專(zhuān)利名稱(chēng)：用于具有抗血管發(fā)生活性的抑制劑的生物標(biāo)志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于通過(guò)使用某些鑒定的生物標(biāo)志來(lái)評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑和小分子 ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑對(duì)血管發(fā)生的作用的方法。此方法對(duì)測(cè)定主要用于治療血管發(fā)生相關(guān)疾病如癌癥的整聯(lián)蛋白抑制劑和小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑的功效尤其有益。尤其是，本發(fā)明涉及與血管發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志，其優(yōu)選是在體液中可及的，并因此允許以無(wú)損傷的方式分析靶調(diào)節(jié)。還公開(kāi)了該生物標(biāo)志在篩選具有整聯(lián)蛋白抑制活性的化合物中的用途。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生廣泛適用于從已有的血管系統(tǒng)(casculature)形成新的血管。經(jīng)歷 DNA合成的內(nèi)皮細(xì)胞增殖是生成血管的微血管血管芽(vaseularsprout)的共同標(biāo)志，而廣泛的芽主要需要內(nèi)皮細(xì)胞遷移。血管發(fā)生是由一系列血管發(fā)生因子和抑制劑安排的基本過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的激活劑主要是受體酪氨酸激酶配體，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)， 但也可以具有非常不同的來(lái)源，如溶血磷脂來(lái)源(LPA) (Berger等QO(^)Nature Reviews 3，401-410頁(yè))。EGF上調(diào)VEGF、FGF和白細(xì)胞介素_8 (IL-8)，而LPA上調(diào)VEGF水平。最先描述的血管發(fā)生抑制劑是血小板反應(yīng)蛋白-1，其調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和游動(dòng)性。顯著地，許多抑制分子(如抑制素)衍生自對(duì)血管發(fā)生無(wú)作用的更大的蛋白質(zhì)；例如制管張素(結(jié)合ATP合酶和膜聯(lián)蛋白III的纖維蛋白溶酶原片段)，以及內(nèi)皮抑制素、tumstatin和canstatin (與整聯(lián)蛋白結(jié)合的膠原蛋白片段)。一般而言，激活劑和抑制劑的水平指定內(nèi)皮細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)或血管發(fā)生狀態(tài)。據(jù)信，血管發(fā)生平衡中的改變介導(dǎo)血管發(fā)生的轉(zhuǎn)換。其生理作用在于細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育、再生和修復(fù)。病理血管發(fā)生是腫瘤及其轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)超過(guò)微觀尺寸所必需的，且它可以引起出血、血管滲漏和組織破壞。病理血管發(fā)生的結(jié)果可以直接或間接導(dǎo)致與廣范圍的血管發(fā)生相關(guān)疾病相關(guān)的癥狀、失能或死亡。這類(lèi)疾病的實(shí)例包括腫瘤障礙、自身免疫病、黃斑變性和動(dòng)脈粥樣硬化(atheriosclerosis)寸。關(guān)于腫瘤進(jìn)展，取決于腫瘤類(lèi)型和環(huán)境，血管發(fā)生轉(zhuǎn)換可以發(fā)生在腫瘤進(jìn)展途徑的不同階段。但是，新血管形成通常是腫瘤進(jìn)展的先決條件。幾條信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及血管發(fā)生的過(guò)程。VEGF在血管生成(vasculogenesis)和血管發(fā)生(angiogenesis)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；在所有血管發(fā)生因子中，VEGF最頻繁地與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。初步的證據(jù)表明，多種同種型的過(guò)量表達(dá)可以對(duì)腫瘤具有不同的作用。腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生中的關(guān)鍵步驟包括由腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，其與它的受體 VEGFR2和內(nèi)皮細(xì)胞上的神經(jīng)粗蛋白結(jié)合(Folkman 2007，Nature Reviews,6, 273-286 頁(yè))。最常見(jiàn)的是來(lái)自腫瘤的至少6種其他促血管發(fā)生因子(pro-angiogenic factor) 0 從腫瘤細(xì)胞，但還由VEGF刺激的細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。MMP動(dòng)員來(lái)自基質(zhì)的促血管發(fā)生蛋白質(zhì)，但還在血管壁中從膠原蛋白18切割血管發(fā)生抑制劑內(nèi)皮抑制素，并參與從循環(huán)纖維蛋白溶酶原切割血管發(fā)生抑制劑制管張素。腫瘤細(xì)胞分泌血管發(fā)生素 (angiopoetin)2(ANGPT2)，其與ANGPTl競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合內(nèi)皮TIE2受體。由許多細(xì)胞表達(dá)的血管發(fā)生素(angiopoietin) 1 (ANGPTl)與內(nèi)皮TIE2 (也稱(chēng)為T(mén)EK)受體結(jié)合，并在血管中幫助維持正常化狀態(tài)。ANGPT2增加血管基膜的降解和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，從而便于芽形成。由許多腫瘤分泌的PDGF可以上調(diào)其自身在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體(PDGFR)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)由其他腫瘤分泌。響應(yīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如VEGF和bFGF，內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)某些整聯(lián)蛋白。整聯(lián)蛋白是細(xì)胞表面黏附分子，其便于內(nèi)皮與胞外環(huán)境結(jié)合，該結(jié)合為細(xì)胞保持生存力和對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白的反應(yīng)性所需。內(nèi)皮細(xì)胞是最具貼壁依賴(lài)性的細(xì)胞。認(rèn)為整聯(lián)蛋白在向腫瘤遷移和提高它們對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如VEGF和bFGF的敏感性所需的間歇脫附過(guò)程中維持內(nèi)皮細(xì)胞生存力。整聯(lián)蛋白在腫瘤血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移，及幾種其他血管發(fā)生依賴(lài)性人疾病如牛皮癬和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Mousa SA, Drugs of theFuture 1998 ；23(1) :51-60)。 它們是將胞外環(huán)境與細(xì)胞骨架偶聯(lián)的細(xì)胞表面黏附分子(Geiger B.等，Nat Rev Mol Cell Biol 2001 ；2 =793-805) 0除其結(jié)構(gòu)功能外，它們還是用于傳遞對(duì)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和存活重要的信號(hào)的受體。由整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的信號(hào)發(fā)放事件是多樣的，且依賴(lài)于細(xì)胞背景。與胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體誘導(dǎo)構(gòu)象變化和整聯(lián)蛋白成束，導(dǎo)致信號(hào)發(fā)放級(jí)聯(lián)的激活和將多蛋白復(fù)合體招募至黏著斑(Geiger B.等，Nat Rev MolCell Biol 2001 ；2 :793-805)。通過(guò)包括 Ras,MAP 激酶(MAPK)、黏著斑激酶(FAK)、Src、Rac/Rho/cdc42GTP 酶、PKC 和 PI3K 的多種胞內(nèi)蛋白激酶和銜接分子傳遞信息。通過(guò)這些分子，整聯(lián)蛋白信號(hào)發(fā)放緊密，而協(xié)調(diào)地與受體酪氨酸激酶信號(hào)發(fā)放相互作用來(lái)調(diào)節(jié)存活、增殖、黏附和遷移(Giancotti FG.等，Science 1999 ；285 (5430) :1028-32)。整聯(lián)蛋白形成由α和β兩個(gè)亞基組成的異二聚體(Hynes R0. TrendsCell Biol 1999 ；12 :33-37)。它們有差別地表達(dá)在多種細(xì)胞類(lèi)型上，并識(shí)別胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的多個(gè)配體，如膠原蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。包括α (ν) β (3)和α (ν) β (5)的整聯(lián)蛋白亞型識(shí)別其配體中的共有基序RGD序列，該序列存在于諸如玻連蛋白、纖連蛋白、凝血因子 I 的配體中(Ruoslahti E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. 12 :697-715)。α νβ 5整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合玻連蛋白，而α νβ 3還結(jié)合臨時(shí)ECM的其他大分子。 α νβ 3結(jié)合例如包括血纖蛋白、凝血因子I、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、玻連蛋白、von Willebrand因子、osteospontin和骨唾液酸蛋白I的配體。這些整聯(lián)蛋白在組織中的許多細(xì)胞相互作用中所發(fā)揮的具體的細(xì)胞黏附作用仍處于研究中，但清楚的是，存在具有不同生物功能的不同整聯(lián)蛋白。α νβ 3在活化的內(nèi)皮細(xì)胞，如腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上，而不在靜息內(nèi)皮細(xì)胞和大多數(shù)正常器官系統(tǒng)上高表達(dá)，這使其成為用于抗血管發(fā)生療法的適宜靶標(biāo)(Brooks PC等，Science 1994 ；264 :569-71)。最初作為惡性黑素瘤的進(jìn)展依賴(lài)性標(biāo)志在癌癥中注意到了 α νβ 3。 它增強(qiáng)了黑素瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)和體外存活。α νβ 3阻斷劑逆轉(zhuǎn)了這些作用。隨后，在包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌等的其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 ανβ3。在許多惡性腫瘤中，ανβ3 還廣泛地過(guò)量表達(dá)于EC中。在體外，由腫瘤衍生的生長(zhǎng)因子激活的血管發(fā)生模型在出芽 (sprouting)的血管系統(tǒng)上過(guò)量表達(dá)且需要ανβ3，而ανβ3和α ν β 5阻斷可抑制血管發(fā)生表型。還顯示α ν β 5支持由一些腫瘤衍生的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的新血管形成。抑制α ν β 5 可以觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡。已提出將整聯(lián)蛋白抑制劑作為尤其是用于預(yù)防和治療主要與血管發(fā)生相關(guān)的障礙的人和獸藥中的藥物有效成分。它們可以用于治療和預(yù)防循環(huán)、血栓形成、心肌梗塞、動(dòng)脈硬化、炎癥、中風(fēng)、心絞痛、腫瘤障礙、溶骨障礙尤其是骨質(zhì)疏松癥、血管發(fā)生和血管發(fā)生引起的障礙，例如眼睛的糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、近視、眼組織胞漿菌病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、虹膜紅變性青光眼、以及潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病(Crohn'sdisease)、多發(fā)性硬化、牛皮癬和血管成形術(shù)后再狹窄。有幾種處于臨床開(kāi)發(fā)中的用于治療癌癥、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬的整聯(lián)蛋白抑制劑，如西倉(cāng)吉肽(cilengitide)、abegrin(vitaxin，MEDI-522)、CNT095、DI-17E6 和 volociximab (Nemeth JA 等，Cancer Invest. 2007 ；25 (7) :632-646)。它們拮抗整聯(lián)蛋白與胞外基質(zhì)(ECM)相互作用，并擾亂內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞的功能。該整聯(lián)蛋白抑制劑表征為不同的特異性和作用機(jī)制。abegrin、volociximab、DI-17E6和CNT095是單克隆抗體拮抗劑。西侖吉肽是模擬RGD基序的拮抗環(huán)肽(環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)) (EP 0770622)。西侖吉肽靶向α ν-整聯(lián)蛋白，尤其是ανβ3和ανβ5。US6521593公開(kāi)了用西侖吉肽作為α νβ 3/ α νβ 5整聯(lián)蛋白抑制劑抑制腦中腫瘤生長(zhǎng)的方法。該發(fā)明包括該整聯(lián)蛋白抑制劑顯示依賴(lài)于抗血管發(fā)生的抗腫瘤發(fā)生作用。此外， 該整聯(lián)蛋白拮抗作用可以誘導(dǎo)不依賴(lài)于抗血管發(fā)生的直接的腫瘤細(xì)胞死亡。W002/41910涉及西侖吉肽作為α νβ 3/ α νβ 5整聯(lián)蛋白抑制劑在治療由血管發(fā)生引起的患者眼睛的疾病中的用途。單克隆小鼠抗體17Ε6特異性抑制具有人整聯(lián)蛋白受體的細(xì)胞的α ν-整聯(lián)蛋白亞基。例如 Mitjans 等(1995 J. Cell Sci. 108,2825)及專(zhuān)利 US5, 985，278 和 EP 719 859 描述了小鼠IgGl抗體。鼠17E6產(chǎn)生自用純化并固定在瓊脂糖上的人ανβ3免疫的小鼠。將來(lái)自免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，得到的雜交瘤克隆之一產(chǎn)生單克隆抗體17Ε6。DI-17Ε6 (CAS No :1105038-73-0)是這樣的抗體，其具有單克隆小鼠抗體17E6的生物學(xué)特征，但尤其是就在人中的免疫原性而言具有改進(jìn)的特性。此修飾的抗體的完整的可變和恒定氨基酸序列顯示于

圖1中和W02009/01(^90中。已在將它們用于抗血管發(fā)生療法的范圍內(nèi)發(fā)展了例如針對(duì)VEGF和VEGFR的酪氨酸激酶抑制劑。VEGFR的酪氨酸激酶抑制劑是低分子量、模擬ATP的蛋白質(zhì)，其與VEGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合催化位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放的阻斷(Morabito等2006The Oncologistll =753-764) 0這些藥劑中的幾種目前處于臨床開(kāi)發(fā)的不同階段。大規(guī)模的隨機(jī)化II期試驗(yàn)已顯示了舒尼替尼(sunitinib)和索拉非尼(sorafenib)分別在治療患有用標(biāo)準(zhǔn)療法難治的胃腸道間質(zhì)腫瘤(GIST)和腎癌的患者中的功效。舒尼替尼(SU011M8)是顯示有效的抗血管發(fā)生和抗腫瘤活性的口服小分子酪氨酸激酶抑制劑(0'Farrell AM等，2003. Blood 101 :3597-3605)。它是小分子ATP位點(diǎn)定向競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。諸如SU6668和STO416 (semaxanib)的酪氨酸激酶抑制劑顯示差的藥理學(xué)特性和有限的功效；因此，針對(duì)其高生物利用率及其對(duì)抗血管發(fā)生的受體酪氨酸激酶(RTK) (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR))的納摩爾范圍效力合理地設(shè)計(jì)和選擇了舒尼替尼。舒尼替尼抑制其他酪氨酸激酶，包括KIT、FLT3、集落刺
6激因子I(CSF-I)和RET，這些酪氨酸激酶涉及許多惡性腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌、GI間質(zhì)腫瘤(GIST)、乳腺癌、急性髓細(xì)胞白血病、2A和2B型多發(fā)性?xún)?nèi)分泌瘤病及家族性甲狀腺髓樣癌。舒尼替尼在臨床前研究中顯示強(qiáng)健的抗腫瘤活性，在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、腎癌和鱗狀細(xì)胞癌的模型中不僅導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制，還導(dǎo)致腫瘤消退，這與VEGFR和PDGFR磷酸化的抑制相關(guān)。在II期研究中在神經(jīng)內(nèi)分泌癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中顯示了臨床活性，而在晚期腎細(xì)胞癌中和在伊馬替尼(imatinib)難治的GIST中已顯示了明確的功效，導(dǎo)致美國(guó)食品與藥品管理局(US Food and DrugAdministration)批準(zhǔn)將舒尼替尼用于治療這兩種疾病。在多種腫瘤類(lèi)型中調(diào)查舒尼替尼單獨(dú)和與化學(xué)療法組合的研究正在進(jìn)行中。RTK 的split激酶結(jié)構(gòu)域家族成員的此小分子抑制劑的臨床基準(zhǔn)確定將導(dǎo)致關(guān)于生物學(xué)、潛在的生物標(biāo)志和在腫瘤、間質(zhì)和內(nèi)皮腔隙中靶向多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的藥劑的臨床效用的其他認(rèn)知。索拉非尼是最初發(fā)展作為Raf激酶信號(hào)發(fā)放的特異性抑制劑的新的雙芳基尿素 (Morabito等2006The Oncologist 11:753-764)。隨后的研究已顯示，此化合物還抑制涉及腫瘤進(jìn)展的幾種其他酪氨酸激酶，包括VEGFR。如通過(guò)抗CD-31免疫染色所測(cè)量，用索拉非尼處理的結(jié)腸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的異種移植模型顯示腫瘤血管發(fā)生的顯著抑制。用索拉非尼在患有不同類(lèi)型腫瘤的患者中進(jìn)行了大規(guī)模的II期隨機(jī)化試驗(yàn)。已報(bào)道了 202名患有晚期腎細(xì)胞癌的患者的結(jié)果。隨后的隨機(jī)化、安慰劑對(duì)照的III期試驗(yàn)確認(rèn)了索拉非尼在細(xì)胞因子難治的晚期腎癌患者中的功效。索拉非尼被很好地耐受，具有可管理的副作用疹(34% )、腹瀉(33% )、手足皮膚反應(yīng)(27% )、疲勞( % )和高血壓 (11% )?；谶@些結(jié)果，F(xiàn)DA于2005年12月宣布批準(zhǔn)將索拉非尼用于患有晚期腎癌的患者。此外，歐洲委員會(huì)(European Commission)最近批準(zhǔn)了索拉非尼用于治療肝細(xì)胞癌的孤兒藥品地位。在II期試驗(yàn)中，用索拉非尼治療的43%的患者經(jīng)歷了持續(xù)至少4個(gè)月的穩(wěn)定疾病，且另外9%的患者經(jīng)歷了腫瘤縮小。目前，III期臨床試驗(yàn)正在評(píng)價(jià)索拉非尼在肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性黑素瘤和NSCLC中的功效；此外，正在用索拉非尼與幾種化療劑(伊立替康 (irinotecan)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine))或分子靶向劑(吉非替尼(gefitinib))組合在晚期實(shí)體瘤中進(jìn)行幾項(xiàng)其他I/II期研究，以最大化該藥物的治療潛能?？寡馨l(fā)生療法主要靶向例如腫瘤中活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞。它可以通過(guò)經(jīng)上文所述的整聯(lián)蛋白抑制防止內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)環(huán)境反應(yīng)來(lái)直接達(dá)到此目的?？寡馨l(fā)生療法還可以通過(guò)如貝伐單抗所做的中和血管發(fā)生因子來(lái)起作用(見(jiàn)下文)。例如血管發(fā)生因子的遺傳變異對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病的臨床治療具有重要影響。例如，由于內(nèi)皮抑制素前體基因的額外拷貝，患有唐氏綜合癥(Down syndrome)的個(gè)體具有比正常個(gè)體高1.6倍的內(nèi)皮抑制素水平。他們似乎是所有人中最不受癌癥影響的。因此，應(yīng)在抗血管發(fā)生療法中考慮由遺傳變異引起的血管發(fā)生中的差異。最優(yōu)地，抗血管發(fā)生療法可以需要將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于穩(wěn)定狀態(tài)的血液抑制劑水平。因此，對(duì)于環(huán)狀多肽抑制劑如西侖吉肽，經(jīng)常施用可以是最優(yōu)的。但是，由于持久的抗體，可以按更大的間隔施用單克隆抗體，如D7E16。腫瘤可以變得用抗血管發(fā)生療法難治，尤其是如果單一的抗血管發(fā)生療法僅靶向一種血管發(fā)生蛋白質(zhì)(例如VEGF)。使用抗VEGF療法(如抗VEGF的抗體(貝伐單抗))，早期腫瘤的血管系統(tǒng)減少，且腫瘤生長(zhǎng)受限制。但是，在回顧性分析中，用貝伐單抗持續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)移
7性腫瘤進(jìn)行抗血管發(fā)生治療未產(chǎn)生益處。雖然高達(dá)60%的人腫瘤表達(dá)VEGF，但大部分腫瘤還可以表達(dá)5至8種其他血管發(fā)生蛋白質(zhì)。在長(zhǎng)時(shí)間抑制該表達(dá)時(shí)，可以出現(xiàn)另一血管發(fā)生蛋白質(zhì)的表達(dá)(Dorrell 等 Q007)Proc. Natl. Acad. Scidoi :10. 1073/pnas. 0607542104)。因此，由于上述原因，說(shuō)明所關(guān)聯(lián)的信號(hào)途徑的一系列敏感和特異的生物標(biāo)志可以輔助選擇抗血管發(fā)生療法。此外，甚至在可以在解剖學(xué)上對(duì)其進(jìn)行定位之前，它們即可以支持微觀復(fù)發(fā)腫瘤的診斷。此外，可通過(guò)顯著低于高度血管化的腫瘤所需的血管發(fā)生抑制劑的劑量來(lái)抑制弱血管化的腫瘤。這些腫瘤可表達(dá)其自身的血管發(fā)生抑制劑，并可以對(duì)更低劑量的血管發(fā)生抑制劑反應(yīng)。例如廣范圍的腫瘤類(lèi)型及其發(fā)展中的遺傳變異和多樣的血管發(fā)生過(guò)程尤其需要一系列提供信息的生物標(biāo)志來(lái)優(yōu)化和個(gè)性化抗血管發(fā)生療法。還可能用基于血管發(fā)生的生物標(biāo)志來(lái)監(jiān)測(cè)某些非瘤的(non-neoplastic)血管發(fā)生依賴(lài)性疾病的進(jìn)展或消退。這些疾病包括例如動(dòng)脈粥樣硬化、子宮內(nèi)膜異位癥、克羅恩氏病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。發(fā)明_既述本發(fā)明基于抗血管發(fā)生治療需要提供信息的分子生物標(biāo)志的多種經(jīng)驗(yàn) (Bertolini F 等 Drug Discov Today. 2007 ； 12 (19-20) :806-12)。該生物標(biāo)志可以?xún)?yōu)選用于例如(1)測(cè)量分子靶標(biāo)狀態(tài)和藥物對(duì)靶標(biāo)的藥物作用的藥效(PD)終點(diǎn)；(2)鑒定血管發(fā)生相關(guān)途徑；(3)找到對(duì)個(gè)體患者而言最適合的抗血管發(fā)生藥物；(4)提供靶標(biāo)調(diào)節(jié)的概念證據(jù)；(5)測(cè)試潛在的假設(shè)；(6)提供抗血管發(fā)生療法的劑量和方案的合理選擇；(7)解釋或預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。雖然分子癌癥治療有許多成功如曲妥珠單抗(trastuzumab)和伊馬替尼，但只有少數(shù)進(jìn)入臨床的腫瘤學(xué)藥物獲得上市批準(zhǔn)。分子生物標(biāo)志的使用應(yīng)降低此高水平的損耗， 從而降低藥物開(kāi)發(fā)成本和提高為癌癥患者贏得創(chuàng)新和活性藥物的可能性。這些分子生物標(biāo)志可以補(bǔ)充由細(xì)胞生物標(biāo)志提供的信息。細(xì)胞生物標(biāo)志是例如不同的內(nèi)皮細(xì)胞群體，如用作血管發(fā)生標(biāo)志的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞。分子生物標(biāo)志可以彌補(bǔ)細(xì)胞生物標(biāo)志的不足，如內(nèi)皮細(xì)胞群體的主觀計(jì)數(shù)。該細(xì)胞生物標(biāo)志的使用需要腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的表征中更多的工作(Bertolini等Q007)Drug discovery today 12,806-812) ο此外，對(duì)于常規(guī)應(yīng)用，諸如動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast resonanceimaging(DCE-MRI))的成像技術(shù)作為測(cè)量血管發(fā)生的方法具有一些強(qiáng)的限制。這些技術(shù)很昂貴，并限于具有充足儀器的中心。本發(fā)明涉及評(píng)估治療劑或藥物的作用、功效、安全性、預(yù)后和/或施用的方法，該治療劑或藥物是血管發(fā)生抑制劑，優(yōu)選用于治療患有血管發(fā)生相關(guān)疾病，優(yōu)選腫瘤的患者的整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑(small molecule ATP site directed multi—kinase inhibitor)。
本發(fā)明還涉及評(píng)估血管發(fā)生抑制劑，優(yōu)選整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑對(duì)這樣的血管發(fā)生的作用的方法。本發(fā)明還涉及用于在基于細(xì)胞的模型中篩選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法。在第一方面，本發(fā)明涉及用于利用具體的提供信息的分子生物標(biāo)志來(lái)評(píng)估血管發(fā)生抑制劑，優(yōu)選整聯(lián)蛋白或ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑對(duì)血管發(fā)生的作用的方法。因此，本發(fā)明尤其基于評(píng)估優(yōu)選在抗血管發(fā)生療法的背景中應(yīng)當(dāng)應(yīng)用于個(gè)體的血管發(fā)生抑制劑的功效的需要。為了治療背景部分中所述的血管發(fā)生相關(guān)疾病，將應(yīng)用該抗血管發(fā)生療法。在另一方面，本發(fā)明涉及該提供信息的分子生物標(biāo)志在患有血管發(fā)生，優(yōu)選整聯(lián)蛋白相關(guān)疾病的患者的診斷和治療中測(cè)定和預(yù)測(cè)這類(lèi)抑制劑的功效中的用途。在提供信息的分子生物標(biāo)志的建立中存在必須考慮的不同注意事項(xiàng)，應(yīng)評(píng)估在抗血管發(fā)生療法的背景中對(duì)個(gè)體施用的血管發(fā)生抑制劑的功效。例如，由于可以對(duì)患有不同類(lèi)型的血管發(fā)生相關(guān)疾病，且不同類(lèi)型的組織和/或器官受該疾病影響的個(gè)體施用抗血管發(fā)生療法，很難或由于醫(yī)療原因甚至不可能獲得足夠的活檢組織來(lái)進(jìn)行分子生物標(biāo)志的分析。此外，若用血管發(fā)生抑制劑例如靶向個(gè)體中轉(zhuǎn)移的腫瘤，則為了分析該抑制劑的作用，多種靶組織的不同活檢組織可以是必需的。因此，用血管發(fā)生抑制劑處理引起的血管發(fā)生依賴(lài)性腫瘤進(jìn)展的評(píng)價(jià)需要某些不同的組織樣品。此外，由于血管發(fā)生依賴(lài)于新血管的形成，且許多血管發(fā)生步驟涉及循環(huán)中的蛋白質(zhì)，不可以通過(guò)分析分子生物標(biāo)志在某種組織中的出現(xiàn)或消失來(lái)評(píng)價(jià)抗血管發(fā)生療法的成功。因此，循環(huán)蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志的用途可以提供關(guān)于抗血管發(fā)生療法的成功的信息。該循環(huán)蛋白質(zhì)可以是可在體液中檢測(cè)的，因此，它們對(duì)克服所討論的注意事項(xiàng)可以是有利的。已在施用某些抗血管發(fā)生療法后在血漿中分析了單個(gè)選擇的血管發(fā)生生長(zhǎng)因子 (angiogenic growth factor)，如 VEGFΛ bFGF 禾口 PLGF (Jubb 等 2006，Nature Reviews，6， 626-63 。但由于來(lái)自血小板和其他細(xì)胞的許多生長(zhǎng)因子的活躍攝取，血漿中血管發(fā)生生長(zhǎng)因子的有意義的評(píng)價(jià)是受限制的。此外，腫瘤細(xì)胞表達(dá)不同水平的該血管發(fā)生生長(zhǎng)因子。 此外，由于血管發(fā)生的復(fù)雜性和蛋白質(zhì)循環(huán)的復(fù)雜性，樣品中少數(shù)單個(gè)生物標(biāo)志的評(píng)價(jià)不足以評(píng)價(jià)抗血管發(fā)生療法。因此，優(yōu)選隸屬于不同蛋白質(zhì)家族和以不同方式涉及血管發(fā)生或相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一系列某些分子生物標(biāo)志可以補(bǔ)充抗血管發(fā)生藥物監(jiān)測(cè)中足夠工具的缺乏。本發(fā)明涉及由于對(duì)個(gè)體施用血管發(fā)生抑制劑和由于其與它的選擇性靶標(biāo)的結(jié)合而優(yōu)選從組織細(xì)胞分泌進(jìn)入其環(huán)境中的某些分子生物標(biāo)志。優(yōu)選地，這些分子生物標(biāo)志可以從組織細(xì)胞分泌進(jìn)入其環(huán)境中，且作為其結(jié)果，它們可以是可在體液中檢測(cè)的。因此，優(yōu)選將來(lái)自通過(guò)該血管發(fā)生抑制劑處理的個(gè)體的體液用于分析該分子生物標(biāo)志。按照本發(fā)明發(fā)現(xiàn)其對(duì)血管發(fā)生相關(guān)受體，優(yōu)選ATP位點(diǎn)定向多激酶整聯(lián)蛋白，及這些受體的抑制劑反應(yīng)的生物標(biāo)志是以下生物標(biāo)志ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA,EDNl，MCPl，MMPlO，AUTS2，LIPG,PDGFB，BMP4，MGP，HTRAl，F(xiàn)BLN5，HHIP，C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG，R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，F(xiàn)LT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，F(xiàn)BX04, EFEMP1，STC2, IL-6，CRP、CD40 配體和 / 或 MMP9。就它們對(duì)一些具體的血管發(fā)生抑制劑的處理的反應(yīng)性而言，本發(fā)明優(yōu)選的生物標(biāo)志是 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配體和 IL6。本發(fā)明最優(yōu)選的生物標(biāo)志是ADAMTS1、STCl、EDm和IL8，或其組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在體液，如血液和血漿、淋巴、液體(liquor)和/或尿液中檢測(cè)該分子生物標(biāo)志。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在血液和/或尿液中檢測(cè)該分子生物標(biāo)志。在這種情況下，可以容易地調(diào)查該分子生物標(biāo)志，因?yàn)榭梢砸詿o(wú)損傷的方式獲取血液和尿液。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該血管發(fā)生抑制劑選自整聯(lián)蛋白抑制劑。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該整聯(lián)蛋白抑制劑選自α (ν)整聯(lián)蛋白抑制劑。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該整聯(lián)蛋白抑制劑選自DI-17E6或其衍生物和/或西侖吉肽為了這樣做，將在獲自個(gè)體的體液中分析該分子生物標(biāo)志，已用假定的治療有效量的DI-17E6或其衍生物和/或西侖吉肽處理了該個(gè)體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該整聯(lián)蛋白抑制劑在內(nèi)皮細(xì)胞上與整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合。優(yōu)選地，該分子生物標(biāo)志將在該內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)，并以更高的量分泌進(jìn)入該內(nèi)皮細(xì)胞的環(huán)境中。在另一種情況下，該生物標(biāo)志的分泌由于用該抑制劑處理而起始。內(nèi)皮細(xì)胞的環(huán)境包括血管腔和鄰近組織。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分子生物標(biāo)志在其從內(nèi)皮細(xì)胞分泌后到達(dá)血流。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，由于該整聯(lián)蛋白抑制劑與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合，該分子生物標(biāo)志在該內(nèi)皮細(xì)胞中下調(diào)，并以更低的量分泌進(jìn)入該內(nèi)皮細(xì)胞的環(huán)境中。在另一種情況下，該生物標(biāo)志的分泌由于用該抑制劑處理而停止。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由于用整聯(lián)蛋白抑制劑處理而可以在某些體液中檢測(cè)的該分子生物標(biāo)志是蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)是血清的可溶性蛋白質(zhì)或包含于血漿中的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，主要可以通過(guò)基于免疫學(xué)的技術(shù)，如Western印跡、Elisa、Luminex和相關(guān)技術(shù)檢測(cè)該蛋白質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，響應(yīng)經(jīng)整聯(lián)蛋白抑制劑處理，該生物標(biāo)志優(yōu)選蛋白質(zhì)在優(yōu)選的體液中定量地提高或減少。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)P值不超過(guò)0.01來(lái)定義在多個(gè)試驗(yàn)中表征的由整聯(lián)蛋白抑制劑的處理引起的某種生物標(biāo)志的提高或減少。在本發(fā)明的另一方面，響應(yīng)用整聯(lián)蛋白抑制劑處理，該生物標(biāo)志優(yōu)選蛋白質(zhì)被修飾。這些改變可以包括該蛋白質(zhì)分子大小的改變、蛋白質(zhì)中的修飾如糖基化和與不同或相同的蛋白質(zhì)亞基的相互作用。在本發(fā)明的另一方面，可以在RNA水平上檢測(cè)該生物標(biāo)志的改變的基因表達(dá)。因此，將從組織細(xì)胞的樣品提取RNA，該樣品獲自響應(yīng)通過(guò)整聯(lián)蛋白抑制劑處理的個(gè)體。因此， 可以通過(guò)已知的基因表達(dá)譜分析技術(shù)如陣列技術(shù)來(lái)分析所表達(dá)的某些生物標(biāo)志的RNA轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選地，所獲取的用于RNA提取的組織細(xì)胞樣品衍生自?xún)?nèi)皮細(xì)胞。
優(yōu)選地，用于評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑在抗血管發(fā)生療法中的功效的方法首先包括對(duì)個(gè)體施用假定的治療有效量的整聯(lián)蛋白抑制劑。治療有效量的假定和測(cè)定基于例如之前的臨床前和臨床研究。其次，通過(guò)本發(fā)明的方法評(píng)估施用假定的治療有效量的該整聯(lián)蛋白抑制劑的功效。內(nèi)收(adduct)該評(píng)估的評(píng)價(jià)，以在改變的條件下重復(fù)其他輪次的血管發(fā)生療法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選該生物標(biāo)志是已與血管發(fā)生相關(guān)，且可以涉及與該整聯(lián)蛋白受體相關(guān)的信號(hào)途徑的候選者。更優(yōu)選地，該生物標(biāo)志可以在施用整聯(lián)蛋白抑制劑后涉及阻斷血管發(fā)生。另一方面涉及本發(fā)明的生物標(biāo)志組的多樣性。優(yōu)選地，它們不可以由于高序列同源性而分組在一個(gè)蛋白質(zhì)家族中，且不可以由于其生理相關(guān)性而分組在功能組中，如血管發(fā)生因子VEGF、EGF和PLGF等。在本發(fā)明的另一方面，為了評(píng)估抗血管發(fā)生藥物的作用，可以分開(kāi)、與本發(fā)明的不同生物標(biāo)志或與本發(fā)明之外測(cè)定的其他血管發(fā)生生物標(biāo)志組合使用生物標(biāo)志。此外，通過(guò)測(cè)定樣品，如體液中的蛋白質(zhì)水平獲得的分子生物標(biāo)志評(píng)價(jià)結(jié)果可以通過(guò)通過(guò)測(cè)定樣品，如內(nèi)皮細(xì)胞中的RNA水平獲得的基因表達(dá)結(jié)果來(lái)實(shí)現(xiàn)。該比較可以是有用的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)錄物形式的分子生物標(biāo)志可以例如由于某些生理環(huán)境而在血液或尿液中不穩(wěn)定。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明涉及用于通過(guò)分子生物標(biāo)志來(lái)評(píng)估血管發(fā)生抑制劑的作用的方法，該方法包括以下步驟在施用血管發(fā)生抑制劑之前從個(gè)體獲得組織樣品，其中從所獲取的組織樣品制備細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞。在確定的實(shí)驗(yàn)室條件下體外培養(yǎng)該細(xì)胞， 然后用血管發(fā)生抑制劑處理。由于用血管發(fā)生抑制劑處理，可以改變?cè)撋飿?biāo)志的表達(dá)和分泌?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)基中跟蹤該改變的分泌。詳細(xì)地，這些分子生物標(biāo)志由于用血管發(fā)生抑制劑處理而從該細(xì)胞分泌進(jìn)入其環(huán)境，即培養(yǎng)基中。結(jié)果，可在該細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)它們。在這種情況下，可以容易地調(diào)查和監(jiān)測(cè)該分子生物標(biāo)志，因?yàn)橐子讷@得和處理培養(yǎng)細(xì)胞的該細(xì)胞培養(yǎng)基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子生物標(biāo)志將在該內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)，并以更高的量分泌進(jìn)入該內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在另一種情況下，該生物標(biāo)志的分泌由于用該抑制劑處理而起始。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該分子生物標(biāo)志在該內(nèi)皮細(xì)胞中下調(diào)，并以更低的量分泌進(jìn)入該內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在另一種情況下，該生物標(biāo)志的分泌由于用該抑制劑處理而停止。表征為該步驟的方法包括優(yōu)選選自整聯(lián)蛋白抑制劑的血管發(fā)生抑制劑。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該整聯(lián)蛋白抑制劑選自α (ν)整聯(lián)蛋白抑制劑。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該整聯(lián)蛋白抑制劑選自DI-17E6或其衍生物和/或西侖吉肽。為了這樣做，將在獲自用假定的有效量的DI-17E6或其衍生物和/或西侖吉肽處理的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中分析該生物標(biāo)志。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由于通過(guò)整聯(lián)蛋白抑制劑的處理而可以在上清中檢測(cè)的該生物標(biāo)志是前一部分中所述的蛋白質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，響應(yīng)通過(guò)整聯(lián)蛋白抑制劑的處理，該生物標(biāo)志優(yōu)選蛋白質(zhì)在內(nèi)皮細(xì)胞樣品的上清中定量地提高或減少。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)P值不超過(guò)0.01來(lái)定義在某些試驗(yàn)中表征的由整聯(lián)蛋白抑制劑的處理引起的某種生物標(biāo)志的提高或減少。
在本發(fā)明的另一方面，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)的該分子生物標(biāo)志優(yōu)選蛋白質(zhì)按前一部分中所述被修飾。在本發(fā)明的另一方面，可以通過(guò)從內(nèi)皮細(xì)胞提取RNA來(lái)在RNA水平上檢測(cè)由通過(guò)整聯(lián)蛋白抑制劑的處理引起的該生物標(biāo)志的基因表達(dá)的改變。因此，可以通過(guò)已知的基因表達(dá)譜分析技術(shù)如陣列技術(shù)來(lái)分析所表達(dá)的某些生物標(biāo)志的RNA轉(zhuǎn)錄物。用于在上一部分中所述的該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑對(duì)血管發(fā)生的作用的方法首先包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞施用假定的治療有效量的整聯(lián)蛋白抑制劑。假定的治療有效量的測(cè)定基于例如之前的臨床前和臨床研究。其次，通過(guò)本發(fā)明中所述的分子生物標(biāo)志來(lái)分析施用假定的治療有效量的該整聯(lián)蛋白抑制劑的作用。內(nèi)收該評(píng)估的評(píng)價(jià)來(lái)測(cè)定或重復(fù)抗血管發(fā)生療法。在另一方面，用于在上一部分中所述的該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑對(duì)血管發(fā)生的影響的方法首先包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞施用探究量(explorative amount)的整聯(lián)蛋白抑制劑。探究量的測(cè)定基于例如之前的臨床前和臨床研究。其次，通過(guò)本發(fā)明中所述的分子生物標(biāo)志來(lái)分析施用探究有效量的該整聯(lián)蛋白抑制劑的作用。內(nèi)收該分析的評(píng)價(jià)進(jìn)行進(jìn)一步的臨床前或臨床研究。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在該細(xì)胞培養(yǎng)基中測(cè)定的該分子生物標(biāo)志優(yōu)選是前一部分中所述的候選者。在本發(fā)明的另一方面，為了評(píng)估抗血管發(fā)生藥物的作用，可以分開(kāi)、與本發(fā)明的不同生物標(biāo)志或與本發(fā)明之外測(cè)定的其他血管發(fā)生生物標(biāo)志組合使用生物標(biāo)志。此外，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水平獲得的分子生物標(biāo)志評(píng)價(jià)結(jié)果可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞的RNA水平獲得的基因表達(dá)結(jié)果來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，可以通過(guò)獲自用整聯(lián)蛋白抑制劑處理的個(gè)體的組織樣品或體液與上文所述的通過(guò)整聯(lián)蛋白抑制劑處理的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品或其細(xì)胞培養(yǎng)基的組合分析來(lái)進(jìn)行利用分子生物標(biāo)志的血管發(fā)生抑制劑作用評(píng)估。在另一方面，本文所述的評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑的抗血管發(fā)生作用和該抑制劑對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病的功效的方法還可以應(yīng)用于評(píng)估小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑的抗血管發(fā)生作用和該抑制劑對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病的功效。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑結(jié)合并模擬靶激酶的 ATP結(jié)合位點(diǎn)，其中該ATP結(jié)合位點(diǎn)定位在該靶激酶的催化活性位點(diǎn)中。該多激酶抑制劑的靶激酶優(yōu)選包括不同的受體酪氨酸激酶，如VEGFR、PDGFR、KIT、 FLT3、CSF-I和RET，以及絲氨酸/蘇氨酸胞內(nèi)激酶RAF。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該小分子ATP位點(diǎn)多激酶抑制劑是舒尼替尼和/或索拉非尼。此外，本發(fā)明利用分子生物標(biāo)志評(píng)估血管發(fā)生抑制劑的作用的所有方法及其用途可以是對(duì)預(yù)防和治療背景部分中所述的血管發(fā)生相關(guān)疾病有益的。在另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的分子生物標(biāo)志的使用來(lái)評(píng)估廣范圍的抗血管發(fā)生藥物的作用的方法。該生物標(biāo)志可以用于評(píng)估其他抗血管發(fā)生藥物對(duì)血管發(fā)生的作用，該其他抗血管發(fā)生藥物不包含于本發(fā)明的抗血管發(fā)生藥物，或與本發(fā)明的抗血管發(fā)生藥物不相關(guān)。
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在另一方面，除了該生物標(biāo)志在血管發(fā)生療法背景中評(píng)估血管發(fā)生藥物的用途外，它們還可以是在早期發(fā)現(xiàn)中有益的。本文指定的方法可以按以下方式提供關(guān)于抗血管發(fā)生療法的成功的信息。該方法可以用于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化對(duì)患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者施用的抗血管發(fā)生藥物的有效劑量和/或有效方案。詳細(xì)地，可以通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)評(píng)估抗血管發(fā)生療法的功效，該抗血管發(fā)生療法包括例如按假定有效的起始劑量用抗血管發(fā)生藥物例如整聯(lián)蛋白抑制劑處理患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者。若該血管發(fā)生療法的功效看起來(lái)例如低，則可以對(duì)該患者應(yīng)用改變的條件，如改變劑量和/或施用的方案和/或抗血管發(fā)生藥物的選擇。由于改變的抗血管發(fā)生療法條件，可以重復(fù)其他輪次的本發(fā)明的方法，直至找到對(duì)該患者而言最適合的個(gè)體療法。在另一優(yōu)選方面，若通過(guò)本發(fā)明的方法將對(duì)患有抗血管發(fā)生疾病的患者施用的抗血管發(fā)生藥物的起始劑量評(píng)估為有效，則改變的條件可以包括降低劑量或延長(zhǎng)該方案。降低對(duì)個(gè)體施用的化合物、組合物、藥劑和治療的劑量的益處包括與更高的劑量相關(guān)的副作用的發(fā)生率的降低。由于要求并在實(shí)施例中更詳細(xì)地描述的方法的結(jié)果，該療法可以是改變當(dāng)前的藥物，并用引起更顯著的生物標(biāo)志模式的其他藥物取代它。該生物標(biāo)志還可以廣泛用于調(diào)查內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或血管發(fā)生。該生物標(biāo)志的評(píng)價(jià)可以在具有獲得對(duì)該生理過(guò)程更好的理解的范圍的實(shí)驗(yàn)中提供信息。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供用于篩選具有可能的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)活性的化合物的方法。該方法包括(a)在體液和/或組織樣品中測(cè)定至少一種選擇的生物標(biāo)志的基線(xiàn)濃度和/或修飾狀態(tài)，其中該樣品獲自尚未用該抑制劑處理的個(gè)體；(b)在已用該抑制劑處理的(a)的樣品中測(cè)定該選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)；(c)計(jì)算通過(guò)步驟(a)和(b)獲得的選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)之間的差異；(d)從該差異的評(píng)價(jià)或預(yù)測(cè)是對(duì)血管發(fā)生具有作用和/或?qū)ρ馨l(fā)生相關(guān)疾病具有抗血管發(fā)生功效的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)分子的指示；在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了獲得處理的細(xì)胞，按估計(jì)處于可能的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)活性范圍內(nèi)的不同劑量對(duì)細(xì)胞優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行目的化合物的施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，獲取該處理的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行前一部分中所述的分析。在優(yōu)選實(shí)施方案中，響應(yīng)用該篩選化合物處理，在細(xì)胞培養(yǎng)基中分析和監(jiān)測(cè)的該生物標(biāo)志是前一部分中所述的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)ρ值不超過(guò)0.01來(lái)定義在某些試驗(yàn)中表征的由篩選化合物的處理引起的某個(gè)生物標(biāo)志的提高或減少。在本發(fā)明的另一方面，響應(yīng)用前一部分中所述的該篩選化合物處理，該生物標(biāo)志優(yōu)選蛋白質(zhì)被修飾。在本發(fā)明的另一方面，可以通過(guò)從通過(guò)篩選化合物處理的細(xì)胞提取RNA來(lái)在RNA 水平上檢測(cè)該生物標(biāo)志基因表達(dá)的改變。因此，可以通過(guò)已知的基因表達(dá)譜分析技術(shù)如陣列技術(shù)來(lái)分析表達(dá)的某些生物標(biāo)志的RNA轉(zhuǎn)錄物。因此，概括而言，本發(fā)明更詳細(xì)地涉及以下 用于利用至少一種選擇性生物標(biāo)志來(lái)評(píng)估血管發(fā)生抑制劑對(duì)血管發(fā)生的影響和/或該抑制劑對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病的功效的離體方法，其中該生物標(biāo)志選自基因產(chǎn)物， 該基因產(chǎn)物選自ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA, EDNl，MCPl，MMP10，AUTS2，LIPG, PDGFB,BMP4，MGP，HTRAl，F(xiàn)BLN5，HHIP， C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，F(xiàn)LT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，F(xiàn)BX04, EFEMP1，STC2、IL-6、CRP、CD40 配體和 / 或MMP9，該方法包括步驟(a)在體液或組織樣品中測(cè)定至少一種選擇的生物標(biāo)志的基線(xiàn)濃度和/或修飾狀態(tài)，其中該樣品獲自尚未用該抑制劑處理的個(gè)體；(b)在獲自已用該抑制劑處理的個(gè)體的樣品中或在隨后的步驟中通過(guò)該抑制劑處理的(a)的樣品中測(cè)定(a)中該選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)；(c)計(jì)算通過(guò)步驟(a)和(b)獲得的該選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)之間的差異；(d)從該差異評(píng)估或預(yù)測(cè)該抑制劑的一個(gè)或多個(gè)以下特性-對(duì)分子靶標(biāo)和對(duì)與該分子靶標(biāo)相關(guān)的各信號(hào)傳導(dǎo)途徑的藥效；-對(duì)血管發(fā)生的作用；-在患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者中的治療功效和臨床結(jié)果。 相應(yīng)的離體方法，其中所獲取的體液樣品是血液、血漿、血清、淋巴、尿液、淚、滑液、創(chuàng)傷液(would fluid)和/或腦脊液。 相應(yīng)的方法，其中該組織樣品包含患病組織或健康組織。 相應(yīng)的方法，其中該組織樣品選自癌組織、皮膚組織和/或滑膜組織。 相應(yīng)的離體方法，其中從所獲取的組織樣品制備內(nèi)皮細(xì)胞。 相應(yīng)的方法，其中在已從個(gè)體獲得并從組織樣品制備該內(nèi)皮細(xì)胞后將它們培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室條件下，其中從該細(xì)胞培養(yǎng)基或來(lái)自該細(xì)胞的提取物測(cè)定至少一種生物標(biāo)志。 相應(yīng)的方法，其中該血管發(fā)生抑制劑是整聯(lián)蛋白抑制劑。 相應(yīng)的方法，其中該血管發(fā)生抑制劑是小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑。 相應(yīng)的方法，其中該整聯(lián)蛋白抑制劑是α (ν)整聯(lián)蛋白的抑制劑。 相應(yīng)的方法，其中該α (ν)整聯(lián)蛋白抑制劑是抗體或其衍生物或小的化學(xué)分子或RGD肽。 相應(yīng)的方法，其中該α (ν)整聯(lián)蛋白抑制劑是DI-17E6或西侖吉肽。 相應(yīng)的方法，其中該小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑是舒尼替尼和/或索拉非尼。
相應(yīng)的方法，其中該內(nèi)皮細(xì)胞和/或體液樣品衍生自健康個(gè)體和/或患有腫瘤障礙和/或其他血管發(fā)生相關(guān)疾病的患病個(gè)體。 相應(yīng)的方法，其中該血管發(fā)生相關(guān)疾病是腫瘤或其各疾病或障礙。 相應(yīng)的方法，其中該生物標(biāo)志由于施用該血管發(fā)生抑制劑而在其水平中和/或在修飾狀態(tài)中下調(diào)或上調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中該生物標(biāo)志選自 ADAMTS1、STCl、MCP-I、IL-8、EDN1、PDGF-BB、 INHBA、IL-6、CRP、CD40 配體和 / 或 MMP9。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志ADAMTS1和/或STCl由于施用至少一種指定的整聯(lián)蛋白抑制劑而上調(diào)。 相應(yīng)的方法，其 中生物標(biāo)志MCP1、INHBA, EDNl和/或PDGF-BB由于施用一種指定的整聯(lián)蛋白抑制劑而下調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志IL8由于施用西侖吉肽或索拉非尼而下調(diào)，且由于施用DI-17E6或舒尼替尼而上調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志IL6和/或CRP由于施用DI-17E6而上調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志⑶40配體由于施用DI-17E6而下調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志STCl由于施用指定的小分子ATP定向多激酶抑制劑而下調(diào)。 相應(yīng)的方法，其中生物標(biāo)志EDm由于施用指定的小分子ATP定向多激酶抑制劑而上調(diào)。 用于利用至少一種選擇性生物標(biāo)志來(lái)在基于細(xì)胞的模型中篩選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的離體方法，其中該生物標(biāo)志選自基因產(chǎn)物，該基因產(chǎn)物選自ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl, ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl, LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40,NOTCHl，INHBA,EDNl，MCPl，MMP10，AUTS2，LIPG,PDGFB,BMP4，MGP，HTRAl，F(xiàn)BLN5，HHIP， C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，F(xiàn)LT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF，F(xiàn)BX04, EFEMP1，STC2、IL-6、CRP、CD40 配體和 / 或 MMP9，該方法包括步驟(a)在體液和/或組織樣品中測(cè)定至少一種選擇的生物標(biāo)志的基線(xiàn)濃度和/或修飾狀態(tài)，其中該樣品獲自尚未用該抑制劑處理的個(gè)體；(b)在已用該抑制劑處理的(a)的樣品中測(cè)定該選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)；(c)計(jì)算通過(guò)步驟(a)和(b)獲得的該選擇的生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)之間的差異；(d)從該差異評(píng)估或預(yù)測(cè)指示整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)分子對(duì)血管發(fā)生具有作用和/或?qū)ρ馨l(fā)生相關(guān)疾病具有抗血管發(fā)生功效的特性。
包含含有用于至少一種 選自以下的生物標(biāo)志的檢測(cè)系統(tǒng)和允許應(yīng)用該方法的指定的血管發(fā)生抑制劑的診斷試劑盒ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl， ADAMl5, SRPX, COROIC, PBEFl， LTB4DH, IL15RA, ENPP4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2, VEGFC, LMNA, CTSL, PTX3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl，STATl，CDCA7, DAF, HYAL2, CD40, NOTCHl，INHBA, EDNl, MCP1, MMP10, AUTS2, LIPG, PDGFB, BMP4, MGP, HTRAl, FBLN5, HHIP, C0L4A1, GALNT, MMP2, IL13RA1, MFAP2, NTN4, DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, R0R1，ANGPTL4，ESM1，CUBN，IGFBP7, CYR61，F(xiàn)LT4，SPOCK, C0L12A1，LTBPl，MMP28， TMEM4, CTSB, C0L1A2, GRP124, SPARC, FST, DKK4, PHLDB2, PVR, CYR61, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, CTGF，NRG1，DKK3, CD44, BCHE，BDNF、FBX04、EFEMP1、STC2、IL-6、CRP、CD40 配體和 / 或 MMP9。參優(yōu)選選自 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配體和 IL6 的生
物標(biāo)志基因或其基因產(chǎn)物的用途，其用于評(píng)估和預(yù)測(cè)整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向激酶抑制劑在基于細(xì)胞的測(cè)定中對(duì)血管發(fā)生的作用，或這類(lèi)抑制劑在離體條件下的功效和/或劑量。參優(yōu)選選自 ADAMTS1、STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB、CRP、CD40 配體和 IL6 的生物標(biāo)志基因或其基因產(chǎn)物的用途，其用于制備用于在對(duì)這些生物標(biāo)志中的至少一種反應(yīng)的患者中治療癌癥的整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向激酶抑制劑。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“血管發(fā)生相關(guān)疾病”促進(jìn)大量疾病或障礙，該疾病或障礙直接由失調(diào)的 (deregulated)血管發(fā)生引起或在失調(diào)的血管發(fā)生的間接作用中偏向。這些大量疾病包括腫瘤障礙、心血管疾病、炎癥、自身免疫病、變性障礙、眼睛障礙。失調(diào)的血管發(fā)生可以由多種病理刺激誘導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“抗血管發(fā)生作用”意指阻斷或至少抑制血管發(fā)生。在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選將抗血管發(fā)生藥物或物質(zhì)用于通過(guò)限制新血管的病理性形成(血管發(fā)生)來(lái)對(duì)抗血管發(fā)生相關(guān)疾病，且由血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病癥狀由于施用抗血管發(fā)生藥物而緩解。術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志”指用作生物學(xué)狀態(tài)的指示物的物質(zhì)。它是作為正常生物學(xué)過(guò)程、 致病過(guò)程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理反應(yīng)的指示物客觀地測(cè)量和評(píng)價(jià)的特征。在本發(fā)明中，優(yōu)選將術(shù)語(yǔ)生物標(biāo)志用作分子生物標(biāo)志，其包括基因轉(zhuǎn)錄物，如RNA和蛋白質(zhì)。該生物標(biāo)志可以定量地以及定性地改變。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，分子生物標(biāo)志定量地改變，即它們?cè)谄渌街袦p少或提高，其中在相同條件下在某些試驗(yàn)中表征所檢查的生物標(biāo)志的可靠性的P值不超過(guò)0.01的值。術(shù)語(yǔ)“體液”包括見(jiàn)于個(gè)體中的流體(fluid)。它們包括從身體排泄或分泌的流體，以及正常情況下不排泄或分泌的流體。這些各種流體包括房水、血液、血清、組織液、淋巴、黏液、胸膜液(pleural fluid)、唾液、血漿、尿液、淚、滑液、創(chuàng)傷液和/或腦脊液。優(yōu)選地，將包括血清和血漿的血液及尿液用于本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“腫瘤/腫瘤障礙”指或描述哺乳動(dòng)物中的生理?xiàng)l件，其通常表征為未調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)。可以利用本發(fā)明的藥物組合物治療腫瘤，如乳腺、心臟、肺、小腸、結(jié)腸、脾、腎、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、腦、胰腺、皮膚、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宮、睪丸、宮頸和肝臟的腫瘤。術(shù)語(yǔ)“基于細(xì)胞的模型/測(cè)定”在本文中指衍生自動(dòng)物或人組織和/或器官，且最優(yōu)選在用于篩選血管發(fā)生調(diào)節(jié)化合物之前將其培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室條件下的細(xì)胞?；诩?xì)胞的模型還包括細(xì)胞系。抗體的“衍生物”表示抗體的衍生形式。術(shù)語(yǔ)“診斷試劑盒”優(yōu)選包含具有定量和/或定性評(píng)價(jià)本發(fā)明的生物標(biāo)志必需的不同包裝的診斷抗體和/或基因芯片陣列和/或試劑的檢測(cè)系統(tǒng)，且通常包含使用該試劑、 診斷抗體或基因陣列的說(shuō)明?？梢宰鳛橐后w、粉末、片劑、懸液提供該抗體以及該試劑。可以以適合于按照本方法分開(kāi)應(yīng)用的分開(kāi)的包裝提供該抗體，即基因陣列和試劑。本發(fā)明的試劑盒還含有該包裝中所包含的材料的“使用說(shuō)明”。術(shù)語(yǔ)“修飾狀態(tài)”指基因產(chǎn)物中的修飾的改變，如分子大小或蛋白質(zhì)糖基化的改變。此外，它還指與不同的蛋白質(zhì)或與相同的蛋白質(zhì)亞基的相互作用的改變。“個(gè)體”包括患有疾病/障礙和/或健康的作為對(duì)照先證者的人和動(dòng)物。此外，還包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物?！笆荏w”或“受體分子”是可溶的或膜結(jié)合/相關(guān)的蛋白質(zhì)或糖蛋白，其包含配體與之結(jié)合形成受體-配體復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。該受體通過(guò)結(jié)合該配體(其可以是激動(dòng)劑或拮抗劑)而活化或失活，并可以起始或阻斷信號(hào)發(fā)放途徑?！敖M織樣品”意指為了優(yōu)選以細(xì)胞的方式將此材料用于分析和評(píng)估物標(biāo)志而從個(gè)體取出的活檢組織。在本發(fā)明中，可以在活組織檢查后直接將組織樣品用于分析生物標(biāo)志。 在本發(fā)明的另一方面，可以在某些實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)從該活檢組織材料提取的細(xì)胞，并在隨后的時(shí)間分析其生物標(biāo)志。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“治療有效量=TED”指對(duì)在哺乳動(dòng)物中治療疾病或障礙有效的藥物，例如治療性抗體的量。在癌癥的情況下，藥物的治療有效量可以減少癌細(xì)胞數(shù)目；減小腫瘤大??； 抑制(即在某種程度上減慢和優(yōu)選終止)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官；抑制(即在某種程度上減慢和優(yōu)選終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在某種程度上減輕與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。在藥物可以阻止生長(zhǎng)和/或殺死已有的癌細(xì)胞的程度上，它可以是抑制細(xì)胞的和/或細(xì)胞毒素的。對(duì)于抗腫瘤療法，例如可以通過(guò)評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間 (TTP)和/或測(cè)定反應(yīng)率(RR)來(lái)測(cè)量功效。術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)”或“反應(yīng)性”指可以用指示對(duì)患者的益處的任意終點(diǎn)評(píng)估的條件，其非限制性地包括疾病進(jìn)展在某種程度上的抑制，包括減慢完全抑制；疾病發(fā)作次數(shù)和/或癥狀的減少；針對(duì)所應(yīng)用的抑制劑藥物的自身免疫應(yīng)答的減少；治療后無(wú)疾病呈現(xiàn)的 長(zhǎng)度的增加；和在治療后的給定時(shí)間點(diǎn)的降低的死亡率。該術(shù)語(yǔ)指可測(cè)量的反應(yīng)，包括完全反應(yīng) (CR)和部分反應(yīng)(PR)。在本發(fā)明的背景中，鼠、嵌合或人源化形式的抗體包括等同的抗體或衍生物，其中按照鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體的定義取代抗體的部分。在此研究中，鑒定了與整聯(lián)蛋白抑制劑和小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑的抗血管發(fā)生活性相關(guān)的生物標(biāo)志，其是在體液中可及的，并因此可以允許以無(wú)損傷的方式分析靶標(biāo)調(diào)節(jié)。為此，采取了兩種不同的策略。首先，分析了內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜響應(yīng)藥物處理的全基因組改變。其次，進(jìn)行了用體內(nèi)血管發(fā)生模型來(lái)鑒定受藥物調(diào)節(jié)的血漿生物標(biāo)志的候選者蛋白質(zhì)組驅(qū)動(dòng)的方法。1.用基因表達(dá)譜鑒定生物標(biāo)志為了鑒定與處理相關(guān)的生物標(biāo)志，用西侖吉肽或DI-17E6處理了 HUVEC。Western 印跡分析揭示，對(duì)于西侖吉肽和DI-17E6，處理后分別抑制了 FAK和MAPK的磷酸化。從每個(gè)條件重復(fù)測(cè)試三次的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生基因表達(dá)譜。為此，從處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞提取RNA，并與全基因組Affymetrix寡核苷酸微陣列雜交來(lái)產(chǎn)生基因表達(dá)譜。用GCRMA算法(WuZ，Journal American Statistical Association 2004 ；99 :909_917)預(yù)處理后，過(guò)濾 Affymetrix GeneChip數(shù)據(jù)，以排除具有低變異性、低信號(hào)或弱探針標(biāo)記(annotation)的探針集。特異性過(guò)濾基因，以獲得可以在人的體液中檢測(cè)和可以在患者中以無(wú)損傷的方式監(jiān)測(cè)的分泌的候選者。通過(guò)每個(gè)探針集的表達(dá)數(shù)據(jù)的線(xiàn)性模型分析來(lái)鑒定在藥物處理的細(xì)胞和未處理或?qū)φ仗幚淼募?xì)胞之間差異表達(dá)的基因，然后進(jìn)行中等t檢驗(yàn)(moderated t-test) (Smyth GK, Stati stical Applications in Genetics and Molecular Biology2004 ；3 Article 3)。響應(yīng) DI-17E6 而上調(diào)的基因包括 ADAMTS1, ADAMTS9, SERPINB2, SERPIND2, STCl, ADAMl5, SRPX, C0R01C, PBEFl，LTB4DH，IL15RA, ΕΝΡΡ4, PLAUR, LAMA5, TNFRSF1A, CLU, T0R3A, ILlRLl，ILlRl，TCN2，VEGFC, LMNA, CTSL, ΡΤΧ3, NCL, GUSB, CLEC3B, IL8, GPX3, CXCLl，SDFRl， STAT1，CDCA7.。響應(yīng)西侖吉肽而上調(diào)的基因包括 ADAMTS9、DAF、STC1、ADAMTS1、LAMA5、TCN2、SRPX、 ADAMl5、GUSB、HYAL2、PLAUR、CD40、NOTCHl、ENPP4。響應(yīng) DI-17E6 而下調(diào)的基因包括 INHBA、EDN1、MCP1、MMP10，AUTS2, LIPG, PDGFB, BMP4，MGP，HTRAl，F(xiàn)BLN5，HHIP，C0L4A1，GALNT，MMP2，IL13RA1，MFAP2，NTN4，DKK3. SERPINE2, C0L5A1, CHSTl，PGF, EFNA4, BCHE, ENG, RORl，ANGPTL4, ESMl，CUBN, IGFBP7, CYR61, FLT4, SPOCK，C0L12A1, LTBP1，MMP28, TMEM4, CTSB，C0L1A2, GRP124，SPARC.。響應(yīng)西倉(cāng)吉肽而下調(diào)的基因包括 INHBA、EDNl、FST、DKK4，BMP4, MCPl，HHIP，NTN4, PHLDB2, PVR, CYR61, AUTS2, MERTK, FSTL3, APLN, PTX3, ANGPTL4, CTGF，SPOCK, IL8, NRGl， DKK3, CD44, BCHE, BDNF, FBX04, EFEMPl，STC2.。在給定的條件下顯示超常的反應(yīng)/反應(yīng)變化/反應(yīng)性的基因有下劃線(xiàn)。按照本發(fā)明的定義，該基因的基因和基因產(chǎn)物還包括引出相同功能活性的同源序列；尤其涉及與該原始序列具有超過(guò)80%，優(yōu)選超過(guò)90%和尤其是超過(guò)95%同源性的序列。因此，具有以下同源性的序列是本發(fā)明的主題80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 和 99%。在蛋白質(zhì)水平上分析了在RNA水平上受任一整聯(lián)蛋白抑制劑高度顯著調(diào)節(jié)的基因。由于分泌的生物標(biāo)志是相關(guān)的，在整聯(lián)蛋白抑制劑處理的細(xì)胞的上清中分析了個(gè)體候選者。用DI-17E6或西侖吉肽處理HUVEC。在不同時(shí)間后，收集培養(yǎng)物上清，并通過(guò)Western 印跡、ELISA或Luminex分析不同的生物標(biāo)志候選者。與對(duì)照細(xì)胞相比較，評(píng)價(jià)了藥物誘導(dǎo)的生物標(biāo)志調(diào)節(jié)。在不同的候選者中，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)整聯(lián)蛋白抑制劑而調(diào)節(jié)了 ADAMTS1、STC-1、 MCP-I、IL-8、內(nèi)皮縮血管肽-1、激活蛋白A和PDGF-BB。Western印跡分析揭示，具有1型血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM金屬肽酶(ADAMTS1)和司腺鈣蛋白-I(STC-I)響應(yīng)用DI-17E6或西侖吉肽處理而上調(diào)(圖2_4)。 ADAMTS1是存在于胞外間隙中的金屬蛋白酶。使用不同的生物系統(tǒng)，已顯示了 ADAMTS1抑制血管發(fā)生(Vazquez F.等，J Biol Chem 1999 ；274 (33) :23349_57)。STC-1 是分泌糖蛋白，最初在硬骨魚(yú)中將其描述為涉及鈣和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的激素。它在包括血管發(fā)生的許多生理過(guò)程中發(fā)揮作用，并已針對(duì)STC-I描述了促血管發(fā)生和抗血管發(fā)生活性二者(FilvarofT EH.等，Endocrinology 2002 ；143 3681-90 ；Zlot C.等，J BiolChem. 2003 ；278 (48) 47654-9)。通過(guò)Luminex分析了單核細(xì)胞趨化蛋白_1 (MCP-1/CCL2)和白細(xì)胞介素-8(IL_8/ CXCL8)。MCP-I響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽而下調(diào)(圖5)。相反，IL-8由兩種整聯(lián)蛋白抑制劑有差別地調(diào)節(jié)。IL-8響應(yīng)DI-17E6而上調(diào)，而西侖吉肽誘導(dǎo)此趨化因子的下調(diào)(圖 6)。MCP-I在巨噬細(xì)胞的招募和活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它是將促血管發(fā)生的巨噬細(xì)胞吸引至腫瘤的關(guān)鍵激動(dòng)劑之一。在小鼠中，MCP-I的抑制減少血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)(KogaM等， Biochem Biophys Res Commun. 2008 ；365 (2) :279_84)。最初針對(duì)其白細(xì)胞趨化活性表征了 IL-8/CXCL8，已知它具有腫瘤發(fā)生和促血管發(fā)生特性(Xie K等，Cytokine Growth Factor Rev 2001 ； 12 (4) 375-91)。

通過(guò)ELISA分析了激活蛋白Α、內(nèi)皮縮血管肽-I(EDN-I)和血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)。三種蛋白質(zhì)都響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽而下調(diào)(圖7-9)。Ε·1介導(dǎo)包括血管發(fā)生的多種腫瘤促進(jìn)活性。它調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白偶聯(lián)性激酶(ILK)(傳遞由整聯(lián)蛋白引起的胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放的多結(jié)構(gòu)域黏著斑蛋白質(zhì))(Rosano L.等，Mol Cancer Ther. 2006 ； 5(4) :833-42)。激活蛋白A(兩個(gè)抑制素βΑ亞基的同二聚體)是激活蛋白/抑制素家族的成員，該家族隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族。它發(fā)揮廣譜的生物活性，包括發(fā)育和生殖過(guò)程、炎癥、癌癥和血管發(fā)生。激活蛋白A在調(diào)節(jié)血管發(fā)生中的作用是有爭(zhēng)議的(contrive)，因?yàn)橐衙枋隽舜傺馨l(fā)生功能和抗血管發(fā)生功能二者(Panopoulou E 等，Cancer Res. 2005 ；65 (5) 1877-86 ；Poulaki V.等，Am J Pathol. 2004 ； 164 (4) 1293-302)。PDGF-BB 是 4 個(gè) PDGF 配體(PDGF-A、PDGF-B, PDGF-C 和 PDGF-D)之一 (Fredriksson L等，Cytokine Growth Factor Rev. 2004 ； 15 197-204)。它隸屬于配體和受體的VEGF/PDGF超家族，根據(jù)它們接近的序列同源性和進(jìn)化關(guān)系分組在一起。PDGF-BB常以高水平表達(dá)于多種腫瘤組織中(Nguyen Μ.等，J. Natl. Cancer Inst. 1994 ;86 :356_361)。 它是周細(xì)胞的促細(xì)胞分裂因子和趨化因子，并在血管壁組裝期間在調(diào)節(jié)血管細(xì)胞中發(fā)揮重要作用(Lindahl P 等，Science 1997 ；277 :242_245)。分析了鑒定的生物標(biāo)志響應(yīng)其他不同的血管發(fā)生抑制劑(舒尼替尼和索拉非尼) 的調(diào)節(jié)，以確定鑒定的生物標(biāo)志是否廣泛地與血管發(fā)生抑制相關(guān)。兩種抑制劑都是通過(guò)與激酶的結(jié)合ATP的催化位點(diǎn)結(jié)合，經(jīng)不相關(guān)的作用機(jī)制起作用的小分子多激酶抑制劑 (Morabito A 等，Current statusand Future oncologist 2006 ； 11 :753_764)。用舒尼替尼和索拉非尼處理后，在內(nèi)皮細(xì)胞上清中分析了生物標(biāo)志候選者的水平。如針對(duì)整聯(lián)蛋白抑制劑所觀察到的，幾個(gè)生物標(biāo)志響應(yīng)這些激酶抑制劑而調(diào)節(jié)。例如， STC-I響應(yīng)任一藥物而下調(diào)(圖10)，而EDm上調(diào)(圖11)。有趣地，針對(duì)整聯(lián)蛋白抑制劑觀察到了相反的調(diào)節(jié)。IL-8由任一激酶抑制劑有差別地調(diào)節(jié)。處理后，索坦(Sutent)引起此趨化因子的上調(diào)，而索拉非尼降低了蛋白質(zhì)水平(圖12)。在整聯(lián)蛋白抑制劑的情況下，也觀察到了有差別的調(diào)節(jié)。這些數(shù)據(jù)一起顯示，鑒定的生物標(biāo)志可以用于監(jiān)測(cè)整聯(lián)蛋白抑制劑以及激酶抑制劑的活性。但是，可以預(yù)期對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的不同作用，因?yàn)橐圆煌姆绞秸{(diào)節(jié)各蛋白質(zhì)，且可以導(dǎo)致不同的生物學(xué)反應(yīng)。由于所有藥物都經(jīng)不同的作用機(jī)制起作用，調(diào)節(jié)不同生物標(biāo)志中所涉及的途徑可能在不同抑制劑之間不同。 概括而言，已在內(nèi)皮培養(yǎng)物的基因表達(dá)譜中鑒定了與整聯(lián)蛋白抑制劑的藥效相關(guān)的藥物特異性生物標(biāo)志。將鑒定的候選者中的幾個(gè)確認(rèn)為細(xì)胞上清中受藥物調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，表明可以在體液中檢測(cè)它們。這些候選者中的一些還受不相關(guān)的多激酶抑制劑調(diào)節(jié)，表明可以在廣義上應(yīng)用該生物標(biāo)志來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和血管發(fā)生的作用。2.利用體內(nèi)血管發(fā)生模型鑒定受藥物調(diào)節(jié)的血漿生物標(biāo)志在此模型中，通過(guò)血管發(fā)生生長(zhǎng)因子bFGF在基質(zhì)膠填料(matrigelplug)中誘導(dǎo)血管發(fā)生。將含有bFGF的基質(zhì)膠填料皮下植入健康食蟹猴(Cynomologus)的腹部，然后立即按不同的劑量對(duì)該動(dòng)物靜脈內(nèi)注射DI-17E6?；|(zhì)膠植入后，通過(guò)定量該基質(zhì)膠填料中的血紅蛋白含量來(lái)進(jìn)行血管發(fā)生的評(píng)價(jià)。在植入基質(zhì)膠填料的不同動(dòng)物中測(cè)試每個(gè)條件。發(fā)現(xiàn)在所有劑量下，用DI-17E6處理猴都阻斷了新血管的形成(圖13)。為了鑒定與DI-17E6的PD作用相關(guān)的生物標(biāo)志，在處理前和處理后收集血漿樣品。通過(guò)與各標(biāo)準(zhǔn)比較，通過(guò)Luminex測(cè)量了不同蛋白質(zhì)的絕對(duì)濃度。通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化預(yù)處理原始數(shù)據(jù)，并通過(guò)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)將DI-17E6處理組與安慰劑處理的動(dòng)物相比較，在t檢驗(yàn)分析中檢查了 DI-17E6的作用。顯著受調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)包括C反應(yīng)蛋白(CRP)和IL-6、CD40配體和MMP9。CRP和IL-6 響應(yīng)用DI-17E6處理而上調(diào)(圖14)。相反，在對(duì)照組中，特異性調(diào)節(jié)了⑶40配體和MMP9。 144小時(shí)后，在安慰劑處理的動(dòng)物中，⑶40配體下調(diào)，而MMP9上調(diào)(圖15)。CRP是炎癥的標(biāo)志及急性期反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)(P印ys MB等，Adv Immunol 1983;34:141-212)。它識(shí)別損傷的細(xì)胞，通過(guò)與免疫系統(tǒng)相互作用起始它們的清除，并因此可以涉及去除響應(yīng)DI-17E6 處理而已損傷的細(xì)胞。IL-6是與血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的多效細(xì)胞因子(Keller ET 等，F(xiàn)ront. Biosei. 1996. 1 :340_357 和 Ancrile B 等，Genes Dev. 2007 年 7 月；21 (14) 1714-9)。IL-6響應(yīng)DI-17E6處理的上調(diào)似乎與其藥理學(xué)活性矛盾，但可以反映已針對(duì)其他血管發(fā)生抑制劑觀察到的調(diào)節(jié)反饋環(huán)。CD40配體是結(jié)構(gòu)上與腫瘤壞死因子-α相關(guān)的跨膜蛋白質(zhì)。它是促進(jìn)炎癥、血栓形成和新血管發(fā)生的促炎癥和促凝血因子(Ferroni P等， Curr Med Chem. 2007 ； 14(20) :217_80)。最后，ΜΜΡ9隸屬于在介導(dǎo)胞外環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用的基質(zhì)金屬蛋白酶家族。已描述了促腫瘤發(fā)生活性和抗腫瘤發(fā)生活性二者(Egeblad M 等，Nature Rev. Cancer 2002 ；2 :161_174)。它調(diào)節(jié)新血管重建和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)(Seandel M 等，Cancer Cell 2008 ； 13 (3) :181_3)。概括而言，已檢測(cè)了藥物特異性藥效血漿生物標(biāo)志，其可以在人的體液中檢測(cè)， 且可以用于提供靶調(diào)節(jié)的概念證據(jù)；選擇適當(dāng)?shù)膭┝亢头桨?；和潛在地解釋或預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。在所鑒定的生物標(biāo)志中，CRP和MMP9可以在機(jī)械上涉及在DI-17E6處理后阻斷血管發(fā)生。3.總結(jié)在這兩項(xiàng)研究中，已鑒定了整聯(lián)蛋白抑制劑和多激酶抑制劑的幾種PD生物標(biāo)志， 其可以在人的體液中檢測(cè)，且可以用于提供靶調(diào)節(jié)的概念證據(jù)；提供劑量和方案的合理選擇；和潛在地解釋或預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。有趣地，大部分候選者與血管發(fā)生相關(guān)，并因此可以在機(jī)械上涉及在藥物處理后阻斷血管發(fā)生。有趣地，一些生物標(biāo)志受具有不同作用機(jī)制的不相關(guān)的藥物調(diào)節(jié)，表明它們可以廣泛用于監(jiān)測(cè)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和血管發(fā)生的作用，并因此適合應(yīng)用于不同的藥物種類(lèi)，包括整聯(lián)蛋白抑制劑(如西侖吉肽、DI-17E6)、VEGF抑制劑 (如Avastin)、多激酶抑制劑(如舒尼替尼、索拉非尼)。附圖簡(jiǎn)述圖1 顯示完整的DI-17E6輕鏈(A)和重鏈(B)序列?？勺儏^(qū)有下劃線(xiàn)，⑶R為粗體。恒定區(qū)中的粗體序列表示修飾的IgGl鉸合部及位置296和297上的突變。圖2 顯示DI-17E6誘導(dǎo)HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白質(zhì)水平。圖3 顯示西侖吉肽誘導(dǎo)HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白質(zhì)水平。圖4 顯示DI-17E6和西侖吉肽誘導(dǎo)HUVEC上清中的STC-I蛋白質(zhì)水平。圖5 顯示HUVEC中MCP-1響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)。圖6 顯示HUVEC中IL-8響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)。圖7 顯示HUVEC中PDGF-BB響應(yīng)DI-17E6和西倉(cāng)吉肽的調(diào)節(jié)。圖8 顯示HUVEC中Ε·1響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)。圖9 顯示HUVEC中激活蛋白A響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)。圖10 顯示HUVEC中STC-I響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)。圖11 顯示HUVEC中EDm響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)。圖12 顯示HUVEC中IL_8響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)。圖13 顯示DI-17E6在猴中抑制基質(zhì)膠填料中的血管發(fā)生。圖14 顯示血漿CRP和IL-6響應(yīng)用DI-17E6處理的調(diào)節(jié)。圖15 顯示血漿⑶40配體和MMP9響應(yīng)用DI-17E6處理的調(diào)節(jié)。圖16 顯示整聯(lián)蛋白特異的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制。
實(shí)施例實(shí)施例1DI-17E6誘導(dǎo)HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白質(zhì)水平將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6孵育6 小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Western印跡分析ADAMTS1。A)DI_17E6介導(dǎo)的 ADAMTS1 (65kD 和 85kD)調(diào)節(jié)(圖 2)。實(shí)施例2西侖吉肽誘導(dǎo)HUVEC上清中的ADAMTS1蛋白質(zhì)水平將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的西侖吉肽孵育6 小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Western印跡分析ADAMTS1。A)西侖吉肽介導(dǎo)的 ADAMTS1 (65kD 和 85kD)調(diào)節(jié)(圖 3)。實(shí)施例3DI-17E6和西侖吉肽誘導(dǎo)HUVEC上清中的STC-I蛋白質(zhì)水平將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育24小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Western印跡分析STC-I。A) STC-I響應(yīng)DI-17E6的調(diào)節(jié)。B) STC-I響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖4)。實(shí)施例4 HUVEC中MCP-I響應(yīng)DI-17E6和西倉(cāng)吉肽的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育6小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Luminex分析MCP-I。A)MCP-I響應(yīng)DI-17E6 的調(diào)節(jié)。B)MCP-1響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖5)。實(shí)施例5HUVEC中IL-8響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育6小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Luminex分析IL_8。A) IL-8響應(yīng)DI-17E6 的調(diào)節(jié)。B) IL-8響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖6)。實(shí)施例6HUVEC中PDGF-BB響應(yīng)DI-17E6和西倉(cāng)吉肽的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育6小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)ELISA分析PDGF-BB。A)PDGF-BB響應(yīng) DI-17E6的調(diào)節(jié)。B) PDre-BB響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖7)。實(shí)施例7HUVEC中EDNl響應(yīng)DI-17E6和西倉(cāng)吉肽的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育6小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)ELISA分析EDm。Α)Ε·1響應(yīng)DI-17E6 的調(diào)節(jié)。B) EDm響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖8)。實(shí)施例8HUVEC中激活蛋白A響應(yīng)DI-17E6和西侖吉肽的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽孵育6小時(shí)至72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)ELISA分析激活蛋白A。A)激活蛋白A響應(yīng)DI-17E6的調(diào)節(jié)。B)激活蛋白A響應(yīng)西侖吉肽的調(diào)節(jié)(圖9)。實(shí)施例9HUVEC中STC-I響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的索坦或索拉非尼孵育6小時(shí)至48小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Western印跡分析STC-I。A) STC-I響應(yīng)索坦的調(diào)節(jié)。B) STC-I響應(yīng)索拉非尼的調(diào)節(jié)(圖10)。實(shí)施例10HUVEC中EDm響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的索坦或索拉非尼孵育6小時(shí)至48小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)ELISA分析EDm。Α)Ε·1響應(yīng)索坦的調(diào)節(jié)。B) EDNl響應(yīng)索拉非尼的調(diào)節(jié)(圖11)。實(shí)施例11HUVEC中IL-8響應(yīng)索坦和索拉非尼的調(diào)節(jié)將HUVEC培養(yǎng)在玻連蛋白包被的平皿上/中，并與不同濃度的索坦或索拉非尼孵育6小時(shí)至48小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清，通過(guò)Luminex分析IL_8。A) IL-8響應(yīng)索坦的調(diào)節(jié)。 B) IL-8響應(yīng)索拉非尼的調(diào)節(jié)(圖12)。實(shí)施例 12DI-17E6在猴中抑制基質(zhì)膠填料中的血管發(fā)生通過(guò)DI-17E6在猴中抑制基質(zhì)膠填料中的血管發(fā)生。在食蟹猴中誘導(dǎo)含有5 μ g/ mL bFGF的皮下基質(zhì)膠植入物中的血管發(fā)生。按100、30、10或3mg/kg作為單次輸注提供 DI-17E6。6天后，通過(guò)測(cè)量基質(zhì)膠填料中的血紅蛋白含量來(lái)定量血管發(fā)生。*表示ρ值 < 0. 05，**表示 ρ 值< 0. 01 (圖 13)。實(shí)施例13血漿CRP和IL-6響應(yīng)用DI-17E6處理的調(diào)節(jié)將含有bFGF的基質(zhì)膠填料植入食蟹猴，并用不同濃度的DI-17E6處理6天。收集血漿，通過(guò)Luminex分析CRP和IL-6。A) CRP的調(diào)節(jié)。B) IL-6的調(diào)節(jié)(圖14)。實(shí)施例14血漿⑶40配體和MMP9響應(yīng)用DI-17E6處理的調(diào)節(jié)A)將含有bFGF的基質(zhì)膠填料植入食蟹猴，并用不同濃度的DI-17E6處理6天。 收集血漿，通過(guò)Luminex分析⑶40配體和MMP9。A)⑶40配體的調(diào)節(jié)。B)MMP9的調(diào)節(jié)(圖 15)。實(shí)施例15整聯(lián)蛋白特異的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制除生長(zhǎng)因子刺激外，整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的與胞外基質(zhì)的黏著對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和遷移也是重要的。通過(guò)整聯(lián)蛋白連接而誘導(dǎo)廣范圍的胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放事件，包括Ras、MAPK、 FAK,Src,Rac/Rho/cdc42GTP酶的活化。為了在血管發(fā)生期間支持內(nèi)皮細(xì)胞的存活，整聯(lián)蛋白α (ν) β (3)/(5)與FAK—起為MAPK級(jí)聯(lián)(即ERK1/2)的持續(xù)活化所需。在此研究中，已分析了兩種整聯(lián)蛋白抑制劑DI-17E6和西侖吉肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用。為了此目的，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)接種在玻連蛋白上，以活化α (ν) β (3)整聯(lián)蛋白，然后用培養(yǎng)基或不同濃度的DI-17E6或西侖吉肽處理。處理24小時(shí)后，制備細(xì)胞裂解物并通過(guò)Western印跡分析。為了解釋細(xì)胞脫附引起的潛在作用，通過(guò)比較各信號(hào)發(fā)放分子的磷酸化水平與總水平之比來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用。如所見(jiàn)，濃度從 0. 01 μ g/mL至10 μ g/mL的DI-17E6和濃度從0. 01 μ M至10 μ M的西侖吉肽以劑量依賴(lài)的方式阻斷FAK和ERK1/2的活化(圖16)。
權(quán)利要求
1.用于利用選自ADAMTSU STCU EDNU MCPU IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配體和 IL6 的至少一種選擇性生物標(biāo)志基因或其基因產(chǎn)物來(lái)測(cè)量整聯(lián)蛋白抑制劑、VEGF抑制劑或小分子 ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑對(duì)血管發(fā)生的作用，和/或這類(lèi)抑制劑對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病的治療功效的離體方法，所述方法包括步驟(a)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置在體液和/或組織樣品中測(cè)量至少一種所選生物標(biāo)志的基線(xiàn)濃度和/或修飾狀態(tài)，其中所述樣品獲自尚未用所述抑制劑處理的個(gè)體；(b)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置在獲自已用所述抑制劑處理的個(gè)體的樣品中或在隨后的步驟中通過(guò)所述抑制劑處理的(a)的樣品中測(cè)量的(a)中所選生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)；(c)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置測(cè)量由步驟(a)和(b)獲得的所選生物標(biāo)志的濃度和/ 或修飾狀態(tài)之間的差異；(d)從步驟(c)獲得的所述差異測(cè)定所述抑制劑的一個(gè)或多個(gè)以下特性或參數(shù)-對(duì)所述分子靶標(biāo)和對(duì)與所述分子靶標(biāo)相關(guān)的各信號(hào)傳導(dǎo)途徑的藥效；-對(duì)血管發(fā)生的作用；-在患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的患者中的治療功效和臨床結(jié)果；和可選地(e)重復(fù)步驟 (a)至(d)，直到獲得希望的特性/參數(shù)；從而允許在個(gè)體中評(píng)估就對(duì)血管發(fā)生的作用或治療功效、安全性、預(yù)后或所述抑制劑的劑量或血管發(fā)生相關(guān)疾病而言的臨床測(cè)量結(jié)果和活性。
2.權(quán)利要求1的離體方法，其中所述獲取的體液樣品是血液、血漿、血清、淋巴、尿液、 淚、滑液、創(chuàng)傷液和/或腦脊液。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織樣品包含患病組織或健康組織。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織樣品選自癌組織、皮膚組織和/或滑膜組織。
5.權(quán)利要求1的離體方法，其中從所述獲取的組織樣品制備內(nèi)皮細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中在已從個(gè)體獲得并從組織樣品制備所述內(nèi)皮細(xì)胞后，將它們培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室條件下，其中從細(xì)胞培養(yǎng)基或來(lái)自所述細(xì)胞的提取物測(cè)定至少一種生物標(biāo)
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述整聯(lián)蛋白抑制劑是α(ν)整聯(lián)蛋白抑制劑， 且是重組單克隆抗體或RGD肽。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抑制劑是mAbDI-17E6或RGD肽西侖吉肽。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑是舒尼替尼和/或索拉非尼。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞和/或體液樣品衍生自健康個(gè)體和/或患有腫瘤障礙和/或其他血管發(fā)生相關(guān)疾病的患病個(gè)體。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述血管發(fā)生相關(guān)疾病是癌癥或癌癥相關(guān)疾病。
12.權(quán)利要求1-11的方法，其中所述生物標(biāo)志由于施用所述整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子 ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑而在其水平中和/或在修飾狀態(tài)中下調(diào)或上調(diào)。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志是ADAMTS1和/或STCl或其基因產(chǎn)物，且由于施用所述整聯(lián)蛋白抑制劑而上調(diào)。
14.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志是MCP1、INHBA、EDNl和/或 PDGF-BB或其基因產(chǎn)物，且由于施用所述整聯(lián)蛋白抑制劑而下調(diào)。
15.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志是IL8或其基因產(chǎn)物，且由于施用西侖吉肽或索拉非尼而下調(diào)，并由于施用DI-17E6或舒尼替尼而上調(diào)。
16.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志IL6和/或CRP由于施用 DI-17E6而上調(diào)。
17.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志⑶40配體由于施用DI-17E6而下調(diào)。
18.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志STCl由于施用小分子ATP定向多激酶抑制劑而下調(diào)。
19.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志EDm由于施用小分子ATP定向多激酶抑制劑而上調(diào)。
20.用于利用選自ADAMTSU STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配體和 IL6 的至少一種選擇性生物標(biāo)志或其基因產(chǎn)物在基于細(xì)胞的模型中篩選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法，所述方法包括步驟(a)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置在體液或組織樣品中測(cè)量至少一種所選生物標(biāo)志的基線(xiàn)濃度和/或修飾狀態(tài)，其中所述樣品獲自尚未用所述整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物處理的個(gè)體；(b)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置在獲自已用所述整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物處理的個(gè)體的樣品中測(cè)量(a)中所選生物標(biāo)志的濃度和/或修飾狀態(tài)；(c)通過(guò)技術(shù)手段和/或裝置測(cè)量通過(guò)步驟(a)和(b)獲得的所選生物標(biāo)志的濃度和 /或修飾狀態(tài)之間的差異；和(d)從步驟(c)獲得的所述差異測(cè)定在所述細(xì)胞測(cè)定中影響血管發(fā)生的調(diào)節(jié)的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的特性或參數(shù)。
21.選自ADAMTSU STCl、EDNl、MCPl、IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配體和 IL6 的生物標(biāo)志基因或其基因產(chǎn)物的用途，其用于評(píng)估和預(yù)測(cè)整聯(lián)蛋白抑制劑、VEGF抑制劑或小分子ATP 位點(diǎn)定向激酶抑制劑在基于細(xì)胞的測(cè)定中對(duì)血管發(fā)生的作用，或這類(lèi)抑制劑在離體條件下的功效和/或劑量。
22.選自ADAMTSU STCU EDNU MCPU IL8、PDGF-BB, CRP、CD40 配體和 IL6 的生物標(biāo)志基因或其基因產(chǎn)物的用途，其用于制備整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向激酶抑制劑，所述整聯(lián)蛋白抑制劑或小分子ATP位點(diǎn)定向激酶抑制劑用于在對(duì)這些生物標(biāo)志中的至少一種反應(yīng)的患者中治療癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過(guò)使用某些鑒定的生物標(biāo)志來(lái)評(píng)估整聯(lián)蛋白抑制劑和小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑對(duì)血管發(fā)生的作用的方法。此方法對(duì)測(cè)定主要用于治療血管發(fā)生相關(guān)疾病如癌癥的整聯(lián)蛋白抑制劑和小分子ATP位點(diǎn)定向多激酶抑制劑的功效尤其有益。尤其是，本發(fā)明涉及與血管發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志，其優(yōu)選是在體液中可及的，并因此允許以無(wú)損傷的方式分析靶調(diào)節(jié)。還公開(kāi)了該生物標(biāo)志在篩選具有整聯(lián)蛋白抑制活性的化合物中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102265156SQ200980152028
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
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