專利名稱：桂枝茯苓藥物組合物色譜指紋圖譜及其檢測(cè)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物的高效液相色譜指紋圖譜及其檢測(cè)方法，具體涉及桂 枝茯苓藥物組合物的高效液相色譜指紋圖譜及其檢測(cè)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桂枝茯苓藥物組合物由桂枝、茯苓、白芍、牡丹皮、桃仁五味藥材制成，具有活血化 瘀、緩消癥塊的功效，臨床主要用于治療慢性盆腔炎、痛經(jīng)、子宮肌瘤等疾病。本發(fā)明的申請(qǐng)人對(duì)桂枝茯苓藥物組合物的制備工藝進(jìn)行了研究，并申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明 專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00310116836. X，公開號(hào)為CN1546129。之后申請(qǐng)人對(duì)該桂枝茯苓藥物組合 物的質(zhì)量檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，并也申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00410000136. 9，公開 號(hào)為 CN1556404。為了提高桂枝茯苓藥物組合物的療效并減少服用劑量，申請(qǐng)人在上述研究的基礎(chǔ) 上改進(jìn)了原有制備工藝，形成了本發(fā)明的桂枝茯苓藥物組合物，該項(xiàng)研究申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明 專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00410041212. 0、公開號(hào)為CN1583102A，該件專利對(duì)本發(fā)明的桂枝茯苓藥 物組合物的制備方法有詳細(xì)的描述。為了有效地控制本發(fā)明的桂枝茯苓藥物組合物的質(zhì) 量，申請(qǐng)人對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)方法的研究，建立了高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與檢測(cè)方 法，用來(lái)對(duì)本發(fā)明的桂枝茯苓藥物組合物進(jìn)行質(zhì)量控制，形成了本發(fā)明的技術(shù)方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供作為質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的一種中藥桂枝茯苓藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn) 指紋圖譜。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該桂枝茯苓藥物組合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的測(cè)定方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該桂枝茯苓藥物組合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜在質(zhì)量控制中 的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的一種由桂枝、茯苓、白芍、桃仁、牡丹皮為原料制備的桂枝茯苓藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn) 高效液相色譜指紋圖譜，該圖譜中呈現(xiàn)5個(gè)主要色譜峰，其中各色譜峰與參照峰(S號(hào)峰) 之間的相對(duì)保留時(shí)間為1號(hào)峰為0. 20 0. 35，S號(hào)峰為1，2號(hào)峰為1. 15 1. 40，3號(hào)峰 為1. 25 1. 50，4號(hào)峰為2. 10 2. 40，其中S號(hào)峰為參照物芍藥苷的色譜峰。上述桂枝茯苓藥物組合物的高效液相色譜指紋圖譜的檢測(cè)方法如下(1)色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以含0. 磷酸及5%乙腈的 水溶液為流動(dòng)相A，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速為 0. 5 1. 5ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 MOnm ；(2)參照物溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，稱定，加甲醇制成Iml含40 60 μ g的溶液；(3)供試品溶液的制備取待測(cè)品0.20 0.30g，置錐形瓶中，加入甲醇20 30ml，超聲，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；(4)測(cè)定分別取參照物溶液和供試品溶液各5 20μ 1，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。上述的檢測(cè)方法的優(yōu)選技術(shù)方案為(1)色譜條件高效液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以含0. 磷酸及5%乙腈的水溶液為流動(dòng)相Α，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行
梯度洗脫，洗脫程序?yàn)闀r(shí)間(min)A%B%01000700100711000801000檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm ；理論板數(shù)按參照物(芍藥苷)峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000 ；(2)參照物溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含 50 μ g的溶液；(3)供試品溶液的制備取待測(cè)品，混勻，研細(xì)，取約0. 25g，置具塞錐形瓶中，精密 加入甲醇25ml，超聲30min，過(guò)濾，取續(xù)濾液做為供試品溶液；(4)測(cè)定分別取參照物溶液和供試品溶液各10μ 1，注入高效液相色譜儀，測(cè)定；上述的指紋圖譜及其檢測(cè)方法可以對(duì)桂枝茯苓藥物組合物的片劑、硬膠囊劑、軟 膠囊劑、丸劑、滴丸劑、顆粒劑的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。上述的指紋圖譜及其檢測(cè)方法用于對(duì)本發(fā)明桂枝茯苓藥物組合物質(zhì)量的檢測(cè)與 控制，標(biāo)準(zhǔn)要求，待測(cè)供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜經(jīng)相似度軟件計(jì)算，相似度不應(yīng)低于 0. 85。相似度軟件為國(guó)家藥典委員會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)。以本發(fā)明桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑為例，對(duì)本發(fā)明提供的指紋圖譜及其檢測(cè) 方法進(jìn)行研究與說(shuō)明1.儀器與試藥(I)Agilent 1100高效液相色譜儀；(2)高速離心機(jī)；(3)本發(fā)明的桂枝茯苓藥物組合物(來(lái)源自制)；(4)乙腈(HPLC 級(jí)，美國(guó) TEDIA 公司)；(5)甲醇(AR級(jí)，南京化學(xué)試劑有限公司)；(6)磷酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；(7)芍藥苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-200732)；2.方法與結(jié)果2. 1色譜條件=Agilent 1100液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色 譜柱Alltima C18，4. 6X 250謹(jǐn)，5 μ m)；以含0. 1 %磷酸及5%乙腈的水溶液為流動(dòng)相A，以 含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)闀r(shí)間(min)A%B%01000
700100711000801000流速為lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。理論板數(shù)按參照物(芍藥苷)峰計(jì)算，應(yīng)不 低于6000。2. 2檢測(cè)波長(zhǎng)選擇桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑中主要成分芍藥苷最大吸收波 長(zhǎng)為230nm。為了能更全面的反映藥物中的成分，發(fā)明人檢測(cè)了 203、218、230、M5、275nm五 個(gè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜，經(jīng)比較分析，確定230nm為最佳波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下的指紋圖譜中，除 已知成分芍藥苷能夠較好的檢測(cè)出外，其它成分指紋峰也能被較好地體現(xiàn)，且各峰分離度 好，基線較平穩(wěn)、重復(fù)性好。2. 3提取溶劑與提取方法選擇發(fā)明人分別考察了甲醇、乙醇作為溶媒的提取效 果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇提取的樣品，色譜峰較多，能夠更全而的反應(yīng)本品的指紋特征；還考察 了超聲提取法、加熱回流法、索式提取法三種提取方法及不同提取時(shí)間，結(jié)果表明，以上三 種提取方法制備的供試品溶液，對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大，考慮節(jié)省時(shí)間和節(jié)約成本的因素，選 用超聲提取30分鐘的方法。2. 4參照物溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含 50 μ g的溶液，即得。2. 5供試品溶液的制備取桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容 物，混勻，研細(xì)，取約0. 25g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲30min，過(guò)濾，取續(xù)濾 液作為供試品溶液，即得。2. 6精密度試驗(yàn)取同一批桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑，按供試品溶液的制備 方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1、2。結(jié)果表明，供試品溶液 中各共有峰的保留時(shí)間及主要峰(占總峰面積5%以上)的峰面積基本一致(RSD <3%), 又以第1次進(jìn)樣所得指紋圖譜做為對(duì)照計(jì)算后5次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度，結(jié)果相似 度結(jié)果均不小于0.99。表明該方法精密度良好。表1桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑指紋圖譜精密度考察結(jié)果
(占總峰面積5 %以上主要峰的保留時(shí)間)
sNv次數(shù) 峰號(hào)123456Aver (平均 值〉RSD% (相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差)RtRtRtRtRtRtRtRtS24. 86924. 86924. 87224. 87224. 88324. 89024. 8690. 0316.8166. 8246. 8296. 8266. 8376. 8506. 8160. 172 "Π31. 64631.65131. 66331. 67031. 68931. 70731. 6460. 073 二34.18434.18434. 19234.19634. 21534. 22834. 1840. 05456. 36356.35956. 36456. 37756. 39856. 41956. 3630. 04
5
注Rt為相對(duì)保留時(shí)間(下同)；Aver為平均值(下同)；RSD%為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (下同)表2桂枝茯苓藥物組合物硬膠囊劑指紋圖譜精密度考察結(jié)果(古總峰面積5%以上的主要峰的峰面積)
權(quán)利要求
1.一種由桂枝、茯苓、白芍、桃仁、牡丹皮為原料制備的桂枝茯苓藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)指 紋圖譜，其特征在于該指紋圖譜為高效液相色譜圖譜，該圖譜中呈現(xiàn)5個(gè)主要色譜峰，其中 各色譜峰與參照峰(S號(hào)峰)之間的相對(duì)保留時(shí)間為1號(hào)峰為0. 20 0. 35，S號(hào)峰為1，2 號(hào)峰為1. 15 1.40，3號(hào)峰為1. 25 1. 50，4號(hào)峰為2. 10 2. 40，其中S號(hào)峰為參照物芍 藥苷的色譜峰。
2.如權(quán)利要求1所述的桂枝茯苓藥物組合物的高效液相色譜指紋圖譜，其特征在于該 指紋圖譜的檢測(cè)方法如下(1)色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以含0.1 %磷酸及5%乙腈的水 溶液為流動(dòng)相A，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速為 0. 5 1. 5ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 MOnm ；(2)參照物溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，稱定，加甲醇制成Iml含40 60μ g的 溶液；(3)供試品溶液的制備取待測(cè)品0.20 0. 30g，置錐形瓶中，加入甲醇20 30ml，超 聲，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；(4)測(cè)定分別取參照物溶液和供試品溶液各5 20μ1，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于(1)色譜條件高效液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以含0.磷酸 及5%乙腈的水溶液為流動(dòng)相Α，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯 度洗脫，洗脫程序?yàn)槠鹗紩r(shí)，流動(dòng)相中A的含量為100%，B的含量為0，0min至70min過(guò) 程中，流動(dòng)相中A的含量從100%線性下降至0，B的含量從0線性上升至100%，71min至 80min的過(guò)程中，流動(dòng)相中A的含量保持在100%，B的含量保持在0 ；流速為lml/min ；檢測(cè) 波長(zhǎng)為230nm ；理論板數(shù)按參照物(芍藥苷)峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000 ；(2)參照物溶液的制備取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含50μg 的溶液；(3)供試品溶液的制備取待測(cè)品，混勻，研細(xì)，取約0.25g，置具塞錐形瓶中，精密加入 甲醇25ml，超聲30min，過(guò)濾，取續(xù)濾液做為供試品溶液；(4)測(cè)定分別取參照物溶液和供試品溶液各10μ1，注入高效液相色譜儀，測(cè)定；。
4.如權(quán)利要求1 3所述的指紋圖譜及其檢測(cè)方法，其特征在于可以對(duì)桂枝茯苓藥物 組合物的片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、丸劑、滴丸劑、顆粒劑的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求1 3所述的指紋圖譜及其檢測(cè)方法在控制桂枝茯苓藥物組合物質(zhì)量中 的應(yīng)用，其特征在于待測(cè)供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜經(jīng)相似度軟件計(jì)算，相似度不應(yīng) 低于0. 85。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種桂枝茯苓藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并提供了該藥物組合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的測(cè)定方法。該指紋圖譜為高效液相色譜圖譜，該圖譜中呈現(xiàn)5個(gè)主要色譜峰，其中各色譜峰與參照峰(S號(hào)峰)之間的相對(duì)保留時(shí)間為1號(hào)峰為0.20～0.35，S號(hào)峰為1，2號(hào)峰為1.15～1.40，3號(hào)峰為1.25～1.50，4號(hào)峰為2.10～2.40，其中S號(hào)峰為參照物芍藥苷的色譜峰。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102114094SQ20101000371
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年1月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月1日
發(fā)明者付小環(huán), 劉濤, 孫永城, 尚強(qiáng), 畢宇安, 王振中, 竇霞, 章晨峰, 蕭偉, 陳鳳龍 申請(qǐng)人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司