中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡是空氣物鏡。
106.權(quán)利要求98至105中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡與光學(xué)檢測(cè)器有效連接。
107.權(quán)利要求104的平臺(tái)，其中所述光學(xué)檢測(cè)器是電荷耦合器件照相機(jī)。
108.權(quán)利要求98至107中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述平臺(tái)設(shè)置為檢測(cè)來自與神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小泡蛋白相連的報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，所述神經(jīng)元細(xì)胞已被刺激而產(chǎn)生至少5個(gè)動(dòng)作電位。
109.權(quán)利要求98至108中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含多個(gè)物鏡。
110.權(quán)利要求99至109中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至 100, 000個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。
111.權(quán)利要求99至110中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000 至4000個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。
112.權(quán)利要求99至111中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。
113.權(quán)利要求99至112中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞為原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元為大鼠原代神經(jīng)元。
114.權(quán)利要求99至113中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。
115.權(quán)利要求99至114中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞包含表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述蛋白具有腔部分。
116.權(quán)利要求98、100和102至115中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。
117.權(quán)利要求98、100和102至116中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)電極對(duì)中的所述電極為基本同心的圓柱體，并且其中所述同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料所分隔。
118.權(quán)利要求98、100和102至117中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)設(shè)置為將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)有效放置在所述多個(gè)孔中的一個(gè)孔中。
119.權(quán)利要求98、100和102至118中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述多個(gè)電極有效連接的電源。
120.權(quán)利要求119的平臺(tái)，其中所述電源設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定電壓。
121.權(quán)利要求120的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍為IV至400V。
122.權(quán)利要求120的平臺(tái)，其中所述電壓的范圍為5V至20V。
123.權(quán)利要求119至122中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述電源和所述多個(gè)電極對(duì)有效連接的脈沖發(fā)生器，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定電壓脈沖。
124.權(quán)利要求123的平臺(tái)，其中所述脈沖發(fā)生器設(shè)置為在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率施加多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。
125.權(quán)利要求124的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為0.2Hz至IOOHz。
126.權(quán)利要求IM或125的平臺(tái)，其中所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。
127.權(quán)利要求IM至126中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間最多2分鐘。
128.權(quán)利要求124至127中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。
129.權(quán)利要求124至128中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。
130.權(quán)利要求IM至129中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍最多 10毫秒。
131.權(quán)利要求IM至130中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍為0. 1毫秒至2毫秒。
132.權(quán)利要求IM至131中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述每個(gè)脈沖起始之間的持續(xù)時(shí)間為 0. 1至5毫秒。
133.權(quán)利要求124至132中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述脈沖數(shù)的范圍為1至1000。
134.權(quán)利要求IM至133中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其還包含與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。
135.權(quán)利要求IM至134中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含光學(xué)傳感器。
136.權(quán)利要求124至135中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含物鏡，所述物鏡設(shè)置為收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。
137.權(quán)利要求136的平臺(tái)，其中所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0.2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。
138.權(quán)利要求135或136的平臺(tái)，其中所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0.4至1. 4。
139.權(quán)利要求138的平臺(tái)，其中所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。
140.權(quán)利要求136至139中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述物鏡不是油浸或水浸鏡頭。
141.權(quán)利要求98至140中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含多個(gè)檢測(cè)器，所述多個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。
142.權(quán)利要求141的平臺(tái)，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包含與所述檢測(cè)器有效連接的計(jì)算機(jī)，并且其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為將來自所述檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。
143.權(quán)利要求141或142的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。
144.權(quán)利要求141至143中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。
145.權(quán)利要求141至144中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中每個(gè)檢測(cè)器設(shè)置為檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。
146.權(quán)利要求98至145中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、J L茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。
147.權(quán)利要求98至146中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子連接到所述突觸小泡蛋白的腔部分。
148.權(quán)利要求98至147中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pH敏感的熒光蛋白。
149.權(quán)利要求98至148中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子為pHluorin。
150.權(quán)利要求98至149中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述報(bào)告分子包含在SEQID NO: 1 (hSyn-SypHy)中所示序列。
151.權(quán)利要求148至150中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中，在7.0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
152.權(quán)利要求148至150中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中，在5.0至6. 0范圍的pH下所述pH敏感的報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
153.權(quán)利要求98至152中任一項(xiàng)的平臺(tái)，其中所述發(fā)光信號(hào)是475nm至525nm范圍的熒光信號(hào)。
154.在多個(gè)細(xì)胞中測(cè)量突觸小泡循環(huán)的方面的方法，所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供電極對(duì)和多個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子；b)用所述電極對(duì)在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)的一系列動(dòng)作電位；以及c)在所述多個(gè)孔中檢測(cè)所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)，其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)是對(duì)突觸小泡循環(huán)的方面的度量。
155.權(quán)利要求154的方法，其中所述多個(gè)細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。
156.權(quán)利要求巧4或155的方法，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在10至100000 個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的范圍內(nèi)。
157.權(quán)利要求巧4或155的方法，其中孔中的所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞是在1000至2000 個(gè)細(xì)胞/mm2孔底面積的范圍內(nèi)。
158.權(quán)利要求巧4至156中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞包括至少兩種不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。
159.權(quán)利要求155至158中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞是原代神經(jīng)元，任選地，其中所述原代神經(jīng)元是大鼠原代神經(jīng)元。
160.權(quán)利要求155至159中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞選自谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞、腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞。
161.權(quán)利要求巧4至160中任一項(xiàng)的方法，其中多個(gè)所述神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)與報(bào)告分子融合的突觸小泡蛋白。
162.權(quán)利要求巧4至161中任一項(xiàng)的方法，其中電極對(duì)中的每個(gè)電極具有基本呈曲線形的表面。
163.權(quán)利要求IM至162中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)電極對(duì)中的所述電極為基本同心的圓柱體，并且其中所述同心圓柱體被環(huán)形絕緣材料所分隔。
164.權(quán)利要求巧4至163中任一項(xiàng)的方法，其還包括采用電極轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將所述多個(gè)電極對(duì)中的每個(gè)電極對(duì)放置在所述多個(gè)孔中的一個(gè)孔內(nèi)。
165.權(quán)利要求IM至164中任一項(xiàng)的方法，其中通過與所述多個(gè)電極有效連接的電源來誘發(fā)所述動(dòng)作電位。
166.權(quán)利要求IM至165中任一項(xiàng)的方法，其中通過向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定電壓來誘發(fā)所述動(dòng)作電位。
167.權(quán)利要求166的方法，其中所述電壓的范圍為IV至400V。
168.權(quán)利要求166的方法，其中所述電壓的范圍為5V至20V。
169.權(quán)利要求165至168中任一項(xiàng)的方法，其中脈沖發(fā)生器與所述電源和所述多個(gè)電極對(duì)有效連接，并且其中所述脈沖發(fā)生器向每個(gè)電極對(duì)施加預(yù)定的電壓脈沖。
170.權(quán)利要求169的方法，其中所述脈沖發(fā)生器在預(yù)定時(shí)間內(nèi)以預(yù)定頻率施加多個(gè)預(yù)定電壓脈沖。
171.權(quán)利要求170的方法，其中所述預(yù)定頻率的范圍為0.2Hz至IOOHz。
172.權(quán)利要求170或171的方法，其中所述預(yù)定頻率的范圍為IOHz至50Hz。
173.權(quán)利要求170至172中任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)定時(shí)間小于或等于2分鐘。
174.權(quán)利要求170至173中任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)定時(shí)間的范圍為0.1至20秒。
175.權(quán)利要求170至174中任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)定時(shí)間的范圍為5至15秒。
176.權(quán)利要求170至175中任一項(xiàng)的方法，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍是最多10毫秒。
177.權(quán)利要求170至176中任一項(xiàng)的方法，其中所述每個(gè)脈沖的持續(xù)時(shí)間的范圍是0. 1毫秒至2毫秒。
178.權(quán)利要求170至175中任一項(xiàng)的方法，其中所述每個(gè)脈沖起始之間的時(shí)間是0.1至5毫秒。
179.權(quán)利要求170至175中任一項(xiàng)的方法，其中所述脈沖數(shù)的范圍是1至1000。
180.權(quán)利要求169至179中任一項(xiàng)的方法，其中所述電壓脈沖由與所述脈沖發(fā)生器有效連接的計(jì)算機(jī)控制，其中所述計(jì)算機(jī)設(shè)置為控制所述電壓脈沖。
181.權(quán)利要求155至180中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)由檢測(cè)器檢測(cè)。
182.權(quán)利要求181的方法，其中所述檢測(cè)器包含光學(xué)傳感器。
183.權(quán)利要求181或182的方法，其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)用多個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)，其中電荷耦合器件照相機(jī)與每個(gè)檢測(cè)器有效連接。
184.權(quán)利要求181的方法，其中每個(gè)檢測(cè)器包含物鏡，所述物鏡設(shè)置成收集來自孔的發(fā)光信號(hào)。
185.權(quán)利要求184的方法，其中所述物鏡設(shè)置為收集來自范圍為0.2mm至5mm的視野區(qū)域的發(fā)光信號(hào)。
186.權(quán)利要求184或185的方法，其中所述物鏡數(shù)值孔徑的范圍為0.4至1. 4。
187.權(quán)利要求186的方法，其中所述物鏡的數(shù)值孔徑為0.5。
188.權(quán)利要求183的方法，其中所述多個(gè)檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)來自多個(gè)孔的信號(hào)。
189.權(quán)利要求183至188中任一項(xiàng)的方法，其中計(jì)算機(jī)與所述多個(gè)檢測(cè)器有效連接并將來自所述檢測(cè)器的發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化成表征神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面的數(shù)據(jù)。
190.權(quán)利要求183至189中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。
191.權(quán)利要求183至190中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)突觸的發(fā)光信號(hào)。
192.權(quán)利要求183至191中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)來自多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。
193.權(quán)利要求IM至192中任一項(xiàng)的方法，其中所述突觸小泡蛋白是VAMP2、vGlutl、突觸素、小泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、J L茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或突觸結(jié)合蛋白。
194.權(quán)利要求IM至192中任一項(xiàng)的方法，其中所述突觸小泡蛋白具有腔部分。
195.權(quán)利要求194的方法，其中所述發(fā)光報(bào)告分子與腔部分相連。
196.權(quán)利要求IM至195中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光報(bào)告分子為pH敏感的報(bào)告分子。
197.權(quán)利要求IM至196中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光報(bào)告分子為pHluorin。
198.權(quán)利要求巧4至196中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光報(bào)告分子包含SEQID NO 1 (hSyn-SypHy)所示序列。
199.權(quán)利要求196的方法，其中，在7.0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于在5. 0至6. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
200.權(quán)利要求197的方法，其中，在7.0至8. 0范圍的pH下所述pH敏感報(bào)告分子發(fā)出熒光，其強(qiáng)度顯著大于在7. 0至8. 0范圍的pH下所發(fā)出的熒光。
201.權(quán)利要求巧4至200中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)在475nm至525nm范圍內(nèi)。
202.權(quán)利要求巧4至201中任一項(xiàng)的方法，其還包括d)使所述多個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)第二系列的動(dòng)作電位，其足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；f)檢測(cè)所述多個(gè)孔中的報(bào)告分子的第二發(fā)光信號(hào)；其中在步驟(c)中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在步驟(f)中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
203.權(quán)利要求巧4至201中任一項(xiàng)的方法，其還包括在步驟(b)之前，使所述多個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在步驟(c)中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與對(duì)照發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
204.權(quán)利要求巧4至201中任一項(xiàng)的方法，其還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種對(duì)照劑相接觸；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在具有對(duì)照劑的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
205.權(quán)利要求巧4至201中任一項(xiàng)的方法，其還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在陰性對(duì)照孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
206.權(quán)利要求205的方法，其還包括使所述陰性對(duì)照孔中的多個(gè)細(xì)胞與不調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的對(duì)照劑相接觸。
207.權(quán)利要求巧4至201中任一項(xiàng)的方法，其還包括d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中在具有測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與在陽性對(duì)照孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間無顯著差異鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
208.權(quán)利要求207的方法，其還包括使所述陽性對(duì)照孔中的多個(gè)細(xì)胞與調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的對(duì)照劑相接觸。
209.權(quán)利要求202至208中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試物是小分子。
210.權(quán)利要求202至208中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試物是多肽。
211.權(quán)利要求202至208中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試物是抗體。
212.權(quán)利要求202至208中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試物是核酸。
213.權(quán)利要求212的方法，其中所述核酸是選定的DNA、RNA、DNA/RNA雜交體、短干擾 RNA、短發(fā)夾RNA、小RNA、核酶或適體。
214.權(quán)利要求202或203的方法，其中所述測(cè)試物是碳水化合物。
215.權(quán)利要求202或203的方法，其中所述測(cè)試物是脂質(zhì)。
216.權(quán)利要求215的方法，其中所述脂質(zhì)是磷脂、甘油三酯或甾類。
217.權(quán)利要求202至216中任一項(xiàng)的方法，其還包括在體內(nèi)模型中監(jiān)測(cè)被鑒定為突觸小泡循環(huán)的方面調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的毒性。
218.權(quán)利要求202至216中任一項(xiàng)的方法，其還包括在體內(nèi)模型中監(jiān)測(cè)被鑒定為突觸小泡循環(huán)的方面調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的效力。
219.權(quán)利要求IM至218中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是高通量的篩選方法。
220.權(quán)利要求IM至219中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)是熒光水平。
221.權(quán)利要求IM至219中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)是在預(yù)定時(shí)間內(nèi)獲得的多個(gè)熒光水平。
222.權(quán)利要求IM至219中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)是熒光增加速率。
223.權(quán)利要求IM至219中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)光信號(hào)是熒光衰減速率。
224.鑒定作為突觸小泡循環(huán)方面之調(diào)節(jié)劑的測(cè)試物的方法，所述方法包括a)提供多個(gè)孔，每個(gè)孔包含電極對(duì)以及表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)第一系列動(dòng)作電位，其足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的第一發(fā)光信號(hào)；d)使所述多個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；e)在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)第二系列動(dòng)作電位，其足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；以及f)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的第二發(fā)光信號(hào)；其中所述報(bào)告分子的第一和第二熒光水平之間的顯著差異鑒定出所述測(cè)試物是突觸小泡循環(huán)的方面的調(diào)節(jié)劑。
225.在多個(gè)細(xì)胞中測(cè)量突觸小泡循環(huán)的方面的方法，所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供電極對(duì)和表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)用所述電極對(duì)在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列動(dòng)作電位，所述動(dòng)作電位足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)；其中所述報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)是突觸小泡循環(huán)的方面的度量；以及d)使所述多個(gè)孔的至少一個(gè)孔中的多個(gè)細(xì)胞與至少一種測(cè)試物相接觸，所述測(cè)試物待檢測(cè)其調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面的能力；其中具有所述測(cè)試物的孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)與對(duì)照孔中檢測(cè)到的發(fā)光信號(hào)之間的比較鑒定出所述測(cè)試物調(diào)節(jié)突觸小泡循環(huán)的方面。
226.測(cè)量多個(gè)細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面的方法，所述方法包括a)在多個(gè)孔的每一個(gè)中提供刺激器和表達(dá)與突觸小泡蛋白相連的熒光報(bào)告分子的多個(gè)細(xì)胞；b)用所述刺激器在所述多個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列動(dòng)作電位，其足以在所述細(xì)胞中引發(fā)突觸小泡循環(huán)；以及c)檢測(cè)所述多個(gè)孔中報(bào)告分子的發(fā)光信號(hào)。
全文摘要
部分而言，本發(fā)明提供用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)。根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)和用于分析突觸小泡循環(huán)的方面的平臺(tái)。根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供測(cè)量多個(gè)細(xì)胞中突觸小泡循環(huán)的方面的方法。根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供用于鑒定測(cè)試物的方法，所述測(cè)試物作為突觸小泡循環(huán)的方面的調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)G01N35/00GK102203622SQ200980144076
公開日2011年9月28日申請(qǐng)日期2009年8月31日優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者喬納森·M·利文森, 大衛(wèi)·J·格伯, 杰弗里·R·科特雷爾, 蒂莫西·A·瑞安申請(qǐng)人:加利尼公司

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技術(shù)研發(fā)人員：大衛(wèi)·Ｊ·格伯
技術(shù)所有人：加利尼公司
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