專(zhuān)利名稱(chēng)：癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及癌癥治療，特別是涉及抗藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡的癌癥。
背景技術(shù)：
1.引言本申請(qǐng)要求下列各美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的利益和優(yōu)先權(quán)序列號(hào)60/625，193，2004 年11月提交，題為“癌癥治療”；和60/660, 266,2005年3月提交，題為“癌癥治療”。這些 申請(qǐng)各自在此以其全文合并作為參考，包括附圖、表格和權(quán)利要求。下面的描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。并非承認(rèn)任何所述信息對(duì)于本發(fā)明而 言是現(xiàn)有技術(shù)或相關(guān)技術(shù)，或者任何明確或隱含引用的公布是現(xiàn)有技術(shù)。2.背景在美國(guó)，癌癥現(xiàn)在是死亡的第二位主要原因，美國(guó)有超過(guò)8，000，000人被診斷 為癌癥。1995年，癌癥占美國(guó)所有死亡的23.3%。參見(jiàn)美國(guó)衛(wèi)生和人類(lèi)服務(wù)部，國(guó)家健 康統(tǒng)計(jì)中心(U. S. Dept. of Health and HumanServices, National Center for Health Statistics)的 Health United Statesl996_97 和Injury Chartbook 117(1997)。癌癥尚未在分子學(xué)水平被完全了解。已知把細(xì)胞暴露于致癌物如某些病毒、某些 化學(xué)物質(zhì)或輻射能導(dǎo)致滅活“抑制性”基因或活化“致癌基因”的DNA的改變。抑制基因是 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因，其一旦突變就不能再控制細(xì)胞生長(zhǎng)。致癌基因起初是正?；?稱(chēng)為原癌 基因)，通過(guò)突變或改變表達(dá)內(nèi)容成為轉(zhuǎn)化基因。轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞的不當(dāng)生長(zhǎng)。超 過(guò)20個(gè)不同的正常細(xì)胞基因可通過(guò)基因改變成為致癌基因。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在很多方面與正常 細(xì)胞不同，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用、膜的成分、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)、蛋白分泌、 基因表達(dá)和死亡率(轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以無(wú)限生長(zhǎng))。瘤，或腫瘤，是細(xì)胞生長(zhǎng)異常的、不受調(diào)節(jié)的和無(wú)組織的增殖，通常稱(chēng)為癌癥。如果 瘤具有破壞性生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的性質(zhì)，就是惡性或癌。浸潤(rùn)是指瘤通過(guò)滲透或破壞周?chē)M 織的局部擴(kuò)散，通常破壞性穿過(guò)限定組織邊界的基底層，因此常常進(jìn)入體循環(huán)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)移通 常指腫瘤細(xì)胞通過(guò)漿膜腔、蛛網(wǎng)膜下腔或其它腔隙，以直接擴(kuò)散的方式遷移。通過(guò)轉(zhuǎn)移過(guò) 程，腫瘤細(xì)胞遷移到身體的其它部位，在遠(yuǎn)離其最初出現(xiàn)位置的部位生成瘤。癌癥現(xiàn)在主要用三種類(lèi)型的治療方法之一或聯(lián)合治療手術(shù)，放療和化療。手術(shù)涉 及大量清除病變組織。雖然手術(shù)對(duì)于清除位于某些位置的腫瘤(例如乳房、結(jié)腸和皮膚) 有時(shí)有效，但它不能用于治療位于其它部位的腫瘤，如脊椎，也不能治療散在的腫瘤病癥如 白血病。放療涉及把活組織暴露在能導(dǎo)致暴露的細(xì)胞死亡或破壞的電離輻射中。放療的副 作用可能是急性和短暫的，但有些可能不可逆轉(zhuǎn)。化療涉及破壞細(xì)胞復(fù)制或細(xì)胞代謝。在 乳房、肺和睪丸癌的治療中最常用。
用全身化療治療腫瘤疾病的不良作用是接受癌癥治療的患者最害怕的。在這些 不良作用中，惡性和嘔吐最常見(jiàn)。其它不良副作用包括接受高劑量化療與骨髓救療(bone marrow rescue)或放療的患者中血細(xì)胞減少、感染、惡病質(zhì)、粘膜炎；禿頭癥(脫發(fā))；皮膚 并發(fā)癥如瘙癢、蕁麻疹和血管性水腫；神經(jīng)并發(fā)癥；肺部和心臟并發(fā)癥；以及生殖和內(nèi)分 泌并發(fā)癥?；煂?dǎo)致的副作用嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，并可能強(qiáng)烈影響患者對(duì)治療的依 從性。因此，需要改進(jìn)的治療方法。3.定義“烷化劑”指化學(xué)修飾DNA并破壞其功能的化療化合物。一些烷化劑導(dǎo)致雙 鏈DNA分子的同一條鏈或互補(bǔ)鏈的核苷酸之間形成交聯(lián)，但另外一些導(dǎo)致DNA鏈之間 的堿基對(duì)錯(cuò)配。烷化劑的實(shí)例包括苯達(dá)莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、 卡鉬(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、順鉬(cisplatin)、苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、環(huán)磷酉先胺(cyclophosphamide)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、六甲啼胺 (hexamethylmelamine)、異環(huán)磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀(Iomustine)、雙氯乙基甲 胺(mechlorethamine)、美法倉(cāng)(melphalan)、米托坦(mitotane)、絲裂霉素(mytomycin) > 哌泊溴烷(pipobroman)、丙卡巴胼(procarbazine)、鏈脲菌素(str印tozocin)、噻替哌 (thiotepa)禾口三亞乙基密胺(triethylenemelamine)?！翱勾x藥”指干擾生物分子合成的化療藥，所述生物分子包括DNA合成必需(如 核苷酸和核苷)的需要合成DNA者。抗代謝藥的實(shí)例包括卡培他濱(capecitabine)、 氯脫氧腺苷(chlorodeoxyadenosine)、阿糖胞苷(cytarabine)(及其活性形式， ara-CMP) > H H1^f (cytosinearabinoside) > dacabazine> M J^ Ρ (f loxuridine) > M 拉賓(fludarabine)、5-氟脲嘧啶(5_fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲 (hydroxyurea) >6- Jft基口票吟(6-mercaptopurine)、甲氛蝶吟(methotrexate)、噴司他丁 (pentostatin)、三甲曲沙(trimetrexate)禾口 6-JlE基鳥(niǎo)曙吟(6—thioguanine)。“抗有絲分裂”指干擾有絲分裂的化療藥，通常是通過(guò)破壞微管形成。抗有絲分 裂化合物的實(shí)例包括諾維本(navelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、泰素帝(taxotere), 長(zhǎng)春堿(vinblastine)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)和長(zhǎng)春瑞賓 (vinorelbine)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“化療藥”指目的在于破壞惡性細(xì)胞和組織的化學(xué)藥品?；熕?包括小分子、核酸(如反義分子、核酶、小干擾RNA分子等)和蛋白質(zhì)(如抗體、抗體片段、 細(xì)胞因子、酶和肽類(lèi)激素)，當(dāng)為了預(yù)防或治療癌癥或其它惡性腫瘤施用給患者時(shí)，其具有 抗腫瘤效應(yīng)?；熕幗?jīng)?；谧饔脵C(jī)制分類(lèi)，如烷化劑、抗代謝類(lèi)和抗有絲分裂劑。術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合治療”指治療方案涉及至少施用兩種不同的療法，以達(dá)到需要的治療效 果。例如，聯(lián)合治療可包括施用兩種或多種化學(xué)活性不同的成分，如快速起作用的化療劑 和骨髓保護(hù)劑。或者，聯(lián)合治療可包括施用一種或多種化療劑以及給予放療和/或手術(shù)或 其它手段，改善患者的生活質(zhì)量或治療癌癥。在施用兩種或多種化學(xué)活性不同的成分的情 況下，應(yīng)理解活性成分可以作為同一組合物的部分或作為不同組合物施用。當(dāng)作為分開(kāi)的 組合物施用時(shí)，包含不同活性成分的組合物可以通過(guò)相同或不同的途徑、采用相同的不同 劑量方案，同時(shí)或不同時(shí)施用，均根據(jù)特定情況的需要并依照主治醫(yī)師的決定。同樣，當(dāng)一 種或多種化療藥與例如放療和/或手術(shù)聯(lián)合時(shí)，藥物可以在手術(shù)或放射治療之前或之后給
5予?！扒度雱敝笇⒆陨聿迦腚p鏈DNA分子中相鄰堿基對(duì)間的化療劑，其破壞DNA結(jié)構(gòu) 并干擾DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、和/或DNA結(jié)合蛋白與DNA的結(jié)合。“單一療法”指治療方案基于給予一種治療有效的化合物，不管是單劑施用或在一 段時(shí)間內(nèi)多次施用。在藥品商業(yè)化的背景下，術(shù)語(yǔ)“促進(jìn)”等指由參與所關(guān)注的具體藥物化合物、組合 物或治療方案的發(fā)現(xiàn)、研究、開(kāi)發(fā)和/或商業(yè)化的制造商、經(jīng)銷(xiāo)商或其它實(shí)體所進(jìn)行或發(fā) 起的任何和所有的信息性的、說(shuō)服性和科學(xué)性的活動(dòng)，直接或間接地導(dǎo)致化合物、組合物或 治療方案的處方、供應(yīng)、購(gòu)買(mǎi)和/或應(yīng)用。這樣的活動(dòng)可以直接面向供應(yīng)和經(jīng)銷(xiāo)鏈中的任何 人，包括但不限于醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員(如醫(yī)生和護(hù)士)、藥劑師、保健管理員、保險(xiǎn)公司或政府代 表、以及患者(包括潛在的患者)。換句話說(shuō)，促進(jìn)的首要目的是刺激特定藥物化合物、組合 物或治療方案的銷(xiāo)售或使用和/或興趣，并因此為該目的服務(wù)的任何活動(dòng)構(gòu)成了特定藥物 化合物、組合物或治療方案的“促進(jìn)”。根據(jù)本發(fā)明的“可獲得專(zhuān)利”的組合物、方法、機(jī)器或制造的物品是指在進(jìn)行研究 的時(shí)候，該主題滿(mǎn)足了關(guān)于專(zhuān)利性的所有法定條件。例如，關(guān)于新穎性、非顯而易見(jiàn)性等，如 果后來(lái)的研究表明，一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求包括了一種或多種將破壞新穎性、非顯而易見(jiàn)性 等的實(shí)施方案，則被定義限制到“可獲得專(zhuān)利”的實(shí)施方案上的權(quán)利要求明確排除不能得到 專(zhuān)利的實(shí)施方案。同樣所附的權(quán)利要求還要解釋為提供最寬的合理范圍以及保持其有效 性。此外，從本申請(qǐng)?zhí)峤换驅(qū)＠跈?quán)的時(shí)間到一條或多條所附權(quán)利要求的有效性被質(zhì)疑的 時(shí)間，如果關(guān)于專(zhuān)利性的一條或多條法定條件被修訂，或者如果評(píng)價(jià)關(guān)于專(zhuān)利性的特定條 件是否滿(mǎn)足的標(biāo)準(zhǔn)改變，本權(quán)利要求應(yīng)該以下述方式解釋(1)保持其有效性和(2)在這種 情況下提供最寬的合理解釋。術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的鹽”指保持本發(fā)明化合物的生物效力和特性的鹽類(lèi)，并且其不 是生物或其它方面不合乎需要的。很多情況下，本發(fā)明的化合物在存在氨基和/或羧基或 與此相似的基團(tuán)的條件下，能形成酸和/或堿鹽。藥物可接受的酸式鹽可以從無(wú)機(jī)和有機(jī) 酸制備，而藥物可接受的堿加成鹽可從無(wú)機(jī)和有機(jī)堿制備。關(guān)于藥物可接受的鹽的綜述見(jiàn) Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sd，vol. 66，1)?！八幬锟山邮艿臒o(wú)毒鹽”指用無(wú)毒的藥物可 接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸或者無(wú)機(jī)或有機(jī)堿形成的無(wú)毒鹽。例如，鹽包括從無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴 酸、硫酸、磺酰胺酸、磷酸、硝酸等衍生的鹽，以及從有機(jī)酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、 硬脂酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸(pamoicacid)、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、 苯基乙酸、谷氨酸、安息香酸、水楊酸、磺胺酸、富馬酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等。鹽還包括來(lái) 自無(wú)機(jī)堿，如氨水、羥乙胺和胼的鹽。適用的有機(jī)堿包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、 三甲胺、三乙胺、乙二胺、羥乙胺、嗎啉、哌嗪和胍。“多個(gè)”指超過(guò)一個(gè)。術(shù)語(yǔ)“利妥昔單抗(rituximab)難以治療的”意思是之前用利妥昔單抗治療，但是 根據(jù)醫(yī)生或治療專(zhuān)家的決定，由于單一藥劑或者聯(lián)合治療施用的利妥昔單抗療法難以治療 的疾病(定義為在全部利妥昔單抗治療的6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有反應(yīng)或病情發(fā)展)，不適合進(jìn)一步治 療，和/或?qū)χ暗睦孜魡慰怪委熡胁涣挤磻?yīng)，使得進(jìn)一步治療得不到保證。術(shù)語(yǔ)“抗-⑶20難以治療的”意思是之前用與⑶20抗原相互作用的藥劑治療，但是根據(jù)醫(yī)生或治療專(zhuān)家的決定，由于單一藥劑或者聯(lián)合治療施用的抗CD20劑的難以治療 的疾病(定義為在全部抗CD20治療的6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有反應(yīng)或病情發(fā)展)，不適合進(jìn)一步治療， 和/或?qū)χ暗睦孜魡慰怪委熡胁涣挤磻?yīng)，使得進(jìn)一步治療得不到保證。細(xì)胞周期的“S期”指染色體復(fù)制的時(shí)期。術(shù)語(yǔ)“種類(lèi)”在不同條件下用于本文，如化療藥的具體種類(lèi)。在每個(gè)條件中，術(shù)語(yǔ) 指在該特定條件下所指的這類(lèi)化學(xué)區(qū)分不明顯的分子類(lèi)群?！皩?duì)象”或“患者”是指需要可由本發(fā)明的分子有效治療的治療的動(dòng)物。可以治療 的動(dòng)物依照本發(fā)明包括脊椎動(dòng)物，哺乳動(dòng)物如牛、犬、馬、貓、羊、豬和靈長(zhǎng)類(lèi)(包括人和非 人靈長(zhǎng)類(lèi))動(dòng)物是特別優(yōu)選的實(shí)例?！爸委熡行Я俊敝甘┯玫叫枰@種治療的對(duì)象中時(shí)，活性成分足以產(chǎn)生治療作用的 量。在癌癥治療的條件下，“治療有效量”是在與癌細(xì)胞存活或代謝有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù) 中，產(chǎn)生有客觀量度的改變的量，包括與特定癌癥相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的增加或減 少、腫瘤負(fù)荷降低、癌細(xì)胞裂解、在生物樣本中(如活檢和體液如全血、血漿、血清、尿等的 等分試樣)檢測(cè)到一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞死亡標(biāo)記、對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡或其它的細(xì)胞死亡 途徑的誘導(dǎo)等。當(dāng)然，治療有效量根據(jù)具體對(duì)象和要治療的病癥、對(duì)象的體重和年齡、病情 嚴(yán)重度、所選的特定化合物、要依照的施用方案、施用時(shí)間、施用方式等而變化，所有這些可 以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易地確定。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，在聯(lián)合治療的情況下，構(gòu)成特定活性 成分的治療有效量可以與單一療法(即治療方案只采用一種實(shí)體化學(xué)藥品作為活性成分) 施用時(shí)構(gòu)成的活性成分的治療有效量不同。術(shù)語(yǔ)“治療”意思是對(duì)疾病或病癥的任何處理，包括預(yù)防或保護(hù)免患疾病或病癥 (即致使臨床癥狀不再發(fā)展)；抑制疾病或病癥(即阻止或抑制臨床癥狀的發(fā)展)；和/或 減輕疾病或病癥(即致使臨床癥狀消退)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，不是總可能區(qū)別“預(yù)防”和“抑制”疾 病或病癥，因?yàn)樽罱K的誘導(dǎo)事件可以是未知的或潛在的。因此，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”應(yīng)理解為構(gòu)成 了一類(lèi)“治療”，既包括“預(yù)防”又包括“抑制”。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)”因而包括“預(yù)防”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是，通過(guò)施用在癌細(xì)胞中引起有絲分裂災(zāi)變(catastrophe)的 化合物(如苯達(dá)莫司汀)，單獨(dú)施用或者與其它化合物和/或治療相結(jié)合，為治療特征在于 癌細(xì)胞抗死亡的癌癥提供了可獲得專(zhuān)利的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些方法包括確定患 者是否患有特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥，如果是，給患者施用治療有效量的苯達(dá)莫司汀。 發(fā)明的另一個(gè)目的涉及在癌癥治療的施用期間或之后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)段，在采集的患者 生物樣本中檢測(cè)癌細(xì)胞死亡標(biāo)記的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)癌癥治療的有效性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療癌癥患者的可獲得專(zhuān)利的方法，所述癌癥患 者的癌癥特征在于癌細(xì)胞抗死亡，即癌細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞程序性死亡或其它程序細(xì)胞死亡途 徑，以及細(xì)胞表現(xiàn)出多藥抗性(MDR)，這是可以被施用一種或多種烷化劑，單獨(dú)施用或與抗 CD20如利妥昔單抗結(jié)合所誘導(dǎo)的。這些方法包括給患者施用治療有效量的、在抗死亡癌 細(xì)胞中引起有絲分裂災(zāi)變的化合物。這樣的細(xì)胞包括對(duì)抗藥物引起的細(xì)胞程序性死亡的 細(xì)胞。所述細(xì)胞的實(shí)例包括P53缺陷的細(xì)胞，通常是包括編碼p53的基因中有缺失或該基 因缺失的突變的結(jié)果。這樣的癌癥代表性的實(shí)例包括非何杰金氏(Hodgkin' s)淋巴瘤
7(“NHL")和慢性淋巴細(xì)胞白血病(“CLL")。誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)變特別優(yōu)選的化合物是 烷化劑苯達(dá)莫司汀。因此，相關(guān)方面涉及包括鑒定特定癌癥細(xì)胞為抗死亡癌細(xì)胞，之后用在 所述細(xì)胞中誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)變的化合物單獨(dú)或與其它化療藥、佐劑、手術(shù)和/或放療結(jié)合 治療的治療方法。另外，可以監(jiān)測(cè)所述治療方案的有效性，評(píng)價(jià)特定的單一療法或聯(lián)合療法 治療能否達(dá)到所需的效果。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療癌癥的某些相關(guān)的可獲得專(zhuān)利的方法，特別是特征 在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥。這些方法包括當(dāng)包含癌癥的至少一部分細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S 期時(shí)，給患者施用治療有效量的化合物。在一些實(shí)施方案中，給患者施用驅(qū)使癌細(xì)胞進(jìn)入S 期的化合物的結(jié)果是，患者癌細(xì)胞的至少一部分被驅(qū)進(jìn)S期。苯達(dá)莫司汀是特別優(yōu)選的驅(qū) 使癌細(xì)胞進(jìn)入S期的化合物。由于苯達(dá)莫司汀適用于把細(xì)胞驅(qū)入S期，另外的優(yōu)選實(shí)施方 案包括隨后施用一種或多種其它當(dāng)細(xì)胞在細(xì)胞周期的S期時(shí)更具活性(即發(fā)揮更大的治療 作用，例如細(xì)胞毒性)的化療劑，。在所述方法中，隨后施用一種或多種其他化療藥優(yōu)選發(fā) 生在苯達(dá)莫司汀施用后至少約10分鐘，優(yōu)選至少約30-約60分鐘或更長(zhǎng)，雖然優(yōu)選施用所 述其它藥發(fā)生在苯達(dá)莫司汀施用后約72小時(shí)之內(nèi)，優(yōu)選約48小時(shí)或更短。在一部分這些 優(yōu)選實(shí)施方案中，其它化療藥在施用苯達(dá)莫司汀后約30分鐘至約36小時(shí)內(nèi)施用，優(yōu)選在施 用苯達(dá)莫司汀后的大約30分鐘至24小時(shí)內(nèi)，某些情況下，在施用苯達(dá)莫司汀后大約30分 鐘至6至大約12小時(shí)內(nèi)。相關(guān)的方法包括減少與癌癥治療有關(guān)的毒性。這樣的方法包括 給癌癥患者施用多個(gè)劑量的治療有效量的苯達(dá)莫司汀。首劑就足以導(dǎo)致不需要的毒性。在 這樣的事件中，可延遲第二次施用(或后續(xù)劑量)，直至不需要的毒性減退。在一些情況下， 苯達(dá)莫司汀在不同時(shí)間的施用劑量也可以變化。本發(fā)明的另一個(gè)方面因此涉及在施用烷化劑(如苯達(dá)莫司汀)的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)癌 癥治療療效的可獲得專(zhuān)利的方法，該方法在整個(gè)治療過(guò)程期間或之后，可以是單一療法或 聯(lián)合療法。當(dāng)在施用包括施用烷化劑(如苯達(dá)莫司汀)的治療方案之后進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，優(yōu)選 先經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間，使烷化劑能發(fā)揮其應(yīng)有的或需要的治療作用。在這樣的方法中，從來(lái)自 患者的生物樣品中檢測(cè)與療效有關(guān)的癌細(xì)胞死亡標(biāo)記(即，由瀕死或死亡的癌細(xì)胞產(chǎn)生或 釋放的分子(例如蛋白質(zhì)、碳?xì)浠衔?、脂質(zhì)、核酸或其它分子)以及如喪失細(xì)胞生存能力、 不能增殖、衰老等表型)來(lái)確定所用的治療是否有效。。優(yōu)選的細(xì)胞死亡標(biāo)記包括腺苷酸激 酶活性水平、PARP切割產(chǎn)物的水平、和細(xì)胞生存能力降低。根據(jù)標(biāo)記，這樣的檢測(cè)可以是定 性、半定量或定量的。檢測(cè)的標(biāo)記的存在或水平表明治療是否有、或曾經(jīng)有效。本發(fā)明的另外一個(gè)方面，發(fā)明涉及在對(duì)患有對(duì)一種或多種烷化劑和抗CD20劑(例 如利妥昔單抗)具有抗性或難以治療的癌癥的患者施用苯達(dá)莫司汀的基礎(chǔ)上，對(duì)癌癥的治 療。優(yōu)選這些方法用于對(duì)抗以癌細(xì)胞抗死亡為特征的癌癥。本發(fā)明相關(guān)的方面涉及在所述 癌癥的治療中處理事務(wù)的方法，包括促進(jìn)苯達(dá)莫司汀用于處理難以治療的癌癥或特征在于 癌細(xì)胞抗死亡的癌癥，特別是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑如利妥昔單抗的聯(lián)合治療 難治的癌癥。還有一個(gè)方面涉及患者的癌癥是否對(duì)苯達(dá)莫司汀治療敏感。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，可以 采用任何適用于苯達(dá)莫司汀敏感性的評(píng)價(jià)。在這些方法的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，從患者采 集的癌組織細(xì)胞樣本的部分或全部在沒(méi)有對(duì)癌細(xì)胞有毒性的化合物存在、使得癌細(xì)胞增殖 的生長(zhǎng)條件下暴露于苯達(dá)莫司汀。然后基于分析結(jié)果進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)。例如，與對(duì)照比較， 增殖減低表明細(xì)胞，即患者的癌癥，對(duì)苯達(dá)莫司汀為基礎(chǔ)的治療敏感。反之，沒(méi)有作用(或提高增殖)顯示缺少敏感性。發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及苯達(dá)莫司汀在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥 是特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥或治療難治性癌癥，特別是用一種或多種烷化劑和抗CD20 劑如利妥昔單抗的聯(lián)合治療難治的癌癥。優(yōu)選所述藥物包括治療有效量的苯達(dá)莫司汀。附圖簡(jiǎn)述本專(zhuān)利申請(qǐng)包含至少一個(gè)彩色制圖。帶有彩色附圖的本專(zhuān)利申請(qǐng)的復(fù)制件在請(qǐng)求 并付必要的費(fèi)用后提供。

圖1有兩個(gè)試驗(yàn)組，A和B，各顯示基因表達(dá)分布圖，A顯示苯達(dá)莫司汀基因表達(dá) 圖譜簇前100個(gè)受調(diào)節(jié)基因，B顯示受三種受試藥物上調(diào)節(jié)水平水平最高的基因。這兩 個(gè)試驗(yàn)組顯示在非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-I中，用含有超過(guò)12，000已知基因的 Affymetrix基因芯片(U133A)測(cè)定的基因表達(dá)。苯達(dá)莫司汀在IC50 (25 μ M ；條帶1)和 IC90(35yM;條帶2)下測(cè)試。苯丁酸氮芥(5 μ M ；條帶3)和環(huán)磷酰胺代謝物磷酰胺氮芥 (50 μ M ；條帶4)在IC90下測(cè)試。暴露后8h分離mRNA。Α.顯示的簇圖(clustergram)代 表與對(duì)照(稀釋劑，DMS0)比較，前100個(gè)受調(diào)節(jié)水平最高的基因。紅色代表上調(diào)的基因， 藍(lán)色代表下調(diào)的基因。B.該簇圖表現(xiàn)出同時(shí)被全部三種被測(cè)藥物誘導(dǎo)的基因。圖2有三個(gè)柱狀圖，2A、2B和2C，2A顯示Q-PCR驗(yàn)證選擇的p53_依賴(lài)性和促細(xì)胞 程序性死亡基因，2B顯示Q-PCR驗(yàn)證選擇的有絲分裂關(guān)卡基因，2C顯示Q-PCR驗(yàn)證選擇的 DNA修復(fù)基因。按照下文方法部分的敘述，在暴露于等毒性濃度的苯達(dá)莫司汀、磷酰胺氮芥 和苯丁酸氮芥的SU-DHL-I中進(jìn)行Q-PCR分析。用對(duì)18s RNA的分析對(duì)輸入cDNA (input cDNA)的水平標(biāo)準(zhǔn)化，未處理樣本中的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)定為1。圖2A顯示兩種代表性p53-依賴(lài) 基因p21和NOXA的相對(duì)RNA水平。圖2B顯示參與M期細(xì)胞周期關(guān)卡的四種基因polo-類(lèi) 激酶(PLK-I)、aurora激酶A和B、以及細(xì)胞周期蛋白Bl的RNA水平。圖2C顯示涉及DNA 修復(fù)機(jī)制的基因EXOl和Fenl的RNA水平。柱代表相對(duì)于DMSO-處理的對(duì)照的倍數(shù)改變均 值 +/-SE。圖3顯示了數(shù)個(gè)免疫印跡，證明了在NHL細(xì)胞(SU-DHL-I)中，苯達(dá)莫司汀(50 μ M) 與環(huán)磷酰胺(50 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4μΜ)比較，細(xì)胞程序性死亡作用提高。為了產(chǎn)生這些 免疫印跡，在如下文方法部分所述暴露20小時(shí)后制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物。用β-肌動(dòng)蛋白作為 點(diǎn)樣對(duì)照對(duì)膜進(jìn)行探查，并顯示在受調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)下方。左上端長(zhǎng)方圖代表Serl5-磷酸化 P53的表達(dá)，用磷特異性抗體檢測(cè)。中間左邊的方圖顯示總p53和p21的表達(dá)。左下方圖代 表Bax的表達(dá)。右方圖顯示全長(zhǎng)PARP (最上方)和用識(shí)別特異的半胱天冬酶斷裂位點(diǎn)的抗 體的PARP半胱天冬酶斷裂片段。圖4由兩個(gè)圖組成，A和B，表示所選的DNA修復(fù)機(jī)制的功能分析，A顯示MX (Ape-I 抑制劑)對(duì)苯達(dá)莫司汀活性的作用與對(duì)環(huán)磷酰胺活性的作用比較，B顯示06-芐基鳥(niǎo)嘌呤 對(duì)苯達(dá)莫司汀、環(huán)磷酰胺和卡莫司汀的作用。圖4A顯示是苯達(dá)莫司汀而不是環(huán)磷酰胺，通 過(guò)堿基切除修復(fù)(BER)導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)。修復(fù)酶Ape-Ι，一種無(wú)嘌呤內(nèi)切酶，在BER途徑 中，在苯達(dá)莫司汀和環(huán)磷酰胺代謝物磷酰胺氮芥(PM)的細(xì)胞毒活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的 作用，用Ape-I抑制劑甲氧胺(MX)對(duì)其作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。用苯達(dá)莫司汀和MX觀察到曲線的 左移，顯示苯達(dá)莫司汀產(chǎn)生的DNA損傷被BER修復(fù)。圖4B顯示抑制MGMT修復(fù)活性不影響 苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞毒性。修復(fù)酶MGMT (O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)在苯達(dá)莫司汀細(xì)胞毒活性中的作用，用MGMT抑制劑O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(O6-BG)評(píng)價(jià)。加入O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤不顯 著改變苯達(dá)莫司汀的IC5tl，因此苯達(dá)莫司汀不可能誘導(dǎo)O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤DNA加成物。反之， O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤明顯使細(xì)胞對(duì)其它氮芥如卡莫司汀和磷酰胺氮芥(PM)敏感化。圖5圖解了苯達(dá)莫司汀有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，引起長(zhǎng)時(shí)間和大范圍的DNA損傷，其導(dǎo) 致了至少三個(gè)信號(hào)途徑的啟動(dòng)1)可能通過(guò)促細(xì)胞程序性死亡的BCL-2家族成員如NOXA 和Bax激活“經(jīng)典的”p53-依賴(lài)性應(yīng)激途徑，導(dǎo)致內(nèi)在細(xì)胞程序性死亡的強(qiáng)烈激活；2)激活 DNA修復(fù)機(jī)制，如堿基切除修復(fù)工具，其不能通過(guò)通常用在NHL或CLL患者中的其它烷化劑 激活；和3)抑制數(shù)個(gè)有絲分裂關(guān)卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。雖然不希望被局限 于具體理論中，但據(jù)估計(jì)，同時(shí)誘導(dǎo)DNA損傷和抑制有絲分裂關(guān)卡阻止了暴露于苯達(dá)莫司 汀的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷有絲分裂之前就有效修復(fù)DNA損傷。從而細(xì)胞以受損的DNA進(jìn)入有絲 分裂，或者不能繼續(xù)進(jìn)行“常規(guī)的”P(pán)53-依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞將通過(guò)有絲分裂災(zāi)變 而死亡。這個(gè)替代的程序化細(xì)胞死亡途徑，連同傳統(tǒng)的細(xì)胞程序性死亡的強(qiáng)烈激活，據(jù)相信 是苯達(dá)莫司汀為何在體外以及在化學(xué)藥品難以治療的腫瘤患者中，非常有效地殺死抗藥癌 細(xì)胞的理由。圖6是直方圖，顯示了在下文的實(shí)施例3描述的數(shù)個(gè)“洗脫”實(shí)驗(yàn)期間，進(jìn)行的腺苷 酸激酶分析的結(jié)果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的藥物處理指定的時(shí)間，洗脫，并使細(xì)胞 在新鮮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48小時(shí)(SU-DHL-I)后進(jìn)行。在這些實(shí)驗(yàn)中，SU-DHL-I細(xì)胞用50 μ M 苯達(dá)莫司汀、20 μ M磷酰胺氮芥或2 μ M苯丁酸氮芥處理30、60或90分鐘。定時(shí)藥物培養(yǎng)之 后，細(xì)胞在IX PBS中清洗，“洗脫”特定化療劑，然后加入新鮮的培養(yǎng)基。之后培養(yǎng)細(xì)胞48 小時(shí)，這段時(shí)間過(guò)后在細(xì)胞上清液中進(jìn)行腺苷酸激酶的分析。粉紅色柱代表藥物(或無(wú)藥) 培養(yǎng)的零分鐘。綠色柱代表培養(yǎng)30分鐘，橙色柱代表培養(yǎng)60分鐘，紫色柱代表培養(yǎng)120分 鐘。結(jié)果繪制了三種藥物和“無(wú)藥”對(duì)照相比較的上清液中腺苷酸激酶活性的水平。標(biāo)準(zhǔn) 偏差在圖上每個(gè)柱子的頂部顯示。圖7與和圖6類(lèi)似是直方圖，顯示了在下文的實(shí)施例3描述的數(shù)個(gè)“洗脫”實(shí)驗(yàn)期 間，進(jìn)行的腺苷酸激酶分析的結(jié)果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的藥物處理指定的時(shí)間， 洗脫，并使細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)72小時(shí)(SU-DHL-I)后進(jìn)行。圖6和7之間描繪的結(jié) 果之間的差異在于圖6表現(xiàn)的數(shù)據(jù)涉及到從培養(yǎng)基“洗脫”各種藥物之后，細(xì)胞培養(yǎng)48小 時(shí)，而圖7的數(shù)據(jù)涉及到“洗脫”特定藥物后細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)。本領(lǐng)域人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，下面的說(shuō)明具體敘述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，因而 只是代表性的，不是描述發(fā)明的實(shí)際范圍。在詳細(xì)敘述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不 局限于所述的具體分子、系統(tǒng)和方法，這些可以變化。還要理解，這里所用的術(shù)語(yǔ)只是為了 描述具體實(shí)施方案，并非意在限制本發(fā)明由所附的權(quán)利要求限定的范圍。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是基于意外的發(fā)現(xiàn)，即烷化劑苯達(dá)莫司汀對(duì)多種癌細(xì)胞類(lèi)型發(fā)揮出非常迅 速的細(xì)胞毒作用，包括傳統(tǒng)化療方案難治的癌細(xì)胞。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如下文具體所述，與其它 抗癌藥相比，苯達(dá)莫司汀通過(guò)獨(dú)特的作用模式發(fā)揮其毒性作用。苯達(dá)莫司汀，4- {5-[雙(2-氯乙基)氨基]-1-甲基-2-苯并咪唑基}，是一種氮芥 類(lèi)化療劑。苯達(dá)莫司汀主要表現(xiàn)烷基化活性，即它是DNA損傷劑。當(dāng)施用于人(通常通過(guò)
10靜脈推注)時(shí)，苯達(dá)莫司汀血清半衰期短，大約2小時(shí)。因此，它從患者身體系統(tǒng)迅速清除。 出人意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，被細(xì)胞攝取后，苯達(dá)莫司汀迅速發(fā)揮其持久的細(xì)胞毒作用。實(shí)際 上，如下面的實(shí)施例3所報(bào)告，化合物的大部分毒性作用要在癌細(xì)胞暴露于藥劑下至少大 約30分鐘后發(fā)揮。當(dāng)前典型的苯達(dá)莫司汀治療方案包括分開(kāi)給予三次靜脈推注，各次含有等量的苯 達(dá)莫司汀。通常在第一次輸注后一天給以第二次輸注，之后在第一次輸注后三周是第三次 輸注。采用這種方案是由于苯達(dá)莫司汀的相關(guān)毒性，包括骨髓抑制。得到了苯達(dá)莫司汀血清 半衰期短和其快速作用的性質(zhì)，則可以通過(guò)延遲第二次和后續(xù)施用降低藥物的相關(guān)毒性。 實(shí)際上，因?yàn)樵谂c苯達(dá)莫司汀治療非何杰金氏淋巴瘤有關(guān)的報(bào)告中，偶見(jiàn)大范圍的并可能 是致死的腫瘤溶解，所以可以增加藥物多次施用的間隔，降低腫瘤溶解的發(fā)生率。除了降低 有害的毒性之外，在特定治療方案中加大苯達(dá)莫司汀施用間隔也會(huì)加大治療窗(window)， 即在此時(shí)間段內(nèi)藥物發(fā)揮其所需的治療效益。實(shí)行本發(fā)明所用的組合物依照藥物配方技術(shù)的傳統(tǒng)方法加工，產(chǎn)生施用于對(duì)象 的醫(yī)用藥劑(即藥物或治療組合物)，所述對(duì)象包括人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物，即分別是“藥 物”和“獸醫(yī)”用藥。參見(jiàn)，例如最新版 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA) 0通常，化合物如苯達(dá)莫司汀與藥學(xué)可接受的載體組合成組 合物。該組合物還可包括下列的一種或多種防腐劑；增溶劑；穩(wěn)定劑；潤(rùn)濕劑；乳化劑；甜 味劑；著色劑；芳香劑；鹽；緩沖劑；涂層劑；和抗氧化劑。實(shí)行本發(fā)明所用的藥物可制備成游離酸或堿，然后優(yōu)選與適當(dāng)?shù)幕衔锝M合，產(chǎn) 生藥物可接受的鹽?！八幬锟山邮艿柠}”的表述指用無(wú)毒的、藥物可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸或 者無(wú)機(jī)或有機(jī)堿形成的無(wú)毒鹽。例如，所述鹽包括從無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺酰胺 酸、磷酸、硝酸等衍生的鹽，以及從有機(jī)酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋(píng)果 酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、苯基乙酸、谷氨酸、安息香酸、水 楊酸、磺胺酸、富馬酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等制備的鹽。鹽還包括來(lái)自無(wú)機(jī)堿，如氨水、羥乙 胺和胼的鹽。適用的有機(jī)堿包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、 羥乙胺、嗎啉、哌嗪和胍。在任何情況下，藥物組合物優(yōu)選制成含有給定量所需治療藥(如苯達(dá)莫司汀)和 載體(即生理可接受的賦形劑)的劑量單位的形式。任何這樣的分子對(duì)人類(lèi)或其它哺乳動(dòng) 物(或其它動(dòng)物)的治療有效量的構(gòu)成，將取決于各種因素，其中包括疾病或病癥的類(lèi)型、 年齡、體重、性別、對(duì)象的醫(yī)療狀況、病情嚴(yán)重度、施用途徑、采用的具體化合物。因此，劑量 方案可以變化很大，但用標(biāo)準(zhǔn)方法可以常規(guī)確定。任何情況下，化療藥的“有效量”是引起 想要的細(xì)胞毒性的量。為達(dá)到想要的作用，所述治療分子的需要量將取決于眾多的考慮事 項(xiàng)，包括特定分子本身、要治療的疾病或病癥、對(duì)象的癌癥響應(yīng)分子的能力，給藥途徑等。為 達(dá)到想要的作用，所需的該分子的精確量取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷，并對(duì)每個(gè)單獨(dú)的對(duì)象是 特定的。但是，適用劑量可以從每天每千克體重約數(shù)納克(ng)活性成分至約數(shù)毫克(mg)。治療組合物的制備是本領(lǐng)域公知的。通常，這樣的組合物制成注射劑，或?yàn)橐后w 溶液或?yàn)閼乙?，但是，也能制成注射前適合溶解在或懸浮在液體中的固體形式。制劑也能被 乳化?；钚灾委煶煞纸?jīng)常同生理可接受并與活性成分可兼容的賦形劑混合。適用的賦形劑 是，例如注射用水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其組合。另外，如果需要，組合物可以含有少量提高活性成分的有效性的助劑如潤(rùn)濕或乳化劑、退熱劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、懸浮劑、麻醉 劑、防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑、止痛劑、PH緩沖劑等。所述成分能提供附加的治療效益，或 作用于預(yù)防施用藥物組合物可能造成的任何潛在的副作用。本發(fā)明的組合物以含有常規(guī)載體、助劑和介質(zhì)的劑量單位制劑，可以口服施用、通 過(guò)吸入噴霧劑胃腸外施用、直腸施用、結(jié)內(nèi)施用(intranodally)、鞘內(nèi)施用、或局部施用。在 治療組合物是為了人類(lèi)施用的情況下，應(yīng)用藥物可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的載體” 和“生理可接受的載體”指施用于對(duì)象時(shí)，生理可耐受并且通常不產(chǎn)生不想要的過(guò)敏或類(lèi)似 不當(dāng)反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物，所述不當(dāng)反應(yīng)如胃不適、頭暈等。對(duì)于口服施用，組合物可以是任何適當(dāng)?shù)男问?，其中包括例如膠囊、片齊IJ、錠齊U、軟 錠劑、粉劑、懸液劑或液體。液體可以作為帶有適當(dāng)載體包括鹽水、葡萄糖或水的組合物注 射施用。術(shù)語(yǔ)“胃腸外”包括經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑輸注(包括持續(xù)或 間斷輸注)和注射。直腸施用的栓劑可以通過(guò)將活性成分與適當(dāng)?shù)臒o(wú)刺激賦形劑如常溫下 為固體但生理溫度下為液體的可可脂和/或聚乙二醇混合而制備。組合物也可以制備成固體形式(包括顆粒、粉末或栓劑)。組合物可以經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的 藥物操作如殺菌和/或可含有傳統(tǒng)的助劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、緩沖劑等?？?服施用的固體劑型可包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在所述固體劑型中，活性化合物 可以與至少一種惰性賦形劑如蔗糖、乳糖或淀粉混合。所述劑型也可包含除了惰性稀釋劑 以外的附加物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型也可包含緩 沖劑。片劑和丸劑也可另外制備成帶有腸衣?？诜┯玫囊后w劑型也可包括藥物可接受的 乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑，其含有通常用于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑如水。所述組合物也可 包含助劑，如潤(rùn)濕劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑。注射制劑如無(wú)菌注射含水或含油懸液，可以根據(jù)已知方法用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖?rùn)濕 劑和懸浮劑制備。注射制劑也可以是在胃腸外可接受的無(wú)毒稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌注射溶 液或懸液?？梢杂玫倪m用介質(zhì)和溶劑是注射用水，Rimger溶液和等滲的氯化鈉溶液等。另 外，無(wú)菌固定油可以用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以用任何溫和的固定油，包括合成的甘 油一酯或甘油二酯。另外，發(fā)現(xiàn)了脂肪酸如油酸在制備注射劑中的用途。作為局部用藥，組合物的適當(dāng)?shù)木植縿┝靠梢悦刻焓┯靡恢了拇危瑑?yōu)選兩或 三次。該劑量的施用也可以有期間不用藥的居間日。局部施用的適用組合物常包含 0. 001% -10% w/w的活性成分，例如制劑的1-2重量％，盡管它可包含多達(dá)10% w/w，但優(yōu) 選不超過(guò)5 % w/w,更優(yōu)選為制劑的0. 1 % -1 %。適于局部施用的制劑包括適于透過(guò)皮膚的 液體或半液體的制劑(如擦劑、洗劑、膏劑、霜?jiǎng)┗蚝齽?，滴劑適合對(duì)眼睛、耳朵或鼻子施 用。施用本發(fā)明的組合物的示例性方法(如使其達(dá)到消毒或無(wú)菌條件)，對(duì)于技術(shù)人 員是顯見(jiàn)的。適合該目的的某些方法在Goodman和GiIman的The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (1985)中提出。對(duì)患者的施用可以是間斷的；或者是以逐步的、 持續(xù)的、恒定的、或控制的速度施用。苯達(dá)莫司汀治療非何杰金氏淋巴瘤的典型治療有效劑量可以約60-120mg/m2，連 續(xù)兩天單劑施用，或在劑量之間間隔數(shù)日?？梢源蠹s每三至四周為周期重復(fù)。為了治療慢 性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，可以在第1和2天給予苯達(dá)莫司汀約80-100mg/m2?？梢栽诖蠹s4周后重復(fù)該周期。為了治療何杰金氏病(II-IV期)，在"DBVBe方案"中可以給予苯達(dá) 莫司汀伴第1和15天用柔紅霉素25mg/m2，第1和15天用博來(lái)霉素10mg/m2，第1和15天 用長(zhǎng)春新堿1. 4mg/m2,以及第1-5天苯達(dá)莫司汀50mg/m2，大約每四周為周期重復(fù)。對(duì)于乳 腺癌，可以在第1和8天給予苯達(dá)莫司汀(120mg/m2)聯(lián)合第1和8天氨甲蝶呤40mg/m2，以 及第1和8天5-氟脲嘧啶600mg/m2，大約每四周為周期重復(fù)。作為乳腺癌的二線治療，苯 達(dá)莫司汀可以在第1和2天給予大約100-150mg/m2，大約每四周為周期重復(fù)。本發(fā)明的方法包括單一療法和聯(lián)合治療。在聯(lián)合治療的情況下，本發(fā)明預(yù)想了施 用兩種或多種化療劑。各種各樣的化療劑是本領(lǐng)域已知的。這些化合物中一些已經(jīng)被許 可用于治療一種或多種癌癥適應(yīng)癥。另一些在不同階段的臨床前和臨床開(kāi)發(fā)中。適合實(shí) 行本發(fā)明的聯(lián)合治療的化療劑實(shí)例包括烷化劑白消安、卡鉬、卡莫司汀、順鉬、苯丁酸氮芥、 環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、六甲嘧胺、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、米托坦、絲 裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴胼、鏈脲菌素、噻替哌和三亞乙基密胺。優(yōu)選的與苯達(dá)莫司汀合用 的抗代謝物類(lèi)包括卡培他濱、氯脫氧腺苷、阿糖胞苷(及其活性形式，ara-CMP)、阿糖胞苷、 dacabazine、氟尿苷、氟達(dá)拉賓、5-氟脲嘧啶、吉西他濱、羥基脲、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、噴 司他丁、三甲曲沙和6-巰基鳥(niǎo)嘌呤。優(yōu)選的與苯達(dá)莫司汀合用的抗有絲分裂的化合物包括 諾維本、紫杉醇、泰素帝、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞賓。其它類(lèi)的化療劑包括拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑(如喜樹(shù)堿(camptothecin)，伊 立替康(irinotecan)，拓?fù)涮婵?topotecan)等)；拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑如柔紅霉素 (daunorubicin)、阿霄素(doxorubicin)、依托泊昔(etoposide)、伊達(dá)比星(idarubicin)、 米托蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊甙(teniposide)；血管生成抑制劑(如達(dá)肝素 (dalteparin)，蘇拉明(suramin)等)；抗體，包括阿侖單抗(alemtuzumab)、貝伐
Jtl (bevacizumab)、胃 # 羅了 (bexarotene)、epratuzumab> pf ^ Jfl (gemtuzumab ozogamicin)、伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、甲石黃酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、 雷替曲噻(raltitrexed)、revlimid、利妥昔單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)；酪氨酸激 酶抑制劑；插入劑；和激素，如阿那曲唑(anastrozole)、雌激素、抗雌激素(如氟維司群 (fulvestrant)和他莫昔芬(tamoxifen))、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、 戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、尼魯米特(nilutamide) > levimasole、 來(lái)曲唑(Ietrozole)、潑尼松(prednisone)和托瑞米芬(toremifene)。其它化療劑包 括蛋白質(zhì)如血管生成抑制素、天冬酰胺酶、deniluekin diftitox、血管內(nèi)皮抑素、咪喹 莫特(imiquimod)、干擾素、白細(xì)胞介素-11和培加帕酶(pegaspargase)。還有其它 的化療劑包括分子，如9-順式視黃酸(alitretinoin)、六甲嘧胺(altretamine)、氨 磷汀(amifostine)、安丫啶(amsacrine)、三氧化砷、博來(lái)霉素(bleomycin)、卡培他濱 (capecitabine)、羧酰胺三唑、塞來(lái)考昔(celecoxib)、更生霉素(dactinomycin)、表柔比 星(印irubicin)、geldanmycin、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17AAG)、伊 立替康、2-甲氧雌二醇、光輝霉素(mithramycin)、絲裂霉素C(mytomycin C)、奧沙利鉬 (oxaliplatin)、鯊胺(squalamine)、替莫唑胺(temozolamide)、沙利度胺(thalidomide)、 tretinoin triapine和valrubicin。本領(lǐng)域人員應(yīng)體會(huì)，這些和其它現(xiàn)在已知或之后開(kāi)發(fā) 的化療劑可以與苯達(dá)莫司汀合用，治療各種腫瘤，包括癌癥。實(shí)施例
提供下列實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的某些方面，并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā) 明。這些實(shí)施例決不能認(rèn)為是以任何方式限制了發(fā)明的范圍。實(shí)施例1苯達(dá)莫司汀作用機(jī)制的分子學(xué)分析A.引言苯達(dá)莫司汀(Treanda ，Salmedix,Inc. CA ；Ribomustin (Ribosepharm GmbH, Munich Germany))是一種抗腫瘤劑，已被臨床前和臨床證明對(duì)抗各種人類(lèi)腫瘤的活性，如 非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病、實(shí)體瘤、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌，以及多種骨 髓瘤，包括傳統(tǒng)DNA損傷劑難治性腫瘤。苯達(dá)莫司汀，4-{5_[雙(2-氯乙基)氨基]-1-甲 基-2-苯并咪唑基}鹽酸丁酸，最初的合成是為了產(chǎn)生具有低毒以及兼具烷基化和抗代謝 物性質(zhì)的藥劑。它具有三個(gè)亞結(jié)構(gòu)元件2_氯乙基氨烷基化基團(tuán)；苯并咪唑環(huán)；和丁酸側(cè) 鏈。2-氯乙基氨烷基化基團(tuán)與其它氮芥類(lèi)，如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和美法侖共用。雖然苯 丁酸氮芥中也有丁酸側(cè)鏈，但苯并咪唑中央環(huán)體系是苯達(dá)莫司汀的獨(dú)有特點(diǎn)。其獨(dú)特的抗 腫瘤活性特點(diǎn)可能歸功于這種多層面結(jié)構(gòu)，并使其與傳統(tǒng)的烷化劑區(qū)別開(kāi)來(lái)。DNA烷化劑在化療物質(zhì)中極為有用。這些藥物具有預(yù)料不到的作用機(jī)制，如這些化 合物中的一些誘導(dǎo)程序化壞死的能力，和另一些(如鉬類(lèi)(platins))甚至在缺少核的細(xì)胞 中誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的能力。在“氮芥”的情況下，主要的差異存在于各種適應(yīng)癥中它們 的區(qū)別使用所反映的活性圖譜環(huán)磷酰胺，主要用于治療NHL ；苯丁酸氮芥，用于治療慢性 淋巴細(xì)胞白血??；美法侖，治療多發(fā)性骨髓瘤。苯達(dá)莫司汀主要的抗腫瘤作用，與其它烷化劑相同，來(lái)自DNA配對(duì)鏈之間形成交 聯(lián)，雖然也可包括其它作用方式。因此，苯達(dá)莫司汀的抗腫瘤作用可以源于比簡(jiǎn)單的經(jīng)典 烷基化活性更為復(fù)雜的機(jī)制，因?yàn)楸竭_(dá)莫司汀導(dǎo)致的DNA鏈斷裂比環(huán)磷酰胺或BNCU導(dǎo)致 的明顯更持久，苯達(dá)莫司汀表現(xiàn)出對(duì)在體外和離體抗其它烷化劑的細(xì)胞系的對(duì)抗活性，并 已證明苯達(dá)莫司汀作為單一藥劑以及與其它抗癌劑合用，在數(shù)個(gè)體外腫瘤模型中具有獨(dú)特 的促細(xì)胞程序性死亡活性。對(duì)苯達(dá)莫司汀作用確切機(jī)制的詳細(xì)分子研究還很少。為此， 運(yùn)用現(xiàn)有的分子工具充分詳細(xì)分析苯達(dá)莫司汀的作用機(jī)制。本實(shí)施例介紹了來(lái)自藥物基 因組學(xué)分析的結(jié)果來(lái)分析苯達(dá)莫司汀在NHL細(xì)胞系中引起的基因表達(dá)圖譜的改變。這些 藥物基因組學(xué)分析通過(guò)處理細(xì)胞程序性死亡信號(hào)的啟動(dòng)、DNA修復(fù)機(jī)制和有絲分裂關(guān)卡的 調(diào)節(jié)的功能分析來(lái)驗(yàn)證。最終，苯達(dá)莫司汀在體外篩選中，以國(guó)家癌癥研究所(National CancerInstitute)的人類(lèi)腫瘤60個(gè)細(xì)胞系表征，并且研究了其相對(duì)于烷化劑庫(kù)(即苯丁酸 氮芥和磷酰胺氮芥(環(huán)磷酰胺的代謝物))的比較活性。利用藥物基因組分析進(jìn)行苯達(dá)莫 司汀在NHL細(xì)胞系中引起的基因表達(dá)圖譜改變的分析，也產(chǎn)生了結(jié)果。這些藥物基因組學(xué) 分析通過(guò)Q-PCR和處理細(xì)胞程序性死亡信號(hào)的啟動(dòng)、DNA修復(fù)機(jī)制和有絲分裂關(guān)卡的調(diào)節(jié) 的功能分析來(lái)驗(yàn)證?？傊?，這些結(jié)果表明苯達(dá)莫司汀具有與其它烷基化藥物不同的多種作 用機(jī)制，解釋了苯達(dá)莫司汀在患有傳統(tǒng)療法難治性腫瘤的患者中的活性。B.材料與方法a.細(xì)胞SU-DHL-I 細(xì)胞從加利福尼亞圣地亞哥大學(xué)(University CaliforniaSan Diego) 得到。細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FBS(Invitrogen)和100單位/ml青霉素/鏈霉素的RPMI
141640 (Hyclone)上生長(zhǎng)。b.試劑鹽酸苯達(dá)莫司汀得自Fujisawa Deutschland(Munich，德國(guó))。磷酰胺氮芥環(huán)己 胺鹽(PM，NSC69945)，環(huán)磷酰胺的活性代謝物，得自國(guó)家癌癥研究所(NCI)發(fā)展治療計(jì)劃 (Developmental Therapeutics Program, DTP)的合成物貯藏庫(kù)。其它所有的試劑得自商 業(yè)來(lái)源，如 Sigma-Aldrich。c.藥物處理對(duì)于本實(shí)施例的多數(shù)分析，選擇使用的苯達(dá)莫司汀、磷酰胺氮芥(環(huán)磷酰胺的活 性代謝物)和苯丁酸氮芥濃度，基于用MTT分析經(jīng)三天時(shí)間測(cè)定的它們的細(xì)胞毒活性。在 DMSO中制備藥物，然后在培養(yǎng)基中稀釋。d.制備RNA樣品和分析表達(dá)數(shù)據(jù)細(xì)胞(5xIO6 細(xì)胞)收集在 ImL TRIZOL 液(Invitrogen，San Diego, CA)中， 然后按照制造商的說(shuō)明書(shū)分離總RNA。生物素標(biāo)記的cDNA(15 μ g)與每個(gè)基因芯片陣列 (Affymetrix, Santa Clara)雜交。簡(jiǎn)言之，制備雜交到芯片上的材料的程序包括多個(gè)步驟。 分離總RNA并通過(guò)光密度定量。⑶NA的產(chǎn)生用特定的能識(shí)別與T7啟動(dòng)子(dT7-(T)24)結(jié) 合的PolyA尾的特定引物，與dNTP、DTT和Superscript II產(chǎn)生cDNA第一條鏈。這種方法 減少了對(duì)分離的poly-A(+)mRNA的需要。第二條鏈通過(guò)加入dNTP，用DNA連接酶、DNA poll 和RNAse H合成，并在加入T4DNA聚合酶再培養(yǎng)5分鐘之前，在16°C培養(yǎng)2小時(shí)。進(jìn)行cDNA 柱純化和定量。在與高密度寡核苷酸陣列雜交之前，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(IVT)。該反應(yīng)的啟始 材料是ι μ g cDNA，其中加入NTP，該NTP少于25%的CTP和UTP是通過(guò)加入IOmM生物素 化-Il-CTP和IOmM生物素化-16-UTP來(lái)代替。最后在37°C下加入在適當(dāng)?shù)木彌_液中的T7 酶6h，產(chǎn)生生物素化的IVT RNA，然后將其進(jìn)行柱純化(RNeasy，Qiagen)。化學(xué)片段的IVT RNA (15 μ g)與對(duì)照寡核苷酸、標(biāo)準(zhǔn)(包括管家基因)和鮭魚(yú)精子DNA在適當(dāng)?shù)木彌_液中混 合，加熱到95°C 5分鐘，與芯片在42°C下雜交16h。未雜交的材料用2XSSPE洗掉，然后在反 應(yīng)中加入藻紅素標(biāo)記的抗生物素蛋白。洗掉過(guò)量的熒光染料，然后掃描芯片每個(gè)合成部件 的熒光強(qiáng)度(合成部件為7. 5平方微米)。e.生物信息分析開(kāi)發(fā)了分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的策略和方法，其涉及運(yùn)用C0RG0N法分析Affymetrix 基因芯片的掃描圖像。C0RG0N是免費(fèi)使用的軟件，其核心統(tǒng)計(jì)方法已知(Sasik，et al. (2002)，Bioinformatics, vol. 18，no. 12 1633-40) 只有在至少一種情況下呈現(xiàn) ρ < 0. 05 (95%置信水平)的基因要考慮作進(jìn)一步分析。C0RG0N與Affymetrix Microarray Suite (AMS) 5. 0軟件的比較表明，C0RG0N的假陽(yáng)性誤差率為4. 4%，比較之下，AMS 5. 0為 29%。所選的基因根據(jù)調(diào)節(jié)的平均值或峰寬來(lái)分選?；诒磉_(dá)模式的相似性，選擇前100 個(gè)受調(diào)節(jié)水平最高的基因進(jìn)行聚類(lèi)。采用分級(jí)聚類(lèi)法。這種最初分類(lèi)在確定研究中什么是 主要基因和該方法的調(diào)節(jié)途徑中極為有用。表現(xiàn)出共調(diào)節(jié)的基因簇接受啟動(dòng)子分析。下一 步是G03分析，是在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址www. geneontology. org)中發(fā)現(xiàn)與該過(guò) 程有關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性條件的無(wú)偏和無(wú)監(jiān)督工具。G03易化了識(shí)別被顯著調(diào)節(jié)的系統(tǒng)關(guān)鍵 成分的過(guò)程。在數(shù)據(jù)庫(kù)中有三種本體(ontology)分子功能；生物過(guò)程；和細(xì)胞成分。該分 l/fi aids Research Genomics Core Facility ^ UCSD Center 巾 it if。
f.定量PCR分析特定轉(zhuǎn)錄的表達(dá)水平用定量PCR (Q-PCR)確定。用RNeasymini-pr印試劑 盒(Qiagen，Valencia, CA)分離每個(gè)處理過(guò)的SU-DHL-1細(xì)胞沉淀的總RNA。cDNA用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)和寡_dT引物根據(jù)制造商的方案制作。Q-PCR 擴(kuò)增和定量用iCycler機(jī)(Bio-RAD，Hercules, CA)進(jìn)行。樣品擴(kuò)增在25 μ L含有2x IQSybrGreen Mix (Bio-Rad) 12. 5 μ L、各引物 1 μ M 和對(duì)應(yīng)于 80ng 總 RNA 的 cDNA 體積的容 量中進(jìn)行。循環(huán)條件為95°C 5秒；每個(gè)引物的適當(dāng)退火溫度下30秒；以及72°C 30秒。分 析的靶特異性通過(guò)熔融曲線分析來(lái)驗(yàn)證。各個(gè)基因的表達(dá)相對(duì)于每個(gè)樣品18s表達(dá)水平進(jìn) 行標(biāo)準(zhǔn)化。然后通過(guò) Livak and Schmittgen ((2001), Methods, vol. 25 402-408)的方法 計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)于未處理的對(duì)照的表達(dá)。用BeaconDesigner (Premier Biosoft, Palo Alto,CA)設(shè)計(jì)引物或根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。引物序列和退火溫度如下(各引物按5’至3’書(shū)寫(xiě)， 后面是其SEQ IDN0)基因ID正向引物反向引物退火溫度
18sCGCCGCTAGAGGTGAAATTC(1)TTGGCAAATGCTTTCGCT (2)55 0C
p21CCTCATCCCGTGTTCTCCTTT(3)GTACCACCCAGCGGACAAGT(4)57 0C
NoxaATTTCTTCGGTCACTACACAA(5)AACGCCCAACAGGAACAC(6)55 0C
PLK-ICTCAACACGCCTCATCCT(7)GTGCTCGCTCATGTAATTGC(8)57 0C
Aurora ATCCTTGTCAGAATCCATTACCTGT(9)GAATGCGCTGGGAAGAATTTG (10)55 0C
Aurora BAGAGTGCATCACACAACGAGA(11)CTGAGCAGTTTGGAGATGAGGTC (12)56 0C
Cyclin BlAGTGTGACCCAGACTGCCTC(13)CAAGCCAGGTCCACCTCCTC (14)57 0C
ExolTTGGTCTGGAGGTCTTGGAGA(15)GAATCGCTCTTTCTTCGGAACTG (16)57 0C
g.比較分析
苯達(dá)莫司汀在NCI的由60個(gè)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系組成的體外抗腫瘤篩查中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)包括10倍稀釋液中最少5個(gè)濃度，每個(gè)篩查重復(fù)兩次。采用48小時(shí)持續(xù)藥物暴露方 案?；酋Ａ_丹明(Sulforhodamine)B蛋白分析評(píng)價(jià)細(xì)胞的存活能力或生長(zhǎng)。比較法和相關(guān) 數(shù)據(jù)可由發(fā)展治療計(jì)劃(DTP)的網(wǎng)站(網(wǎng)址dtp. nci.nih.gov)免費(fèi)獲得。NCI指定的苯 達(dá)莫司汀號(hào)NSC138783。h. Western 印跡分析SU-DHL-I細(xì)胞用50 μ M苯達(dá)莫司汀、2 μ M苯丁酸氮芥或20 μ M磷酰胺氮芥培 養(yǎng)20小時(shí)。細(xì)胞用Ix PBS清洗兩次并用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解緩沖液(1Μ Tris-HCl (ρΗ7. 4)，IM KCl,5mMEDTA, 1 % NP-40,0. 5 % 脫氧膽堿鈉，帶有 ImM 原釩酸鈉 (sodiumorthovanidate)、lmM氟化鈉、蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Nut ley, NJ)和磷酸酶 抑制劑混合物(Sigma，St. Louis, MO))進(jìn)行裂解。沉淀不溶的膜、DNA和其它沉淀物，得到 蛋白上清。蛋白質(zhì)濃度用Bradford分析(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定。20 μ g裂解產(chǎn)物用 凝膠電泳在4-12%的聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Invitrogen)上，用下 列單克隆一抗通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)抗-P53、抗-磷酸化p53 (Serospecific)、抗-21、抗裂 解的PARP (半胱天冬酶特異性切割位點(diǎn))，均購(gòu)自Cell Signaling (Beverly, ΜΑ)；抗-Bax 和抗PARP，購(gòu)自BD Pharmingen(San Diego, CA)；以及抗-β肌動(dòng)蛋白，用作點(diǎn)樣對(duì)照，購(gòu)自Sigma (St. Louis，M0)。一抗在輕柔振動(dòng)下，4°C培養(yǎng)過(guò)夜。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour680 山羊抗小鼠的二抗(1 4000) (Molecular Probes,Eugene,OR)在室溫下輕柔振 動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。印跡用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey掃描器上掃描。i.基于細(xì)胞的體外Ape-I和AGT分析細(xì)胞或用6mM甲氧胺(Sigma)或用50 μ M O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(Sigma)預(yù)先培養(yǎng)30 分鐘，二者分別是Ape-I堿基切除修復(fù)酶和烷基脒基轉(zhuǎn)移酶(AGT)的抑制劑。然后將細(xì)胞 暴露在各種濃度的指示劑下72小時(shí)。用MTT分析(13)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，測(cè)定IC5tl作為未處 理的對(duì)照數(shù)值被抑制了 50%時(shí)的藥物濃度。用GraphPad Prism 3. 00版GraphPad軟件 (SanDiego, CA)進(jìn)行分析。j.細(xì)胞周期分析SU-DHL-I細(xì)胞用等毒濃度(IC5tl)的苯達(dá)莫司汀(50μΜ)、苯丁酸氮芥(4 μ Μ) 或磷酰胺氮芥(50μΜ)培養(yǎng)8小時(shí)。細(xì)胞用PBS清洗，并固定在20°C的70%乙醇 中至少1小時(shí)。固定的細(xì)胞通過(guò)PBS清洗重新水合。細(xì)胞重新懸浮在由IOyg/ ml 鵬化丙 Pg (Calbiochem, La Jolla, CA)、10 μ g/mlRNAse A(DNase free, Novagen, Madison, WI)和10 μ 1/ml Triton-X (Sigma)在PBS中組成的碘化丙啶染色液中。樣 品用 FACSCalibur(BDBiosciences，San Jose, CA)分析。用 DNA ModFit LT(Verity HouseSoftware, Inc. Sunnyvale, CA)模型軟件分析細(xì)胞周期分布。LH2AX轉(zhuǎn)化灶形成細(xì)胞在 Lab-Tek 室玻片(chamber slides) (NaIge Nunc Intl.，Naperville, IL) 上，于補(bǔ)充有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。讓細(xì)胞附著至少一天后，細(xì)胞在培養(yǎng) 基中用DMSO或50 μ M苯達(dá)莫司汀處理。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)30分鐘，然后用PBS洗兩次。在 37°C再培養(yǎng)4小時(shí)。然后細(xì)胞用Ix PBS洗兩次，并在-20°C的100%乙醇中培養(yǎng)10分鐘 固定細(xì)胞。然后清洗三次，每次用Ix PBS洗5分鐘。室溫下在封阻緩沖液(10% FBS的 Ix PBS, 1% BSA)中培養(yǎng)1小時(shí)。玻片在4°C下用一級(jí)多克隆抗-H2AX抗體(R&D Systems, Minneapolis，MN)振搖過(guò)夜培養(yǎng)?？贵w在封阻緩沖液中以1 10，000的比例稀釋。玻片 用 Ix PBS 洗三次，并用 Alexa Flour 488 山羊抗兔二抗(1 4000) (Molecular Probes, Eugene, OR)室溫下輕柔振搖培養(yǎng)45分鐘。玻片用Ix PBS洗三次，然后取下艙室，細(xì)胞中 加入帶有 DAPI (Molecular Probes)的退色防止劑(SlowFade Light Antifade)，并用蓋玻 片封閉玻片。用具有DIC光學(xué)和熒光、Zeiss AxioCam HRm照相機(jī)和Zeiss Axiovision軟 件4. 2版的電控Zeiss AxioPlan 2e成像顯微鏡進(jìn)行分析。1.免疫印跡中H2AX在Ser 139殘基的磷酸化細(xì)胞系生長(zhǎng)，鋪滿(mǎn)補(bǔ)充有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。然后細(xì)胞用Ix PBS洗 兩次，并用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解緩沖液(1M Tris-HCl (pH7. 4)，IM KCl, 5mM EDTA，NP-40，0. 5%脫氧膽堿鈉，帶有 ImM 原釩酸鈉(sodium orthovanidate) UmM NaF、 蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Nut ley，NJ)和磷酸酶抑制劑混合物(Sigma，St. Louis, MO)) 進(jìn)行裂解。沉淀不溶的膜、DNA和其它沉淀物，得到蛋白上清。蛋白質(zhì)濃度用Bradford分 析(Pierce，Rockford, IL)測(cè)定。20微克裂解產(chǎn)物用凝膠電泳在4-12%的聚丙烯酰胺凝 膠上分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Invitrogen，Carlsbad, CA)上，用多克隆抗-H2AX抗體 (R&DSystems，Minneapolis，MN)通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)。抗體在封阻緩沖液中以1 2000的比例稀釋?zhuān)ぴ谑覝叵螺p柔振動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour 680 山羊抗兔的二抗(1 5000) (Molecular Probes, Eugene, OR)在室溫下輕柔振動(dòng)培養(yǎng)2小 時(shí)。印跡用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey掃描器上掃描。C.結(jié)果a.基因表達(dá)圖譜鑒定了受不同于苯丁酸氮芥或環(huán)磷酰胺的苯達(dá)莫司汀調(diào)節(jié)的特 征基因通過(guò)測(cè)定細(xì)胞暴露在藥物下三天后的存活率，測(cè)定苯達(dá)莫司汀、苯丁酸氮芥和磷 酰胺氮芥(環(huán)磷酰胺活性代謝物)的等毒濃度。對(duì)于本研究出現(xiàn)的分析，選用的苯達(dá)莫司 汀、磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥的濃度以該數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)(下面的表1)。這些濃度也反映了各 藥的臨床可實(shí)現(xiàn)水平。AffymetriX基因芯片分析用于比較在藥物處理過(guò)的SU-DHL-I (非 何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞系)中超過(guò)12，000個(gè)基因的表達(dá)水平，細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞比較。 SU-DHL-I細(xì)胞用IC5tl濃度(25 μ M)和IC9tl濃度(35 μ Μ)的苯達(dá)莫司汀培養(yǎng)。苯丁酸氮芥 和環(huán)磷酰胺代謝物磷酰胺氮芥在IC9tl，即分別為5 μ M和50 μ M下，進(jìn)行測(cè)試。藥物處理后8 小時(shí)監(jiān)測(cè)基因表達(dá)，鑒定該早期應(yīng)激反應(yīng)的最接近事件?；蚪M分析揭示，在三個(gè)受試藥物之間，多數(shù)基因的調(diào)節(jié)相似，如前100個(gè)受調(diào)節(jié) 的基因的簇圖所示(圖1Α)。大多數(shù)基因暴露于藥物后被上調(diào)(紅色)。基因的亞群在藥 物處理后被抑制轉(zhuǎn)錄(藍(lán)色)。重要的是，鑒定了一組基因，其表現(xiàn)出被苯達(dá)莫司汀的調(diào)節(jié) 較之其它兩個(gè)受試藥有差異。已知很多被誘導(dǎo)的基因(圖1Β)在其啟動(dòng)子區(qū)具有ρ53-反應(yīng)元件，被認(rèn)為是ρ53 依賴(lài)性的。這些基因的實(shí)例有Ρ21(ρ53-誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂激酶抑制劑)；wipl(p53-誘 導(dǎo)的蛋白磷酸酶1) ；N0XA(p53-誘導(dǎo)的促細(xì)胞程序性死亡Bcl-2家族成員)；DR5/ KILLER( P 53-調(diào)節(jié)的DNA損傷-可誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受體)；和BTG2。有趣的是，在前100個(gè) 受調(diào)節(jié)的基因中，鑒定了腫瘤壞死因子受體超家族的四個(gè)成員(成員6、9、10和10b)。這些 基因中數(shù)個(gè)已表現(xiàn)出在調(diào)節(jié)外在細(xì)胞程序性死亡途徑(REF，TRAIL/TNF細(xì)胞程序性死亡) 中有關(guān)鍵作用。另外幾個(gè)基因在苯達(dá)莫司汀和另兩個(gè)化合物之間表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(數(shù)據(jù) 未顯示)。這些基因受苯達(dá)莫司汀兩種濃度的上調(diào)，但均被苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥下調(diào)。為了評(píng)價(jià)苯達(dá)莫司汀、苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥之間的藥物基因組學(xué)差異，基因 圖譜的結(jié)果用G03軟件重新分析，該軟件是無(wú)偏和無(wú)監(jiān)督工具，用于在Gene Ontology(GO) 數(shù)據(jù)庫(kù)中(網(wǎng)址WWW，gene0nt0l0gv. org)發(fā)現(xiàn)與該過(guò)程有關(guān)的有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的條件。在 苯達(dá)莫司汀處理的細(xì)胞中明顯上調(diào)或下調(diào)的基因和超過(guò)或低于對(duì)照處理的細(xì)胞表達(dá)至少 1.5倍的基因與Gene Ontology(GO)聯(lián)盟提供的生物過(guò)程注解關(guān)聯(lián)?；贕O注解的分級(jí)結(jié) 構(gòu)，每個(gè)緊接著的子項(xiàng)目與所選基因數(shù)目關(guān)聯(lián)的可能性(P值)用概率進(jìn)行計(jì)算。DMSO處理 的對(duì)照和苯達(dá)莫司汀處理的細(xì)胞(在IC9tl劑量)相比較的GO分析結(jié)果報(bào)告在下文表2中。 在下面的表2中，第一列說(shuō)明一般類(lèi)別，第二和第三列是特定生物過(guò)程的編號(hào)和名稱(chēng)，最后 一列是每個(gè)過(guò)程的P值。P值用G03軟件計(jì)算。發(fā)現(xiàn)四個(gè)主要的功能組被苯達(dá)莫司汀統(tǒng)計(jì) 水平調(diào)節(jié)=(I)DNA損傷，應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞程序性死亡；(2) DNA代謝，DNA修復(fù)，轉(zhuǎn)錄；(3)細(xì)胞 增殖，細(xì)胞周期，有絲分裂關(guān)卡；和(4)細(xì)胞調(diào)節(jié)。這些組每個(gè)都包括數(shù)個(gè)被發(fā)現(xiàn)受到苯達(dá) 莫司汀明顯調(diào)節(jié)的生物過(guò)程。P值最低且因此最具統(tǒng)計(jì)顯著性的生物過(guò)程是對(duì)DNA損傷 應(yīng)激的反應(yīng)(G06974) ；DNA代謝(G06259)；和細(xì)胞增殖(G08283)。
用苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥進(jìn)行類(lèi)似的分析提示，用苯達(dá)莫司汀和苯丁酸氮芥得 到的圖譜之間很少有重疊。苯達(dá)莫司汀和磷酰胺氮芥之間觀察到基因調(diào)節(jié)的一些相似性， 雖然只限于“DNA代謝，DNA修復(fù)，和轉(zhuǎn)錄”組。這些結(jié)果為選擇特定基因產(chǎn)物進(jìn)行定量驗(yàn)證 苯達(dá)莫司汀的基因陣列結(jié)果和更確定的區(qū)別提供了基礎(chǔ)。b.用實(shí)時(shí)定量Q-PCR分析進(jìn)行基因組分析的驗(yàn)證陣列數(shù)據(jù)的證實(shí)和驗(yàn)證通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析(Q-PCR)進(jìn)行。當(dāng)將苯達(dá)莫司汀與 其他檢驗(yàn)的烷化劑相比較時(shí)，數(shù)個(gè)參與P53-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序性死亡、DNA修復(fù)和細(xì)胞周 期/有絲分裂關(guān)卡的基因均被差異調(diào)節(jié)。為Q-PCR驗(yàn)證選擇的“經(jīng)典的”p53-依賴(lài)性基因的兩個(gè)實(shí)例是，p21 (Cipl/ffafl)， 細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A，和促細(xì)胞程序性死亡BH3-only Bcl_2家族成員， Ν0ΧΑ。暴露于苯達(dá)莫司汀8小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因均在SU-DHL-I細(xì)胞中被誘導(dǎo)。兩個(gè)基因 也被等毒濃度的磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥誘導(dǎo)，但程度低得多(圖2A)。從驗(yàn)證分析中顯現(xiàn)的最驚人的結(jié)果之一是，數(shù)個(gè)有絲分裂-相關(guān)基因的差異化調(diào) 節(jié)，包括polo-類(lèi)激酶I(PLK-I)、Aurora激酶A和B、以及細(xì)胞周期蛋白B 1。這些基因被 認(rèn)為在有絲分裂關(guān)卡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。用苯達(dá)莫司汀處理導(dǎo)致所有這些基因的 mRNA表達(dá)下調(diào)了 60-80%。相比之下，磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄本僅僅 發(fā)揮了很小的效應(yīng)，可能除了 Aurora激酶(圖2B)。在分析DNA-修復(fù)基因核酸外切酶-I(EXOl)的mRNA表達(dá)中也顯現(xiàn)出不同。苯達(dá) 莫司汀誘導(dǎo)的Exol表達(dá)上調(diào)(2.5倍)(圖20較之磷酰胺氮芥(1.5-倍)或苯丁酸氮芥 (1.8-倍)稍微強(qiáng)一些。Fenl (flap核酸內(nèi)切酶1)也被苯達(dá)莫司汀上調(diào)，用等毒濃度的磷 酰胺氮芥時(shí)，該基因也被上調(diào)同樣水平(圖2C)。c. NHL細(xì)胞中苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞程序性死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為了仔細(xì)研究NHL細(xì)胞中參與苯達(dá)莫司汀-誘導(dǎo)的程序化細(xì)胞死亡的分子事件， 用免疫印跡分析監(jiān)測(cè)關(guān)鍵的細(xì)胞程序性死亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果清楚表明，苯達(dá)莫司汀能有 效和迅速地觸發(fā)典型的p53-依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡途徑。正如用特異識(shí)別絲氨酸-15殘 基磷酸化的抗體所檢測(cè)，起始和頂端事件之一是誘導(dǎo)P53磷酸化。在暴露于苯達(dá)莫司汀的 SU-DHL-I細(xì)胞中觀察到絲氨酸-15磷酸化p53上調(diào)了 8倍，而在磷酰胺氮芥處理的細(xì)胞中， 僅見(jiàn)到輕微上調(diào)，苯丁酸氮芥處理的細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變化(圖3，左上圖)。與磷酸化p53平行，在苯達(dá)莫司汀處理的細(xì)胞中，總p53的表達(dá)強(qiáng)烈上升。苯丁酸 氮芥處理的細(xì)胞表現(xiàn)出總P53的少量增加，而暴露于磷酰胺氮芥沒(méi)有誘導(dǎo)p53水平改變。 與P53蛋白表達(dá)水平的改變相比較，在p21蛋白表達(dá)中觀察到的變化，對(duì)于各藥是輕微的。 僅在苯達(dá)莫司汀處理的SU-DHL-I細(xì)胞中，觀察到Bax (關(guān)鍵的BH3-only促細(xì)胞程序性死亡 Bcl-2家族成員)的蛋白表達(dá)增加(圖3，左下板)。在比較苯達(dá)莫司汀與磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥的作用中，觀察到的最驚人的差異 是在比較PARP(聚ADP核糖聚合酶-1)的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。PARP是關(guān)鍵的NAD需要的酶，在 DNA修復(fù)機(jī)制中很重要。PARP也是促細(xì)胞程序性死亡的蛋白水解半胱天冬酶(caspase)的 “早期”底物。用苯達(dá)莫司汀處理的SU-DHL-I細(xì)胞表現(xiàn)出PARP蛋白表達(dá)的急劇減少(圖 3，右上圖)。PARP表達(dá)減少的原因是它被半胱天冬酶切割，這被“切割_特異性”抗體識(shí)別 的蛋白水解切割產(chǎn)物的出現(xiàn)所證實(shí)(圖3，中右圖)。值得注意的是，在以等毒濃度的磷酰
19胺氮芥或苯丁酸氮芥處理的NHL細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到PARP表達(dá)的改變。當(dāng)用雙倍等毒劑量 的磷酰胺氮芥(40 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4 μ Μ)，而保持苯達(dá)莫司汀(50 μ Μ)的劑量時(shí)，結(jié)果是 相似的(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，評(píng)價(jià)PARP表達(dá)水平可以用于各種目的。例如，PARP分析可 以提供具體治療方案有效性的指示，其中PARP表達(dá)減少(優(yōu)選在蛋白水平測(cè)定，例如通過(guò) PARP活性，PARP切割產(chǎn)物的存在，等等)指示施用的藥物具有所需的作用。另外，PARP分 析可以用于前瞻性地確定，例如，組織的細(xì)胞(例如，來(lái)自活檢或其它生物樣品的細(xì)胞)是 否可能對(duì)特定治療起反應(yīng)(如，苯達(dá)莫司汀單一治療或其中療法之一利用了苯達(dá)莫司汀的 組合治療)。d.抑制堿基切除修復(fù)，但不是O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)，阻斷了苯達(dá) 莫司汀的活性用Ape-I抑制劑甲氧胺評(píng)價(jià)修復(fù)酶Ape-I的作用，它是一種無(wú)嘌呤核酸內(nèi)切酶，在 苯達(dá)莫司汀和環(huán)磷酰胺代謝物磷酰胺氮芥的細(xì)胞毒活性中，在堿基切除修復(fù)(BER)中起到 關(guān)鍵的作用。加入甲氧胺，苯達(dá)莫司汀的IC5tl降低了約四倍(從大約50μΜ至大約12μΜ) (圖4Α)。反之，加入甲氧胺時(shí)，磷酰胺氮芥的ICstl只有輕微改變。結(jié)果提示BER可能在修 復(fù)苯達(dá)莫司汀誘導(dǎo)的DNA損傷中起了重要作用，而不是在修復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的損傷中。O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤，一種已知的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)，對(duì)苯達(dá)莫司 汀的抗腫瘤活性的作用也在SU-DHL-I細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，加入O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤 不提高苯達(dá)莫司汀細(xì)胞毒效力。環(huán)磷酰胺得到了相反的結(jié)果，提示與環(huán)磷酰胺不同，苯達(dá)莫 司汀對(duì)O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNA修復(fù)機(jī)制并不特別依賴(lài)(圖4Β)。e.鹽酸苯達(dá)莫司汀迅速引起導(dǎo)致獨(dú)有的細(xì)胞周期改變的雙鏈斷裂形成為了研究鹽酸苯達(dá)莫司汀引起雙鏈斷裂(DSBs)的能力，分析了兩個(gè)生化標(biāo)記以 免疫熒光法進(jìn)行H2AX組蛋白的核定位；和用免疫印跡分析H2AX Serl39殘基的磷酸化。結(jié) 果證實(shí)，鹽酸苯達(dá)莫司汀在各種腫瘤細(xì)胞中有力和迅速地誘導(dǎo)DSBs，包括多藥抗性和p53 缺陷的細(xì)胞系。用50 μ M鹽酸苯達(dá)莫司汀培養(yǎng)，導(dǎo)致在短至30分鐘的時(shí)間內(nèi)，可檢測(cè)到核 內(nèi)轉(zhuǎn)化灶的形成。時(shí)程分析顯示，在持續(xù)暴露在鹽酸苯達(dá)莫司汀24小時(shí)后以及在很短時(shí)間 暴露于藥物(30分鐘)，隨后藥物被清除(洗脫后)，可檢測(cè)到Y(jié) -Η2ΑΧ的Serl39磷酸化。 鹽酸苯達(dá)莫司汀誘導(dǎo)的H2AX磷酸化發(fā)生得早于其它2-氯乙基胺DNA烷化劑如環(huán)磷酰胺。 SU-DHL-I淋巴瘤細(xì)胞暴露于50 μ M鹽酸苯達(dá)莫司汀8小時(shí)的細(xì)胞周期分析顯示，平均S-期 分布增加了超過(guò)40%，而沒(méi)有伴隨的G2M停滯。暴露于等毒濃度的苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺， 分別增加了 S-期分布大約20%和15%。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，鹽酸苯達(dá)莫司汀能誘導(dǎo)DNA雙鏈 斷裂，即便是在短暫的30分鐘暴露后。f.用NCI比較分析，苯達(dá)莫司汀表現(xiàn)出獨(dú)特的活性圖譜在國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)的臨床前抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)篩選 (NCI篩選)的60個(gè)人類(lèi)細(xì)胞系中，評(píng)價(jià)苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞毒性。NCI篩選適用于從超過(guò) 45，000個(gè)化合物和天然產(chǎn)物的大范圍數(shù)據(jù)庫(kù)中，比較潛在的抗腫瘤劑與已知治療劑的相對(duì) 效力。COMPARE分析用苯達(dá)莫司汀作為“種子”產(chǎn)生的GI50結(jié)果運(yùn)行。具有高Pearson相 關(guān)系數(shù)(PCC)的化合物經(jīng)常具有相似的作用機(jī)制。在NCI篩選中，沒(méi)有表明苯達(dá)莫司汀與 任何藥有強(qiáng)相關(guān)(> 0. 8)(下面的表3)。在與苯達(dá)莫司汀匹配的前六個(gè)之外，只有甲基化 劑DTIC(達(dá)卡巴嗪)表現(xiàn)出大約80%的相關(guān)一致性(r值)。反之，鑒別出了 25個(gè)與美法
20侖、苯丁酸氮芥或環(huán)磷酰胺的活性代謝物相關(guān)系數(shù)超過(guò)0. 83的化合物。另外，在此篩選中， 美法侖、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺敏感性模式的直接比較表明這三個(gè)藥物之間有高相關(guān)系數(shù) (0. 762-0. 934，數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)顯示了藥劑的敏感性圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)一致性和作用機(jī) 制共用的高似然率。苯達(dá)莫司汀和氮芥類(lèi)其它成員之間缺少相關(guān)性是引人注目的，并揭示 苯達(dá)莫司汀具有獨(dú)特的抗腫瘤活性模式。D.討論用各種生物和分析工具得到的這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與其它共享相同“氮芥”活 性部分的臨床應(yīng)用的化合物如環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥相比，苯達(dá)莫司汀擁有獨(dú)特的作用機(jī) 制。本研究采用的工具之一是藥物基因組方法，其在靶細(xì)胞系與所選的藥物培養(yǎng)后， 可以同時(shí)分析和監(jiān)測(cè)數(shù)千個(gè)完全表征的基因的表達(dá)水平，已經(jīng)成功地用于闡明其它抗癌藥 物的作用機(jī)制。其主要優(yōu)勢(shì)在于產(chǎn)生無(wú)偏信息，導(dǎo)致苯達(dá)莫司汀獨(dú)特作用機(jī)制的鑒定，并將 其與其它DNA烷化劑區(qū)分開(kāi)來(lái)。用這種方法，檢測(cè)到苯達(dá)莫司汀強(qiáng)烈的經(jīng)典p53-依賴(lài)性應(yīng)激反應(yīng)“特征”，在磷酰 胺氮芥和苯丁酸氮芥處理的細(xì)胞中也存在，但強(qiáng)度低得多。Q-PCR分析證實(shí)了基因陣列分 析，確認(rèn)了含有P53-效應(yīng)元件的基因的上調(diào)，如p21(Waf/Cipl)和NOXA。作為細(xì)胞周期 蛋白_依賴(lài)性激酶的抑制劑，特別是那些在細(xì)胞周期的G1期起作用的抑制劑，據(jù)相信p21/ Wafl/Cipl是介導(dǎo)，至少部分介導(dǎo)，p53-誘導(dǎo)的G1停滯。導(dǎo)致p53_誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯和 細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制已被廣泛研究和報(bào)告。Noxa編碼Bcl-2蛋白家族的Bcl-2同源體 3(BH3)-only成員。NOXA顯示出是p53-介導(dǎo)的反式激活的標(biāo)靶，并且通過(guò)線粒體功能異常 起到P53-依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡的介導(dǎo)體的作用。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中Noxa缺陷表現(xiàn) 出對(duì)DNA損傷起反應(yīng)的原癌基因依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡的顯著抗性。然后通過(guò)免疫印跡分析，檢測(cè)磷酸化的p53(Serl5)，以及Bax的上調(diào)，證實(shí)了 p53 促細(xì)胞程序性死亡途徑的激活。雖然對(duì)其它氮芥類(lèi)誘導(dǎo)P53-介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)之前已經(jīng)有 報(bào)告，但與等毒劑量的環(huán)磷酰胺代謝物(PM)或苯丁酸氮芥比較，苯達(dá)莫司汀提供了更強(qiáng)和 更快速的誘導(dǎo)信號(hào)。還發(fā)現(xiàn)苯達(dá)莫司汀誘導(dǎo)快速和廣泛的PARP切割，PARP是催化各種蛋白 的聚(ADP-核糖基化)的酶。雖然苯達(dá)莫司汀誘導(dǎo)PARP切割，但在SU-DHL-I細(xì)胞中，三種 藥物之間導(dǎo)致PARP切割的能力差異是顯著的。快速誘導(dǎo)PARP切割在苯達(dá)莫司汀的作用機(jī) 制中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用，給予了 PARP對(duì)DNA修復(fù)機(jī)制的重要性。事實(shí)上，對(duì)DNA損 傷發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞最初激活PARP，導(dǎo)致DNA與DNA修復(fù)酶和轉(zhuǎn)錄因子的接近度增加。另外， PARP通過(guò)細(xì)胞程序性死亡或壞死參與啟動(dòng)細(xì)胞死亡。從藥物基因組學(xué)圖譜顯現(xiàn)出的苯達(dá)莫司汀和其它受試氮芥的另一個(gè)主要差別在 于對(duì)polo-類(lèi)激酶1 (PLK-I)、Aurora激酶(A和B)和細(xì)胞周期蛋白Bl表達(dá)水平的作用。 有絲分裂關(guān)卡激酶PLK-I和Aurora參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的很多方面，如激活和滅活CDK/ 細(xì)胞周期蛋白復(fù)合體、中心體的裝配和成熟、以及在中期-后期轉(zhuǎn)變期間活化后期促進(jìn)復(fù) 合體(APC)、還有胞質(zhì)分裂。有趣的是，當(dāng)用siRNA或用目標(biāo)小分子抑制這些關(guān)卡調(diào)節(jié)物時(shí)， 觀察到了 DNA-損傷藥物作用的增強(qiáng)，連同出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)變。有絲分裂災(zāi)變是細(xì)胞死亡的 一種形式，發(fā)生在中期，形態(tài)上與細(xì)胞程序性死亡截然不同。有絲分裂災(zāi)變能發(fā)生在沒(méi)有功 能性P53的情況下或在常規(guī)的半胱天冬酶依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡被抑制的細(xì)胞中。因此，有絲分裂災(zāi)變是腫瘤細(xì)胞死亡的誘人機(jī)制，因?yàn)樗谟贸Ｒ?guī)化療藥進(jìn)行數(shù)輪化療后選擇出 的腫瘤細(xì)胞中也可能起作用。苯達(dá)莫司汀引發(fā)的廣泛和持久的DNA-損傷以及苯達(dá)莫司汀 對(duì)M-期特異性關(guān)卡的協(xié)同抑制，可能在受處理的細(xì)胞中觸發(fā)有絲分裂災(zāi)變。這可以解釋 臨床資料中苯達(dá)莫司汀在包括環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥的方案中對(duì)難治的患者的活性。已經(jīng)證實(shí)，有效的DNA修復(fù)機(jī)制在DNA-烷化藥物的作用機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 對(duì)于共有相似的化學(xué)特征的藥物而言，激活離散的DNA藥物修復(fù)機(jī)制也可賦予獨(dú)特的活性 圖譜。本文所述的藥物基因組學(xué)分析鑒定了被苯達(dá)莫司汀較之磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥有 區(qū)別調(diào)節(jié)的DNA修復(fù)基因。一個(gè)這樣的基因，內(nèi)切核酸酶1 (Exol)，是與MutS和MutL同源 物相互作用的5' -3'內(nèi)切核酸酶，并牽涉DNA錯(cuò)配修復(fù)的切除步驟以及雙鏈斷裂的加工 和修復(fù)。Exol參與體細(xì)胞超突變和類(lèi)別轉(zhuǎn)換重組，并因此在B細(xì)胞功能和抗體產(chǎn)生中非常 重要。為了進(jìn)一步研究苯達(dá)莫司汀、環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥之間修復(fù)機(jī)制的差異，進(jìn)行 功能分析。研究了兩個(gè)主要機(jī)制DNA修復(fù)蛋白，O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)；和 無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶的內(nèi)切核酸酶Ape-1。AGT，一種泛素酶，清除由數(shù)個(gè)烷化劑(包括硝脲類(lèi)和 三氮烯類(lèi))導(dǎo)致的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA加合物。臨床證據(jù)提示，腦腫瘤表達(dá)高水平AGT，可 因此對(duì)某些DNA烷化劑如替莫唑胺更具抗性。核苷O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(O6-BG)提供了有效滅 活A(yù)GT蛋白的方法。在一些細(xì)胞系中，芐基鳥(niǎo)嘌呤明確提高了環(huán)磷酰胺活化態(tài)的毒性。如 本文所示，添加O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤，提高了環(huán)磷酰胺而不是苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞毒效力，表明苯 達(dá)莫司汀不誘導(dǎo)能被AGT修復(fù)的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤DNA加成物。Ape-1/Ref-l是無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶的內(nèi)切核酸酶，在堿基切除修復(fù)(BER)途徑中發(fā) 揮極為重要的作用。BER被各種DNA-損傷藥物，包括DNA烷化劑和DNA甲基化劑如替莫唑 胺誘導(dǎo)的損傷所激活。Ape-I的作用以化合物甲氧胺(MX)，該酶活性的特異抑制劑-測(cè)試。 用MX抑制Ape-Ι，提高了苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞毒活性，表明了對(duì)BER的作用。用環(huán)磷酰胺代 謝物沒(méi)有觀察到改變，隱示了在這些藥物活化的DNA修復(fù)機(jī)制之間的主要差異。對(duì)可能的抗腫瘤劑和其它已知的治療劑進(jìn)行比較，適用NCI人類(lèi)腫瘤60細(xì)胞系 體外篩查。還已經(jīng)證明，在許多情況下，當(dāng)發(fā)現(xiàn)配對(duì)化合物在用該系列的篩選結(jié)果之間有 高相關(guān)系數(shù)，則如COMPARE統(tǒng)計(jì)分析程序所評(píng)價(jià)，這些藥物通常有相似的作用機(jī)制。氮芥 類(lèi)美法侖、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺觀察到的高相關(guān)性在已知的烷化劑中都如此，證實(shí)了 COMPARE分析發(fā)現(xiàn)共同作用機(jī)制的能力。除了與苯達(dá)莫司汀相配的前6名之外，只有甲基化 劑DTIC(達(dá)卡巴嗪)表現(xiàn)出大約80%的相關(guān)一致性(r值)。這些結(jié)果揭示，苯達(dá)莫司汀在 與其它已知烷化劑的關(guān)系中，表現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制。基于本實(shí)施例呈現(xiàn)的結(jié)果，苯達(dá)莫司汀的推導(dǎo)作用機(jī)制顯示在圖5中。苯達(dá)莫司 汀可有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)間和廣泛的DNA烷基化和斷裂，可能是由于苯達(dá)莫司 汀的苯并咪唑環(huán)體系賦予的吖丙啶轉(zhuǎn)換態(tài)環(huán)的高化學(xué)穩(wěn)定性。苯達(dá)莫司汀處理啟動(dòng)了三個(gè) 主要的信號(hào)途徑1) “經(jīng)典的”P(pán)53依賴(lài)性應(yīng)激途徑的激活，導(dǎo)致內(nèi)在細(xì)胞程序性死亡的強(qiáng) 烈激活，其由促細(xì)胞程序性死亡BCL-2家族成員如NOXA和Bax介導(dǎo)；2)DNA修復(fù)機(jī)制的激 活，如堿基切除修復(fù)元件(machinery)，其不由常用于NHL或CLL患者的其它氮芥類(lèi)激活； 和3)抑制數(shù)個(gè)有絲分裂關(guān)卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。協(xié)同誘導(dǎo)DNA損傷和抑制 有絲分裂關(guān)卡可使暴露于苯達(dá)莫司汀的腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷有絲分裂之前，不能充分修復(fù)DNA損傷。帶著廣泛損傷的DNA進(jìn)入有絲分裂的細(xì)胞，或者不能繼續(xù)進(jìn)行“常規(guī)” P53依賴(lài)性細(xì) 胞程序性死亡的細(xì)胞，將通過(guò)有絲分裂災(zāi)變經(jīng)受死亡。這種替代的程序化細(xì)胞死亡途徑，連 同傳統(tǒng)細(xì)胞程序性死亡的強(qiáng)烈激活，表明了為何苯達(dá)莫司汀在體外的藥物抗性細(xì)胞中以及 在患有化療難治性腫瘤的患者中有效。因此，在其它作用中，對(duì)于臨床醫(yī)生治療患有慢性的 非何杰金氏淋巴瘤和其它血癌的患者的全部治療方法(armamentarium)中，苯達(dá)莫司汀治 療將表現(xiàn)出是重要的添補(bǔ)。實(shí)施例2苯達(dá)莫司汀在NHL細(xì)胞中的活性誘導(dǎo)了有絲分裂災(zāi)變死亡途徑如上文實(shí)施例1所述，苯達(dá)莫司汀是具有獨(dú)特作用機(jī)制的烷化劑，并在傳統(tǒng)DNA損 傷劑難治的NHL和CLL患者中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。苯達(dá)莫司汀在NHL細(xì)胞的基因表達(dá)中誘導(dǎo) 了獨(dú)有的改變，并表現(xiàn)于與其它2-氯乙胺烷化劑缺少交叉抗性。定量PCR分析證實(shí)，NHL細(xì) 胞系SU-DHL-I在暴露于藥物的臨床相關(guān)濃度8小時(shí)后，細(xì)胞中G 2/M關(guān)卡調(diào)節(jié)劑Polo-類(lèi) 激酶I(PLK-I)和Aurora A激酶(AurkA)下調(diào)。當(dāng)細(xì)胞暴露在等毒劑量的苯丁酸氮芥或環(huán) 磷酰胺的活性代謝物時(shí)，在同樣這些基因中沒(méi)有改變。對(duì)苯達(dá)莫司汀在不能經(jīng)受經(jīng)典的caspase介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞中誘導(dǎo) 細(xì)胞毒性的能力進(jìn)行了調(diào)查。多藥抗性的MCF-7/ADR和p53缺陷的RK0-E6結(jié)腸腺癌細(xì)胞， 在只有50 μ M苯達(dá)莫司汀或者50 μ M苯達(dá)莫司汀和20 μ M泛半胱天冬酶抑制劑zVAD-fmk 下暴露二或三天。雖然zVAD-fmk能抑制苯達(dá)莫司汀誘導(dǎo)的Armexin-V陽(yáng)性細(xì)胞增加，但在 苯達(dá)莫司汀單獨(dú)或與zVAD-fmk聯(lián)合處理的細(xì)胞中，用DNA染色劑DAPI進(jìn)行核形態(tài)的顯微 分析表明，微核發(fā)生率增加。多核/微核以及異常的染色質(zhì)凝聚二者是有絲分裂災(zāi)變的標(biāo) 記，并在暴露于微管結(jié)合藥物如長(zhǎng)春生物堿類(lèi)和紫杉類(lèi)的腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)觀察到。有絲分 裂災(zāi)變的激活可擴(kuò)大苯達(dá)莫司汀的細(xì)胞毒性以及其在經(jīng)典細(xì)胞程序性死亡途徑受抑制的 腫瘤細(xì)胞中的活性。實(shí)施例3在淋巴瘤和白血病細(xì)胞中，快速起效的苯達(dá)莫司汀激活有效的細(xì)胞程序性死亡和 細(xì)胞死亡如上所述，在其它作用中，烷化劑苯達(dá)莫司汀表現(xiàn)出對(duì)抗有藥物抗性的癌癥的化 療活性，并在與其它相關(guān)抗腫瘤劑比較時(shí)，具有獨(dú)特的作用機(jī)制。與其它抗腫瘤氮芥類(lèi)的 情況一致，苯達(dá)莫司汀在人類(lèi)中的血清半衰期相對(duì)短(大約2小時(shí))，并且臨床通過(guò)靜脈推 注施用。本實(shí)施例報(bào)告的工作目的是，評(píng)價(jià)苯達(dá)莫司汀短期暴露于體外癌細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞 死亡和細(xì)胞程序性死亡的能力。在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜竭_(dá)莫司汀的活性與其它結(jié)構(gòu)相關(guān)的藥物 相比較。得到的結(jié)果表明，苯達(dá)莫司汀短時(shí)(30分鐘)暴露于細(xì)胞中后，發(fā)揮最大的抗腫瘤 活性。為得到這些結(jié)果，NHL細(xì)胞系SU-DHL-I短期(30分鐘至4小時(shí))暴露在50 μ M苯達(dá) 莫司汀下，清洗，在無(wú)藥培養(yǎng)基中恢復(fù)20小時(shí)。細(xì)胞暴露在苯達(dá)莫司汀中短達(dá)30分鐘即表 現(xiàn)出廣泛的生存能力喪失，這用各種生物分析測(cè)定，包括在藥物暴露后48和72小時(shí)，測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)ATP和釋放到上清液中的腺苷酸激酶(圖6和7)。相反，細(xì)胞用這類(lèi)烷化劑的其它 成員處理(這里是苯丁酸氮芥、美法侖和環(huán)磷酰胺的代謝物磷酰胺氮芥；顯示的數(shù)據(jù)是苯 丁酸氮芥和磷酰胺氮芥)，當(dāng)暴露于這些藥劑30、60和120分鐘時(shí)，存活率有極輕微的損失。 在這些分析中，其它這些氮芥需要長(zhǎng)得多的暴露時(shí)段(至少4小時(shí))誘導(dǎo)與苯達(dá)莫司汀相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性。用MTT為基礎(chǔ)的分析證實(shí)了這些結(jié)果，其中在暴露于藥物30分鐘、4小時(shí) 或72小時(shí)后72小時(shí)的SU-DHL-I和HL-60細(xì)胞中，苯達(dá)莫司汀的IC5tl相似。相比之下，苯 丁酸氮芥、美法侖和磷酰胺氮芥用同樣這些細(xì)胞系培養(yǎng)30分鐘，與持續(xù)(72小時(shí))暴露比 較，顯示出IC50要高10-20倍。細(xì)胞內(nèi)ATP水平用下面的熒光素酶為基礎(chǔ)的ATP分析進(jìn)行分析。IOmL CellTiter-Glo 試劑與適當(dāng)量的CellTiter-Glo底物(根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)；Promega Corp.)混合， 混合物平衡10分鐘。然后該溶液100 μ L與100 μ L含有細(xì)胞的培養(yǎng)基結(jié)合，讓混合物培養(yǎng) 10分鐘。用CCD為基礎(chǔ)的平板讀數(shù)器檢測(cè)發(fā)光。選擇腺苷酸激酶(ADK)分析是因?yàn)樘幚磉^(guò)的細(xì)胞完整性松解，ADK釋放到培養(yǎng)基 中，或者在生物樣品的條件下，釋放到細(xì)胞間隙、血液等。為了在96孔板中進(jìn)行ADK分析， 每個(gè)測(cè)試孔中，短時(shí)離心沉淀細(xì)胞的培養(yǎng)基等分試樣的上清20 μ L，與100 μ L新鮮制備 的ADK試劑(根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，20mL Cambrex ToxiLight試劑加上適當(dāng)量的Cambrex ToxiLight底物；Cambrex Corp.，NJ)混合，并使其平衡15分鐘。然后培養(yǎng)反應(yīng)混合物兩分 鐘，使激酶反應(yīng)發(fā)生。然后在平板讀數(shù)器上立即讀出樣品的發(fā)光。還通過(guò)20 μ L特定細(xì)胞培養(yǎng)物的等分試樣與180 μ L GuavaViaCount試劑(Guava Technologies，Hayward，CA)混合，使用前即刻稀釋的1 10稀釋液，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。之 后各混合物培養(yǎng)5分鐘。然后用Guava PC流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行ViaCoimt細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定 每1，000個(gè)總細(xì)胞中的活細(xì)胞數(shù)。存活和死亡的細(xì)胞用染料7AAD區(qū)別，其能通過(guò)損壞的細(xì) 胞膜擴(kuò)散進(jìn)死亡或?yàn)l死的細(xì)胞中。如實(shí)施例1所述，快速誘導(dǎo)PARP(聚[ADP-核糖]聚合酶)斷裂是苯達(dá)莫司汀在 NHL細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡的標(biāo)志。SU-DHL-I細(xì)胞暴露于50 μ M SDX-105短達(dá)30分鐘，之后洗 去藥物，進(jìn)一步培養(yǎng)8小時(shí)，觀察到PARP最大斷裂。在以相似方式用40 μ M磷酰胺氮芥、 4 μ M苯丁酸氮芥或2 μ M美法侖處理30分鐘的細(xì)胞中，沒(méi)有觀察到PARP斷裂。所用的各藥 物濃度代表了與50 μ M苯達(dá)莫司汀相比較的等毒濃度，這是在暴露在藥物下72小時(shí)后，用 MTT [3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_溴化二苯基四唑]為基礎(chǔ)的分析測(cè)定的。MTT分析用各種藥物的遞增劑量進(jìn)行，測(cè)定殺死50%受處理細(xì)胞所需的有效濃 度。這些分析在96孔板中進(jìn)行。濃度范圍最高可達(dá)500 μ Μ。在各分析中，對(duì)照包括未處理 細(xì)胞和殺死對(duì)照。對(duì)于在“洗脫”實(shí)驗(yàn)中用于檢驗(yàn)細(xì)胞的平板，離心平板5分鐘，沉淀細(xì)胞。 然后除去培養(yǎng)基，細(xì)胞沉淀用IX PBS洗一次，然后重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。細(xì)胞用特定 劑量的藥物在含有5.0% CO2的氣氛中，37°C培養(yǎng)3天。三天后，各孔加入IOyL MTT(12mM) 試劑(5mg/mL MTT(Promega)溶解于新鮮培養(yǎng)基中，過(guò)濾消毒，保存在2_8°C )。培養(yǎng)四小時(shí) 后，各孔加入100 μ L裂解緩沖液(20% SDS, 0. 015Μ HCl)。混合物在含有5. 0% CO2的氣 氛中，37°C放置過(guò)夜。第二天早晨，用多孔掃描分光光度計(jì)在595nm下測(cè)定細(xì)胞裂解水平。用100 μ M苯達(dá)莫司汀或12 μ M苯丁酸氮芥處理人類(lèi)癌細(xì)胞系HL-60，得到可比擬 的結(jié)果。暴露在藥物下的時(shí)間是30分鐘、1小時(shí)或2. 5小時(shí)，其中在所提到的時(shí)間后，除去 含有藥物的培養(yǎng)基，用不含藥物的新鮮培養(yǎng)基取代。匯總起來(lái)，這些結(jié)果表明了苯達(dá)莫司汀即便與癌細(xì)胞短暫培養(yǎng)之后，即可激活不 可逆的細(xì)胞死亡途徑的獨(dú)特能力，這種能力有別于其它相關(guān)的烷化劑。所述的快速起效的 細(xì)胞毒性證實(shí)了苯達(dá)莫司汀有效的臨床活性，并表明它將適用于治療各種癌癥，包括傳統(tǒng)
24化療難治的癌癥。實(shí)施例4臨床數(shù)據(jù)本研究評(píng)價(jià)了苯達(dá)莫司汀在患有復(fù)發(fā)的或之前化療方案難治的NHL患者中的有 效性和毒性。利妥昔單抗難治的患者在治療的6個(gè)月內(nèi)病情發(fā)展。方法該II期多中心試驗(yàn)在美國(guó)和加拿大的17個(gè)地點(diǎn)，募集患有復(fù)發(fā)的慢性或轉(zhuǎn) 化的利妥昔單抗難治的B-細(xì)胞NHL患者。在84%患者中發(fā)現(xiàn)了慢性的組織學(xué)表型，而16% 有轉(zhuǎn)化的疾病?；颊叩闹形荒挲g為63歲(38-84歲)，88%有III/IV期疾病。患者在第1 和2天，經(jīng)30-60分鐘接受苯達(dá)莫司汀120mg/m2，21天為1周期，直至6個(gè)周期。用國(guó)際工
(International Working Group) t示}i^flJ胃β@。結(jié)果意向治療(ITT)人群由之前化療中位數(shù)為2的75名難治性患者組成。ITT 人群的總體目標(biāo)反應(yīng)率(ORR)為74% ；25%有完全的反應(yīng)，49%有部分反應(yīng)，12%病情穩(wěn) 定，14%病情發(fā)展。在以前的烷化劑治療難控制的15名患者中(患者在至少一次以前的 含烷化劑治療后病情發(fā)展)，10人(67%)經(jīng)歷了對(duì)苯達(dá)莫司汀的目標(biāo)反應(yīng)。所有患者的反 應(yīng)中位時(shí)期為6. 6月，慢性患者為9. 3個(gè)月，轉(zhuǎn)化患者為2. 4個(gè)月。結(jié)論在預(yù)治療的利妥昔單抗難治的慢性和轉(zhuǎn)化NHL患者中，包括之前的烷化劑 治療難治的患者，苯達(dá)莫司汀單藥能產(chǎn)生持久的目標(biāo)反應(yīng)，毒性可接受，雖然有不樂(lè)觀的預(yù) 后特征。雖然本發(fā)明參考上述實(shí)施例進(jìn)行描述，但應(yīng)當(dāng)理解對(duì)其的修改和變化也包括在本 發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受所附的權(quán)利要求的限制。根據(jù)本公開(kāi)，本文公開(kāi)和要求的所有組合物和方法無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)即能制備和實(shí) 行。雖然本發(fā)明的組合物和方法根據(jù)其優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是顯然對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員各種變化可以應(yīng)用于本組合物和方法，并按照這里描述的方法的步驟或步驟的順 序，而不背離本發(fā)明以所附的權(quán)利要求限定的精神和范圍。說(shuō)明書(shū)中提到的所有發(fā)明、申請(qǐng)和公開(kāi)表示本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的 水平。所有發(fā)明、申請(qǐng)和公開(kāi)，包括要求優(yōu)先權(quán)或其它利益者，在此以其全文作為參考引入， 如同各單獨(dú)公開(kāi)被具體和單獨(dú)表明作為參考引入。本文適當(dāng)?shù)卣f(shuō)明性描述的發(fā)明，在缺少任何沒(méi)有在此公開(kāi)的具體元素的情況下可 以實(shí)施。因此，例如，在本文的每個(gè)例子中，任何術(shù)語(yǔ)“包含”、“基本由...組成”和“組成” 可以用其它兩個(gè)術(shù)語(yǔ)之一代替。采用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用作說(shuō)明的術(shù)語(yǔ)而非限制，并且沒(méi)有意 向在所述術(shù)語(yǔ)的使用和表達(dá)中，排除了表現(xiàn)和描述的任何等效特征或其部分，需要認(rèn)識(shí)在 本發(fā)明要求的范圍內(nèi)，各種修改都是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明被優(yōu)選的實(shí)施方 案和任選的特征所具體公開(kāi)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取這里公開(kāi)的理念的各種修改和 變化，這樣的修改和變化被認(rèn)為是在所附的權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
序列表
<110>賽福倫公司(C印halon，INC.) <120> 癌癥治療(Cancer Treatments) <130>SPI095027-41 <160>16
<170>PatentIn version 3.5<210>1
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gaatcgctct ttcttcggaa ctg23[0163權(quán)利要求
治療癌癥的方法，包括確定患者患有特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥，然后給所述患者施用治療有效量的苯達(dá)莫司汀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的癌癥抗細(xì)胞程序性死亡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗死亡的癌細(xì)胞包含p53缺陷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的癌癥選自非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。
5.治療癌癥患者的方法，包括施用苯達(dá)莫司汀，等至少約30分鐘但不長(zhǎng)于約48小時(shí)， 以及施用另一種化療劑或當(dāng)細(xì)胞在細(xì)胞周期的S期時(shí)更有效的藥劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達(dá)莫司汀后約30分鐘至約36小時(shí) 施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達(dá)莫司汀后約30分鐘至24小時(shí)施用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達(dá)莫司汀后約30分鐘至12小時(shí)施用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達(dá)莫司汀后約30分鐘至6小時(shí)施用。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的患者患有特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥。
11.評(píng)價(jià)癌癥治療有效性的方法，包括確定從癌癥患者采集的生物樣品中癌細(xì)胞死亡 標(biāo)記的水平是否與治療有效性相關(guān)，其中所述確定在施用目的在于治療癌癥的治療方案期 間或之后進(jìn)行，其中的治療方案包括施用烷化劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的烷化劑是苯達(dá)莫司汀。
13.評(píng)價(jià)癌癥治療的有效性的方法，包括a.用治療有效量的苯達(dá)莫司汀治療癌癥；b.等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間使苯達(dá)莫司汀發(fā)揮所需的治療作用；以及c.測(cè)定癌細(xì)胞死亡標(biāo)記的水平，以確定用苯達(dá)莫司汀治療是否有效。
14.減少與包括給癌癥患者施用多個(gè)劑量的苯達(dá)莫司汀的癌癥治療有關(guān)的毒性的方 法，包括給患者施用第一劑量的治療有效量的苯達(dá)莫司汀，所述第一個(gè)苯達(dá)莫司汀的劑量 導(dǎo)致不需要的毒性，并延遲給患者施用第二劑治療有效量的苯達(dá)莫司汀，直至不需要的毒 性開(kāi)始消退。
15.評(píng)價(jià)患者的癌癥是否對(duì)苯達(dá)莫司汀敏感的方法，包括a.在不存在對(duì)癌細(xì)胞有毒性的化合物的生長(zhǎng)條件下，將患者癌組織的細(xì)胞樣品的至少 一部分暴露于苯達(dá)莫司汀，使癌細(xì)胞增殖；以及b.評(píng)價(jià)癌癥是否對(duì)暴露于苯達(dá)莫司汀敏感。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中評(píng)價(jià)癌癥是否對(duì)暴露于苯達(dá)莫司汀敏感包括測(cè)定癌 細(xì)胞死亡標(biāo)記的水平。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的癌細(xì)胞死亡標(biāo)記選自腺苷酸激酶活性水平、細(xì)胞 存活率和PARP切割產(chǎn)物的水平。
18.治療癌癥的方法，包括確定患者患有特征在于抗一種或多種烷化劑和抗CD20劑的 癌癥，包括給所述患者施用治療有效量的苯達(dá)莫司汀。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述癌癥為非何杰金氏淋巴瘤。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的抗CD20劑為利妥昔單抗。
21.與治療特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥有關(guān)的工作方法，包括促進(jìn)苯達(dá)莫司汀用于 治療特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的癌癥是用包括一種或多種烷化劑和抗CD20劑的組 合難以治療的癌癥。
23.與難以治療的癌癥的治療有關(guān)的工作方法，包括促進(jìn)苯達(dá)莫司汀用于治療難以治療的癌癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中難以治療的癌癥是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑 的組合難以治療的癌癥。
25.苯達(dá)莫司汀在制備用于治療特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥藥物中的應(yīng)用。
26.苯達(dá)莫司汀在制備用于治療難以治療的癌癥藥物中的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中難以治性的癌癥是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑 的組合難以治療的癌癥。全文摘要
本發(fā)明描述了用于治療特征在于癌細(xì)胞抗死亡的癌癥的方法和組合物。大體上，這樣的方法包括施用治療有效量的誘導(dǎo)一些，并且優(yōu)選大多數(shù)或者所有癌細(xì)胞的有絲分裂災(zāi)變的化合物。本發(fā)明還提供了評(píng)價(jià)這種治療的有效性的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101933923SQ20101000151
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者克里斯蒂娜·卡洛爾·尼邁爾, 加里·T·埃利奧特, 希瑟·海倫妮·賓德?tīng)? 普拉提克·S·穆?tīng)査? 洛倫佐·M·萊奧尼 申請(qǐng)人:賽福倫公司