專利名稱：生物分子的同種型的體內(nèi)代謝的同時(shí)測量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的同時(shí)測量的方法。
背景技術(shù)：
阿耳茨海默氏病(AD)是癡呆的最通常的原因，并且是日益增加的公共健康問題。 AD如同其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ退行性疾病一樣，特征在于生物分子產(chǎn)生、積聚和清除的紊亂。結(jié)果，需要測量生物分子在受試者中代謝的高效方法。特別地，需要同時(shí)測量在相同樣品中的生物分子的不同異構(gòu)體。這些方法將節(jié)省時(shí)間、金錢并需要來自給定受試者的更少的樣品。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面包括同時(shí)測量在受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法。該方法包括將標(biāo)記的部分施用至受試者。在所述受試者中產(chǎn)生所述生物分子時(shí)，所述標(biāo)記的部分典型地引入所述生物分子中。然后樣品得自受試者，其中樣品包含用所述部分標(biāo)記的第一生物分子級(jí)分和不用所述部分標(biāo)記的第二生物分子級(jí)分。第一生物分子級(jí)分包含生物分子的兩種或多種標(biāo)記的同種型，并且第二生物分子級(jí)分包含生物分子的兩種或多種未標(biāo)記的同種型。各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量被檢測，其中對(duì)于特定同種型標(biāo)記的同種型與未標(biāo)記的同種型的比例直接成比例于所述受試者中所述特定同種型的代謝。本發(fā)明另一方面包括一種確定治療劑是否影響在受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法。該方法包括將治療劑施用至受試者并且將標(biāo)記的部分施用至受試者。在所述受試者中產(chǎn)生所述生物分子時(shí)，所述標(biāo)記的部分典型地引入所述生物分子中。樣品得自受試者，并且通常包含用所述部分標(biāo)記的第一生物分子級(jí)分和不用所述部分標(biāo)記的第二生物分子級(jí)分。第一生物分子級(jí)分包含生物分子的兩種或多種標(biāo)記的同種型，并且第二生物分子級(jí)分包含生物分子的兩種或多種未標(biāo)記的同種型。生物樣品中各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量被檢測，其中對(duì)于特定同種型標(biāo)記的同種型與未標(biāo)記的同種型的比例直接成比例于所述受試者中所述特定同種型的代謝。比較各同種型的代謝和合適的對(duì)照值，使得對(duì)于特定同種型從所述對(duì)照值的改變指示所述治療劑影響在所述受試者的所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所述特定同種型的代謝下面將更全面地描述本發(fā)明的其他方面和重述部分。附圖簡述

圖1示出通過納升-LC串聯(lián)MS檢測在永生敲入鼠星形細(xì)胞表達(dá)人ApoE2或ApoE4 中的人ApoE同種型特定胰蛋白酶肽。將ApoE4培養(yǎng)基(0. 5ml)和ApoE2培養(yǎng)基(Iml)集合并在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。使樣品變性、還原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以產(chǎn)生同種型特定肽，其通過納升-LC串聯(lián)MS來分析。(A)用于各同種型特定肽的雙電荷離子的提取離子色譜法。(B)具有標(biāo)記的b和y離子的各肽的對(duì)應(yīng)MS2譜。圖2示出通過納升-LC串聯(lián)MS檢測CSF中的人ApoE同種型特定胰蛋白酶肽。將來自年輕正常對(duì)照參加者的CSF(0. Iml)在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。 使樣品變性、還原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以產(chǎn)生同種型特定肽，其通過納升-LC串聯(lián) MS來分析。(A)和(B)衍生自具有ApoE3/4基因型的個(gè)體。提取離子色譜法示于(A)中用于各同種型特定肽的雙電荷離子，并且對(duì)應(yīng)的MS2譜顯示于(B)。(C)和(D)衍生自具有 ApoE3/2基因型的個(gè)體。提取離子色譜法示于(C)中用于各同種型特定肽的雙電荷離子，并且對(duì)應(yīng)的MS2譜顯示于(D)。圖3示出ApoE3特定肽的檢測。ApoE蛋白用WUE4抗體免疫沉淀，變性、還原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以產(chǎn)生同種型特定肽，其通過納升-LC串聯(lián)MS來分析。(A)用于 ApoE3特定肽的提取離子色譜法。(B)各肽的對(duì)應(yīng)MS2譜。圖4展示從13C-標(biāo)記的ApoE4和ApoE2星形細(xì)胞培養(yǎng)基中分離的各ApoE同種型特定胰蛋白酶肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)記的和未標(biāo)記的ApoE同種型特定肽通過串聯(lián)MS檢測，并且從標(biāo)記與未標(biāo)記的離子的比例來計(jì)算標(biāo)記百分率。(A)ApoE3/2肽。(B)ApoE3/4肽。(C) ApoE2 肽。(D)ApoE4 肽。圖5展示在永生敲入鼠星形細(xì)胞中產(chǎn)生人ApoE4。ApoE4表達(dá)星形細(xì)胞生長至融匯。在時(shí)間t = O將13C6-亮氨酸加入培養(yǎng)基，從而使13C6-亮氨酸總百分率至50%。在48 小時(shí)內(nèi)收集培養(yǎng)基。ApoE用Iiposorb捕獲，還原和烷基化。ApoE4特定肽通過納升-LC MS/MS。SILT法用于測定13C6-亮氨酸引入ApoE(n = 3，誤差線SEM)。ApoE4的級(jí)分合成率 (FSR)使用初始斜率與每小時(shí)8. 5%的坪示蹤劑與被示蹤物的比(TTR)來計(jì)算。圖6展示ApoE同種型在人CNS中的代謝。ApoE2、ApoE3和ApoE4分離自從O至Mi 灌注13C6-亮氨酸Qmg/kg/h)的年輕正常對(duì)照參加者的CSF。(A)ApoE4 = LGADMEDVR(SEQ ID NO 3)，ApoE3 = LGADMEDVcGR(SEQ ID NO 1). (B)ApoE3 = LAVYQAGAR(SEQ ID NO 2)， ApoE2 = cLAVYQAGAR(SEQ ID NO :4)。TTR =示蹤劑與被示蹤物的比。圖7示出可溶性APP-β在CHO培養(yǎng)基中的檢測。(A).通過納升-LC示出未標(biāo)記和標(biāo)記的可溶性APP-β的分離。兩種肽在相同時(shí)間23. 洗脫。(B)示出未標(biāo)記和標(biāo)記的可溶性APP-β肽的成對(duì)圖譜。圖譜看起來類似，不同之處在于用箭頭指示的離子質(zhì)量的較小位移。指示的離子在標(biāo)記的sAPP-β肽中更重3m/z，因?yàn)檫@些離子都是帶雙電荷的。 標(biāo)記離子與未標(biāo)記離子的信號(hào)強(qiáng)度的比較表示為離子的％標(biāo)記與％未標(biāo)記的比。多種離子的比被加合以提供整個(gè)sAPP-β肽的％標(biāo)記未標(biāo)記的精確比。圖8示出可溶性APP-α在CHO培養(yǎng)基中的檢測。(A).通過納升-LC示出未標(biāo)記和標(biāo)記的可溶性APP-α的洗脫。兩種肽在相同時(shí)間25. ISmin洗脫。(B)示出未標(biāo)記和標(biāo)記的可溶性ΑΡΡ-α肽的成對(duì)圖譜。指示標(biāo)記的離子在標(biāo)記離子中更重2m/z，因?yàn)檫@些離子都是帶三電荷的。標(biāo)記離子與未標(biāo)記離子的信號(hào)強(qiáng)度的比較表示為離子的％標(biāo)記與％未標(biāo)記的比。多種離子的比被加合以提供整個(gè)sAPP-β肽的％標(biāo)記未標(biāo)記的精確比。圖9展示各sAPP- α和SAPP_ β肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測和定量的實(shí)際標(biāo)記與未標(biāo)記的比針對(duì)標(biāo)記與未標(biāo)記的理論百分率(基于CHO培養(yǎng)基的已知標(biāo)記與未標(biāo)記的亮氨酸)來繪制。(A)sAPP-a 肽。(Β)8ΑΡΡ_β 肽。圖10示出表示在CSF中測量時(shí)在人受試者中在48小時(shí)內(nèi)標(biāo)記可溶性APP離子百分率與未標(biāo)記可溶性APP離子百分率的比的變化的兩個(gè)圖。(A)表示可溶性ΑΡΡβ肽離子。 (B)表示可溶性APP α肽離子?？扇苄訟PP α和可溶性APP β的產(chǎn)生和清除率可通過下列方式來確定計(jì)算加合的APP α或APP β肽離子的產(chǎn)生和清除率。圖11示出從淀粉樣四_4(|、淀粉樣-β 29_42、淀粉樣-β 29_38等的混合物中檢測淀粉樣_β29,肽。淀粉樣用抗-淀粉樣抗體免疫沉淀，并用胰蛋白酶消化。肽通過納升-LC串聯(lián)MS分析。㈧用于淀粉樣-β 29-40肽的提取離子色譜法。⑶各肽的對(duì)應(yīng)MS2譜。圖12示出通過納升-LC串聯(lián)MS檢測CSF中Αβ同種型特異性Lys-N肽的圖。將來自年輕正常對(duì)照參加者的CSF(Iml)在室溫下用HJ5. 1抗體孵育2小時(shí)。純化的Aβ用 Lys-N消化以產(chǎn)生同種型特定肽，其通過納升-LC串聯(lián)MS分析。提取離子色譜法示于組中用于各同種型特定肽的帶雙電荷的離子(A)消化物的總洗脫曲線，(Β)Αβ1-38，(C)Aβ 1-40 和(D) A β 1-42。對(duì)應(yīng) MS2 譜展示在下組中=(E)A β 1-38, (F) A β 1-40 和(G) A β 1-42 圖13示出分離自13C-標(biāo)記的Αβ細(xì)胞培養(yǎng)基的各Αβ同種型特異性Lys-N肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。標(biāo)記的和未標(biāo)記的Αβ同種型特定肽通過串聯(lián)MS檢測，并且從標(biāo)記與未標(biāo)記的例子的比來計(jì)算標(biāo)記百分率。(Α)Αβ 1-38. (B)Aβ 1-40. (C)Aβ 1_42。圖14示出在人受試者中Αβ的產(chǎn)生和清除的時(shí)間過程的圖。Αβ-1-40和 Aβ-1-42的單獨(dú)曲線衍生自從來自人CSF的單一免疫沉淀法獲得的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的生物分子或蛋白的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的同時(shí)測量的方法。特別地，本發(fā)明提供確定目標(biāo)生物分子或蛋白的數(shù)種同種型在一種生物樣品中的體內(nèi)產(chǎn)生和清除率的方法。本發(fā)明的方法可用于比較CNS-衍生的生物分子或蛋白的數(shù)種不同同種型的代謝，以確定在多種同種型中代謝是否不同，或者一種或多種同種型的代謝是否隨時(shí)間而改變。典型地，目標(biāo)生物分子或蛋白意指在神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂中，使得所述方法可用于診斷或監(jiān)控神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂的進(jìn)展或治療。而且，所述方法被提供以確定是否治療劑影響CNS-衍生的生物分子或蛋白的數(shù)種不同同種型的體內(nèi)代謝。(I)同時(shí)測量數(shù)種同種型的代謝的方法本發(fā)明提供在單一生物樣品中同時(shí)測量CNS衍生的生物分子或蛋白的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法。CNS衍生的生物分子或蛋白可意指在神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂中。特別地，所述方法包括當(dāng)目標(biāo)生物分子或蛋白在CNS中產(chǎn)生時(shí)將其標(biāo)記，收集包含生物分子或蛋白的標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的生物樣品，并且將各標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的量進(jìn)行定量，使得可以測定各同種型的代謝。該方法可用于計(jì)算目標(biāo)生物分子或蛋白的兩種或多種同種型中的每種的代謝參數(shù)，例如CNS內(nèi)的產(chǎn)生和清除率。(a)神經(jīng)退行性疾病本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到本發(fā)明的方法可用于測定意指在數(shù)種神經(jīng)病學(xué)和/或神經(jīng)退行性疾病、紊亂或過程中的CNS衍生的生物分子或蛋白的數(shù)種不同同種型的代謝， 合適的疾病或紊亂的非限制性例子包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥、中風(fēng)、額顳葉癡呆(FTD)、亨廷頓氏病、進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)、衰老有關(guān)的疾病給我癡呆、多發(fā)性硬化癥、朊病毒病(例如克雅氏病、牛海綿狀腦病或瘋牛病和癢病)、路易體病、精神分裂癥和肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS或盧格里格病)。還預(yù)想本發(fā)明的方法可用于研究CNS的正常生理學(xué)、代謝和功能。CNS衍生的生物分子或蛋白的同種型的體內(nèi)代謝可在哺乳動(dòng)物受試者中測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者可以是寵物例如犬或貓。在另一實(shí)施方案中，受試者可以是家畜動(dòng)物例如奶牛、豬、綿羊或山羊。在又一實(shí)施方案中，受試者可以是動(dòng)物園動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中，受試者可以是研究動(dòng)物例如非-人靈長動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物。在又一實(shí)施方案中，受試者可以是人。受試者可以或不可以患有或易患有上述神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂。(b)CNS衍生的生物分子或蛋白的同種型本發(fā)明提供在CNS中產(chǎn)生的生物分子或蛋白的兩種或多種同種型的代謝的測量方法。生物分子可以是蛋白、脂質(zhì)、核酸或碳水化合物。可能的生物分子僅受到下列因素的限制在體內(nèi)產(chǎn)生或加工過程將它們標(biāo)記以及收集一種或多種其代謝可被測量的樣品的能力。在示例性實(shí)施方案中，生物分子是蛋白。合適的蛋白的非限制性例子包括淀粉樣-β (Αβ)及其C-末端和N-末端變異體、淀粉樣前體蛋白(APP)、載脂蛋白Ε(同種型2、 3或4)、載脂蛋白J(也稱為聚集Tau (另一種關(guān)聯(lián)AD的蛋白)、磷酸化Tau、神經(jīng)膠原纖維酸性蛋白、α-2巨球蛋白、突觸核蛋白、S100B、髓鞘堿性蛋白(意指在多發(fā)性硬化癥中)、朊病毒、自細(xì)胞介、TDP-43、超氧化物歧化酶-1、亨廷頓蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)、熱休克蛋白90(HSP90)及其組合?？杀话邢虻牧硗馍锓肿影ê虶ABA能神經(jīng)元、去甲腎上腺素能神經(jīng)元、組胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元和谷氨酰胺能神經(jīng)元相互作用的產(chǎn)物、或蛋白、或肽、術(shù)語"同種型"是指生物分子或蛋白的不同形式。生物分子或蛋白的不同形式可通過多種過程或機(jī)理而產(chǎn)生。在生物分子是蛋白的實(shí)施方案中，同種型可以是序列相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白。例如，蛋白同種型可以是遺傳等位基因?？蛇x擇地，蛋白同種型可以是交替切割、RNA編輯、翻譯后加工等的產(chǎn)物。如下所述，這些同種型可原封未動(dòng)地被分析，或者可通過蛋白的多種形式的離體裂解以產(chǎn)生"同種型特異性片段"來檢測。在生物分子是蛋白的其他實(shí)施方案中，同種型可以是通過蛋白酶活性體內(nèi)產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物。合適的體內(nèi)蛋白酶的非限制性例子包括α-分泌酶、β-分泌酶和可變Y-分泌酶?？蛇x擇地，裂解產(chǎn)物也可以通過非蛋白酶體內(nèi)產(chǎn)生。合適的非蛋白酶裂解體系包括但不限于溶酶體酶類、超氧化物歧化酶、自由基等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白可以是淀粉樣前體蛋白(APP)并且APP的同種型可以是可溶性APP- α和可溶性APP- β，其分別是α -分泌酶和β -分泌酶的裂解產(chǎn)物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白可以是淀粉樣-β并且淀粉樣的C-末端同種型可以是淀粉樣-β M7、淀粉樣-β ^8、淀粉樣-β ^9、淀粉樣-β ^、淀粉樣-β i-41、淀粉樣-β H2和/ 或淀粉樣-h,。在甚至另外的實(shí)施方案中，蛋白可以是載脂蛋白E(ApoE)并且ApoE的同種型可以使ApoE的基因同種型的同種型特異性片段(例如，ApoE2、ApoE3和ApoE4)。(c)標(biāo)記的部分標(biāo)記的部分可包含放射活性同位素或非放射活性(穩(wěn)定)同位素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，非-放射活性同位素可被使用并通過質(zhì)譜來測量。優(yōu)選穩(wěn)定同位素包括氘(2H)、13C、15N、170、180、33S、34S或^5S,但認(rèn)識(shí)到多種其他穩(wěn)定同位素也將是有效的，相對(duì)于流行天然形式中觀察到的情況，該同位素通過增加或減少中子而改變原子的質(zhì)量。在研究中相對(duì)于改變同種型的片段的質(zhì)量，合適的標(biāo)記通常通過增加或減少中子而改變原子的質(zhì)量，使得其可在質(zhì)譜儀中被檢測。在一個(gè)實(shí)施方案中，待測量的生物分子可以是核酸，并且標(biāo)記的部分可以是包含非-放射活性同位素(例如15N)的核苷三磷酸。在另一實(shí)施方案中，待測量的生物分子可以是蛋白，并且標(biāo)記的部分可以是包含非-放射活性同位素(例如，13C)的氨基酸?？蛇x擇地，蛋白可以用標(biāo)記的部分例如包含合適的同位素的乙酸酯或ATP翻譯后標(biāo)記在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)所述方法被用于測量蛋白同種型的代謝時(shí)，標(biāo)記的部分典型地將是氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到數(shù)種氨基酸可用在本發(fā)明的方法中。通常，氨基酸的選擇基于多種因素，例如(1)氨基酸的至少一個(gè)殘基存在于目標(biāo)蛋白的兩種或多種同種型中的每種中。( 氨基酸通常能夠穿過血腦屏障快速平衡并且快速達(dá)到蛋白產(chǎn)生位點(diǎn)。亮氨酸是標(biāo)記CNS中產(chǎn)生的蛋白的優(yōu)選氨基酸，如實(shí)施例中所證實(shí)。( 氨基酸理想地可以是必需氨基酸(不由機(jī)體產(chǎn)生)，使得可以實(shí)現(xiàn)更高的標(biāo)記百分率。也可以使用非必需氨基酸；然而測量可能會(huì)較不精確。(4)氨基酸標(biāo)記通常不影響目標(biāo)蛋白的代謝(例如，非常大劑量的亮氨酸可影響肌肉代謝)。以及( 期望氨基酸的適用性(即，相對(duì)于其他氨基酸，一些氨基酸更加昂貴或難以生產(chǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸可以是13C6-苯丙氨酸，其含有6個(gè)1Y原子。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸可以是13C6-亮氨酸。 還預(yù)想在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，包含不同穩(wěn)定的同位素的一種或多種標(biāo)記的氨基酸可同時(shí)或依次使用。有大量商業(yè)來源的標(biāo)記的氨基酸，非-放射活性同位素和放射活性同位素的。通常，標(biāo)記的氨基酸可生物或合成制備。生物制備的氨基酸可得自有機(jī)體(例如，巨藻/海草)，所述有機(jī)體在當(dāng)有機(jī)體產(chǎn)生蛋白時(shí)引入氨基酸中的13Cn或另外同位素的富集混合物中生長。然后分離和純化氨基酸?？蛇x擇地，氨基酸可用已知合成化學(xué)方法來制備。(d)標(biāo)記的部分的施用標(biāo)記的部分可通過數(shù)種方法施用至受試者。合適的施用路徑包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、 皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服。在蛋白被標(biāo)記的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記的部分可以是氨基酸。 在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸可通過靜脈內(nèi)輸注來施用。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸可口服攝入。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記的部分可施用1)在一段時(shí)間內(nèi)緩慢進(jìn)行，幻較大單劑量取決于選擇的分析類型(例如，穩(wěn)定態(tài)或單次/追逐)，或幻初始單次劑量后在一段時(shí)間內(nèi)緩慢進(jìn)行。為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的生物分子或蛋白的穩(wěn)定態(tài)水平，標(biāo)記時(shí)間通常應(yīng)該是足夠的時(shí)間期間，使得標(biāo)記的生物分子或蛋白可以可靠地量化。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸可以是標(biāo)記的亮氨酸并且標(biāo)記的亮氨酸可靜脈內(nèi)施用。標(biāo)記的亮氨酸可靜脈內(nèi)施用從約1 小時(shí)至約M小時(shí)的時(shí)間期間。標(biāo)記的亮氨酸的施用速率可為約0. 5mg/kg/hr至約5mg/kg/ hr,優(yōu)選為約 lmg/kg/hr 至約;3mg/kg/hr，或更優(yōu)選為 1. 8mg/kg/hr 至約 2. 5mg/kg/hr。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記的亮氨酸可作為單次劑量來施用，所述單次劑量為約50至約500mg/ kg受試者體重，約50至約300mg/kg受試者體重，或者約100至約300mg/kg受試者體重。 在又一實(shí)施方案中，標(biāo)記的亮氨酸可作為單次劑量來施用，所述單次劑量為約200mg/kg受試者體重。在可替換的實(shí)施方案中，標(biāo)記的亮氨酸可在初始單次劑量后如上詳述靜脈內(nèi)施用，所述單次劑量為約0. 5至約10mg/kg，約1至約％ig/kg，或約ang/kg受試者體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到標(biāo)記的氨基酸的量(或劑量)可以并且將改變，通常，所述量取決于下列因素(和由下列因素來評(píng)價(jià))(1)期望的分析類型。例如，為了在血漿中實(shí)現(xiàn)約15%標(biāo)記的亮氨酸的穩(wěn)定態(tài)，要求在IOmin內(nèi)初始單次劑量ang/kg后在約9hr內(nèi)施用約ang/kg/hr。相反，如果不要求穩(wěn)定態(tài)，可以初始給予更大的單次劑量的標(biāo)記的亮氨酸(例如，1或5克的標(biāo)記的亮氨酸)。(2)分析中的蛋白。例如，如果蛋白快速產(chǎn)生，可需要較少的標(biāo)記時(shí)間，并且可需要較少的標(biāo)記-可能少至1小時(shí)內(nèi)0. 5mg/kg。然而，大部分蛋白具有數(shù)小時(shí)至數(shù)天的半衰期，因此更加可能的是在0. 5mg/kg至％ig/kg下可使用連續(xù)輸注4、9或12小時(shí)。以及(3)標(biāo)記的檢測靈敏度。例如，隨著標(biāo)記檢測的靈敏度增加，需要的標(biāo)記的量可降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到在單一受試者中可使用多于一種的標(biāo)記的氨基酸。這將允許目標(biāo)蛋白的兩種或多種同種型的多次標(biāo)記，并且可提供在不同時(shí)間各同種型代謝的信息。例如，第一標(biāo)記的氨基酸可在初始時(shí)間期限內(nèi)給予受試者，然后可以施加治療劑和第二標(biāo)記的氨基酸。通常，得自該受試者的樣品的分析將提供AND前和施用治療劑后各蛋白同種型的代謝的測量，從而直接測量在相同受試者中治療劑的藥物動(dòng)力學(xué)效果。可選擇地，多次標(biāo)記的氨基酸可在相同時(shí)間施用至受試者以增加目標(biāo)蛋白的多種同種型的標(biāo)記。(e)生物樣品本發(fā)明的方法提供得自受試者的生物樣品，使得可以測量目標(biāo)生物分子或蛋白的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝。包含被收集用于分析的目標(biāo)標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的生物樣品可以并且將取決于實(shí)施情況來改變。在一些實(shí)施方案中，生物樣品可以是體液。合適的體液包括但不限于腦脊髓液(CSF)、血漿、血清、全血、尿液、唾液、汗液和眼淚。在其他實(shí)施方案中，生物樣品可以是CNS組織，即，腦組織或脊髓組織。生物樣品通常使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來收集。例如，腦脊髓液可以使用或不使用留置CSF導(dǎo)管(如果在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次收集，則優(yōu)選導(dǎo)管)通過腰椎穿刺來獲得。血液可以使用或不使用靜脈內(nèi)導(dǎo)管靜脈穿刺來收集。尿液可通過簡單尿液收集來收集，或使用導(dǎo)管來更精確地收集。唾液和眼淚可使用標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)良臨床試驗(yàn)規(guī)范(GCP)方法通過直接收集來收集。CNS組織可通過組織切片、解剖或切除來獲得，可選擇地，其可使用激光顯微切割來獲得。受試者可以或不可以被處死以獲得 CNS組織樣品，這取決于期望的CNS樣品和利用的受試者。通常，在施用標(biāo)記的部分之前，本發(fā)明典型地提供得自受試者的第一生物樣品，以提供用于受試者的基線。在施用標(biāo)記的部分后，一種或多種生物樣品通常取自受試者。如本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到的，樣品數(shù)量和何時(shí)將它們?nèi)〕鐾ǔ⑷Q于多種因素，例如分析類型、施用類型、目標(biāo)蛋白、代謝速率、檢測類型等。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品(例如，血液和/或CSF)可在開始標(biāo)記后36小時(shí)每小時(shí)取樣。可選擇地，樣品每隔其他小時(shí)或甚至更少頻率地取樣。通常，在蛋白的第一較小半衰期中獲得的生物樣品(例如，在開始標(biāo)記淀粉樣后約12hrs)可用于測定各同種型的產(chǎn)生率，在標(biāo)記結(jié)束后(例如，開始標(biāo)記淀粉樣-β后約蛋白的數(shù)個(gè)半衰期取出的生物樣品可用于測定各同種型的清除率。在其他可替換形式中，一種樣品可在標(biāo)記一段時(shí)間例如12小時(shí)后取出，以估計(jì)產(chǎn)生率，但這可比多次樣品更加不精確。在其他可替換形式中，取決于蛋白的產(chǎn)生和清除率，樣品可分別地從小時(shí)至數(shù)天或甚至數(shù)周來取出。(f)檢測本發(fā)明還包括檢測目標(biāo)生物分子或蛋白的各標(biāo)記的同種型和各未標(biāo)記的同種型的量，使得可以測定不同的同種型的體內(nèi)代謝。標(biāo)記的同種型與未標(biāo)記的同種型的比例直接成比例于受試者的CNS中同種型的代謝。檢測標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的合適的方法可以并且將改變，這取決于目標(biāo)生物分子或蛋白和用于標(biāo)記目標(biāo)生物分子或蛋白的標(biāo)記的部分的類型。在優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)譜可用于檢測生物分子或蛋白的標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型之間的質(zhì)量差別。在一個(gè)實(shí)施方案中，氣相色譜-質(zhì)譜可以用于檢測標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的量。在可替換的實(shí)施方案中，MALDI-T0F質(zhì)譜可以用于檢測標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型。在優(yōu)選實(shí)施方案中，高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜可以用于檢測標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型。在示例性實(shí)施方案中，生物分子是蛋白，并且蛋白的不同同種型通過質(zhì)譜檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到對(duì)應(yīng)于體內(nèi)產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物的同種型可直接檢測，或者它們可體外進(jìn)一步消化以產(chǎn)生更小的肽以用于通過質(zhì)譜來檢測。對(duì)應(yīng)于蛋白的不同形式的同種型 (即，遺傳等位基因、轉(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后加工)通常離體消化以產(chǎn)生同種型特異性片段以用于通過質(zhì)譜來檢測?！巴N型特異性片段"典型地通過下列方式來產(chǎn)生分離目標(biāo)蛋白(參見下面)并且使用合適的蛋白酶將其消化(如實(shí)施例中詳述)?？捎糜诋a(chǎn)生同種型特異性片段的合適蛋白酶的非限制性例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶Arg-C、 肽鏈內(nèi)切酶Lys-C和肽鏈內(nèi)切酶Glu-C。在檢測和分析之前，另外的技術(shù)可用于從生物樣品中的其他生物分子中分離生物分子或蛋白的同種型。例如，標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型可使用特異性抗體通過免疫沉淀法來分離和純化。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型可通過吸附至衍生聚合物來分離和純化。例如，聚合物可以和對(duì)目標(biāo)同種型具有特異性的抗體綴合，或者聚合物可綴合結(jié)合同種型的另外的底物。可選擇地，聚合物可以是使用氧乙烯化脂肪醇衍生的多羥基亞甲基聚合物(例如PHM-Liposorb ，由Calbiochem，San Diego, CA生產(chǎn))，使得聚合物結(jié)合脂蛋白。而且，同種型還可以通過液相色譜法分離和/或分開。例如，具有色譜設(shè)置設(shè)備的質(zhì)譜儀可用于分離和/或分開同種型，然后其進(jìn)行質(zhì)譜，如實(shí)施例中所證實(shí)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，同種型可被免疫沉淀，消化成更小的肽，然后通過接口有串聯(lián)MS單元(裝備電噴霧電離源(LC-ESI-串聯(lián)MS))的液相色譜法系統(tǒng)進(jìn)行分析。在另外示例性實(shí)施方案中，目標(biāo)同種型可通過吸附至衍生的PHM基質(zhì)而分離，消化成較小的肽(或同種型特異性片段)，然后通過接口有串聯(lián)MS單元(裝備電噴霧電離源(LC-ESI-串聯(lián)MS))的液相色譜法系統(tǒng)進(jìn)行分析。(g)分析一旦在樣品中檢測了兩種或多種標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的量，可確定各標(biāo)記的同種型的百分率的比例。各同種型的代謝(產(chǎn)生率、清除率、滯后時(shí)間、半衰期等)可從隨著時(shí)間變化的標(biāo)記與未標(biāo)記的同種型的比來計(jì)算。有許多合適的方式來計(jì)算這些參數(shù)。本發(fā)明的方法允許同時(shí)在相同樣品中測量各標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的量，使得可以計(jì)算各同種型的標(biāo)記與未標(biāo)記的比。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于本發(fā)明的方法的標(biāo)記的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。例如，可以計(jì)算各同種型的級(jí)分合成率(FSR)。FSR等于標(biāo)記與未標(biāo)記的同種型的初始增加率除以前體富集(precursor enrichment)。同樣，可以計(jì)算各同種型的級(jí)分清除率(FCR)。另外，可以確定各同種型的其他參數(shù)(例如，絕對(duì)產(chǎn)生率、絕對(duì)清除率、新產(chǎn)生的生物分子的曲線下面積分析、滯后時(shí)間和同位素示蹤劑穩(wěn)定態(tài))，并且可用作同種型的代謝和生理學(xué)的指示。此外，可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模以擬合多隔室模型，從而評(píng)價(jià)隔室之間的轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，選擇的數(shù)學(xué)建模的類型將取決于單個(gè)蛋白產(chǎn)生和清除參數(shù)(例如，單室、多室、穩(wěn)定態(tài)、非穩(wěn)定態(tài)、隔室建模等)。本發(fā)明提供目標(biāo)同種型的產(chǎn)生典型地基于標(biāo)記/未標(biāo)記的同種型的比隨著時(shí)間的增加率(即，斜率，指數(shù)擬合曲線，或隔室模型擬合限定產(chǎn)生速度)。對(duì)于這些計(jì)算，典型地需要最少量的一種樣品(人員能夠估計(jì)基線標(biāo)記)，兩種是優(yōu)選的，并且多種樣品是更優(yōu)選的以計(jì)算標(biāo)記攝取到生物分子或蛋白中的精確曲線(即，產(chǎn)生率)。相反地，在停止施用標(biāo)記后，標(biāo)記與未標(biāo)記的同種型的比的降低率典型地反映同種型的清除率。對(duì)于這些計(jì)算， 典型地需要最少量的一種樣品(人員能夠估計(jì)基線標(biāo)記)，兩種是優(yōu)選的，并且多種樣品是更優(yōu)選的以計(jì)算標(biāo)記從生物分子或蛋白中隨著時(shí)間而減少的精確曲線(即，清除率)。在給定時(shí)間在樣品中的各標(biāo)記的同種型的量反映產(chǎn)生率或清除率(即，去除或破壞)，并且通常表示為受試者中同種型的％ /小時(shí)或質(zhì)量/時(shí)間(例如，mg/hr)。(h)應(yīng)用本發(fā)明的方法可用于確定是否目標(biāo)生物分子或蛋白的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝存在差別。一種同種型的產(chǎn)生率或清除率可有別于目標(biāo)其他同種型的產(chǎn)生率或清除率。而且，本發(fā)明的方法可用于確定是否目標(biāo)一種或多種同種型的體內(nèi)代謝隨著時(shí)間而改變。這種信息可允許本領(lǐng)域技術(shù)人員來診斷或監(jiān)控神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂的進(jìn)展或治療。類似地，這種信息可有助于理解疾病或紊亂的病原學(xué)和/或病理學(xué)。另外，本發(fā)明的方法可用于確定設(shè)計(jì)的治療性治療方法不同地影響多種同種型的效果。例如，Y-分泌酶調(diào)節(jié)劑可設(shè)計(jì)來減少淀粉樣-β H2同種型，而增加淀粉樣-β i_38 同種型。本發(fā)明的方法可用于測量淀粉樣同種型的產(chǎn)生和清除率，并且鑒定在相同樣品和試驗(yàn)中對(duì)于兩種同種型的特異性治療性應(yīng)答。本發(fā)明允許相同試驗(yàn)的相同樣品的同種型的直接比較。這控制不同試驗(yàn)條件并且除去對(duì)照和試驗(yàn)條件之間假設(shè)的必要，因此減少試驗(yàn)的生物和試驗(yàn)可變性。另外，本發(fā)明還通過在各樣品制劑中測量多于一種的同種型而直接減少樣品制劑的數(shù)量。此外，本發(fā)明減低了對(duì)于各蛋白同種型的特異性純化或抗體的需要，因?yàn)樗械鞍淄N型可收集在一起，并且然后LC-MS可一起分析所有同種型。這將導(dǎo)致即使實(shí)質(zhì)性減少，以開發(fā)各同種型的特異性抗體、樣品制備時(shí)間，并且也開發(fā)質(zhì)譜分析時(shí)間。更多的同種型被分析，并且更多時(shí)間和資源被節(jié)省。(II)確定治療劑是否影響兩種或多種蛋白片段的代謝的方法本發(fā)明的另一方面提供評(píng)價(jià)是否用于治療神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂的治療劑影響受試者的CNS中產(chǎn)生的生物分子或蛋白的各種同種型中任一種的代謝的方法。例如，各同種型的代謝可通過它們各自的片段來測量以確定是否特定治療劑導(dǎo)致給定同種型的產(chǎn)生增加、產(chǎn)生降低、清除增加、或清除降低。因此，使用本方法將允許本領(lǐng)域技術(shù)人員精確地確定目標(biāo)同種型的產(chǎn)生或清除的改變程度，并且使這些測量關(guān)聯(lián)于治療的臨床結(jié)果。 因此，來自該方法的結(jié)果可有助于確定治療劑的最佳劑量和給藥頻率，可有助于決定有關(guān)臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，并且可最終加速用于治療神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)退行性疾病的有效治療劑的批
所述方法包括將治療劑和標(biāo)記的部分施用至受試者，其中當(dāng)生物分子或蛋白在 CNS中產(chǎn)生時(shí)，標(biāo)記引入其中。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑可在施用標(biāo)記的部分之前施用至受試者。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記的部分可在施用治療劑之前施用至受試者。各種施用之間的時(shí)間期限可以是數(shù)分鐘、1小時(shí)、數(shù)小時(shí)、或更多小時(shí)。在甚至另外實(shí)施方案中，治療劑和標(biāo)記的部分可同時(shí)施用。所述方法還包括收集至少一種包含目標(biāo)生物分子或蛋白的標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的生物樣品，檢測標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型的量以確定各同種型的代謝，并且比較各同種型的代謝和合適的對(duì)照值，以確定是否治療劑改變受試者的CNS中特定同種型的產(chǎn)生率或清除率。神經(jīng)退行性疾病、生物分子或蛋白的同種型、標(biāo)記的部分、標(biāo)記的部分的施用途徑、生物樣品、檢測方式和分析方式的非限制性例子分別在上面章節(jié)(1) (a)、(1) (b)、(1) (c)、(1) (d)、(1) (e)、(1) (f)和(1) (g)中詳述。(a)治療劑本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到治療劑可以并將改變，這取決于待治療的神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病或紊亂、和/或代謝被分析的同種型。在同種型包括可溶性APP-α、可溶性 APP-β或淀粉樣(Αβ)肽的實(shí)施方案中，合適的治療劑的非限制性例子包括Y-分泌酶抑制劑、Y -分泌酶調(diào)制劑、β -分泌酶抑制劑、α -分泌酶激活劑、RAGE抑制劑、A β產(chǎn)生的小分子抑制劑、A β聚合的小分子抑制劑、A β產(chǎn)生的鉬-基抑制劑、聚合的鉬-基抑制劑、 干擾金屬-蛋白相互作用的藥劑、結(jié)合可溶性Αβ的蛋白(例如，低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白(LRP)或可溶性LRP)、和清除可溶性Aβ和/或斷裂沉積的Αβ的抗體。用于治療阿耳茨海默氏病的其他治療劑包括膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、膽堿脂酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑、激素、神經(jīng)保護(hù)劑和細(xì)胞死亡抑制劑。上述治療劑中的多種還可影響意指在神經(jīng)變性紊亂中的其他蛋白的體內(nèi)代謝。可影響tau和tau同種型的代謝的另外治療劑，例如包括tau激酶抑制劑、tau聚集抑制劑、組織蛋白酶D抑制劑等。而且，可影響突觸核蛋白和突觸核蛋白同種型的體內(nèi)代謝的治療劑包括乙?；?抑制劑、 突觸核蛋白聚集抑制劑、蛋白體抑制劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到多種不同治療劑可用在本發(fā)明的方法中。治療劑可依照已知的方法施用至受試者。典型地，治療劑口服施用，但是其他施用途徑例如胃腸外或局部施用也可以使用。施用至受試者的治療劑的量可以并將改變，其取決于藥劑的類型、受試者和施用的特定方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到劑量可使用Goodman & Goldman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition(2001), Appendix II, pp. 475—493 禾口 the Physicians' Desk Reference 的指導(dǎo)來確定。(b)對(duì)照值通常，對(duì)照值是指在施用治療劑之前目標(biāo)特定同種型在相同受試者中的體內(nèi)代謝，預(yù)計(jì)被治療劑差別影響或在未施用治療劑的不同受試者中的對(duì)照同種型。測試受試者和對(duì)照受試者之間的差別通常將揭示是否治療劑影響目標(biāo)特定同種型的產(chǎn)生率或清除率。 治療劑可差別改變一種目標(biāo)同種型的代謝，使得該信息可用于預(yù)計(jì)受試者對(duì)特定治療劑產(chǎn)生應(yīng)答。而且，該信息可用于確定特定治療劑的合適劑量和施用時(shí)間。定義
除非另有說明，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意思。下列參考文獻(xiàn)提供技術(shù)人員本發(fā)明中使用的多種術(shù)語的通常定義Singleton et al. , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed. ,1988)； The Glossary of Genetics,5th Ed. , R. Rieger et al. (eds. ), Springer Verlag(1991)； 禾口 Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文中使用， 除非另有說明，否則下列術(shù)語具有賦予它們的意思?！?Αβ 〃是指淀粉樣β。“清除率"是指生物分子或其同種型除去的速率?！?CNS樣品〃是指衍生自CNS組織或CNS流體的生物樣品。丨‘CNS組織〃包括血腦屏障內(nèi)的所有組織。類似地，“CNS流體"包括血腦屏障內(nèi)的所有流體?！?CNS衍生的細(xì)胞〃包括血腦屏障內(nèi)的所有細(xì)胞，包括神經(jīng)元、星形細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、其他膠質(zhì)細(xì)胞等?！凹?jí)分清除率"或FCR計(jì)算為標(biāo)記的生物分子或其同種型在指定的時(shí)間期限內(nèi)比例的自然對(duì)數(shù)?！凹?jí)分合成率"或FSR計(jì)算為標(biāo)記的生物分子或其同種型在指定的時(shí)間期限內(nèi)增加率的斜率除以標(biāo)記的前體的預(yù)計(jì)的穩(wěn)定態(tài)值?！巴N型"是指任何可替換形式的生物分子或蛋白，蛋白的同種型可通過下列非限制性機(jī)理而產(chǎn)生不同遺傳等位基因或拷貝、在轉(zhuǎn)錄過程中蛋白可選擇的切割、在翻譯過程改變的加工、翻譯后修飾、產(chǎn)生后修飾、內(nèi)源性加工、或內(nèi)源性裂解成產(chǎn)物?！巴凰?是指給定元素的所有形式，所述元素的細(xì)胞核具有相同的原子序數(shù)， 但是具有不同質(zhì)量數(shù)，因?yàn)樗鼈兒胁煌瑪?shù)量的中子。通過非限制性例子，12C和1V都是碳的穩(wěn)定的同位素?！皽髸r(shí)間"通常是指生物分子或其同種型首次標(biāo)記直到標(biāo)記的生物分子或其同種型被檢測之間的時(shí)間延遲?！按x"是指生物分子或其同種型的產(chǎn)生、運(yùn)輸、斷裂、修飾或清除率的任何組
I=I O‘‘產(chǎn)生率〃是指生物分子或其同種型產(chǎn)生的速率?！胺€(wěn)定態(tài)"是指在指定的時(shí)間期限內(nèi)測量參數(shù)未發(fā)生顯著改變的狀態(tài)。在代謝示蹤劑研究中，“穩(wěn)定同位素"是比最豐富的天然存在的同位素較少的非放射活性同位素。本文中使用的"受試者"意指具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活有機(jī)體。特別地，受試者可以是哺乳動(dòng)物。合適的受試者包括研究動(dòng)物、伴侶動(dòng)物、家畜和動(dòng)物園動(dòng)物。在無需過度試驗(yàn)的情況下考慮本公開，可以實(shí)施和執(zhí)行本文中公開和所要求的所有方法。盡管已經(jīng)涉及優(yōu)選實(shí)施方案來描述本發(fā)明的方法，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，在不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍的條件下，可對(duì)方法、或本文所述的方法的步驟或步驟順序進(jìn)行改變。更具體地，明顯的是，化學(xué)和生理相關(guān)的某些藥劑可代替本文中所述的藥劑，同時(shí)將實(shí)現(xiàn)相同或類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的所有這些類似的代替和修改被認(rèn)為在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。實(shí)施例下列實(shí)施例被包括以證實(shí)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到下面實(shí)施例中公開的技術(shù)表示本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，其在實(shí)施本發(fā)明中發(fā)揮良好，并且因此可被認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而考慮本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以對(duì)公開的特定實(shí)施方案進(jìn)行多種改變，并且仍舊獲得相同或類似的結(jié)果。實(shí)施例1 載脂蛋白E同種型穩(wěn)定的同位素標(biāo)記動(dòng)力學(xué)載脂蛋白E(ApoE)是阿耳茨海默氏病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。人有三種導(dǎo)致ApoE同種型的主要等位基因ApoE2(cysll2，cysl58)、ApoE3 (cysll2，argl58)和 ApoE4 (argll2， argl58)。下列例子證實(shí)使用穩(wěn)定同位素-標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜在相同樣品中同時(shí)檢測和定量不同ApoE同種型的方法。ApoE源是13C-標(biāo)記的和未標(biāo)記的生物樣品。標(biāo)記的和未標(biāo)記的人CSF樣品得自正在進(jìn)行的體內(nèi)穩(wěn)定的同位素標(biāo)記研究。星形細(xì)胞培養(yǎng)基收集自永生小鼠星形細(xì)胞，所述永生小鼠星形細(xì)胞衍生自敲入小鼠表達(dá)人ApoE2或ApoE4。使細(xì)胞在含有血清的生長培養(yǎng)基中生長至接近融匯，此時(shí)培養(yǎng)基改變至無血清培養(yǎng)基M小時(shí)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充0、1. 25、 2. 5、5、10 或 20% 13C6-亮氨酸(98% 13C6, Cambridge Isotope Laboratories, Andover,ΜΑ) ApoE通過下列方式分離和耦合CNBr-激活的kpharose珠的抗-ApoE抗體 (WUE4)孵育過夜，或者和 PHM-LiposorbTM(Calbiochem，San Diego, CA)孵育 30mir^4°C )。 將珠用PBS和IOOmM Tris, pH 8. 5洗滌。結(jié)合的ApoE蛋白使用三氟乙醇(40%，在25mM 碳酸氫銨上)變性。在變性后，ApoE蛋白在室溫下用5mM 二硫蘇糖醇(DTT)還原30min，并且在黑暗中在室溫下用IOmM碘乙酰胺(IAM)烷基化30min。將樣品在珠上在37°C下使用 0. 5μ g的胰蛋白酶消化過夜。在使用Nu-tip碳尖(Glygen Corp. ,Columbia,MD)脫鹽后，將含有 ApoE 肽的上清通過之前描述(Bateman et al. ,2006, Nature Medicine, 12 :856-861) 的納升-LC 串聯(lián)MS(Thermo-Finnigan LTQ，裝備有 New Objective nanoflow ESI 源)來分析。樣品使用由 Bateman et al. 2007 J Am Soc Mass Spectrum 18(6) :007-1006 描述的穩(wěn)定同位素串聯(lián)標(biāo)記的(SILT)質(zhì)譜法來定量。標(biāo)記的離子質(zhì)量偏移6、3、2或1.5m/z，這取決于任何特定前體的電荷(即，分別+1、+21、+3或+4)。標(biāo)記的ApoE的百分率使用標(biāo)記與未標(biāo)記的肽的所有b和y離子的比來計(jì)算。檢測4種同位素特異性ApoE肽(參見表1)。當(dāng)集合在一起時(shí)，ApoE2和ApoE4培養(yǎng)基產(chǎn)生所有四種同種型特定肽(圖1)。類似地，所有四種肽在來自表達(dá)兩種不同同種型的雜合個(gè)體的CSF中進(jìn)行檢測(圖幻。圖1和2中檢測的ApoE肽產(chǎn)生自ApoE蛋白，該蛋白通過吸附至Liposorb而分離。圖3示出ApoE3肽的檢測，該肽產(chǎn)生自ApoE蛋白，該蛋白通過免疫沉淀法分離。相對(duì)于測定對(duì)預(yù)計(jì)的標(biāo)記與未標(biāo)記的肽的百分率，所有四種ApoE肽在1-20% 13C-標(biāo)記范圍內(nèi)顯示強(qiáng)烈線性相關(guān)(圖4)。這些數(shù)據(jù)指示這些同種型特定肽的檢測對(duì)于定量是牢靠的和可重現(xiàn)的。表1.人ApoE同種型特異性胰蛋白酶肽
1權(quán)利要求
1.一種同時(shí)測量產(chǎn)生在受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法，該方法包括a)將標(biāo)記的部分施用至所述受試者，在所述受試者中產(chǎn)生所述生物分子時(shí)，所述標(biāo)記的部分引入所述生物分子中；b)從所述受試者獲得生物樣品，所述生物樣品包含用所述部分標(biāo)記的第一生物分子級(jí)分和不用所述部分標(biāo)記的第二生物分子級(jí)分，所述第一生物分子級(jí)分包含所述生物分子的兩種或多種標(biāo)記的同種型，并且所述第二生物分子級(jí)分包含所述生物分子的兩種或多種未標(biāo)記的同種型；以及c)檢測各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量，其中對(duì)于特定同種型的標(biāo)記的同種型與未標(biāo)記的同種型的比例直接成比例于所述受試者中所述特定同種型的代謝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白，所述蛋白的兩種或多種同種型選自通過蛋白酶活性體內(nèi)產(chǎn)生的裂解片段、通過非蛋白酶活性體內(nèi)產(chǎn)生的裂解片段、 所述蛋白的遺傳等位基因、RNA加工產(chǎn)物和翻譯后產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述遺傳等位基因、RNA加工產(chǎn)物和翻譯后產(chǎn)物在步驟(c)中檢測為通過蛋白酶活性離體產(chǎn)生的同種型特異性片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述蛋白選自淀粉樣_β、載脂蛋白E、載脂蛋白 1、突觸核蛋白、可溶性淀粉樣前體蛋白、1^1130 -43、亨廷頓蛋白、前顆粒蛋白、0-2巨球蛋白、S100B、髓鞘堿性蛋白、白細(xì)胞介素和TNF。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分包含選自2H、13C、15N、170、180、33S、 34S和siS的非放射活性同位素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分是包含1V的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分通過選自靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、 腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和口服的途徑施用至所述受試者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品選自腦脊髓液、血液、尿液、唾液、 眼淚、腦組織和脊髓組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括從所述生物樣品分離所述標(biāo)記的同種型和所述未標(biāo)記的同種型。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述標(biāo)記的片段和所述未標(biāo)記的片段通過選自下列的方法分離自所述生物樣品免疫沉淀法、吸附至衍生聚合物、液相色譜法及其組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量通過質(zhì)譜檢測。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述標(biāo)記的部分是13C6-亮氨酸；所述蛋白是載脂蛋白E(ApoE) ；ApoE通過免疫沉淀法或吸附至衍生多羥基亞甲基聚合物分離自所述生物樣品；被檢測的所述同種型是通過ApoE的離體裂解產(chǎn)生的ApoE同種型特異性片段；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述標(biāo)記的部分是13C6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)；所述同種型是可溶性APP-α和可溶性ΑΡΡ-β ； 所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過免疫沉淀法分離自所述樣品；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述標(biāo)記的部分是 13C6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉樣- β ；所述同種型選自淀粉樣- β i_38、淀粉樣- β M9、淀粉樣-β ^、淀粉樣-β H1和淀粉樣-β H2 ；所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過免疫沉淀法分離自所述樣品；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
15.一種確定治療劑是否影響在受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法，該方法包括a)將所述治療劑施用至所述受試者；b)將標(biāo)記的部分施用至所述受試者，在所述受試者中產(chǎn)生所述生物分子時(shí)，所述標(biāo)記的部分引入所述生物分子中；c)從所述受試者獲得生物樣品，所述生物樣品包含用所述部分標(biāo)記的第一生物分子級(jí)分和不用所述部分標(biāo)記的第二生物分子級(jí)分，所述第一生物分子級(jí)分包含所述生物分子的兩種或多種標(biāo)記的同種型，并且所述第二生物分子級(jí)分包含所述生物分子的兩種或多種未標(biāo)記的同種型；d)檢測所述生物樣品中各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量，其中對(duì)于特定同種型的標(biāo)記的同種型與未標(biāo)記的同種型的比例直接成比例于所述受試者中所述特定同種型的代謝；以及e)比較各同種型的代謝和合適的對(duì)照值，使得對(duì)于特定同種型從所述對(duì)照值的改變指示所述治療劑影響在所述受試者的所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所述特定同種型的代謝。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟(b)在步驟(a)之前進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白，所述蛋白的兩種或多種同種型選自通過蛋白酶活性體內(nèi)產(chǎn)生的裂解片段、通過非蛋白酶活性體內(nèi)產(chǎn)生的裂解片段、所述蛋白的遺傳等位基因、RNA加工產(chǎn)物和翻譯后產(chǎn)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述遺傳等位基因、RNA加工產(chǎn)物和翻譯后產(chǎn)物在步驟(d)中檢測為通過蛋白酶活性離體產(chǎn)生的同種型特異性片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述蛋白選自淀粉樣-β、載脂蛋白E、載脂蛋白J、突觸核蛋白、可溶性淀粉樣前體蛋白、Tau、TDP-43、亨廷頓蛋白、前顆粒蛋白、α _2巨球蛋白、S100B、髓鞘堿性蛋白、白細(xì)胞介素和TNF。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分包含選自咕、13(、151170、180、335、 34S和siS的非放射活性同位素。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分是包含13C的氨基酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述標(biāo)記的部分通過選自靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和口服的途徑施用至所述受試者。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述治療劑通過選自靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和口服的途徑施用至所述受試者。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物樣品選自腦脊髓液、血液、尿液、唾液、眼淚、腦組織和脊髓組織。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述合適的對(duì)照值選自施用所述治療劑之前的相同受試者、未施用所述治療劑的對(duì)照受試者和對(duì)照同種型。
26.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，還包括從所述生物樣品分離所述標(biāo)記的同種型和所述未標(biāo)記的同種型。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述標(biāo)記的同種型和所述未標(biāo)記的同種型通過選自下列的方法分離自所述生物樣品免疫沉淀法、吸附至衍生聚合物、液相色譜法及其組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中各標(biāo)記的同種型的量和各未標(biāo)記的同種型的量通過質(zhì)譜檢測。
29.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述標(biāo)記的部分是 UC6-亮氨酸；所述蛋白是載脂蛋白E(ApoE) ；ApoE通過免疫沉淀法或吸附至衍生多羥基亞甲基聚合物分離自所述生物樣品；被檢測的所述同種型是通過ApoE的離體裂解產(chǎn)生的 ApoE同種型特異性片段；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
30.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述標(biāo)記的部分是 UC6-亮氨酸；所述蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)；所述同種型是可溶性APP-α和可溶性 APP-β ；所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過免疫沉淀法分離自所述樣品；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
31.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物分子是蛋白；所述蛋白是淀粉樣-β； 所述標(biāo)記的部分是1%-亮氨酸；所述同種型選自淀粉樣-β i-38、淀粉樣-β H9、淀粉樣-β ^、淀粉樣-β H1和淀粉樣-β H2 ；所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過免疫沉淀法分離自所述樣品；以及所述標(biāo)記的和未標(biāo)記的同種型通過質(zhì)譜檢測。
全文摘要
本發(fā)明包括同時(shí)測量生物分子的兩種或多種同種型的體內(nèi)代謝的方法。生物分子典型地產(chǎn)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102246033SQ200980150353
公開日2011年11月16日 申請日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者J·多布羅夫斯卡, K·G·穆恩耶加, K·R·懷爾德史密斯, L·芒賽爾, R·J·貝特曼 申請人:華盛頓大學(xué)