專利名稱：一種檢測(cè)對(duì)人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)對(duì)人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒。

背景技術(shù)：
近年來(lái)食品質(zhì)量安全的惡性事件頻發(fā)，嚴(yán)重威脅人民的健康和生命安全，食品安全問題已成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。對(duì)獸藥、農(nóng)藥、食品添加劑、激素等殘留和危害物質(zhì)進(jìn)行有效監(jiān)控是保障動(dòng)物源食品安全、維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定的關(guān)鍵。
目前檢測(cè)上述殘留物或危害物質(zhì)的普遍方法為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。其高靈敏度和特異性，使殘留分析操作大大簡(jiǎn)化。由于免疫分析成本低、快速、可靠，且傳感器靈敏度高因而廣泛用于殘留分析和監(jiān)測(cè)。但ELISA技術(shù)亦有其自身的缺陷，由于抗原抗體的特異性結(jié)合，只可以對(duì)一種藥物進(jìn)行檢測(cè)，即使制備廣譜性抗體也只能實(shí)現(xiàn)對(duì)同一類藥物的多殘留檢測(cè)，與真正意義上的多種藥物殘留檢測(cè)相距甚遠(yuǎn)。
半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米晶(semiconductor nanocrystal)，簡(jiǎn)稱量子點(diǎn)(quantumdots，QDs)，是由一定數(shù)量的實(shí)際原子組成的聚集體，尺寸小于10nm的半導(dǎo)體化合物，是一類理想的熒光指示劑。QDs具有熒光量子產(chǎn)率高、抗光漂白能力強(qiáng)、激發(fā)光譜分布連續(xù)、熒光發(fā)射光譜窄、峰形對(duì)稱、熒光發(fā)射波長(zhǎng)隨尺寸變化可調(diào)等一系列獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可同時(shí)檢測(cè)三種對(duì)人體有害的小分子物質(zhì)的免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的免疫試劑盒，包括不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物，所述不透明微孔板中至少有一個(gè)孔包被有三種小分子物質(zhì)包被原； 不透明微孔板可為白色不透明微孔板或黑色不透明微孔板；具體可為96孔的微孔板； 所述三種小分子物質(zhì)包被原選自如下任意一種且不相同小分子物質(zhì)I的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、小分子物質(zhì)II的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物和小分子物質(zhì)III的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III不相同； 所述發(fā)光復(fù)合物為如下1)、2)和3)所示 1)抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗抗體和量子點(diǎn)I形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物I；其中，量子點(diǎn)I與抗抗體形成復(fù)合物，復(fù)合物再通過抗抗體與抗小分子物質(zhì)I的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)I的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物I； 2)抗小分子物質(zhì)II的抗體、生物素、親和素與量子點(diǎn)II形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物II；其中，抗小分子物質(zhì)II的抗體與生物素形成復(fù)合物I，親和素與量子點(diǎn)II形成復(fù)合物II，復(fù)合物I與復(fù)合物II通過生物素與親和素的相互作用而結(jié)合形成結(jié)合物II； 3)抗小分子物質(zhì)III的抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點(diǎn)III形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物III；其中，金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點(diǎn)III形成復(fù)合物III，復(fù)合物III再通過金黃色葡萄球菌A蛋白與抗小分子物質(zhì)III的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)III的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物III； 所述量子點(diǎn)I、量子點(diǎn)II和量子點(diǎn)III在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下具有不同的特征發(fā)射波長(zhǎng)；量子點(diǎn)I、量子點(diǎn)II和量子點(diǎn)III的發(fā)射波長(zhǎng)相差30nm～70nm。
選擇具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，是為了區(qū)別各量子點(diǎn)所標(biāo)記的物質(zhì)。
所述偶聯(lián)物是通過戊二醛法或混合酸酐法或重氮化法制備得到的。
在上述試劑盒的具體應(yīng)用中，實(shí)際上是發(fā)光復(fù)合物對(duì)應(yīng)了三種檢測(cè)體系，即 (a)生物素-親和素體系“生物素化一抗”與“親和素-量子點(diǎn)”的結(jié)合物； (b)金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)體系一抗與“SPA-量子點(diǎn)”的結(jié)合物； (c)二抗體系一抗與“量子點(diǎn)-二抗”的結(jié)合物。
上述免疫試劑盒中，所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III為對(duì)人體或動(dòng)物體有危害的小分子物質(zhì)。
上述免疫試劑盒中，還可包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品稀釋液； 所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為所述小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液； 所述樣品稀釋液為0.03mol/L～0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.2。
上述免疫試劑盒中，所述對(duì)人體或動(dòng)物體有危害的小分子物質(zhì)為磺胺藥物、喹諾酮藥物、阿維菌素類藥物、聚醚類藥物、氯霉素類藥物、四環(huán)素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、青霉素類藥物、鏈霉素藥物、蘇丹紅、孔雀石綠或三聚氰胺。
上述免疫試劑盒中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
上述免疫試劑盒中，所述聚醚類藥物為鹽霉素；所述磺胺藥物為磺胺喹噁啉；所述阿維菌素類藥物為阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素； 所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III選自如下a)、b)和c)中的任意一種且不相同a)鹽霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素； 所述抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗小分子物質(zhì)II的抗體和抗小分子物質(zhì)III的抗體選自如下任意一種且不相同由保藏編號(hào)為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-3分泌得到的單克隆抗體、由保藏編號(hào)為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4分泌得到的單克隆抗體和由保藏編號(hào)為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1分泌得到的單克隆抗體； 所述抗鹽霉素的抗體為由保藏編號(hào)為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-3分泌得到的； 所述抗阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素的抗體為由保藏編號(hào)為CGMCCNo.1606的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4分泌得到的； 所述抗磺胺喹噁啉的抗體為由保藏編號(hào)為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1分泌得到的； 所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下1)、2)和3)所示 1)如下各濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L； 2)如下各濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L； 3)如下各濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L。
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液是用樣品稀釋液稀釋各標(biāo)準(zhǔn)品得到的，所述濃度為0μg/L的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
上述免疫試劑盒中，所述抗抗體為羊抗鼠抗體。
上述免疫試劑盒中，所述量子點(diǎn)為具有如下發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)525nm、585nm、655nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍為360nm~440nm。量子點(diǎn)的特征是激發(fā)帶寬發(fā)射帶窄，在360nm~440nm范圍內(nèi)均可作為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)波長(zhǎng)優(yōu)選為400-420nm。
生物素和親和素為現(xiàn)有技術(shù)中常用的能相互結(jié)合的生物素和親和素即可。但是本發(fā)明中的N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)更易標(biāo)記抗體，且和親和素具有更好的結(jié)合效果。
上述免疫試劑盒中，所述不透明微孔板中，所述三種小分子物質(zhì)包被原的量分別為(48-50)ng/孔、(38-42)ng/孔、(28-32)ng/孔。相同孔中三種小分子物質(zhì)包被原的量具體可分別為48ng/孔、40ng/孔、30ng/孔。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)樣品中對(duì)人體或動(dòng)物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中對(duì)人體或動(dòng)物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法，是用上述任一所述免疫試劑盒對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
上述方法中，所述方法包括如下步驟 1)制作上述任一所述免疫試劑盒中的每種小分子物質(zhì)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值、所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的對(duì)數(shù)值或所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的半對(duì)數(shù)值，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為各小分子物質(zhì)包被原與孔內(nèi)發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度； 2)向上述任一所述免疫試劑盒中的不透明微孔板的孔中加入待測(cè)樣品的溶液，再加入所述免疫試劑盒中的三種發(fā)光復(fù)合物，孵育；檢測(cè)孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度； 3)將步驟2)中得到的小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度與步驟1)中的小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，得出所測(cè)樣品中小分子物質(zhì)的濃度值； 所述檢測(cè)孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度是指用熒光酶標(biāo)儀特定波長(zhǎng)下激發(fā)，得到包被抗原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比求出待測(cè)樣品中小分子物質(zhì)的濃度。通常樣品中待測(cè)抗原(即下分子物質(zhì))濃度越大，包被原結(jié)合的發(fā)光復(fù)合物越少，所測(cè)得的相對(duì)熒光強(qiáng)度越低。
相對(duì)熒光強(qiáng)度定義熒光的相對(duì)強(qiáng)弱，以不同峰、谷的熒光強(qiáng)度之差來(lái)表示，是一個(gè)對(duì)應(yīng)的值。
所述方法中，在步驟2)前，包括對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行前處理的步驟。
所述待測(cè)樣品為食品、血清或飼料。
所述食品為蜂蜜、牛奶、奶粉、禽畜肉、禽畜肝臟或水產(chǎn)。
食品均為新鮮未變質(zhì)的，通過正常商業(yè)渠道均可獲得。
對(duì)牛奶進(jìn)行前處理的方法包括如下步驟將牛奶進(jìn)行脫脂，用PBS溶液將脫脂后的牛奶稀釋，得到的稀釋液即為待測(cè)樣品溶液。
本發(fā)明為多組分同步分析，具體是采用多種競(jìng)爭(zhēng)抗原包被，多種抗體發(fā)光復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)，采用同一波長(zhǎng)激發(fā)，可以測(cè)得不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)同一樣品種不同組分的定量分析。
本發(fā)明利用量子點(diǎn)的多色標(biāo)記功能，以量子點(diǎn)納米晶作為熒光標(biāo)記物，將不同直徑的量子點(diǎn)分別標(biāo)記不同物質(zhì)的抗體，將三種標(biāo)記的抗體同時(shí)用于檢測(cè)，以量子點(diǎn)為熒光探針，根據(jù)其熒光強(qiáng)度的變化得到小分子物質(zhì)的濃度，即可同時(shí)檢測(cè)出三種小分子物質(zhì)的含量。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了三種小分子物質(zhì)的同步檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率。量子點(diǎn)具有激發(fā)譜寬、發(fā)射譜窄、熒光性強(qiáng)、顏色的可調(diào)性等優(yōu)勢(shì)。量子點(diǎn)與傳統(tǒng)熒光染料相比，熒光光譜對(duì)稱，熒光強(qiáng)度高，較ELISA相比，熒光穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)重復(fù)性好。本發(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通的ELISA方法，檢測(cè)靈敏度可提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，減少加入酶標(biāo)二抗和底物顯色的步驟，整個(gè)反應(yīng)只需1步即可完成，大大縮短檢測(cè)時(shí)間和技術(shù)難度，減少操作誤差。另外，本發(fā)明方法樣品前處理過程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)，能夠快速大量的檢測(cè)樣品，適合于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)或大批量樣品的初篩。



圖1為量子點(diǎn)標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng)過程模式圖。
圖2為三種不同顏色量子點(diǎn)發(fā)射圖譜(激發(fā)波長(zhǎng)400nm)。
圖3為阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施例方式 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
SPA購(gòu)自上海翔升生物有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為EK11230；N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)購(gòu)自上海銳聰科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為RC2006；鏈親和素購(gòu)于上海銳聰科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為RC00433A。
實(shí)施例1、試劑盒的組成及制備 1、同一孔中同時(shí)包被阿維菌素包被原、鹽霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶標(biāo)板； 阿維菌素包被原為阿維菌素半抗原與卵血清白蛋白的偶聯(lián)物。
鹽霉素包被原為鹽霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物。
磺胺喹噁啉包被原為磺胺喹噁啉半抗原與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)物。
2、發(fā)光復(fù)合物 1)鹽霉素單克隆抗體與“量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體復(fù)合物”形成的結(jié)合物；量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)585nm； 2)“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物”形成的結(jié)合物；生物素為N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)，親和素為鏈親和素；量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)525nm； 3)磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”形成的結(jié)合物；量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)655nm。
阿維菌素單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4分泌得到的(ZL 200610007260.7)； 鹽霉素單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-3分泌得到的(ZL 200610007285.7)； 磺胺喹噁啉單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1分泌得到的(ZL 200610007256.0)。
3、標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1)如下不同濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品為阿維菌素；該標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為31732；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
2)如下不同濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品為鹽霉素；該標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為84350；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
3)如下不同濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品為磺胺喹噁啉；該標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為86024；用樣品稀釋液將該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如上濃度的溶液；0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品稀釋液。
4、洗滌液由吐溫20、疊氮化鈉和磷酸鹽緩沖液組成；洗滌液中磷酸鹽的終濃度為0.01M，吐溫20在洗滌液中的終濃度為1.0％(v/v)，疊氮化鈉在洗滌液中的終濃度為0.5mg/L；洗滌液pH值為7.4； 5、樣品稀釋液0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.2。是將濃縮液稀釋20倍得到，濃縮液為0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
二、試劑盒的制備 (一)包被原及包被有包被原的酶標(biāo)板的制備 1、包被原的制備 1.1、阿維菌素包被原的制備及驗(yàn)證 t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosi lane)購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為19905； 阿維菌素半抗原是在阿維菌素的C4″位置上連接琥珀酸酐得到的4″-羥-琥珀酸酐阿維菌素(4″-o-succinoyl AVM)即為阿維菌素半抗原。阿維菌素半抗原的合成分三步 (1)5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-0H的合成將1.0g阿維菌素置于25mL三口雞心瓶中，6mL N，N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合。機(jī)械攪拌下，將2mL DMF稀釋的0.52g t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosilane)逐滴加入，30℃反應(yīng)2h。向反應(yīng)液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)混合?；旌弦河?0mL水洗滌3次。分離EtoAc層，MgSO4干燥，減壓濃縮得到微黃色粘稠物。將該微黃色粘稠物用CH2Cl2溶解，硅膠柱層析分離產(chǎn)物，干燥后得到5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH。
(2)5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl的合成取0.50g 5-o-t-BuM2Si-R-4″-OH置于50mL三口雞心瓶中，加12mLCH2Cl2使其溶解，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，水浴中回流2.5小時(shí)，溶液由無(wú)色變?yōu)樽厣⒑谏?與反應(yīng)原料無(wú)關(guān))。減壓蒸干CH2Cl2后，加入100mL乙醚，過濾除去不溶物后轉(zhuǎn)至250mL分液漏斗中，乙醚層用100mL 3.6％(質(zhì)量百分含量)HCl洗滌2次，再用100mL水洗滌2次。MgSO4干燥，濃縮，得淡黃色粘稠物，用CH2Cl2溶解后，用薄層色譜(TLC)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離(展開劑各成分體積比為CH2Cl2∶四氫呋喃(THF)∶CH3OH＝95∶5∶5)。TLC出現(xiàn)三條區(qū)帶，將中間最大的區(qū)帶刮下，用CH2Cl2和CH3OH(體積比為1∶1)淋洗，減壓濃縮，真空干燥24h(避光)得到5-o-t-BuM2Si-AVM-″-o-succinoyl。
(3)將步驟2)得到的產(chǎn)物脫去保護(hù)基5-o-t-BuM2Si，得到4″-o-succinoyl-AVM，即為阿維菌素半抗原。
包被原的制備本試驗(yàn)采用N-羥基琥珀酰亞胺酯法(NHS)將阿維菌素半抗原與載體蛋白卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到OVA-AVM偶聯(lián)物即為包被原。
包被原合成的具體步驟如下 1)取12mg阿維菌素半抗原置于5mL圓底燒瓶中，加0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)使阿維菌素半抗原溶解，再加入2.7mg N-羥基琥珀酰亞胺酯和4.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)，混合后，室溫(18-20℃)避光攪拌10小時(shí)。
2)攪拌下，在1h內(nèi)將步驟1)得到的反應(yīng)液逐滴加到6mL含30mg OVA和0.6ml DMF的硼酸鹽緩沖液(0.2M，pH 9.4)。溶液開始略顯混濁，最后有少量沉淀出現(xiàn)，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，再轉(zhuǎn)至4℃下攪拌10-12小時(shí)，立即進(jìn)行下述透析純化。
3)將步驟2)得到的反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(截止分子量10,000Da)4℃攪拌下，透析2d，其間換PBS三次。將透析物1000rpm離心5min，除去沉淀，得到的上清液即為包被原OVA-AVM偶聯(lián)物。
通過紫外分光光度法測(cè)定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明卵清蛋白和阿維菌素半抗原的偶聯(lián)比率為卵清蛋白阿維菌素半抗原＝1∶11，偶聯(lián)物的濃度為3.8mg/mL。
1.2、鹽霉素包被原的制備 半抗原的合成將鹽霉素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)合成鹽霉素半抗原。具體步驟為將鹽霉素和對(duì)氨基苯甲酸按1∶1比例混合攪拌反應(yīng)，室溫下反應(yīng)過夜，得到鹽霉素半抗原。
包被原的合成采用混合酸酐法將鹽霉素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原。
包被原的具體制備方法如下 (1)取鹽霉素半抗原2g溶于30ml，50％的N，N’-二甲基甲酰胺溶液中； (2)取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二噁烷中，加到步驟1)得到的半抗原溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)； (3)取卵清蛋白22g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中； (4)將步驟(3)得到的卵清蛋白滴加到步驟(2)得到的半抗原溶液中，4℃攪拌過夜； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物用0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次，即得到鹽霉素包被原。
通過紫外分光光度法測(cè)定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明卵清蛋白(OVA)和鹽霉素半抗原的偶聯(lián)比率為卵清蛋白∶鹽霉素半抗原＝1∶9，偶聯(lián)物的濃度為4.5mg/mL。
1.3、磺胺喹噁啉包被原的制備 (1)磺胺喹噁啉半抗原的合成方法將磺胺喹噁啉和對(duì)羧基苯甲醛通過縮合反應(yīng)合成磺胺喹噁啉半抗原，給磺胺喹噁啉接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了磺胺喹噁啉分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——喹噁啉。同時(shí)也增加了半抗原的抗原性。
其半抗原的制備的過程為取1g磺胺喹噁啉加入無(wú)水乙醇溶解，為溶液I；另取對(duì)羧基苯甲醛1g溶于無(wú)水乙醇中，為溶液II；將溶液I和溶液II混合，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)2小時(shí)，經(jīng)硅膠柱層析分離得到磺胺喹噁啉半抗原。
(2)包被原將磺胺喹噁啉半抗原和人血清白蛋白(HSA)水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
包被原的具體制備方法如下取磺胺喹噁啉半抗原300mg和人血清白蛋白(HSA)500mg混合溶于50ml水，加入EDC 100μl室溫?cái)嚢柽^夜，得到磺胺喹噁啉包被原。
通過紫外分光光度法測(cè)定特定吸收值，再根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物的偶聯(lián)比，結(jié)果表明人血清白蛋白(HSA)和磺胺喹噁啉半抗原的偶聯(lián)比率為人血清白蛋白∶磺胺喹噁啉半抗原＝1∶13，偶聯(lián)物的濃度為4.2mg/mL。
2、包被阿維菌素包被原、鹽霉素包被原和磺胺喹噁啉包被原的酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液稀釋阿維菌素包被原，得到阿維菌素包被原溶液，其中阿維菌素包被原的濃度為0.76μg/mL。
用包被緩沖液稀釋鹽霉素包被原，得到鹽霉素包被原溶液，其中鹽霉素包被原的濃度為1.2μg/mL。
用包被緩沖液稀釋磺胺喹噁啉包被原，得到磺胺喹噁啉包被原溶液，其中磺胺喹噁啉包被原的濃度為1.0μg/mL。
在白色不透明96孔酶標(biāo)板的同一孔中加入阿維菌素包被原溶液40μl、鹽霉素包被原溶液40μl和磺胺喹噁啉包被原溶液40μL，同一孔中鹽霉素包被原、阿維菌素包被原和磺胺喹噁啉包被原的物質(zhì)的量比為1∶1∶1；在pH值9.6、37℃條件下包被2小時(shí)；取出，甩干孔內(nèi)包被液，加入洗滌液260μL/孔，室溫反應(yīng)3~4分鐘，倒出孔內(nèi)液體，拍干；加入封閉液，180μL/孔，37℃封閉2小時(shí)，倒出孔內(nèi)液體，拍干。用鋁膜真空密封保存。
包被緩沖液組成碳酸鈉1.59g；碳酸氫鈉2.9g；去離子水1000mL。
洗滌液組成氯化鈉320g；磷酸氫二鉀10g；氯化鉀0.18g；十二水合磷酸二氫鈉116g；吐溫-20100mL；Proclin300 1.5mL；去離子水4900mL； 封閉液組成蔗糖50g；十二水合磷酸二氫鈉5.8g；小牛血清50mL；Proclin300300μL；去離子水950mL； (二)發(fā)光復(fù)合物的制備 1、鹽霉素單克隆抗體與“量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體復(fù)合物”的結(jié)合物； 量子點(diǎn)的表征1、量子點(diǎn)的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點(diǎn)的直徑10~15nm；3、量子點(diǎn)的發(fā)光情況橙色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測(cè)的波長(zhǎng)(即激發(fā)波長(zhǎng)400nm)下，量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)585nm。
上述量子點(diǎn)為表面氨基修飾的量子點(diǎn)，購(gòu)自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)Cat.No.Q21511MP； 量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體的復(fù)合物的制備 (1)活化量子點(diǎn)表面氨基(-NH2)修飾的水溶性QDs 2ml經(jīng)20μl偶聯(lián)劑SMCC(琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來(lái)酸]-1-羧環(huán)己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子點(diǎn)。凝膠柱去除過量的SMCC。
(2)還原羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體2ml中加入還原劑DTT 25μl(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，斷開二硫鍵形成的巰基。凝膠柱去除DTT。
(3)將活化的量子點(diǎn)和還原的羊抗鼠抗體混合，37℃反應(yīng)1小時(shí)，10μl beta-巰基乙醇終止反應(yīng)，形成量子點(diǎn)標(biāo)記的羊抗鼠抗體。最終的反應(yīng)溶液經(jīng)凝膠柱分離純化，收集量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體復(fù)合物，利用紫外分光光度儀測(cè)定濃度。
鹽霉素單克隆抗體的制備將保藏編號(hào)為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
鹽霉素單克隆抗體與“量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取鹽霉素單克隆抗體工作液(A液)5ml，加入量子點(diǎn)與羊抗鼠抗體復(fù)合物(B液)3ml(即反應(yīng)物中，鹽霉素單克隆抗體與羊抗鼠抗體的摩爾比為1∶1.5)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，4℃，避光保存。
2、“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物； 量子點(diǎn)的表征1、量子點(diǎn)的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點(diǎn)的直徑10~15nm；3、量子點(diǎn)的發(fā)光情況綠色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測(cè)的波長(zhǎng)(即激發(fā)波長(zhǎng)400nm)下，量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)525nm。
上述量子點(diǎn)為表面羧基修飾的量子點(diǎn)，購(gòu)自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為Cat.No.Q21541MP； 阿維菌素單克隆抗體的制備將保藏編號(hào)為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細(xì)胞株置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物的制備將阿維菌素單克隆抗體用0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6)稀釋到1mg/m L，對(duì)抗體充分透析。用1ml DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)1mg，向1ml抗體溶液(即一抗蛋白質(zhì)1mg)加入120μl NHSB溶液(即NHSB 120μg)；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2~4小時(shí)；加入9.6μl1mol/l NH4Cl水溶液(即每25μgNHSB加1μl NH4Cl水溶液)，在室溫下攪拌10分鐘；在4℃，超濾除去游離的生物素；將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質(zhì)在1~3ml之間洗下，得到一抗與生物素的復(fù)合物；最后，樣品加入疊氮鈉(疊氮鈉在樣品中的終濃度0.5g/L)及BSA(BSA在樣品中的終濃度為1.0g/L)。將產(chǎn)物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。
親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物的制備用磷酸緩沖液(PBS 0.1mol/L，pH＝8.2)將量子點(diǎn)進(jìn)行10倍稀釋成濃度為0.08μM，加入100μL濃度為5.0g/L的EDC，室溫下攪拌1min后，并向其加入5mg的鏈親和素，室溫下攪拌反應(yīng)2.5h后。經(jīng)過Sephadex G2100層析柱進(jìn)行分離純化，得到得到量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈親和素溶液，將產(chǎn)物置4℃，避光保存。
“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”(C液)5ml，加入“親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物”(D液)3ml(即反應(yīng)物中，生物素和親和素的摩爾比為1∶1)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，得到“阿維菌素單克隆抗體與生物素的復(fù)合物”與“親和素與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物；4℃，避光保存。
3、磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物 金黃色葡萄球菌A蛋白即為SPA； 量子點(diǎn)的表征1、量子點(diǎn)的組成核為CdSe，殼為ZnS；2、量子點(diǎn)的直徑10~15nm；3、量子點(diǎn)的發(fā)光情況紅色熒光；4、在酶標(biāo)儀檢測(cè)的波長(zhǎng)(即激發(fā)波長(zhǎng)400nm)下，量子點(diǎn)的特征發(fā)射波長(zhǎng)655nm。
上述量子點(diǎn)為表面氨基修飾的量子點(diǎn)，購(gòu)自invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為Cat.No.Q21521MP； 磺胺喹噁啉單克隆抗體的制備將保藏編號(hào)為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(體積百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/L；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的制備取氨基修飾的量子點(diǎn)溶于0.2ml的25％戊二醛溶液中(以0.1M、pH值為6.8的PBS緩沖液配制)，蓋好瓶蓋。室溫放置18小時(shí)(防止干燥，可放在溫盒中)。于4℃下對(duì)1000ml生理鹽水透析三天，換水3~4次，以除去游離的戊二醛，然后加生理鹽水至1ml。加1ml濃度為5mg/ml的SPA生理鹽水溶液。加0.1ml 1.0M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)，混勻，4℃冰箱內(nèi)靜置24小時(shí)。加0.1ml、0.2M賴氨酸水溶液，混勻后室溫靜置2小時(shí)，以封閉戊二醛上多余的醛基。1000ml 0.02M PBS緩沖液(pH7.4)透析24小時(shí)。攪拌下逐滴加等量100％飽和度的硫酸銨，4℃冰箱內(nèi)靜置60分鐘后，離心3000rpm，30分鐘(或4000rpm，15分鐘)，收集沉淀，沉淀即為SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物。沉淀用50％飽和度的硫酸胺洗2次。將沉淀溶于少量0.02M PBS緩沖液(pH7.4)中。4℃PBS緩沖液透析24小時(shí)，中間換液三次。結(jié)合物4℃，避光保存。
磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物的制備取磺胺喹噁啉單克隆抗體(E液)5ml，加入“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”溶液(F液)3ml(即反應(yīng)物中，磺胺喹噁啉單克隆抗體與SPA的摩爾比為1∶2)，輕輕混合，室溫下孵育20min后，得到磺胺喹噁啉單克隆抗體與“SPA與量子點(diǎn)的復(fù)合物”的結(jié)合物，4℃，避光保存。
實(shí)施例2、檢測(cè)方法 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 向包被有三種包被原的酶標(biāo)板的同一微孔中加入鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl、阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl、磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μl，隨后相繼加入三種發(fā)光復(fù)合物各40μl，37℃溫育30分鐘，倒出孔內(nèi)液體，260μl/孔洗滌4次，拍干。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)(激發(fā)波長(zhǎng)400nm，發(fā)射波長(zhǎng)鹽霉素發(fā)光復(fù)合物對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)585nm；阿維菌素復(fù)合物對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)525nm；磺胺喹噁啉發(fā)光復(fù)合物對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)655nm；)，多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。
鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液設(shè)如下不同濃度0、0.2、1、5、25、125μg/l； 對(duì)于每種標(biāo)準(zhǔn)品而言，用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值(F)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的相對(duì)熒光強(qiáng)度(F0)再乘以100％，得到百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值。以該種標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品、阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品、磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值(％)＝(F/F0)×100％。
2、對(duì)檢測(cè)樣本溶液進(jìn)行檢測(cè) 向包被有三種包被原的酶標(biāo)板同一微孔中加入檢測(cè)樣本溶液50μl，隨后相繼加入三種發(fā)光復(fù)合物各40μl，37℃溫育30分鐘，倒出孔內(nèi)液體，260μl/孔洗滌4次，拍干。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。
結(jié)果判斷用加入檢測(cè)樣本溶液的孔中鹽霉素包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值(F)除以第一個(gè)鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的相對(duì)熒光強(qiáng)度值(F0)再乘以100％，得到百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值。將百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值與鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線中的百分相對(duì)熒光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)，則從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出該檢測(cè)樣本中鹽霉素的殘留量。同理，得到該檢測(cè)樣本中阿維菌素、磺胺喹噁啉的殘留量。
3、樣品前處理 在檢測(cè)前，可對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行前處理，例如牛奶樣品的處理如下 對(duì)牛奶樣品進(jìn)行脫脂(4000rmp離心5min)后，棄去上層脂類物質(zhì)，用吸管吸取2ml至50ml聚苯乙烯離心管中，加入0.1mol/l pH7.2的PBS溶液按1∶9進(jìn)行稀釋，混勻后取50μl分析。
實(shí)施例3、試劑盒的效果 (一)靈敏度(IC50和檢測(cè)限) 評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)靈敏度的方法，常用的有IC50抑制濃度(指標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50％處所對(duì)應(yīng)的藥物濃度)和檢測(cè)限，兩者值越低說(shuō)明方法的靈敏度越高。檢測(cè)限的定義有多種，本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)限的定義為20份空白樣品或零標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為方法的檢測(cè)限。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)二中的三種標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三種物質(zhì)對(duì)應(yīng)的IC50抑制濃度，如表1-3所示。
將20份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的牛奶樣品分別按照實(shí)施例2中所述方法進(jìn)行前處理，然后按照實(shí)施例2中所述方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)限。結(jié)果如表4-表6所示。
表1阿維菌素類IC50統(tǒng)計(jì)表μg/l
表2鹽霉素IC50統(tǒng)計(jì)表μg/l
表3磺胺喹噁啉IC50統(tǒng)計(jì)表μg/l
表4阿維菌素空白牛奶測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表μg/l
表5鹽霉素空白牛奶測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表μg/l
表6磺胺喹噁啉空白牛奶測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表μg/l
結(jié)果表明，本方法對(duì)阿維菌素檢測(cè)的IC50在2.0μg/l左右，對(duì)牛奶樣品中阿維菌素的檢測(cè)限為0.5μg/l；對(duì)鹽霉素檢測(cè)的IC50在1.5μg/l左右，對(duì)牛奶樣品中鹽霉素的檢測(cè)限為0.4μg/l；對(duì)磺胺喹噁啉檢測(cè)的IC50在1.0μg/l左右，對(duì)牛奶樣品中磺胺喹噁啉的檢測(cè)限為0.15μg/l。
(二)添加回收率試驗(yàn) 向同一份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶樣品中，添加阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉三種標(biāo)準(zhǔn)品，使牛奶樣品中阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的濃度分別為1μg/l和2μg/l；將添加后的樣品按照實(shí)施例2中樣品前處理方法進(jìn)行前處理，得到樣本溶液，再按照實(shí)施例2中檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度做5個(gè)平行，分別計(jì)算每種添加物質(zhì)的回收率(回收率＝實(shí)測(cè)值/添加值)。
結(jié)果見表7。
表7樣本回收率測(cè)定
結(jié)果表明，牛奶樣品中三種物質(zhì)的添加回收率在73.5％~97.2％之間，符合準(zhǔn)確度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。
(三)精密度試驗(yàn) 向同一份不含阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的空白牛奶樣品中，添加阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉三種標(biāo)準(zhǔn)品，使牛奶樣品中阿維菌素、鹽霉素和磺胺喹噁啉的濃度分別為4.0μg/l；將添加后的樣品按照實(shí)施例2中樣品前處理方法進(jìn)行前處理，得到樣本溶液，再按照實(shí)施例2中檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表8、9、10。
板內(nèi)變異系數(shù)的計(jì)算方法板內(nèi)變異系數(shù)＝同一次測(cè)定的同一塊板內(nèi)某樣本(一般為中等水平)重復(fù)測(cè)定次數(shù)所得結(jié)果的變異系數(shù)。
批內(nèi)變異系數(shù)的計(jì)算方法批內(nèi)變異系數(shù)＝同一次測(cè)定中各平行樣本的變異系數(shù)。
批間變異系數(shù)的計(jì)算方法批間變異系數(shù)＝同一樣本在不同批次測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。
表8添加阿維菌素的精密度試驗(yàn)結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)
表9添加鹽霉素的精密度試驗(yàn)結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)
表10添加磺胺喹噁啉的精密度試驗(yàn)結(jié)果(添加濃度4.0μg/l)

結(jié)果，本試劑盒添加阿維菌素類藥物樣品的精密度在4.7％~10.2％之間，添加鹽霉素藥物樣品精密度在5.5％~9.6％，添加磺胺喹噁啉藥物樣品精密度在3.4％~9.2％，滿足殘留檢測(cè)需求。
(四)交叉反應(yīng)率試驗(yàn) 選擇與待測(cè)藥物類似結(jié)構(gòu)的化合物和臨床使用的代表獸藥，測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過各種標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計(jì)算該方法對(duì)其它類似物的交叉反應(yīng)率。

結(jié)果如表11所示。
表11交叉反應(yīng)率 結(jié)果表明，本方法對(duì)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、愛普菌素、磺胺喹噁啉和鹽霉素的特異性好，可以用于對(duì)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、愛普菌素、磺胺喹噁啉和鹽霉素藥物的同步測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種免疫試劑盒，包括不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物，所述不透明微孔板中至少有一個(gè)孔包被有三種小分子物質(zhì)包被原；
所述三種小分子物質(zhì)包被原選自如下任意一種且不相同小分子物質(zhì)I的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、小分子物質(zhì)II的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物和小分子物質(zhì)III的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III不相同；
所述發(fā)光復(fù)合物為如下1)、2)和3)所示
1)抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗抗體和量子點(diǎn)I形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物I；其中，量子點(diǎn)I與抗抗體形成復(fù)合物，復(fù)合物再通過抗抗體與抗小分子物質(zhì)I的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)I的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物I；
2)抗小分子物質(zhì)II的抗體、生物素、親和素與量子點(diǎn)II形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物II；其中，抗小分子物質(zhì)II的抗體與生物素形成復(fù)合物I，親和素與量子點(diǎn)II形成復(fù)合物II，復(fù)合物I與復(fù)合物II通過生物素與親和素的相互作用而結(jié)合形成結(jié)合物II；
3)抗小分子物質(zhì)III的抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點(diǎn)III形成的結(jié)合物，記作結(jié)合物III；其中，金黃色葡萄球菌A蛋白與量子點(diǎn)III形成復(fù)合物III，復(fù)合物III再通過金黃色葡萄球菌A蛋白與抗小分子物質(zhì)III的抗體的相互作用而與抗小分子物質(zhì)III的抗體相結(jié)合形成結(jié)合物III；
所述量子點(diǎn)I、量子點(diǎn)II和量子點(diǎn)III在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下具有不同的特征發(fā)射波長(zhǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫試劑盒，其特征在于所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III為對(duì)人體或動(dòng)物體有危害的小分子物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫試劑盒，其特征在于所述免疫試劑盒中包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品稀釋液；
所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的免疫試劑盒，其特征在于所述對(duì)人體或動(dòng)物體有危害的小分子物質(zhì)為磺胺藥物、喹諾酮藥物、聚醚類藥物、阿維菌素類藥物、氯霉素類藥物、四環(huán)素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氨基糖苷類藥物、青霉素類藥物、鏈霉素藥物、蘇丹紅、孔雀石綠或三聚氰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述聚醚類藥物為鹽霉素；所述磺胺藥物為磺胺喹噁啉；所述阿維菌素類藥物為阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素；
所述小分子物質(zhì)I、小分子物質(zhì)II和小分子物質(zhì)III選自如下a)、b)和c)中的任意一種且不相同a)鹽霉素，b)磺胺喹噁啉，c)阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素或愛普菌素；
所述抗小分子物質(zhì)I的抗體、抗小分子物質(zhì)II的抗體和抗小分子物質(zhì)III的抗體選自如下任意一種且不相同由保藏編號(hào)為CGMCC No.1609的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-3分泌得到的單克隆抗體、由保藏編號(hào)為CGMCC No.1606的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4分泌得到的單克隆抗體和由保藏編號(hào)為CGMCC No.1615的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-4-1分泌得到的單克隆抗體；
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下1)、2)和3)所示
1)如下各濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；
2)如下各濃度的鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L；
3)如下各濃度的磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、1、5、25、125μg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述量子點(diǎn)為具有如下發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)525nm、585nm或655nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的免疫試劑盒，其特征在于所述不透明微孔板中，所述三種小分子物質(zhì)包被原的量分別為(48-50)ng/孔、(38-42)ng/孔和(28-32)ng/孔。
9.一種檢測(cè)樣品中對(duì)人體或動(dòng)物體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法，是用權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟
1)制作權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒中的每種小分子物質(zhì)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值、所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的對(duì)數(shù)值或所述小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值的半對(duì)數(shù)值，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為各所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度；
2)向權(quán)利要求1-8中任一所述免疫試劑盒中的不透明微孔板的孔中加入待測(cè)樣品的溶液，再加入所述免疫試劑盒中的三種發(fā)光復(fù)合物，孵育；檢測(cè)孔中各種所述小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度；
3)將步驟2)中得到的小分子物質(zhì)包被原與發(fā)光復(fù)合物形成的復(fù)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度與步驟1)中的小分子物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，得出所測(cè)樣品中小分子物質(zhì)的濃度值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)對(duì)人體有害的小分子物質(zhì)殘留的方法及其專用試劑盒。該免疫試劑盒，包括同一孔中同時(shí)包被三種小分子物質(zhì)包被原的不透明微孔板和發(fā)光復(fù)合物。本發(fā)明充分利用了QDs的多色標(biāo)記功能，建立簡(jiǎn)捷、迅速的新型多殘留檢測(cè)試劑盒及方法，將具有不同粒徑的QDs，通過其表面特定的官能團(tuán)(如氨基)與靶標(biāo)偶聯(lián)，進(jìn)而間接標(biāo)記獸藥的多抗或單抗，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記。通過分離純化獲得不同熒光特性的量子點(diǎn)-抗體多色標(biāo)記物，并以此為熒光探針，根據(jù)其熒光強(qiáng)度的變化建立同步分析不同類多種抗原成分反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性食品中獸藥等多殘留的同步檢測(cè)。且此方法更具有操作簡(jiǎn)單，熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101762706SQ20101003361
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者丁雙陽(yáng), 肖希龍, 沈建忠, 江海洋, 李建成, 夏曦, 王戰(zhàn)輝, 陳軍霞, 徐飛, 饒欽雄, 李金貴, 朱奎, 李存, 張啟迪 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)