專利名稱：一種快速分析單分子的納米孔測試儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠用于單分子多種特性研究的納米孔測試儀，該測試儀能夠應用于基因的超快速測序、用于生物單分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì)分子等)的篩選、分離、計數(shù)，能 夠用于納米量級大小的藥物分子的篩選和分析。
背景技術(shù)：
目前，檢測生物單分子的方法，尤其是檢測DNA分子排序的常用方法有“Sanger方 法”和“shotgun方法”，以及“454生命科學公司”的JonathanRothberg與其同事發(fā)明的方 法——焦磷酸測序法。這些測序方法，基本原理和方法都是對樣品先“分段”、再“測序”，最 后“拼接”。使用這些技術(shù)對一種生物的基因進行完全測序，其花費十分昂貴，所需時間長?；驕y序技術(shù)進一步發(fā)展和普及應用需要研發(fā)新的測序方法，降低測序成本、提 高測序速度。新一代基因測序技術(shù)的革新目標主要集中在以下幾個方面(1)測序成本低； (2)測序速度(超)快；(3)結(jié)果準確性高；(4)每次閱讀堿基長度大。目前，新一代測序技 術(shù)的研發(fā)以單分子測序技術(shù)為指導思想，主要技術(shù)有合成測序技術(shù)，雜交測序技術(shù)，連接 測序技術(shù)，納米孔測序技術(shù)。其中，美國哈佛大學Daniel Branton.Jene Golovchenko以及 加利福尼亞大學Dave Deamer教授等提出的納米孔測序技術(shù)是最有潛力實現(xiàn)低價高效超快 的全基因測序技術(shù)。但是，利用現(xiàn)有的納米孔研制方法制作納米孔，成品率不高；納米孔的厚度一般也 比較大，有IOnm左右；而且，所研制的納米孔是單獨存在的，即單個納米孔被制作在一塊面 積較大的絕緣固體薄膜的中心(蛋白質(zhì)α-溶血素生物納米孔也是被安置在一塊面積較大 的絕緣平面上)。單個的納米孔在測序應用中有許多缺點。首先，穿孔的DNA分子是隨機競 爭的結(jié)果；不能夠控制單獨一個DNA分子穿越納米孔。其次，穿孔的DNA分子速度很大，而 且不是勻速運動；不能控制DNA分子的穿越速度。這些因素導致不能獲取穿孔DNA分子的 準確信息，從而導致對基因序列的誤判，嚴重制約納米孔技術(shù)的實用化發(fā)展。中國發(fā)明專利申請“一種合成的固體側(cè)向納米孔”(申請?zhí)?007100729863)公開 了一種合成的固體側(cè)向納米孔，其目的是為了有效引導單個DNA分子無糾纏、勻速地穿越 納米孔，并對其準確測序。其不足之處是缺乏對單個樣品分子的有效選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠挑選單個樣品分子，并引導其無糾纏、勻速進入納 米孔的快速分析單分子的納米孔測試儀，用于生物分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、核糖，甚至細 胞、以及藥物分子等的多種特性研究，解決對單個樣品分子性質(zhì)的快速測定。本發(fā)明實現(xiàn)過程如下一種快速分析單分子的納米孔測試儀，包括樣品操縱系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)，其中 樣品操縱系統(tǒng)用于引導被分析樣品無糾纏、伸展開、勻速地穿越納米孔通道系統(tǒng)，其包括微 納米孔通道系統(tǒng)和動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)；信號處理系統(tǒng)包括信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)，微納米孔通道系統(tǒng)由高絕緣材料制作而成，其對單個分析樣品進行選擇，并保證 分析樣品無纏繞、勻速地進出并穿越整個通道；信號采集系統(tǒng)用于實時收集樣品在外力作用下流經(jīng)通道系統(tǒng)時引起的通道阻塞 效應信號；信號分析系統(tǒng)用于接收信號采集系統(tǒng)采集到的信號，進行數(shù)據(jù)整理，同時，接收 動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)檢測到的樣品輸運信息，根據(jù)分析結(jié)果，將信息反饋給動態(tài)檢測調(diào)控系 統(tǒng)；
計算機顯示系統(tǒng)根據(jù)信號分析系統(tǒng)傳遞的信息，結(jié)合生物物理數(shù)學模型，確定分 析樣品的特定性質(zhì)；動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)接受信號采集系統(tǒng)采集到的樣品輸運信息，根據(jù)信號分析系統(tǒng) 的分析結(jié)果，控制樣品的運動方向和速度。所述的微納米孔通道系統(tǒng)采用了 “T”字形結(jié)構(gòu)的兩段樣品進出通道、在初始進樣 通道內(nèi)沉積有選擇單分子的多個檢測調(diào)控電極(一般2 5個)，通道內(nèi)設置有調(diào)整樣品運 動方向的電極，使用軟件控制多電極配合組對。微納米孔通道系統(tǒng)包括有樣品儲蓄池，樣品 回收池，初始進樣通道，進樣通道，輔助出樣通道，出樣通道，選擇單個DNA分子以及檢測和 調(diào)控樣品輸運狀態(tài)的電極和納米孔。微納米孔通道系統(tǒng)包括有孔徑可小至1. 5納米、孔深 至單原子級的納米孔。在上述微納米孔通道系統(tǒng)中集成有多組(4 8組)電極，在通道系統(tǒng)的分叉路口 設置有用于探測分析樣品的運動位置和引導樣品運動方向的電極。納米孔檢測儀系統(tǒng)的樣品動態(tài)檢測與調(diào)控系統(tǒng)采用集成電路芯片實現(xiàn)。納米孔檢測儀的信號采集部分采用精密微電流測試儀。動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)、信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)為模塊化集 成式結(jié)構(gòu)，各模塊通過軟件控制實現(xiàn)功能聯(lián)動。本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果本發(fā)明所提供的納米孔檢測儀系統(tǒng)，通道內(nèi)徑由微米逐漸減至納米的結(jié)構(gòu)與多電 極相結(jié)合，保證了對單個分析樣品的選擇；與納米孔直接相連的足夠長(可至厘米級)的進 樣通道和出樣通道保證長鏈生物大分子分析樣品一次性進出納米孔、無需分割；與納米孔 直接相連的足夠長、孔徑小至50nm的進樣通道和出樣通道保證了樣品分子勻速、無糾纏進 出和穿越納米孔；孔徑小至1. 5nm、孔深至單原子級的納米孔保證了分析樣品時檢測電流 的高準確性；樣品操縱系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)通過軟件實現(xiàn)功能聯(lián)動，保證了對分析樣品運 動狀態(tài)的實時監(jiān)測調(diào)節(jié)，進而實現(xiàn)對單個分子特定性質(zhì)的快速檢測。


圖1本發(fā)明快速分析單分子的納米孔測試儀總體框圖；圖2微納米孔通道系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；圖3信號分析與處理軟件流程圖。1-樣品儲蓄池 2-樣品回收池 3-樣品回收池4-電極5-電極6-電極
7-電極8-電極9-電極10-電極11-初始進樣通道12-進樣通道13-輔助出樣通道14-出樣通道 15-納米孔
具體實施例方式圖1為本發(fā)明提供的納米孔測試儀系統(tǒng)原理框圖。如圖1所示，它包括五個主要 組成部分微納米孔通道系統(tǒng)，信號采集系統(tǒng)，信號分析系統(tǒng)，樣品動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)和計 算機顯示系統(tǒng)。圖2為微納米孔通道系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，其可選擇單個DNA分子、并操縱其定向運 動，包括有樣品儲蓄池(1)，樣品回收池(2)，樣品回收池(3)，初始進樣通道(11)，進樣通道 (12)，輔助出樣通道(13)，出樣通道(14)，選擇單個DNA分子、以及檢測和調(diào)節(jié)樣品輸運狀 態(tài)的電極(4)、電極(5)、電極(6)、電極(7)、電極(8)、電極(9)、電極(10)和納米孔(15)。微納米孔通道系統(tǒng)包括有絕緣材料組成的通道實體和沉積在其中的電極，在信息 分析系統(tǒng)和動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的信號指令控制下，各電極上的電壓實時調(diào)整，引導樣品在通道 內(nèi)運動，并與通道相結(jié)合，挑選單個分析樣品，在通道內(nèi)勻速運動。本發(fā)明采用了“T”字形 結(jié)構(gòu)的兩段樣品進出通道、在初始進樣通道內(nèi)沉積有選擇單個樣品的多個檢測調(diào)控電極、 通道內(nèi)設置有調(diào)整樣品運動方向的專用電極等。在本發(fā)明的較佳實施例子中，選擇單個樣品的初始進樣通道內(nèi)設置的微電極系統(tǒng) 有3個，通道的長度2毫米，通道的孔徑是逐漸縮小、為楔型結(jié)構(gòu)。當然，也可以選取1 2 個或更多的電極系統(tǒng)和孔徑相等的通道等組成挑選單個樣品的通道。圖2中的電極(10) 設置在通道系統(tǒng)的分叉路口，作用有兩個，一是用于探測分析樣品的運動位置，一是引導樣 品的運動方向。本發(fā)明的信號處理系統(tǒng)包括信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)。信 號處理系統(tǒng)用來對通道內(nèi)的流體施加特定的外電場作用，引導操縱樣品在通道內(nèi)的運動、 分析穿越納米孔樣品的一定特性。在較佳的實施例子中，信息處理系統(tǒng)各個部分各自采用 集成電路實現(xiàn)。檢測電極(7)、電極(8)、電極(9)和電極(10)與樣品儲蓄池(1)、樣品回收 池⑵和樣品回收池(3)內(nèi)的電極(4)、電極(5)、電極(6)構(gòu)成回路，監(jiān)測分析樣品分子是 否通過該處，由信息采集系統(tǒng)電極實時采集信號、并反饋至信息分析系統(tǒng)，由分析系統(tǒng)分析 得到的結(jié)果，判斷測試樣品在通道內(nèi)的運動情況，并向通道檢測和調(diào)控系統(tǒng)發(fā)出指令，調(diào)整 各電極正負、調(diào)整電場方向，控制樣品在通道內(nèi)運動。根據(jù)圖3所示的信號分析與處理軟件流程圖中描述的信息控制流程，實現(xiàn)信號采 集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)、動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)、計算機顯示系統(tǒng)之間的功能聯(lián)動，本發(fā)明納米 孔測試儀對單個DNA分子的測序?qū)嶒灮具^程如下首先將適量的緩沖液注入到樣品儲蓄池(1)內(nèi)，由于液體的流動以及毛細管作 用，緩沖液將連續(xù)通過初始進樣通道(11)、初始出樣通道(13)，進入樣品回收池(2)；同時， 緩沖液連續(xù)通過初始進樣通道(11)、進樣通道(12)、納米孔(15)、出樣通道(14)，最后進入 樣品回收池(3)。然后，將樣品DNA溶液注入到樣品儲蓄池⑴內(nèi)，接通電極(4)、電極(5)，前者為 負、后者為正電極。DNA在外界電場力作用下，進入初始進樣通道(11)，并向樣品回收池(2)方向移動。當樣品進入通道(11)后，信號分析控制系統(tǒng)向動態(tài)監(jiān)控系統(tǒng)發(fā)出指令，檢測電 極(7)開通，并與電極(4)組成阻止樣品繼續(xù)定向運動的電場，禁止后續(xù)樣品繼續(xù)進入通道 (11)；同時，電極(7)與電極(5)組成的電場繼續(xù)引導樣品在通道(11)內(nèi)移動。根據(jù)同樣 原理，信息分析控制系統(tǒng)向動態(tài)監(jiān)控系統(tǒng)發(fā)出指令，依次間隔開通電極(8)、電極(9)，組成 不同大小和方向的電場力，在通道(11)內(nèi)分階段阻止更多樣品的移動，選擇單個DNA分子 越過電極(9)。 隨后，信息采集系統(tǒng)將信息傳遞給分析控制系統(tǒng)，后者向動態(tài)監(jiān)控系統(tǒng)發(fā)出指令， 控制系統(tǒng)電路，開通電極(10)、電極(6)，同時關(guān)閉電極(5)。電極(9)和電極(10)之間的 電場將減緩DNA分子的運動速度，電極(6)與電極(9)、電極(10)之間組成電場引導樣品進 入進樣通道(12)，穿越納米孔(15)、出樣通道(14)，最后進入回收池(3)。在本發(fā)明的較佳實施例子中，進樣通道(12)的孔徑<50nm，最佳為 5nm，長度足 夠長、大于被測樣品的長度。進入進樣通道(12)內(nèi)的單個DNA分子伸展開勻速移動。樣品 在電場作用下，無糾纏地進入并穿越納米孔(15)后進入出樣通道(14)。本發(fā)明較佳實施例 子中，納米孔(15)孔徑能夠隨不同的樣品體積而更換，測試單鏈DNA分子(基因)的孔徑 為丄；?。。孔厚。^!!!!!。出樣通道(14)與進樣通道(12)的結(jié)構(gòu)、尺寸大小相同。最后，如圖3所示，信息分析系統(tǒng)將采集系統(tǒng)傳遞來的信息精確地傳遞給信息顯 示系統(tǒng)，后者經(jīng)過系統(tǒng)快速分析后，將檢測信號轉(zhuǎn)化成分析樣品DNA分子組成成分核苷酸 的排列順序。以上敘述的僅是本發(fā)明示范性實施舉例，根據(jù)本發(fā)明的基本精神和方法，測試儀 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，可以有多種變化和組合，它們由本發(fā)明的權(quán)利要求書加以限定。
權(quán)利要求
一種快速分析單分子的納米孔測試儀，包括樣品操縱系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)，其特征在于樣品操縱系統(tǒng)用于引導被分析樣品無糾纏、伸展開、勻速地穿越納米孔通道系統(tǒng)，其包括微納米孔通道系統(tǒng)和動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)；信號處理系統(tǒng)包括信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)，微納米孔通道系統(tǒng)由高絕緣材料制作而成，其對單個分析樣品進行選擇，并保證分析樣品無纏繞、勻速地進出并穿越整個通道；信號采集系統(tǒng)用于實時收集樣品在外力作用下流經(jīng)通道系統(tǒng)時引起的通道阻塞效應信號；信號分析系統(tǒng)用于接收信號采集系統(tǒng)采集到的信號，進行數(shù)據(jù)整理，同時，接收動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)檢測到的樣品輸運信息，根據(jù)分析結(jié)果，將信息反饋給動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)；計算機顯示系統(tǒng)根據(jù)信號分析系統(tǒng)傳遞的信息，結(jié)合生物物理數(shù)學模型，確定分析樣品的特定性質(zhì)；動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)接受信號采集系統(tǒng)采集到的樣品輸運信息，根據(jù)信號分析系統(tǒng)的分析結(jié)果，控制樣品的運動方向和速度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于微納米孔通道 系統(tǒng)采用了 “T”字形結(jié)構(gòu)的兩段樣品進出通道、在初始進樣通道內(nèi)沉積有選擇單分子的多 個檢測調(diào)控電極，通道內(nèi)設置有調(diào)整樣品運動方向的電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于微納米孔通道 系統(tǒng)包括有樣品儲蓄池，樣品回收池，初始進樣通道，進樣通道，輔助出樣通道，出樣通道， 選擇單個DNA分子以及檢測和調(diào)控樣品輸運狀態(tài)的電極和納米孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于微納米孔通道 系統(tǒng)包括有孔徑可小至1. 5納米、孔深至單原子級的納米孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于微納米孔通道 系統(tǒng)中集成有多組電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于在通道系統(tǒng)的 分叉路口設置有用于探測分析樣品的運動位置和引導樣品運動方向的電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于使用軟件控制 多電極配合組對。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于納米孔檢測儀 系統(tǒng)的樣品動態(tài)檢測與調(diào)控系統(tǒng)采用集成電路芯片實現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于納米孔檢測儀 的信號采集部分采用精密微電流測試儀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分析單分子納米孔測試儀，其特征在于動態(tài)檢測調(diào)控 系統(tǒng)、信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)為模塊化集成式結(jié)構(gòu)，各模塊通過軟 件控制實現(xiàn)功能聯(lián)動。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速分析單分子的納米孔測試儀，其包括樣品操縱系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)，樣品操縱系統(tǒng)用于引導被分析樣品無糾纏、伸展開、勻速地穿越納米孔通道系統(tǒng)，其包括微納米孔通道系統(tǒng)和動態(tài)檢測調(diào)控系統(tǒng)；信號處理系統(tǒng)包括信號采集系統(tǒng)、信號分析系統(tǒng)和計算機顯示系統(tǒng)。本發(fā)明所提供的納米孔檢測儀能夠應用于基因的超快速測序、用于生物單分子的篩選、分離、計數(shù)，能夠用于納米量級大小的藥物分子的篩選和分析。
文檔編號G01N27/416GK101799447SQ201010100860
公開日2010年8月11日 申請日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者任兆玉, 王凱歌, 白晉濤, 賀慶麗, 高愛華 申請人:西北大學