專利名稱：因紫外線引起的皮膚變黑趨勢的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及因紫外線引起的皮膚變黑趨勢的評價方法。
背景技術(shù)：
人們擔(dān)心紫外線對皮膚的致癌作用、對白內(nèi)障等眼部疾病的影響、對免疫功能的影響等很多對健康方面的影響。被紫外線照射時，會誘發(fā)皮膚的各種紫外線損傷。紫外線使皮膚產(chǎn)生炎癥，將皮膚的不飽和脂質(zhì)氧化從而產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，生成過氧化脂質(zhì)。這種因紫外線引起的炎癥、氧化會誘發(fā)組織、細胞、DNA的損傷。作為因皮膚暴露于紫外線中所產(chǎn)生的現(xiàn)象，通常可例舉皺紋、斑點、皮膚癌等。近年來，作為免疫學(xué)數(shù)據(jù)，有關(guān)于根據(jù)對紫外線的敏感性(肌膚顏色、皮膚類型等)不同而發(fā)生皮膚癌的風(fēng)險提高的報道(非專利文獻1、幻。而且作為皮膚癌的一種的惡性黑色素瘤(melanoma)的危險風(fēng)險度，已證明由黑皮質(zhì)素1受體(melanocortin 1 receptor)的一個堿基置換的基因突變所引起的風(fēng)險增高數(shù)倍(非專利文獻3、4)。對紫外線的敏感性根據(jù)皮膚類型不同而大不相同，或者區(qū)分成為6個等級的不同類型，或者以產(chǎn)生紅色(紅斑)的最小紫外線能量(最小紅斑量MED)為標(biāo)準(zhǔn)進行分類，但前者為主觀觀測，而后者則伴隨不照射紫外線就無法測定的風(fēng)險。由于臭氧層破壞等，比以前增加的紫外線增加已成為問題，所以有必要針對個人對紫外線的敏感性風(fēng)險進行適當(dāng)評價。一方面，通常來說在形成被稱為斑點的色素沉積的初期階段，在皮膚表面上明顯出現(xiàn)之前由于各種刺激使表皮角質(zhì)化細胞生成α -MSH、bFGF、CGRP、內(nèi)皮素等信息傳遞物質(zhì)，再傳遞給黑素細胞。傳遞給黑素細胞之后，在細胞內(nèi)形成大量黑色素。另一方面，由于紫外線的作用使代謝回轉(zhuǎn)發(fā)生異常，致使大量形成的黑色素?zé)o法排泄，所以向色素病變方面轉(zhuǎn)變。有報道指出，在使用in vitro系的實驗中，向黑素細胞照射紫外線時，作為細胞增殖因子標(biāo)記物的p73、Nup88、p27、Idl、PCNA以及作為細胞凋亡關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)的bcl_2的表達發(fā)生增減(非專利文獻幻。到目前為止，有報道指出，對于斑點的狀況，通過活組織檢查使用皮膚組織進行侵襲式地比較斑點部和正常部，斑點部的NT-3、ADAM9、HB-EGF等蛋白質(zhì)的表達顯著增加(專利文獻1)。進而，有報道指出，作為預(yù)測皮膚斑點形成的檢查方法，通過活組織檢查來測定MLSTD1、MOGATl、Mcp9、Krt2-m3等的mRNA量，從而判斷斑點形成的風(fēng)險 (專利文獻2、3、4)。此外，專利文獻5中公開作為非侵襲方法，將通過膠帶剝離或摩擦而采集的來自皮膚的角質(zhì)層作為試樣，分析白介素I(IL-I)與白介素1受體拮抗劑(IL-Ira) 的存在量，從而評價肌質(zhì)的方法。專利文獻1日本特開2004-205246號公報專利文獻2日本特開2005-106745號公報專利文獻3日本特開2005-110505號公報專利文獻4日本特開2007-289063號公報專利文獻5日本專利第3590708號公報非專利文獻IArch Dermatol. 2004 ； 140 :819-824
非專利文獻2Cancer Causes Control. 1997 ；8 (2) :246-252非專利文獻；investDermatol. 117 :294-300,2001非專利文獻4Am. J. Hum. Genet. 66 :176-186，2000非專利文獻5Carcinogenesis 24(12) 1929-1934，200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供評價紫外線損傷風(fēng)險的方法，特別是將提供以下方法作為其目的，使用采用非侵襲的方法采集的皮膚角質(zhì)層，用于預(yù)知該被驗者的皮膚變黑趨勢的方法。本發(fā)明的主要構(gòu)成如下所述。(1) 一種因紫外線引起的皮膚變黑趨勢的評價方法，其特征在于，根據(jù)皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量，評價皮膚因紫外線引起的皮膚變黑趨勢強。(2) 一種方法，其特征在于，采用(1)中記載的皮膚變黑趨勢的評價方法，篩選對皮膚變黑產(chǎn)生影響的成分。(3) 一種方法，其特征在于，根據(jù)采用(1)中記載的皮膚變黑趨勢的評價方法而得到的皮膚變黑趨勢來選擇化妝品。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)表達的作為蛋白質(zhì)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量與暴露于紫外線所產(chǎn)生的黑色素的量呈正相關(guān)性，證明能夠評價皮膚變黑趨勢。通過本發(fā)明，在不實際照射紫外線的情況下可評價因紫外線引起的皮膚變黑趨勢。本發(fā)明因為可使用采用非侵襲的膠帶剝離方法采集的皮膚角質(zhì)層來評價，所以既安全又簡便。此外，利用本發(fā)明的評價法，可以篩選對于抑制因紫外線引起的皮膚變黑趨勢或者抑制暴露于紫外線后的黑色素生成有用的成分。根據(jù)本發(fā)明，可使應(yīng)對斑點的措施、預(yù)防斑點的美容變得容易。即可提供針對斑點等色素沉積部位的化妝品、醫(yī)藥部外品、醫(yī)藥品或美容用健康食品的選擇以及對此有效的信息?？蓽?zhǔn)確地進行應(yīng)對斑點的措施等美容咨詢。


圖1表示紫外線照射后的L*值的變化量?？v軸表示L*值的變化量。圖2表示即將照射紫外線之前(第0天)的L*值與膜聯(lián)蛋白II在角質(zhì)層中的表達量的相關(guān)關(guān)系。圖3表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第2天的L*值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖4表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第4天的L*值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖5表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第7天的L*值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖6表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第10天的L*值的變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。
圖7表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第14天的L*值的變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖8表示紫外線照射后的N值的經(jīng)時變化量?？v軸表示N值的變化量。圖9表示即將照射紫外線之前(第0天)的N值與膜聯(lián)蛋白II在角質(zhì)層中的表達量的相關(guān)關(guān)系。圖10表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第2天的N值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖11表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第4天的N值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖12表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第7天的N值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖13表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第10天的N值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。圖14表示以第0天的N值為標(biāo)準(zhǔn)的紫外線照射后第14天的N值變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的實施方式進行更加詳細地說明。本發(fā)明提供包括測定皮膚角質(zhì)層中含有的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量在內(nèi)的評價紫外線損傷風(fēng)險的方法。本申請發(fā)明，根據(jù)測定的采用非侵襲方法而采集的作為在皮膚角質(zhì)層中存在的蛋白質(zhì)的膜聯(lián)蛋白II的存在量，可預(yù)知因暴露于紫外線所引起的作為該皮膚角質(zhì)層的來源的人所變黑的風(fēng)險。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)暴露后的黑色素生成的變化與膜聯(lián)蛋白II的表達量有正相關(guān)性， 并且證明通過測定膜聯(lián)蛋白II的表達量，可預(yù)測暴露時黑色素生成的風(fēng)險，進而可預(yù)測皮膚變黑的程度。根據(jù)該結(jié)果，通過預(yù)知皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II的表達量，可采取選擇抑制暴露于紫外線的影響的化妝品等預(yù)防措施。并且，可根據(jù)對暴露于紫外線所產(chǎn)生的影響的預(yù)測來研究應(yīng)對措施。即根據(jù)本發(fā)明可使應(yīng)對斑點的措施、預(yù)防斑點的美容變得容易。而且可提供針對斑點等色素沉積部位的化妝品、醫(yī)藥部外品、醫(yī)藥品或美容用健康食品的選擇以及對此有效的信息?？捎锌茖W(xué)根據(jù)地準(zhǔn)確地進行應(yīng)對斑點的措施等美容咨詢。此外，利用膜聯(lián)蛋白II高表達產(chǎn)生的培養(yǎng)皮膚模型，通過探索對于該膜聯(lián)蛋白II 蛋白質(zhì)的表達量產(chǎn)生影響的被測物質(zhì)，可篩選出可抑制黑色素生成的藥劑。本申請發(fā)明因通過膠帶剝離等非侵襲方法安全且容易地采集皮膚角質(zhì)層，使用該皮膚角質(zhì)層在短時間特定目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達量，所以，可在化妝品柜臺等簡單地進行測定， 可以當(dāng)場作為化妝品選擇的資料。測定該膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的表達量的儀器，可在比較檢測結(jié)果與指標(biāo)后進行提示。進而也可根據(jù)該結(jié)果，表示出合適的化妝品、產(chǎn)品目錄。膜聯(lián)蛋白II為分子量為38，473Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，是通過鈣調(diào)節(jié)的膜結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)上結(jié)合兩個鈣離子。有2組的膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列中，一個結(jié)合鈣，一個結(jié)合磷脂。該蛋白質(zhì)或者與結(jié)合在細胞膜的磷脂上的肌動蛋白、細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)， 或者通過t-PA(組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator))激活纖溶酶原?；驂A基序列信息(Annexin A2，Gene 95 :243-251 (1990)，BC015834)。氨基酸序列信息(Annexin A2,J.Biol.Chem. 266 :5169-5176(1991)，P07355)?！鲈路蚺灐げ? ■艦·馳誠(1)利用膠帶剝離法采集角質(zhì)層膠帶剝離法是指通過在皮膚上粘貼膠帶并剝離粘附膠帶，而采集粘附在粘附面上的角質(zhì)層的方法。使用市售的粘附膠帶，例如通過在人的面頰部按壓粘附膠帶，可使角質(zhì)層粘附在粘附膠帶上來采集。作為市售的粘附膠帶，可例舉ASAHIBI0MED公司制的角質(zhì)檢測儀、 Moritex公司制角質(zhì)層膠條(seal)、PR0M0T00L公司質(zhì)的角質(zhì)檢測儀(盤式W、盤式G、PRO 式)、htegral公司制Corneofix、3M公司制透明膠帶、3M公司制透明雙面膠帶等。(2)提取緩沖液為了從粘附在粘附膠帶上的角質(zhì)層中提取出角質(zhì)層蛋白質(zhì)，使用提取緩沖液。作為提取緩沖液，例如可例舉以下組成。組成PBS(-)、0. 1% SDS0用粘附膠帶采集到的皮膚角質(zhì)層是角質(zhì)化細胞分化的產(chǎn)物，含有大量的細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。因此，為了提高角質(zhì)層蛋白質(zhì)的提取效率，優(yōu)選該提取緩沖液中含有適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?。作為表面活性劑，?yōu)選使用SDS(月桂基硫酸鈉CH3(CH2)11OSO3Na)。(3)角質(zhì)層蛋白質(zhì)的提取將采集了角質(zhì)層的粘附膠帶放入圓筒容器，通過使用高速旋轉(zhuǎn)的均質(zhì)器用研杵 (Pestle)(以下稱為“研杵”)摩擦粘附面，可迅速地提取角質(zhì)層蛋白質(zhì)。將粘附膠帶的粘附面朝向圓筒容器內(nèi)側(cè)，將粘附面的相反面沿圓筒容器的內(nèi)側(cè)放入圓筒容器。通過將粘附膠帶的粘附面的相反面沿圓筒容器的內(nèi)側(cè)放入，可容易地用研杵摩擦粘附面。作為其他方法， 可將采集了角質(zhì)層的粘附膠帶浸入提取緩沖液中并用刮刀刮擦以提取角質(zhì)層蛋白質(zhì)，也可使用振蕩法、超聲波法。(4)角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液的回收優(yōu)選使角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液靜置約1分鐘并使泡沫沉靜，然后從圓筒容器中吸出角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液并回收。(5)角質(zhì)層蛋白質(zhì)中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的分析得到的角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量可通過免疫印跡法、 ELISA法、抗體芯片法、FRET法進行定量分析。通過本發(fā)明證明皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量與IMED(最小紅斑量) 的紫外線照射后的皮膚亮度有負(fù)相關(guān)性。此外，皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量與 IMED(最小紅斑量)的紫外線照射后的黑色素量(用測試儀(Mexameter)測定的N值)有正相關(guān)性。因此，皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量比平均值高時，可評價為皮膚的因紫外線引起的皮膚變黑趨勢強。具體來說，皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量比平均值高的人，可評價為由于暴露于紫外線中容易使黑色素的產(chǎn)生亢進，容易產(chǎn)生斑點等紫外線損傷。抑制因紫外線引起的皮膚變黑的抑制劑的篩詵通過探索使小鼠等的皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量減少的成分，可篩選出抑制因紫外線引起的皮膚變黑的抑制劑。實施例1.被驗者將10名20多歲和30多歲的男性作為被驗者。各被驗者的年齡、皮膚類型、最小紅斑量、紫外線照射前的L*值、N值如表1所示。此外，皮膚類型II為“容易產(chǎn)生曬斑 (Sunburn)，略微產(chǎn)生曬黑(Simtan) ”的類型，III為“一般性產(chǎn)生曬斑，一般性產(chǎn)生曬黑(曬為淡茶色)”的類型，IV為“略微產(chǎn)生曬斑，經(jīng)常產(chǎn)生曬黑(曬為茶色)”的類型。此外，L*值為用分光測色儀(CM-500、柯尼卡美能達公司制)測定的L*a*b*顯色系的亮度，L*值大時評價為明亮(未變黑)，L*值小時評價為暗淡(已變黑)。此外，N值為黑色素量的指標(biāo)，使用Courage+Khazaka制mexameter MX16測定。N值越大，評價為已變黑，N值小時黑色素量減少，評價為膚色白。表 1
年齡皮膚類型最小紅斑量 (mj/cm2)L氺值N值31IV2566.1484.536II2563.2501.539II3061.6494.028II5058.6522.029IV5062.0504.528IV5061.6507.038II206b.5492.537II2064.3470.032III2567.7480.026II206&.0482.02.皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的測定2. 1用膠帶剝離法采集角質(zhì)層作為粘附膠帶，使用ASAHIBI0MED公司制角質(zhì)檢測儀(2. 5cmX 2. 5cm)。在被驗者的背部粘貼角質(zhì)檢測儀，用指尖輕輕刮擦以使皮膚角質(zhì)層粘附在角質(zhì)檢測儀的粘附面上， 利用膠帶剝離從背部采集共計5片的樣品。此外，利用膠帶剝離的采集部位從紫外線照射部位采集。2. 2皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)的提取提取緩沖液=PBS(-) ,0. 1% (w/v) SDS。
提取緩沖液量200 μ L0提取容器直徑Ilmm的圓筒容器。將粘附膠帶的粘附面的相反面沿容器內(nèi)壁放入圓筒容器中，加入提取緩沖液，在迷你無線研磨器(Mini Cordless Grinder) (funakoshi公司codel3753E)上連接作為研杵的Handy pestle (Τ0Υ0Β0公司、code HMX-301)，使研杵以9000rpm旋轉(zhuǎn)，摩擦沿著圓筒容器內(nèi)壁的粘附膠帶的粘附面。攪拌時間為90秒。使皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液靜置約1分鐘并使泡沫沉靜，然后從圓筒容器中吸出皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液并回收。3.皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)的量的測定使用DC蛋白定量試劑盒(DC protein Assay Kit) (BIO-RAD公司)測定皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液中含有的全部蛋白質(zhì)的量。4.皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)量的測定使用皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)的量1 μ g份，通過免疫印跡法測定膜聯(lián)蛋白II的表達量。 使用各被驗者的皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)Iyg份，使用5-15%梯度凝膠經(jīng)過SDS-PAGE分離后，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶進行封閉(blocking)。將一級抗體(膜聯(lián)蛋白II多克隆抗體Santa CruzBiotechnology公司制)稀釋1000倍，將二級抗體(兔抗羊IgG (HRP 標(biāo)記)ZYMED Laboratories公司制)稀釋10000倍并進行反應(yīng)后，進行ECLplus (BD Bioscience公司制)檢測。將得到的條帶的強度用圖像分析軟件NIH-Image (NIH制)使其變?yōu)閿?shù)值。將該數(shù)值作為膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量。5.紫外線照射在被驗者的背部的直徑約8mm的圓內(nèi)照射IMED紫外線。紫外線照射裝置使用 solar light company 制多太陽紫外線模擬器模型(Multiple Solar Ultraviolet Simulator Model) 601。紫夕卜線強度使用 solar light company 制 Erythema UV & UVAIntensity Meter Model 3D_600v2. 0 來設(shè)定。6.皮膚亮度的測定使用分光測色儀(CM-500、柯尼卡美能達公司制)測定紫外線照射部位及非照射部位的L*值。測定紫外線照射前、照射后第2、4、7、10、14天的紫外線照射部位及非照射部位的L*值，將同一天內(nèi)測定的照射部位與非照射部位的L*之差作為測定日的L*變化量而用于解析。7.皮膚黑色素量的測定使用Courage+Khazaka制mexameterMX16測定作為黑色素量的指標(biāo)的N值。N為波長568 660nm的光的反射率。測定紫外線照射前、照射后第2、4、7、10、14天的紫外線照射部位及非照射部位的 N值，將同一天內(nèi)測定的照射部位與非照射部位的N值之差作為測定日的N值變化量而用于分析。8.皮膚亮度的測定結(jié)果紫外線照射后的L*值變化量如圖1所示。L*值的變化量(紫外線照射后的L*值-紫外線照射前的L*值)在紫外線照射第 2天變?yōu)樨?fù)值最大，其后在第14天基本恢復(fù)。紫外線照射第2天L*值最低，反映皮膚已經(jīng)變黑。分析第0天L*值與膜聯(lián)蛋白II在角質(zhì)層中表達量的相關(guān)關(guān)系，以及第2天、第4 天、第7天、第10天、第14天的L*值的變化量與變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量的相關(guān)關(guān)系?；貧w直線圖如圖2 7所示，相關(guān)系數(shù)如表2所示。變換為自然對數(shù)的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量與第2、10、14天的L*值的變化量顯示 “較強的負(fù)相關(guān)”，第4、7天的L*值的變化量顯示“強的負(fù)相關(guān)”。由上述可知，皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量越多，因暴露于紫外線而產(chǎn)生的L*值降低(皮膚變黑)的趨勢越強。證明皮膚角質(zhì)層中膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量成為因暴露于紫外線而引起的皮膚變黑趨勢的指標(biāo)。表 權(quán)利要求
1.一種因紫外線引起的皮膚變黑趨勢的評價方法，其特征在于，根據(jù)皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量，評價皮膚因紫外線引起的皮膚變黑趨勢強。
2.一種方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1中記載的皮膚變黑趨勢的評價方法，篩選對皮膚變黑產(chǎn)生影響的成分。
3.一種方法，其特征在于，根據(jù)采用權(quán)利要求1中記載的皮膚變黑趨勢的評價方法而得到的皮膚變黑趨勢來選擇化妝品。
全文摘要
本發(fā)明提供以采用非侵襲的方法采集的皮膚角質(zhì)層中的膜聯(lián)蛋白II蛋白質(zhì)的量為指標(biāo)的推算皮膚黑色素量的方法，或者評價因紫外線所引起的皮膚變黑趨勢的評價方法。
文檔編號G01N33/50GK102239413SQ20098014844
公開日2011年11月9日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者安田知永, 速水耕介 申請人:株式會社芳珂