專利名稱：柯薩奇病毒a16型核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒(Enterovirus，EV)引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見(jiàn)的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(Coxsackieviruses 16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)最為常見(jiàn)。
腸道病毒感染的特異性診斷方法有三種，即病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)。病毒的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，繁雜費(fèi)時(shí)，無(wú)法滿足病毒流行期間同時(shí)處理大量樣本的需要。分子生物學(xué)的進(jìn)展開(kāi)拓了腸道病毒的快速診斷技術(shù)，特別是PCR技術(shù)，由于其檢測(cè)材料用量少、快速、靈敏度高且具有很高的特異性，在病毒感染的診斷中發(fā)揮越來(lái)越多的重要作用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)已成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段。傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)需要兩步反應(yīng)，整個(gè)過(guò)程需要6-8小時(shí)，時(shí)間消耗大，不能滿足爆發(fā)時(shí)期的檢測(cè)需求；另外，該技術(shù)還存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在一段時(shí)間之后不可避免的出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)并具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是提供一種柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有 (1).PCR反應(yīng)酶，其中包括熱啟動(dòng)Taq酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑； (2).PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCR Buffer、柯薩奇病毒A16型正向引物、柯薩奇病毒A16型反向引物、柯薩奇病毒A16型探針； 柯薩奇病毒A16型正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示5’-CGCTGCCGATACTGAAGCACCG-3’， 柯薩奇病毒A16型反向引物序列如序列表中SEQID NO.2所示5’-CTGTCTCCGCGGCTTGTAG-3’， 柯薩奇病毒A16型探針序列如序列表中SEQID NO.3所示5’-CGACAGATTAGGCACTGGTGTTGTACCGTA-3’； (3).陰性質(zhì)控品，為DEPC處理水； (4).陽(yáng)性質(zhì)控品，為采用T7RNA聚合酶制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
所述探針5’端標(biāo)記JOE熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記ECLIPSE熒光淬滅基團(tuán)。
所述PCR反應(yīng)酶中各組分含量的配比為濃度為5U/μL的熱啟動(dòng)Taq酶用量0.25μL；濃度為200U/μL的MLV逆轉(zhuǎn)錄酶用量0.5μL；40U/μL的RNA酶抑制劑的用量0.25μL。
所述PCR反應(yīng)液中各組分含量的配比為DEPC處理水用量16μL；2.5mM dNTPs用量2μL；10×PCR Buffer用量2.5μL；10μM引物混合溶液用量1μL；10μM探針用量0.5μL。
本發(fā)明還提供一種利用上述試劑盒檢測(cè)柯薩奇病毒A16型核酸的檢測(cè)方法，包括下列步驟 (1)RNA提取采用商業(yè)化病毒RNA提取試劑盒如QIAamp Viral RNA Mini Kit提??； (2)PCR Mix配制及分裝按22μL∶1μL的比例，分別吸取PCR反應(yīng)液和PCR反應(yīng)酶，充分混勻，12,000rpm離心10s，配制成PCR Mix，取出PCR反應(yīng)管，給每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入23μL上述配制的PCR Mix； (3)加樣向上述PCR反應(yīng)管中分別加入提取的樣本RNA，陽(yáng)性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品2μL，12,000rpm離心10s； (4)PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器中，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類、樣本名稱及類型，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 42℃5min； 95℃2min； 95℃10s，60℃30s；40個(gè)循環(huán)；在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值； (5)分析判斷Ct值小于等于35的為陽(yáng)性；Ct值大于37的為陰性；Ct值在35-37之間的為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)柯薩奇病毒A16型核酸序列的方法，具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。



圖1是實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖； 圖2是實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有PCR反應(yīng)酶，其中包括熱啟動(dòng)Taq酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑；PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCR Buffer、柯薩奇病毒A16型正向引物、柯薩奇病毒A16型反向引物、柯薩奇病毒A16型探針；陰性質(zhì)控品，為DEPC處理水；陽(yáng)性質(zhì)控品，為采用T7RNA聚合酶制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
試劑盒的制造 1.試劑 本試劑盒制造過(guò)程中所用的試劑主要購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)， 其余購(gòu)自普洛麥格公司、北京全式金生物技術(shù)有限公司、北京化工廠。
2.PCR反應(yīng)液制備 (1)引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 從Genbank上下載國(guó)內(nèi)不同年份和地區(qū)的CA16全基因組序列，通過(guò)生物學(xué)軟件AlignX進(jìn)行多序列比對(duì)，在VP1基因區(qū)選擇一段保守序列，依據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，采用Primer Express軟件設(shè)計(jì)CA16特異性引物及探針。設(shè)計(jì)結(jié)果如下表所示
表中Fforward，正向；CA16-F表示柯薩奇病毒A16型正向引物。
Rreverse，反向；CA16-R表示柯薩奇病毒A16型反向引物。
Pprobe，探針；CA16-P表示柯薩奇病毒A16型探針。
JOE熒光報(bào)告基團(tuán)。
ECLIPSE熒光淬滅基團(tuán)。
按照上表的設(shè)計(jì)結(jié)果，分別委托Invitrogen和Takara公司分別合成引物和探針。
(2)引物及探針的溶解取凍存的CA16的引物(CA16-F和CA16-R)、探針(CA16-P)干粉管，12,000rpm離心2min，按照引物探針說(shuō)明書加入TE Buffer將干粉溶解，使探針濃度為10μM，兩種引物濃度各為20μM，等量取兩種引物溶液到1.5mL EP管中混合，配制成10μM引物混合溶液，振蕩混勻離心，備用； (3)PCR反應(yīng)液配制 按下述比例DEPC處理水16μL∶2.5mM dNTPs 2μL∶10×PCR Buffer2.5μL∶10μM引物混合溶液1μL和10μM探針0.5μL，配制成PCR反應(yīng)液。
3.PCR反應(yīng)酶制備 按濃度為5U/μL的熱啟動(dòng)Taq酶0.25μL、濃度為200U/μL的MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL和40U/μL的RNA酶抑制劑的0.25μL的比例，混合制備PCR反應(yīng)酶。
4.陰性質(zhì)控品制備 陰性質(zhì)控品的作用是用來(lái)防止因污染而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本發(fā)明采用DEPC處理水作為陰性質(zhì)控品，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。
5.陽(yáng)性質(zhì)控品制備 陽(yáng)性質(zhì)控品的作用是監(jiān)控試劑是否失效及性能是否下降。本發(fā)明采用科薩奇病毒A16型體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為陽(yáng)性質(zhì)控品。按照本技術(shù)領(lǐng)域中常用的分子克隆技術(shù)，其制備方法如下 (1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和提取首先在CA16-F、CA16-R的外側(cè)設(shè)計(jì)以下引物對(duì)柯薩奇病毒A16型陽(yáng)性菌株的基因組DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增 上游引物如序列表中SEQ ID NO5所示TTGCAGACATGATTGACCAG 下游引物如序列表中SEQ ID NO6所示GAGTGATGGTTCAACACACA 然后采用博邁德《多功能DNA純化回收試劑盒》回收PCR產(chǎn)物作為目的片段；采用全式金公司的pEAZY-T3 Cloning Vector試劑盒，將上述目的片段插入含有T7啟動(dòng)子的載體pEAZY-T3中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌；該陽(yáng)性克隆菌經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用博邁德《高純度質(zhì)粒提取試劑盒》提取培養(yǎng)菌液中的質(zhì)粒并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
(2)體外轉(zhuǎn)錄RNA質(zhì)控品的制備 用Takara公司的SAC I酶對(duì)上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切使其線性化后，采用Takara公司的T7RNA聚合酶對(duì)上述酶切反應(yīng)液進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液用Takara公司的DNase I進(jìn)行消化以除去其中的質(zhì)粒DNA，隨后采用全式金公司的TransZol提取該消化液中的RNA，此即體外轉(zhuǎn)錄RNA；采用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行定量后，將其稀釋到濃度為105拷貝/μL作為體外轉(zhuǎn)錄RNA質(zhì)控品。
重組質(zhì)粒中插入的柯薩奇A16型特異性目的片段序列如序列表中SEQ ID NO.4所示 TTGCAGACATGATTGACCAGACCGTGAATAATCAAGTGAACCGCTCCTTA ACTGCATTGCAAGTATTACCTACCGCTGCCGATACTGAAGCACCGAGCGA CAGATTAGGCACTGGTGTTGTACCGTAACTACAAGCCGCGGAGACAGGGG CGTCGTCAAATGCTAGTGACAAGAATCTCATTGAGACTAGATGTGTGTTG AACCATCACTC 實(shí)施例1 用本發(fā)明的試劑盒在ABI 7300熒光定量PCR儀上檢測(cè)柯薩奇病毒A16型核酸的方法 (1)RNA提取采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取， (2)PCR Mix配制按22μL∶1μL的比例，分別吸取PCR反應(yīng)液和PCR反應(yīng)酶，充分混勻，12,000rpm離心10s，取出PCR反應(yīng)管，其中一個(gè)為陽(yáng)性質(zhì)控品反應(yīng)管，一個(gè)為陰性質(zhì)控品反應(yīng)管，其余為被測(cè)樣品反應(yīng)管，給每個(gè)反應(yīng)管中加入23μL上述配制的PCRMix； PCR Mix配制方法如下表所示
(3)加樣向3個(gè)反應(yīng)管中分別加入提取的樣本RNA 2μL，陽(yáng)性質(zhì)控品2μL及陰性質(zhì)控品2μL，混勻后12,000rpm離心10s； (4)PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀的反應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置未知標(biāo)本、陽(yáng)性質(zhì)控品品和陰性質(zhì)控品，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類，按下表設(shè)置反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


注報(bào)告基團(tuán)設(shè)為JOE，淬滅基團(tuán)設(shè)為none，Passive Reference設(shè)為none；在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值。
(5)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性質(zhì)控品質(zhì)控品陰性； 陽(yáng)性質(zhì)控品質(zhì)控品陽(yáng)性且Ct值小于35。
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。
(6)分析判斷Ct值小于等于35的為陽(yáng)性；Ct值大于37的為陰性；Ct值在35-37之間的為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。本發(fā)明實(shí)施例1的試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，Ct值為34.56。
本發(fā)明實(shí)施例所用的試劑及材料分別如下 (1)試劑 QIAamp Viral RNAMini Kit，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司； 柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明產(chǎn)品。
(2)材料 移液器槍頭0.2mL、0.5mL、1.5mL，購(gòu)自AXYGEN公司； PCR反應(yīng)管0.2mL薄壁八聯(lián)管，購(gòu)自AXYGEN公司。
(3)儀器 ABI 7300熒光定量PCR儀，購(gòu)自AB公司。
實(shí)施例2 用本發(fā)明的試劑盒按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)未知樣本，未知樣本來(lái)源于××醫(yī)院病人待測(cè)定的樣品，本發(fā)明實(shí)施例2的試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，Ct值為24.87。
以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的一種，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
CA16-1序列表_ST25.txt
SEQUENCE LISTING
<110>北京愛(ài)普益生物科技有限公司
<120>柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
<130>09SG1F0547
<160>6
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(22)
<400>1
cgctgccgat actgaagcac cg 22
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(19)
<400>2
ctgtctccgc ggcttgtag 19
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>探針
<222>(1)..(30)
<400>3
cgacagatta ggcactggtg ttgtaccgta30
<210>4
<211>211
<212>DNA
<213>病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(211)
<400>4
ttgcagacat gattgaccag accgtgaata atcaagtgaa ccgctcctta actgcattgc 60
aagtattacc taccgctgcc gatactgaag caccgagcga cagattaggc actggtgttg 120
taccgtaact acaagccgcg gagacagggg cgtcgtcaaa tgctagtgac aagaatctca 180
ttgagactag atgtgtgttg aaccatcact c 211
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<400>5
ttgcagacat gattgaccag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<400>6
gagtgatggt tcaacacaca 20
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于
該試劑盒含有
(1).PCR反應(yīng)酶，其中包括熱啟動(dòng)Taq酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑；
(2).PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCR Buffer、柯薩奇病毒A16型正向引物、柯薩奇病毒A16型反向引物、柯薩奇病毒A16型探針；
柯薩奇病毒A16型正向引物序列為5’-CGCTGCCGATACTGAAGCACCG-3’，
柯薩奇病毒A16型反向引物序列為5’-CTGTCTCCGCGGCTTGTAG-3’，
柯薩奇病毒A16型探針序列為5’-CGACAGATTAGGCACTGGTGTTGTACCGTA-3’；
(3).陰性質(zhì)控品，為DEPC處理水；
(4).陽(yáng)性質(zhì)控品，為采用T7RNA聚合酶制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述探針5’端標(biāo)記JOE熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記ECLIPSE熒光淬滅基團(tuán)。
3.一種利用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒檢測(cè)柯薩奇病毒A16型核酸的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下列步驟
(1)RNA提取采用商業(yè)化病毒RNA提取試劑盒提?。?br> (2)PCR Mix配制及分裝按22μL∶1μL的比例，分別吸取PCR反應(yīng)液和PCR反應(yīng)酶，充分混勻，12,000rpm離心10s，配制成PCR Mix，取出PCR反應(yīng)管，給每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入23μL上述配制的PCR Mix；
(3)加樣向上述PCR反應(yīng)管中分別加入提取的樣本RNA，陽(yáng)性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品2μL，12,000rpm離心10s；
(4)PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器中，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類、樣本名稱及類型，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
42℃5min；
95℃2min；
95℃10s，60℃30s；40個(gè)循環(huán)；在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值；
(5)分析判斷Ct值小于等于35的為陽(yáng)性；Ct值大于37的為陰性；Ct值在35-37之間的為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒含有PCR反應(yīng)酶，其中包括熱啟動(dòng)Taq酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑；PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCR Buffer、柯薩奇病毒A16型正向引物、柯薩奇病毒A16型反向引物、柯薩奇病毒A16型探針；柯薩奇病毒A16型正向引物序列為5’-CGCTGCCGATACTGAAGCACCG-3’，柯薩奇病毒A16型反向引物序列為5’-CTGTCTCCGCGGCTTGTAG-3’，柯薩奇病毒A16型探針序列為5’-CGACAGATTAGGCACTGGTGTTGTACCGTA-3’；陰性質(zhì)控品，為DEPC處理水；陽(yáng)性質(zhì)控品，為制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)柯薩奇病毒A16型核酸序列的方法，具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101713003SQ201010105089
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者周騁, 姚志建, 劉自誠(chéng), 逄鍵濤, 王維 申請(qǐng)人:北京愛(ài)普益生物科技有限公司