專利名稱：發(fā)酵乳酸桿菌的熒光定量pcr快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵乳酸桿菌(LactcAacillus fermentum)的熒光定量PCR快速檢測方法。
背景技術(shù)：
酸性罐頭食品(pH 4.5以下)，在其中存活的微生物多為耐酸、抗熱性極強(qiáng)的桿菌、球菌等，它們的存在通常會(huì)引起罐頭的腐敗。由于酸性罐頭食品提供的酸性環(huán)境，其中通常是以喜歡酸性環(huán)境的乳酸菌為優(yōu)勢菌群，發(fā)酵乳酸桿菌是其中的一種。發(fā)酵乳酸桿菌目前常用的檢測方法是厭氧平板培養(yǎng)法，待生長出菌落后用肉眼觀察挑選可疑菌落，然后進(jìn)行革蘭氏染色和生化鑒定。發(fā)酵乳酸桿菌營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)特性比較特殊，而且傳統(tǒng)平板培養(yǎng)生長緩慢，分離培養(yǎng)鑒定周期約需7 9d，因此建立快速檢測和鑒定發(fā)酵乳酸桿菌的檢驗(yàn)方法勢在必行。熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種核酸定量技術(shù)。該技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中引入了熒光標(biāo)記的探針，具有高靈敏性、特異性和精確性的特點(diǎn)。熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，有效解決了 PCR污染和對模板定量不準(zhǔn)確的問題。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食源性微生物檢測領(lǐng)域。然而，迄今國內(nèi)還未見有利于熒光定量PCR方法快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，提供一種檢測速度快、靈敏度高的快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的熒光定量PCR方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的方法，其特征在于有如下步驟首先提取待測樣品分離瓊脂平板上可疑菌落純培養(yǎng)的基因組DNA并稀釋備用。然后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25 μ 1，包括提取的基因組 DNA，2y 1 ； 10 X PCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+ 1. 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物、探針各IOpmol ；最后加(MH2O至25 μ 1 ；設(shè)置熒光定量PCR儀的程序參數(shù)為37°C 2min ；95°C預(yù)變性30s，95°C變性5s，60°C退火40s，同時(shí)收集 FAM熒光，40個(gè)循環(huán)；4°C保存。其中發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物為L. fermenF-1 :5，-CGTCGTTGACGAATACATCC-3，；L. fermenR-2 :5，-TCGATACGACCAGAAGCAAC-3，。特異性探針為L. fermenF-3 5’ -FAM-CAAGCCATTCATGATGCCTGTCG-3 ’。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，發(fā)酵乳酸桿菌能形成典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值 < 35。本發(fā)明提供了擴(kuò)增發(fā)酵乳酸桿菌的特異引物L(fēng). fermenF-1、L. fermenR-2和探針L. fermenF-3，從而提供一種快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的方法，同現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)占.1.檢測速度快，直接利用分離瓊脂平板上可疑菌落純培養(yǎng)的基因組DNA進(jìn)行檢測，省去了革蘭氏染色和生化鑒定步驟，而生化鑒定一般需要M 72h。2.成本低，由于省略了革蘭氏染色和生化鑒定步驟，節(jié)省了革蘭氏染色和生化試劑的費(fèi)用，降低了檢測成本。3.靈敏度高，由于該技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中引入了熒光標(biāo)記的探針，提高了檢測的靈敏度。
具體實(shí)施例方式首先無菌操作取25g待測樣品，充分剪碎，加入盛有225ml滅菌生理鹽水的滅菌容器內(nèi)，進(jìn)行10倍系列稀釋后，選擇2個(gè) 3個(gè)適當(dāng)稀釋度，各以0. ImL涂布到MRS瓊脂平板上，36°C 士 1°C，兼性厭氧條件下培養(yǎng)48h。挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種于MRS瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng)，36°C 士 1 °C，兼性厭氧條件下培養(yǎng)48h，提取基因組DNA并稀釋備用。然后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25 μ 1，包括提取的基因組 DNA，2y 1 ； 10 X PCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+ 1. 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物、探針各IOpmol ；最后加(MH2O至25 μ 1 ；設(shè)置熒光定量PCR儀的程序參數(shù)為37°C 2min ；95°C預(yù)變性30s，95°C變性5s，60°C退火40s，同時(shí)收集 FAM熒光，40個(gè)循環(huán)；4°C保存。其中發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物為L. fermenF-1 :5，-CGTCGTTGACGAATACATCC-3，；
L. fermenR-2 5’ -TCGATACGACCAGAAGCAAC-3 ’。特異性探針為L. fermenF-3 :5’ -FAM-CAAGCCATTCATGATGCCTGTCG-3’熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，發(fā)酵乳酸桿菌能形成典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值 < 35。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的熒光定量PCR方法，其特征在于首先提取待測樣品分離瓊脂平板上可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用發(fā)酵乳酸桿菌基因組保守性DNA 序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針；然后使用該引物和探針對待測樣品分離瓊脂平板上可疑菌落的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和檢測，其中所述的發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物為L. fermenF-1 :5’ -CGTCGTTGACGAATACATCC-3，；L. fermenR-2 :5’ -TCGATACGACCAGAAGCAAC-3，。特異性探針為L. fermenF-3 :5’ -FAM-CAAGCCATTCATGATGCCTGTCG-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的熒光定量PCR方法，其加樣參數(shù)為每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25 μ 1，包括提取的基因組DNA，2 μ 1 ； 10XPCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+L 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；UNG 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物、 探針各IOpmol ；最后加ddH20至25 μ 1 ；設(shè)置熒光定量PCR儀的程序參數(shù)為37°C ^iin ；95°C 預(yù)變性30s，95°C變性5s，60°C退火40s，同時(shí)收集FAM熒光，40個(gè)循環(huán)；4°C保存。
全文摘要
一種快速檢測發(fā)酵乳酸桿菌的熒光定量PCR方法。首先提取待測樣品分離瓊脂平板上可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用發(fā)酵乳酸桿菌基因組保守性DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對待測樣品分離瓊脂平板上可疑菌落的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和檢測。其加樣參數(shù)為每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括提取的基因組DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；UNG酶1u；dNTP 0.1mmol/L；發(fā)酵乳酸桿菌特異性引物、探針各10pmol；最后加ddH2O至25μl；設(shè)置熒光定量PCR儀的程序參數(shù)為37℃2min；95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火40s，同時(shí)收集FAM熒光，40個(gè)循環(huán)；4℃保存。具有檢測速度快、靈敏度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/64GK102304560SQ20101011023
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者劉云國, 姜英輝, 房保海, 李正義, 賈俊濤, 趙麗青, 雷質(zhì)文 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心