專利名稱：吡咯/n-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雜環(huán)化合物，含有兩個或更多的雜環(huán)，以氮原子作為僅有的環(huán)雜原子 技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種被環(huán)原子-環(huán)原子的鍵直接連接的吡咯/N_ (2-羧乙基)吡咯復合 納米粒子。
背景技術(shù)：
凝血酶是一種重要的生理蛋白酶，在血液凝固、炎癥和創(chuàng)傷愈合等生理及病理過 程中發(fā)揮重要作用。由于惡性腫瘤患者常有不同程度的出血傾向，腫瘤組織對周圍組織的 侵襲、轉(zhuǎn)移的形成以及腫瘤組織和腫瘤患者血液本身的變化，均可導致病人凝血機制的改 變，而凝血酶的濃度及活性作為衡量凝血機制的重要指標，對揭示腫瘤的發(fā)生機制，或作為 早期診斷、分子分型、療效及預(yù)后判斷具有重大意義。因此檢測凝血酶在醫(yī)學上有重要意 義。傳統(tǒng)直接測定凝血酶方法主要有熒光法和發(fā)色底物法。熒光法是用熒光底物標記凝血 酶，通過測定熒光強度得出凝血酶的含量，其中標記步驟較繁瑣。發(fā)色底物法利用凝血酶切 斷其與發(fā)色肽的作用點，使對硝基苯胺游離出來，溶液顯淺黃色，在405 410nm波長處對 光有最大吸收，據(jù)此可進行定量測定，該法簡單易行。但兩種方法都有一個共同缺點就是靈 敏度不高，不宜進行微量分析，無法適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學要求的痕量檢測。 電化學發(fā)光分析法具有靈敏度高、線性范圍寬、設(shè)備簡單、操作方便、快速、易于實 現(xiàn)自動化、可控性強、可提供高活性的發(fā)光反應(yīng)物質(zhì)和節(jié)省試劑等特點，已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)境科 學、生命科學和材料科學等領(lǐng)域。在電化學發(fā)光分析眾多的電化學發(fā)光試劑中，三聯(lián)吡啶釕 Ru (bpy) 32+由于具有水溶性好，化學性能穩(wěn)定，氧化還原可逆，發(fā)光效率高，應(yīng)用的pH范圍 較寬等特點而廣泛應(yīng)用于電化學發(fā)光分析的研究中。但在流動體系的液相電化學發(fā)光分析 檢測應(yīng)用中，由于昂貴的Ru (bpy) 32+或相關(guān)衍生物作為流動反應(yīng)試劑被大量消耗，導致較高 的分析成本，從而限制了 Ru (bpy) 32+的應(yīng)用。而目前的固定負載方法主要有物理包埋，靜電 吸附，共價鍵合等，其中物理包埋，靜電吸附等普遍存在泄漏的問題，共價鍵合的固定較為 牢固，但若固定在一般塊體材料上，固定量不大，若固定在無機納米材料上，如二氧化硅微 球上，由于其不良的導電性會影響電子的傳導，對電化學發(fā)光分析目標物產(chǎn)生一定的影響。
聚吡咯類聚合物具有良好的環(huán)境穩(wěn)定性、簡易合成、高電導率以及良好的生物相 容性等諸多優(yōu)點，這些性質(zhì)賦予其不同于其他導電聚合物的特異性能，成為化學或生物傳 感器優(yōu)先選擇的材料之一。尤其是納米結(jié)構(gòu)的聚吡咯類聚合物擁有特殊的力學、磁學、熱 學、光學和電化學活性；而聚吡咯類聚合物納米化簡單，化學氧化聚合和電氧化聚合均可施 行，使其在生物醫(yī)學工程、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生和科學等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用 前景。尤其是將納米技術(shù)引入生物傳感器，提高了檢測靈敏度、縮短檢測響應(yīng)時間、延長使 用壽命，可實現(xiàn)高通量的實時檢測。聚吡咯類聚合物納米材料對生物分子進行固定可以提 高固載量，對基底電極進行修飾可以提高電催化活性，從而制備出響應(yīng)性高、敏感性高、選 擇性高以及穩(wěn)定性高的新型納米生物傳感器。目前將N-(2-羧乙基)吡咯單體(英文名稱為lH-Pyrrole-l-propanoic acid)為功能化試劑與吡咯單體采用化學氧化聚合的方法制 備吡咯/N- (2-羧乙基)吡咯復合納米粒子并應(yīng)用于制備凝血酶電化學發(fā)光探針的研究尚 未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于提供一種操作簡便、所制備的產(chǎn)物為納米級 且粒度均勻的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的制備方法。 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于為吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒 子提供一種用途。 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它由下述步驟組成
1、預(yù)處理吡咯單體 將市售吡咯在0. 02MPa減壓蒸餾，收集70 8(TC餾分，得到吡咯單體，充氮氣保 護，避光保存于4°C冰箱內(nèi)，備用。
2、化學反應(yīng) 將吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體按摩爾比為1 : 0. 125 1加入到盛有正 戊醇的錐形瓶中，震蕩溶解，再加入質(zhì)量濃度為86. 8g/L的表面活性劑水溶液，充分攪拌30 分鐘，緩慢加入氧化劑，吡咯單體與正戊醇、質(zhì)量濃度為86. 8g/L的表面活性劑水溶液、氧 化劑的體積比為1 : 1.5 2. 7 : 80 160 : 12 21. l，室溫攪拌反應(yīng)12小時，得到含 有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液。 上述的吡咯和N-(2-羧乙基)吡咯單體購于Sigma公司；表面活性劑為十二烷 基硫酸鈉或苯磺酸鈉或十二烷基苯磺酸鈉，購于阿拉丁公司；氧化劑為FeCl3 6H20或 (NH4)2S208，由西安化學試劑廠生產(chǎn)。
3、分離 在含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液中加入甲醇破乳，含有吡 咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液與甲醇的體積比為1 : 2，8000轉(zhuǎn)/分鐘離 心分離10分鐘，沉淀物用甲醇洗滌2 3次，再用蒸餾水洗至蒸餾水無色為止。
4、干燥 洗滌后的沉淀物在真空度為0. OlMPa的電熱恒溫真空干燥箱內(nèi)6(TC干燥3 5小 時，制備成吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。 在本發(fā)明的化學反應(yīng)步驟2中，將吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體按最佳摩 爾比為l : 0.5加入到盛有正戊醇的錐形瓶中，震蕩溶解，再加入質(zhì)量濃度為86.8g/L的 表面活性劑水溶液，充分攪拌30分鐘，緩慢加入氧化劑，吡咯單體與正戊醇、質(zhì)量濃度為
86.8g/L的表面活性劑水溶液、氧化劑的最佳體積比為i : 2 : 120 : 16，室溫攪拌反應(yīng)i2
小時，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液。 吡咯/N- (2-羧乙基)吡咯復合納米粒子在制備凝血酶電化學發(fā)光探針中的用途。
吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子在制備凝血酶電化學發(fā)光探針中的使用 方法如下 將N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3- (3- 二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽溶于pH為7. 40 的磷酸鹽緩沖溶液中，在磷酸鹽緩沖溶液中N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)
4碳二亞胺鹽酸鹽的物質(zhì)的量濃度均為O. lmol/L，加入吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒 子，室溫活化1小時，再加入物質(zhì)的量濃度為10 ii mol/L的凝血酶適體II和物質(zhì)的量濃度 為6. 3 i！ mol/L的氨基釕聯(lián)吡啶衍生物，氨基釕聯(lián)吡啶衍生物與凝血酶適體II、N-氨基琥珀 酰胺、l-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽、吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子 的質(zhì)量比為l : 11 : 4020 : 6678 : 700，室溫攪拌過夜，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分 鐘，沉淀物用物質(zhì)的量濃度為0. 5mol/L的NaCl水溶液洗滌3次，所得沉淀震蕩分散于pH 為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液中，制備成凝血酶電化學發(fā)光探針。 將石墨電極插入含有物質(zhì)的量濃度為0. 005mol/L的對氨基苯磺酸和物質(zhì)的量濃 度為0. 10mol/L的氯化鉀的水溶液中，用循環(huán)伏安法以10mV/s的掃速從0. 5 1. 40V掃四 圈，取出電極，用蒸餾水沖洗1分鐘，在物質(zhì)的量濃度為0. 04mol/L的PC15的丙酮溶液中浸 泡30分鐘，取出電極，用pH為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面3分鐘，向電極表面滴 加物質(zhì)的量濃度為10 y mol/L的凝血酶適體I，室溫培育6小時，用pH為7. 40的磷酸鹽緩 沖溶液清洗電極表面3分鐘，制備成凝血酶適體傳感器。在凝血酶適體傳感器上滴加物質(zhì) 的量濃度為1. 0X 10—15 1. 0X 10—12mol/L的凝血酶，室溫培育30分鐘，用pH為7. 40的磷 酸鹽緩沖溶液清洗電極表面3分鐘，再滴加凝血酶電化學發(fā)光探針，室溫培育20分鐘，用pH 為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面3分鐘，室溫放置至電極表面干燥。所得電極用于 檢測凝血酶。 上述的N-氨基琥珀酰胺和1-乙基_3-(3- 二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽均購 自Sigma公司；氨基釕聯(lián)吡啶衍生物(英文名字為Ruthenium bis(2，2' -bipyridine) (2， 2， -bipyridine-4， 4， -dicarboxylic acid)-ethylenedi咖ine)為本實驗室根據(jù)文 獻 (Terpetschnig， E. ;Szmacinski， H. ;Malak， H. ;Lakowicz， J. R. Biophys. J. 1995,68， 342-350.)合成；凝血酶適體I為5' -NH2- (CH2) 6_GGT TGG TGT GGTTGG-3' (15個堿基)， 凝血酶適體II為5' -NH2-(CH2)6-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGGTGA CT-3' (29個 堿基)，均購于上海生物工程有限公司；凝血酶購于華美生物公司；對氨基苯磺酸購于國藥 集團化學試劑有限公司。 本發(fā)明制備的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子，具有較高的比表面積和較 多的羧基官能團，增大了氨基釕聯(lián)吡啶衍生物的負載量，使電化學發(fā)光信號增強。采用吡咯 /N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子制備凝血酶電化學發(fā)光探針，可用于檢測凝血酶，具有 良好的選擇性、靈敏度及檢出限，可在醫(yī)學痕量檢測儀器上使用。


圖1是實施例1制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的透射電鏡圖。
圖2是實施例1制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的掃描電鏡圖。
圖3是實施例1制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的紅外光譜圖。
圖4是實施例1制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的X射線電子衍 射譜圖。 圖5是吡咯單體與N- (2-羧乙基)吡咯不同摩爾比所制備的吡咯/N- (2_羧乙基) 吡咯復合納米粒子的紅外光譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。 實施例1 1、預(yù)處理吡咯單體 將市售吡咯在0. 02MPa減壓蒸餾，收集70 8(TC餾分，得到吡咯單體，充氮氣保 護，避光保存于4°C冰箱內(nèi)，備用。
2、化學反應(yīng) 取N_(2-羧乙基)吡咯單體0. 5026g、吡咯單體0. 5mL，加入到盛有l(wèi)mL正戊醇 的錐形瓶中，吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比為1 : 0.5，震蕩溶解，加入 60mL質(zhì)量濃度為86. 8g/L的十二烷基硫酸鈉水溶液，充分攪拌30分鐘，緩慢加入8mL物 質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的FeCl3 6H20水溶液，吡咯單體與正戊醇、質(zhì)量濃度為86. 8g/L 的十二烷基硫酸鈉水溶液、物質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的FeCl3 6H20水溶液的體積比為
i : 2 : 120 : 16，室溫攪拌反應(yīng)12小時，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒
子的混合液。
3、分離 在含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液中加入甲醇破乳，含有吡 咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液與甲醇的體積比為1 : 2，8000轉(zhuǎn)/分鐘離 心分離10分鐘，沉淀物用甲醇洗滌2 3次，再用蒸餾水洗至蒸餾水無色為止。
4、干燥 洗滌后的沉淀物在真空度為0. OlMPa的電熱恒溫真空干燥箱內(nèi)6(TC干燥3 5小 時，制備成吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。 所制備的產(chǎn)物用透射電鏡、掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀、X-射線衍射儀進行了表 征，透射電鏡觀測結(jié)果見圖l，掃描電子顯微鏡照片見圖2，紅外光譜圖見圖3， X-射線衍射 譜圖見圖4。 由圖1、圖2可見，產(chǎn)物呈類球形，分散較為均勻，粒徑為40 50nm。
由圖3可見，3440、 1545cm—1為妣咯環(huán)上_NH的特征吸收峰，1308cm—1和1043cm—1分 別為吡咯環(huán)上C-N伸縮振動吸收峰和C-H鍵的變形振動吸收峰，1702cm—1處的特征吸收峰 則證實了聚合物上羧基的存在。通過紅外光譜數(shù)據(jù)分析，所制備的產(chǎn)物為吡咯和N-(2-羧 乙基)吡咯兩種單體的復合物，且表面具有功能化羧基官能團。 由圖4可見，2 9在15。禾口30°之間出現(xiàn)了聚吡咯的無定型衍射峰，另外還出現(xiàn)一 些尖峰，說明所制備的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的結(jié)晶度好于聚吡咯，對于 改善聚吡咯不溶不融、難以加工的性質(zhì)具有一定的意義。目前，通過x-射線衍射圖譜計算 結(jié)晶度最常用的方法是分峰法。分峰法首先對衍射圖譜進行分峰處理，計算各個峰的面積， 然后以總的峰面積除以總衍射面積，計算出結(jié)晶度。通過計算機軟件模擬，吡咯/N-(2-羧 乙基)吡咯復合納米粒子的結(jié)晶度為7.9%。
實施例2 在本實施例的化學反應(yīng)步驟2中，取N_(2-羧乙基)吡咯單體0. 1256g、吡咯單體 0. 5mL，加入到盛有0. 75mL正戊醇的錐形瓶中，吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾 比為1 : 0. 125，震蕩溶解，加入40mL質(zhì)量濃度為86. 8g/L的十二烷基硫酸鈉水溶液，充分攪拌30分鐘，緩慢加入6mL物質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的FeCl3 6H20水溶液，吡咯單體 與正戊醇、質(zhì)量濃度為86. 8g/L的十二烷基硫酸鈉水溶液、物質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的 FeCl3 61120水溶液的體積比為1 : 1.5 : 80 : 12，室溫攪拌反應(yīng)12小時，得到含有吡咯 /N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液。其他步驟與實施例l相同。制備成吡咯/ N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。
實施例3 在本實施例的化學反應(yīng)步驟2中，取N_(2-羧乙基)吡咯單體1. 0052g、吡咯單體 0. 5mL，加入到盛有1.35mL正戊醇的錐形瓶中，吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩 爾比為1 : 1，震蕩溶解，加入80mL質(zhì)量濃度為86. 8g/L的十二烷基硫酸鈉水溶液，充分攪 拌30分鐘，緩慢加入10. 55mL物質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的FeCl3 6H20水溶液，吡咯單 體與正戊醇、質(zhì)量濃度為86. 8g/L的十二烷基硫酸鈉水溶液、物質(zhì)的量濃度為1. 35mol/L的 FeC1^6H^水溶液的體積比為1 : 2. 7 : 160 : 21. 1，室溫攪拌反應(yīng)12小時，得到含有吡 咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液。其他步驟與實施例l相同。制備成吡咯 /N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。
實施例4 在上述實施例1 3的化學反應(yīng)步驟2中，所用表面活性劑十二烷基硫酸鈉用等 質(zhì)量的苯磺酸鈉替換，氧化劑FeCl3 *61120用等摩爾的(朋4)25208替換，該步驟的其他步驟與 相應(yīng)的實施例相同。其他步驟與實施例l相同。制備成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納 米粒子。 實施例5 在上述實施例1 3的化學反應(yīng)步驟2中，所用表面活性劑十二烷基硫酸鈉用等 質(zhì)量的十二烷基苯磺酸鈉替換，該步驟的其他步驟與相應(yīng)的實施例相同。其他步驟與實施 例1相同。制備成吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。
實施例6 采用本發(fā)明實施例1制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子在制備凝血 酶電化學發(fā)光探針中的應(yīng)用如下 將N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3- (3- 二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽溶于pH為7. 40 的磷酸鹽緩沖溶液中，在磷酸鹽緩沖溶液中N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基) 碳二亞胺鹽酸鹽的物質(zhì)的量濃度均為0. lmol/L，加入2mg吡咯/N_(2_羧乙基)吡咯復合 納米粒子，室溫活化1小時，再加入350 ii L物質(zhì)的量濃度為10 ii mol/L的凝血酶適體II和 500 ii L物質(zhì)的量濃度為6. 3 ii mol/L的氨基釕聯(lián)吡啶衍生物，氨基釕聯(lián)吡啶衍生物與凝血 酶適體II、 N-氨基琥珀酰胺、1_乙基_3-(3- 二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽、妣咯/N-(2-羧
乙基)吡咯復合納米粒子的質(zhì)量比為i : ii : 4020 : 6678 : 700，室溫攪拌過夜，12000
轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘，沉淀物用物質(zhì)的量濃度為0. 5mol/L的NaCl水溶液洗滌3次， 所得沉淀震蕩分散于lmL pH為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液中，制備成凝血酶電化學發(fā)光探針。
將石墨電極插入2mL含有物質(zhì)的量濃度為0. 005mol/L的對氨基苯磺酸和物質(zhì)的 量濃度為0. 10mol/L的氯化鉀的水溶液中，用循環(huán)伏安法以10mV/s的掃速從0. 5 1. 40V 掃四圈，取出電極，用蒸餾水沖洗1分鐘，在2mL物質(zhì)的量濃度為0. 04mol/L的PC15丙酮溶 液中浸泡30分鐘，取出電極，用pH為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面3分鐘，向電極表面滴加5 ii L物質(zhì)的量濃度為10 ii mol/L的凝血酶適體I，室溫培育6小時，用pH為7. 40 的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面3分鐘，制備成凝血酶適體傳感器。在凝血酶適體傳感器 上滴加5 y L物質(zhì)的量濃度為1. OX 10—15 1. OX 10—12mol/L的凝血酶，室溫培育30分鐘，用 pH為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面3分鐘，再滴加3 L凝血酶電化學發(fā)光探針，室 溫培育20分鐘，用pH為7. 40的磷酸鹽緩沖溶液清洗電極表面3分鐘，室溫放置至電極表 面干燥。所得電極用于檢測凝血酶。 其他實施例制備的吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子用于制備凝血酶電化 學發(fā)光探針的方法與上述方法相同。 為了確定本發(fā)明的最佳工藝步驟，發(fā)明人進行了大量的實驗室研究試驗，各種試 驗情況如下 實驗儀器高分辨透射電子顯微鏡，型號為JEM-2100,由日本電子公司生產(chǎn)；尼高 力傅里葉變換紅外光譜儀，型號為AVTAR360，由尼高力儀器公司生產(chǎn)。 1、 N_(2-羧乙基)吡咯單體用量對吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子粒徑 的影響 取N_(2_羧乙基)卩比咯單體0. 1256g、0. 1884g、0. 2512g、0. 3768g、0. 5026g、 1. 0052g共6份，分別加入到盛有l(wèi)mL正戊醇的錐形瓶中，再分別加入0. 5mL吡咯單體， 吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比分別為1 : 0.125U : 0.167U : 0.25、
i : o.333、i : o.5、i : i。其他步驟與實施例i相同，制備成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯
復合納米粒子。 所制備的產(chǎn)物用透射電子顯微鏡進行觀測，觀測結(jié)果見表1 ;采用傅里葉變換紅 外光譜儀進行了表征，紅外光譜圖見圖5。 表1 N_(2-羧乙基)吡咯單體用量對吡咯/N_(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子粒
徑的影響
吡咯單體與N-(2-幾乙基)吡咯單體摩爾比1 : 0. 1251 : 0. 1671 : 0. 251 : 0. 333i : o. 5i : i
吡咯/N-(2-幾乙基)吡咯復合納米粒子粒徑(nm)20010050404080 由表1可知，吡咯單體與N_(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比對產(chǎn)物的粒徑影響較 大，妣咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比為1 : 0. 125時，妣咯/N-(2-羧乙基) 吡咯復合納米粒子的粒徑為200nm，摩爾比為1 : 0. 167時，吡咯/N_ (2-羧乙基)吡咯復合 納米粒子粒徑為100nm，隨著N-(2-羧乙基)吡咯單體量的加大，粒子粒徑逐漸減小，摩爾比 為l : 0.5時，吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的粒徑為40nm，呈類球形，且分散較 為均勻，摩爾比為1 : 1時，粒徑又增大為80nm。 在圖5中，曲線a、b、c、d、e、f分別是吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾
比為i : o. 125、i : o. 167、i : o. 25、i : o. 333、i : o. 5、i : i的紅外光譜曲線。由圖5
可見，曲線a和曲線b上1702處羧基峰不太明顯，隨著N- (2-羧乙基)吡咯單體量的加大，紅外光譜上1702cm—1峰的強度逐漸變強，吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比為 1 : 0.5、1 : l時，羧基峰較為明顯，證實了納米粒子上羧基的存在，適用于制備凝血酶電化 學發(fā)光探針。 由以上實驗數(shù)據(jù)可知，吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比為 1 : 0. 125 1時，所制備的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的粒徑均較小。本發(fā) 明選擇吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體的摩爾比為l : 0. 125 1，最佳選擇1 : 0.5。
為了驗證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人利用電化學發(fā)光分析系統(tǒng)對實施例6制備的 電極檢測凝血酶的效果進行了測試，各種試驗情況如下 實驗儀器MPI-E型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)，由西安瑞邁分析有限儀器公司生產(chǎn)。
實驗方法將本發(fā)明實施例6制備的電極作為工作電極，插入到2mL含物質(zhì)的量濃 度為0. lmol/L的正三丙胺的磷酸鹽緩沖溶液的電化學發(fā)光池中，以鉑電極為對極，以Ag/ AgCl(飽和KCl)為參比電極，在MPI-E電致化學發(fā)光分析儀上，采用計時電流法，在電位為 1. 35V時，對不同濃度的凝血酶進行電化學發(fā)光強度測試。 實驗結(jié)果表明，凝血酶的濃度為1.0X10—15 1.0X10—"mol/L時，凝血酶濃度的
對數(shù)和電化學發(fā)光強度呈線性相關(guān)，其線性回歸方程為
S = 722. 01 X lgC+10956 其中S是電化學發(fā)光強度，C是凝血酶的濃度，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9958，檢出限為 5. 0 X 10—16mol/L (S/N = 3)，低于已報道值6 X 10—"mol/L。 同時為了驗證凝血酶適體1、凝血酶適體II僅對凝血酶有特異性識別作用，分別 對1. 0 X 10—10mol/L牛血清白蛋白、1. 0 X 10—10mol/L血紅蛋白、1. 0 X 10—10mol/L免疫球蛋白 G、l. 0X10—"W)1/L溶菌酶、1. 0X10— 01/L的凝血酶和1. 0X10— 01/L的凝血酶與上述四 種同等濃度的蛋白混合成的混合溶液進行檢測，以不加凝血酶為空白，在相同條件下測定 電化學發(fā)光強度，平行測量三次，根據(jù)下述公式計算電化學發(fā)光強度增強值
檢測蛋白的發(fā)光強度平均值-空白的發(fā)光強度平均值
電化學發(fā)光強度增強值=

檢測凝血酶的發(fā)光強度平均值-空白的發(fā)光強度平均值 測試和計算結(jié)果見表2。
表2實施例6制備的電極檢測不同蛋白的電化學發(fā)光強度
xl00%
溶菌酶血紅蛋白牛血清蛋白免疫球蛋白G空白凝血酶混合溶液
發(fā)光強度 (a. u.)126±29136±35125±22139±21110±232342±1372333±240
發(fā)光強度增強值 (%)0. 721. 20. 671. 399. 6
9
由表2可見，使用牛血清白蛋白、血紅蛋白、免疫球蛋白G、溶菌酶進行實驗時，只 能檢測到與空白值相近的電化學發(fā)光信號，與凝血酶的電化學發(fā)光強度增強值相比，分別 增大0. 67% 、 1. 2% 、 1. 3% 、0. 72% 。這說明只有凝血酶存在時，才能構(gòu)建夾心結(jié)構(gòu)，檢測到 很強的電化學發(fā)光信號?；旌先芤簻y得的電化學發(fā)光強度與1.0X10—"mol/L凝血酶所得 的電化學發(fā)光強度無顯著差異，說明制備的凝血酶電化學發(fā)光探針用于檢測凝血酶具有良 好的選擇性。
權(quán)利要求
一種吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的制備方法，其特征在于它由下述步驟組成(1)預(yù)處理吡咯單體將市售吡咯在0.02MPa減壓蒸餾，收集70～80℃餾分，得到吡咯單體，充氮氣保護，避光保存于4℃冰箱內(nèi)，備用；(2)化學反應(yīng)將吡咯單體與N-(2-羧乙基)吡咯單體按摩爾比為1∶0.125～1加入到盛有正戊醇的錐形瓶中，震蕩溶解，再加入質(zhì)量濃度為86.8g/L的表面活性劑水溶液，充分攪拌30分鐘，緩慢加入氧化劑，吡咯單體與正戊醇、質(zhì)量濃度為86.8g/L的表面活性劑水溶液、氧化劑的體積比為1∶1.5～2.7∶80～160∶12～21.1，室溫攪拌反應(yīng)12小時，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液；上述的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉或苯磺酸鈉或十二烷基苯磺酸鈉；氧化劑為FeCl3·6H2O或(NH4)2S2O8；(3)分離在含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液中加入甲醇破乳，含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液與甲醇的體積比為1∶2，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘，沉淀物用甲醇洗滌2～3次，再用蒸餾水洗至蒸餾水為無色；(4)干燥洗滌后的沉淀物在真空度為0.01MPa的電熱恒溫真空干燥箱內(nèi)60℃干燥3～5小時，制備成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子。
2. 按照權(quán)利要求l所述的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的制備方法，其特征 在于在化學反應(yīng)步驟(2)中，將吡咯單體和N-(2-羧乙基)吡咯單體按摩爾比為1 : 0.5 加入到盛有正戊醇的錐形瓶中，震蕩溶解，再加入質(zhì)量濃度為86. 8g/L的表面活性劑水溶 液，充分攪拌30分鐘，緩慢加入氧化劑，吡咯單體與正戊醇、質(zhì)量濃度為86. 8g/L的表面活性劑水溶液、氧化劑的體積比為i : 2 : 120 : ie，室溫攪拌12小時，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的混合液。
3. 權(quán)利要求l所述的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子在制備凝血酶電化學發(fā) 光探針中的用途。
全文摘要
一種吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子的制備方法，由預(yù)處理吡咯單體、化學反應(yīng)、分離、干燥步驟組成，具有操作簡便、所制備的產(chǎn)物為納米級且粒度均勻的優(yōu)點。本發(fā)明制備的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子，具有較高的比表面積和較多的羧基官能團，增大了氨基釕聯(lián)吡啶衍生物的負載量，使電化學發(fā)光信號增強。采用吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯復合納米粒子制備凝血酶電化學發(fā)光探針，可用于檢測凝血酶，具有良好的選擇性、靈敏度及檢出限，可在醫(yī)學痕量檢測儀器上使用。
文檔編號G01N21/76GK101787125SQ201010101108
公開日2010年7月28日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者孫波, 張成孝, 漆紅蘭, 賈麗娟 申請人:陜西師范大學