專利名稱：一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領域，涉及牛奶中殘留抗生素的檢測方法，特別是
涉及一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法。
背景技術(shù)：
工業(yè)化奶牛養(yǎng)殖中，經(jīng)常使用抗生素治療牛乳腺炎和其他乳牛疾病，這些抗生素 不可避免地會轉(zhuǎn)移到最初幾天的牛乳中。牛乳中殘留的抗生素會對乳制品品質(zhì)帶來嚴重的 影響。世界糧農(nóng)組織(FA0)、世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品法對牛奶中抗生素最高殘留限量都 有明確規(guī)定，歐盟亦對最大殘留量(MRL)作了詳細的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部2001年頒布實施了 《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標準》，對新鮮牛乳的衛(wèi)生指標明確了"抗生素不得檢出"。
青霉素，因其高效、低毒是目前獸醫(yī)學臨床上應用最受青睞的藥物之一。但青霉素 對乳酸菌的抑制作用與其他抗生素相比又是最強烈的，而且青霉素的熱穩(wěn)定性相當好，超 過任何一種其他常用抗生素，一般的加熱殺菌處理不能將其完全破壞。牛奶生產(chǎn)中，如果使 用含有青霉素殘留的生鮮乳生產(chǎn)巴氏消毒奶和超高溫滅菌奶，產(chǎn)品中仍會有相當量的青霉 素殘留；同時牛奶中青霉素殘留可能會導致人體的各種不良反應，人體對青霉素類抗生素 藥物的敏感性下降，增加病原菌對藥物的耐藥性。 青霉素的檢測至今都是該領域的技術(shù)難點，原因是青霉素的水溶液不穩(wěn)定，會產(chǎn) 生降解，且結(jié)構(gòu)中不含活性基團氨基。現(xiàn)有技術(shù)中，已應用的青霉素殘留技術(shù)有微生物檢 測法如TTC法，理化檢測方法包括色譜法，以及免疫分析法等。上述方法在檢測精密度等 方面各有所長，有的靈敏度低、選擇性差；有的操作過程步驟較為繁瑣，有的需購置昂貴儀 器，但大都存在檢測耗時長、成本高的缺點，給乳品加工企業(yè)造成諸多不便。中國發(fā)明專利 200910041985. 1(CN101633948)公開的"牛奶中P _內(nèi)酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法" 涉及的是一種以微生物為原理的檢測方法，與本發(fā)明有本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡便、成本低廉、檢測結(jié)果
準確的牛奶中青霉素殘留量的檢測方法。 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。 —種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，包括以下步驟 1、青霉素的降解及荷移復合物的形成配制青霉素鈉濃度O. 01 100mg/L的標準 工作無水乙醇液，用稀HC1調(diào)至pH 2±0. 5或4±0. 5，沸水浴10 30min使其降解，得到降 解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與濃度為1X10—3 10X10—3mol/L的苯醌 類物質(zhì)在常溫下反應5 10min，得到荷移復合物，備用； 2、測定波長的選擇將步驟1得到的青霉胺荷移復合物在紫外分光光度計下測 定紫外最大吸收波長，或是將得到的青霉烯酸荷移復合物在熒光分光光度計下測定熒光 的激發(fā)和發(fā)射光譜；其中，所述的紫外吸收或是熒光的激發(fā)發(fā)射波長的測定選擇范圍為200nm 600nm ; 3、針對不同的荷移復合物分別計算吸收光強度與荷移復合物的線性范圍、回收 率、標準偏差、檢測限和工作曲線； 4、樣品前處理將牛奶樣品與脫蛋白、脫脂肪沉淀劑混合均勻，在轉(zhuǎn)速800 3000r/min條件下離心分離3 10min，取上清液備用； 5、樣品測定取步驟4中的上清液，按照步驟1進行降解、荷移反應，得到相應的荷 移復合物，再按照步驟2的要求測定紫外最大吸收波長或熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜，計算該 荷移復合物的吸收度，代入步驟3所得的該類荷移復合物的工作曲線中即可求得牛奶中青 霉素的殘留量。 步驟(1)中以水、甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種作為反應介質(zhì)；所述的苯醌
類物質(zhì)為苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基對二次甲基苯醌中的一種。 步驟(4)中所述的脫蛋白、脫脂肪沉淀劑選自酸性乙腈(pH2)、三氯乙酸、鎢酸鈉、
醋酸鈉或醋酸鉛中的一種。其中，使用酸性乙腈或三氯乙酸時將其與牛奶等體積混合；使用
鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛時按牛奶重量的2 10%重量百分數(shù)混合。 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點 1、本發(fā)明解決了青霉素檢測的難點。由于青霉素本身紫外吸收很弱，無熒光，且
水溶液易降解，現(xiàn)有技術(shù)一直無法直接用紫外或熒光分光光度法測定牛奶中的青霉素殘留
量。本發(fā)明首創(chuàng)將青霉素降解后再與苯醌類物質(zhì)發(fā)生荷移反應，反應生成的青霉胺荷移復
合物具有強的紫外吸收能力，而青霉烯酸荷移復合物具有強的熒光吸收能力，從而一舉攻
克了這一技術(shù)難題，為乳品加工企業(yè)降低生產(chǎn)成本、減輕運作風險提供了保證； 2、檢測速度快，檢測范圍寬，靈敏度高，準確率高，選擇性好，全部操作過程可在
40min內(nèi)完成; 3、無需購置昂貴的抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機與紫外或熒光分光光度 計即可完成檢測； 4、操作方法簡單，對操作人員無特殊技術(shù)要求。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步地說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
實施例1 以下實施例中牛奶樣品均為牛奶生產(chǎn)企業(yè)收購的生鮮乳。 1、取100mL、0. 50mg/L青霉素鈉標準工作無水乙醇液于小燒杯中。用稀HC1調(diào)至 pH4，沸水浴10min，降解得到青霉烯酸。 2、取上述青霉素鈉降解物青霉烯酸3mL置于10mL比色管中，加入 3. 00mL5X10—3mol/L四氯苯醌無水乙醇溶液，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10min， 得到荷移復合物。 3、將上述荷移復合物溶液以323nm為激發(fā)波長，475nm為發(fā)射波長測定荷移反應 產(chǎn)物的熒光強度，同時做空白試驗。 4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟分別進行荷 移熒光測定，其線性回歸方程為A = 0. 04568C+0. 058，線性范圍0. 05mg/L-100mg/L，相關(guān)系
4數(shù)r = 0. 9990，回收率95% -103%，相對標準偏差2. 6% (n = 6)，檢測限0. 05mg/L。
5、加標準回收試驗，分別將100mL牛奶樣品、5g醋酸鈉與5mL、 10mL、20mL 0. 50mg/L青霉素鈉混合，在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進行，進行加標回收測定，平均回收率(n = 3)為91.4%。 6、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進行，測定熒光吸收強度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為12. 3mg/L。 該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例2 : 1、取100mL、0. 50mg/L青霉素鈉標準工作無水乙醇液于小燒杯中。用稀HC1調(diào)至pH2，沸水浴20min，降解得到青霉胺。 2、取上述青霉素鈉降解物青霉胺3mL置于10mL比色管中，加入5. OOmL1X10—3mol/L四氯苯醌無水乙醇溶液，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置5min，得到荷移復合物。 3、將上述荷移復合物溶液以400nm為紫外吸收波長測定荷移反應產(chǎn)物的紫外強度，同時做空白試驗。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進行荷移紫外測定，其線性回歸方程為A = 0. 03901C+0. 04821，線性范圍0. 5mg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0. 9991，回收率97% _101%，相對標準偏差2. 3% (n = 6)，檢測限0. 5mg/L。
5、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進行，測定紫外吸收強度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為3. 5mg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例3 :
1、同實例1。 2、取上述3mL的青霉素鈉降解物于10mL比色管中，加入3. OOmL 5X10—^01/L對苯醌丙酮溶液，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10min。 3、將上述溶液以335nm為激發(fā)波長，460nm為發(fā)射波長測定荷移反應產(chǎn)物的熒光強度，同時做空白試驗。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進行荷移熒光測定，，其線性回歸方程為A = 0. 06412C+0. 07634，線性范圍0. lmg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9992，回收率97% _103%，相對標準偏差2. 8% (n = 6)，檢測限0. lmg/L。
5、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進行，測定熒光吸收強度，帶入步驟3的回歸方程，求出青霉素濃度為4. lmg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例4 :
1、同實例1。 2、將實例2中的四氯苯醌無水乙醇溶液換成對苯醌丙酮溶液，其余相同。
3、將實例2中的紫外吸收波長換成320nm。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進行荷移紫外測定，其線性回歸方程為A = 0. 08124C+0. 0126，線性范圍0. 5mg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0. 9990，回收率95% _103%，相對標準偏差2. 5% (n = 6)，檢測限0. lmg/L。
5、取含青霉素抗生素的牛奶樣品20mL與三氯乙酸20mL在2500r/min條件下離心5min，取上清液5mL按步驟1、2、3進行，測定紫外吸收強度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為1. 4mg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
權(quán)利要求
一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，包括以下步驟(1)青霉素的降解及荷移復合物的形成配制青霉素鈉濃度0.01～100mg/L的標準工作無水乙醇液，用稀HCl調(diào)至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴10～30min使其降解，得到降解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與濃度為1×10-3～10×10-3mol/L的苯醌類物質(zhì)在常溫下反應5～10min，得到荷移復合物，備用；(2)測定波長的選擇將步驟1得到的青霉胺荷移復合物在紫外分光光度計下測定紫外最大吸收波長，或是將得到的青霉烯酸荷移復合物在熒光分光光度計下測定熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜；其中，所述的紫外吸收或是熒光的激發(fā)發(fā)射波長的測定選擇范圍為200nm～600nm；(3)針對不同的荷移復合物分別計算吸收光強度與荷移復合物的線性范圍、回收率、標準偏差、檢測限和工作曲線；(4)樣品前處理將牛奶樣品與脫蛋白、脫脂肪沉淀劑混合均勻，在轉(zhuǎn)速800～3000r/min條件下離心分離3～10min，取上清液備用；(5)樣品測定取步驟4中的上清液，按照步驟1進行降解、荷移反應，得到相應的荷移復合物，再按照步驟2的要求測定紫外最大吸收波長或熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜，計算該荷移復合物的吸收度，代入步驟3所得的該類荷移復合物的工作曲線中即可求得牛奶中青霉素的殘留量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于步驟(1)中，以水、甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種作為反應介質(zhì)；所述的苯醌類物質(zhì)為苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基對二次甲基苯醌中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于步驟(4)中所述的脫蛋白、脫脂肪沉淀劑選自酸性乙腈(pH2)、三氯乙酸、鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于當使用酸性乙腈或三氯乙酸時將其與牛奶等體積混合；使用鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛時按牛奶重量的 2 10%重量百分數(shù)混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法。配制青霉素鈉標準工作無水乙醇液，用稀HCl調(diào)至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴得到降解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與苯醌類物質(zhì)發(fā)生反應，得到荷移復合物，計算不同荷移復合物的工作曲線。檢測時以同樣的方法計算牛奶樣品的荷移復合物的吸收度，代入該類荷移復合物的工作曲線中即可求得牛奶中青霉素的殘留量。本發(fā)明率先實現(xiàn)了直接用紫外或熒光分光光度法測定牛奶中的青霉素殘留量。該方法檢測速度快，檢測范圍寬，靈敏度高，準確率高，選擇性好，無需購置昂貴的抗生素檢測儀器，操作方法簡單，為乳品加工企業(yè)降低生產(chǎn)成本、減輕運作風險提供了保證，具有良好的應用前景。
文檔編號G01N21/64GK101776591SQ20101010937
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者楊亞玲, 耿衛(wèi)東 申請人:云南健牛生物科技有限公司