專利名稱：：一種克倫特羅檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種檢測尿液、動物組織(肌肉、心臟、肝臟)、血清、飼料等中的克倫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒和其使用方法。
背景技術(shù)：
：克倫特羅(Clenbuterol，CLE)，俗稱"瘦肉精"，化學(xué)名為"2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽"，藥品名為"克喘素"是一種P-興奮劑。因其能改善脂肪型動物的肉與脂肪的比例，并能加速動物生長，而被廣泛添加于動物飼料中，并且可以殘留在動物的體內(nèi)。經(jīng)大量實驗結(jié)果證實，克倫特羅的毒性并不很強，但因其半衰期長，在體內(nèi)代謝慢等原因，人體對其的耐受量非常小，治療用藥時也都十分慎重，用量過大或無病用藥則會導(dǎo)致肌肉震顫、心悸、戰(zhàn)栗、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀。由于這種藥物對人有嚴(yán)重的副作用，輕則導(dǎo)致心跳及心率不正常，重則可引發(fā)心臟病。目前，我國已禁止其使用。而在生產(chǎn)上，一些不法生產(chǎn)者在育肥豬(6070Kg以上)飼料中添加，連用至宰前。由于克倫特羅飼用濃度是治療用量的IO倍以上，停藥期短(如果停藥造成受體調(diào)節(jié)減弱，脂肪在皮下和內(nèi)臟補償性蓄積，瘦肉率下降)，更重要的是它的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此在肝、肺等動物內(nèi)臟器官殘留量很大。另外，克倫特羅能耐受IO(TC高溫，經(jīng)126t:油煎5min才會破壞減半，常規(guī)烹調(diào)對肉食品中克倫特羅殘留起不到破壞作用，因而人類食用后會發(fā)生中毒。早在上世紀(jì)80年代就有學(xué)者開始對于克倫特羅的定量檢測和分析研究，上述分析技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)20余年。通常，檢測克倫特羅的主要方法有分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等。這些方法由于儀器設(shè)備復(fù)雜、檢測時間長、過程繁瑣、檢測費用昂貴等原因，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。1993年Boyd等人(D.Boyd，P.Shearan.J.P.HopkinsandM.0'Keeffe.Applicationofmatrixsolidphasedispersionforthedeterminationofclenbuterolinliversamples[J]，AnalyticaChimicaActa,1993，27(5):221-226.)應(yīng)用基質(zhì)固相分散法與放免法結(jié)合對肝臟中克倫特羅殘留作了檢測。檢測中用^標(biāo)記克倫特羅，檢測限達0.5ng/g，回收率大于70%，上述方法的應(yīng)用開創(chuàng)了免疫檢測分析克倫特羅殘留的先河。放免法檢測克倫特羅殘留具有很好的特異性和高度靈敏度。但由于對條件要求比較苛刻且放射性同位素對工作人員有一定傷害，因而限制了該法的廣泛應(yīng)用。隨后發(fā)展起來的熒光免疫分析法(FIA)同放免法相比，克服了放免法中的核輻身寸缺點。Bacigalupo等(M.A.Bacigalupo，A丄us，G.MeroniDovisandEPetruzzlli.Comparisonoftime—resolvedfluroimm皿oassayandimmm皿oenzymometricassayforclenbuterol[J].Analyst,1995，120(8):2269-2271.)利用單抗技術(shù)與熒免分析技術(shù)檢測了克倫特羅在牛尿中的殘留，檢測線性范圍10105pg，檢測限10pg。與色譜法相比，熒光免疫法檢測克倫特羅殘留具有特異性高，穩(wěn)定性好，對樣品處理要求比較簡單及一次可檢測多個樣品等優(yōu)點。缺點是對溫度的強烈依賴性和熒光強度取決于激發(fā)波長。3標(biāo)記免疫分析技術(shù)是"邁向21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)"之一，其發(fā)展趨勢是新標(biāo)記物的發(fā)展與聯(lián)合應(yīng)用、單克隆以及基因工程抗體的應(yīng)用及免疫放大技術(shù)，可明顯提高檢測特異性，敏感度可達z印to(10—2°)、yocto(10—24)水平，即可實現(xiàn)分子水平的檢測。目前，檢測克倫特羅較高效的免疫分析技術(shù)是ELISA技術(shù)。McCo皿ell等人(McCo皿ellRI，McCormickA，LamontJV，etal.Developmentofanimm皿oaffinitycolumnandanenzymeimmunoassayforthescreeningofclenbuterolinmeatsamplesandthepracticalapplicationofthistestinthescreeningof1005samples[J]FoodAgriImmunol,1994，6:147-153.)在1994年米用ELISA方法對1005份包括肝臟、腎臟、肌肉在內(nèi)的組織樣品進行了篩選實驗。由于組織試樣的前處理采用了IAC分離技術(shù)，因此假陽性率極低。經(jīng)過復(fù)核測定，僅有4份假陽性，假陽性率為0.4%。其中檢出的陰性樣品有982份，陽性樣品23份。1998年陳繼明等(陳繼明，龔曉明，陸承平.兔異源蛋白與自身蛋白作為載體制備克倫特羅抗血清南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，21(3):81-88.)用ELISA方法檢測了飼料、尿樣與臟器中克倫特羅含量，檢測范圍為15.6iig/mL1.90ng/mL;回收率多在85X。上述檢測結(jié)果有較好的穩(wěn)定性和較高的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，與用HPLC檢測結(jié)果大體一致。目前，作為商品化的檢測試劑盒來講，英國的Randox公司和德國的r-biopharm公司均率先開發(fā)出了檢測肉品、飼料中克倫特羅殘留的ELISA試劑盒。中國在應(yīng)用ELISA檢測克倫特羅方面的研究起步相對國外稍晚些，但近幾年取得了明顯的進展。目前國內(nèi)企業(yè)和研究單位已經(jīng)開發(fā)成功自主知識產(chǎn)權(quán)的克倫特羅ELISA檢測試劑盒，并在近期通過了農(nóng)業(yè)部獸藥殘留試劑盒的備案審核。早在2002年葉妮等(葉妮，閆小峰.國內(nèi)外克倫特羅ELISA檢測試劑盒評價中國獸藥雜志，2002，36(10):25-28.)對中國獸藥監(jiān)察所研制的試劑盒及國外快速檢測試劑盒進行了測試，結(jié)果表明該試劑盒與德國r-biopharm公司生產(chǎn)的CLEELISA檢測試劑盒有相當(dāng)?shù)目杀刃?，且檢測水平相當(dāng)。上述多種檢測克倫特羅的方法中，色譜、質(zhì)譜等方法的檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、常常作為高端實驗室確證手段。但是，實驗室確診不能完全取代快速、便捷、高效的現(xiàn)場檢測和大樣本量、高通量的篩選。根據(jù)我國目前已經(jīng)形成了一套獸藥殘留的監(jiān)控檢測技術(shù)，對于克倫特羅的監(jiān)控過程包括了ELISA篩選，HPLC或GC-MS、HPLC-MS定量，GC-MS或HPLC-MS/MS確證。由此可見，ELISA作為一種準(zhǔn)確、靈敏性、高性價比的檢測方法，是食品安全監(jiān)測、獸藥殘留監(jiān)測領(lǐng)域?qū)?瘦肉精"進行高通量篩選的理想方法。本發(fā)明通過特有的免疫方案免疫動物制備具有高親和力、高特異性的抗體克倫特羅抗體，并采用酶標(biāo)記抗原，建立一種可以檢測克倫特羅的高特異性、高親和力、靈敏快速的直接競爭ELISA檢測方法。相比其他產(chǎn)品，本方法具有操作更簡便、時間更短、特異性更高等特點。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人進行了廣泛深入的研究，并因此完成本發(fā)明。本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來進行的。首先在微孔板上包被克倫特羅特異性抗體，然后加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測樣品，再加入酶標(biāo)抗原，溫4育后，用洗滌液洗板后分別加入底物液A和底物液B，顯色后，加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長讀取吸光值，然后通過提供的軟件對結(jié)果進行計算分析。在整個反應(yīng)完成后，樣品中克倫特羅含量越多，反應(yīng)呈色就越淺；反之，樣品中克倫特羅含量越少，則呈色越深?！矫妫景l(fā)明提供了一種快速、結(jié)構(gòu)簡單、使用簡便、價格便宜、靈敏度高及便于攜帶的用于檢測克倫特羅的試劑盒。本發(fā)明的克倫特羅檢測試劑盒包括以下物質(zhì)(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)清洗緩沖液；(4)濃縮酶標(biāo)記物；(5)底物溶液A;(6)底物溶液B;(7)反應(yīng)終止液；(8)酶標(biāo)稀釋液，其中，將克倫特羅進行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進行偶氮連結(jié)，形成克倫特羅-BSA，作為制備多克隆抗體的免疫抗原，并且用該免疫抗原制備的多克隆抗體包被微量測試孔，以及在酶標(biāo)記物的制備中，將小分子克倫特羅先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進行偶氮連接形成酶標(biāo)抗原克倫特羅-HRP。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，在包被了克倫特羅抗體的微量測試孔的制備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1iig/mL，包被體積為100iiL，37t:放置2小時后置于4t:靜置過夜。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，清洗緩沖液可為含有吐溫20的PBS，優(yōu)選為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，濃縮酶標(biāo)記物(酶標(biāo)抗原)的濃度可為0.3lig/mL_l.0lig/mL。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，底物液A液可為用一定濃度的檸檬酸緩沖液，調(diào)pH值至4.5-5.O，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，底物溶液B可為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞砜和水。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，反應(yīng)終止液可為10%_15%的硫酸溶液。本發(fā)明所述的克倫特羅檢測試劑盒中，酶標(biāo)稀釋液可為0.05mol/L的PBS溶液。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了一種檢測克倫特羅的試劑盒，該試劑盒包括以下各項5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>另一方面，本發(fā)明提供了使用所述試劑盒檢測克倫特羅的方法，該方法包括1、檢測樣品的制備；2、使用本發(fā)明的試劑盒檢測克倫特羅；禾口3、分析檢測結(jié)果。其中，使用本發(fā)明的試劑盒檢測克倫特羅的方法包括向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競爭反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25。C下溫育10min顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長讀數(shù)。計算方法(1)計算B/B。值，用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B。)再乘以100%。(2)以B/B。值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線。(3)根據(jù)每個樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。(4)有些樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定再要乘以其稀釋倍數(shù)。本發(fā)明的克倫特羅檢測試劑盒，除可用于尿液檢測以外，同時著重于對血清樣本的檢測，使檢驗結(jié)果更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定；也可以對飼料、肌肉、組織等樣品進行檢測。該試劑盒簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到40分鐘，回收率為80%120%，靈敏度可達到0.05ppb，是各類飼料企業(yè)、屠宰企業(yè)及各級政府檢測機構(gòu)的理想產(chǎn)品。圖1為克倫特羅檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施例方式下文中，將通過實施例詳細(xì)描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明的范圍不僅僅限于實施例。實施例材料與儀器藥品和耗材藥物名稱生產(chǎn)廠家規(guī)格批號NaOH國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF20080125HCL國藥集團化學(xué)試劑有限公司AR080101NaN02國藥集團化學(xué)試劑有限公司AR080103牛血清白蛋白(BSA)SEEBIO公司OG2012A鹽酸克倫特羅Sigma公司HPLC067K0668完全福氏佐劑Sigma公司不完全福氏佐劑Sigma公司H2S04國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF20080128NaCL國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF20080104KCL國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF20080110KH2P04國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF20080106Na2HP0412H20國藥集團化學(xué)試劑有限公司ARF200711037<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例1主要材料的制備1、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備克倫特羅(以下簡稱CLE)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，lmL/瓶。制備過程如下參精確稱取CLE標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用蒸餾水溶解，定容至lOOmL，得到lOOppmCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液；參取1.OmL100卯m標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容至lOOmL，得到1.O卯mCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液；參用1.O卯mCLE標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稀釋成0.lppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7卯b、8.lppb(Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.Ing/mL)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、克倫特羅免疫抗原與酶標(biāo)抗原的制備參將CLE進行重氮化(段行信.實用精細(xì)有機合成手冊[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000)，再與BSA(Bovineserumalbumin,牛血清白蛋白BSA)蛋白進行偶氮連結(jié)，形成CLE-BSA，作為制備多抗的免疫抗原；參酶標(biāo)抗原CLE-HRP:將小分子CLE先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)進行偶氮連接。3、克倫特羅多抗的制備參CLE-BSA過柱(葡聚糖凝膠G25)純化，其中BSA含量有9mg/mL;參初次免疫用100-500iigCLE-BSA加入lmL福氏完全佐劑(Freund'sCompleteAdjuvant,FCA)，在家兔背部皮下注射10點每點0.lmL;參每隔4-6個星期用100-500iigCLE-BSA于福氏不完全佐劑(Freund'slncompleteAdjuvant,FIA)中，在肌肉皮下靜脈注射和腳趾皮下注射加強免疫5次，每次lmL;參佐劑和CLE-BSA按照1:1的比例混合乳化。每只兔子每次免疫用lmL乳化完的抗原，CLE-BSA含量100-500iig;分10個點打入，每個點0.lmL。參最后一次免疫直接用lmL生理鹽水稀釋100-500ygCLE-BSA，靜脈注射，10天后頸部靜脈取血，獲得抗血清。4、克倫特羅抗體的檢測9免疫時間免疫次數(shù)效價抑制(0.l卯b)抑制(lppb)2007年9月9日1i:io萬5%21%2007年10月1日21:40萬17%58%2007年10月22日3i:ioo萬24%79%2007年11月13日4i:400萬28%87%2007年12月4日5i:800萬32%94%2007年12月25日第五次免疫后測定為合格(用間接法測定效價達到檢測要求且通過直接競爭法測定靈敏度達到0.05ng/mL)可以取血。5、多克隆抗體的純化1)將上述經(jīng)測定達到要求的兔血經(jīng)4t:或室溫離心13000r/min(20000Xg)，30min，收集上清；2)取上清約20mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加40mL飽和硫酸氨溶液，于4。C沉淀30min以上或過夜，使蛋白充分沉淀；3)13000r/min，4。C離心10min，棄上清；4)用12mL生理鹽水溶解沉淀，同步驟(2)滴加8mL飽和硫酸銨溶液，4"C靜置lh;5)重復(fù)步驟3)離心，用13.3mL生理鹽水溶解沉淀；6)滴加6.6mL飽和硫酸氨溶液，4"靜置lh;7)重復(fù)步驟4)離心后所得沉淀物用少許鹽水溶解沉淀，并裝入透析袋；8)用大于20倍體積的PBS緩沖液于4。C透析，更換透析液數(shù)次，然后加入等體積甘油置-2(TC保存。9)多抗效價的測定采用間接ELISA法(EnzymeImmunoassays:FromConc印ttoProductDevelopment.S.S.DESP應(yīng)DE.ChapmanandHall，NewYork，1996.)測定多抗血清的效價。實施例2檢測方法的建立1、包板多抗及克倫特羅-HRP最佳濃度的選擇將上述制備的多抗做不同稀釋后，進行方陣滴定(EnzymeImmunoassays:FromConcepttoProductDevelopment.S.S.DESPHANDE.ChapmanandHal1，NewYork,1996.)，在用ELISA法測定一定濃度的克倫特羅中，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長時的吸光值在2.3-2.8時，即為兩個參數(shù)的最佳工作濃度。2、競爭ELISA法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品含量的測定在確定了最優(yōu)化的多抗包被濃度和CLE-HRP濃度的基礎(chǔ)上，用CLE標(biāo)準(zhǔn)品與CLE-HRP進行競爭ELISA。103、樣品提取方法的研究情況3.l待測物為尿液直接將尿液取50L進行測試，如有混濁請先離心取上清液進行分析。3.2待測物為血清抽取待驗動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取0.ImL血清，加入0.4mL樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)，渦旋1分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50yL進行分析。3.3待測物為肉類取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進行1:3(4倍)稀釋后，取50iiL進行分析。3.4.待測物為心、肝等器官取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)進行l(wèi):3(4倍)稀釋后，取50iiL進行分析。3.5.待測物為飼料取lg已磨碎的待測飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，取上清液100iiL，用樣品稀釋液(0.05moL/L的PBS)做10倍稀釋。取50yL進行分析。4、理化方法的比較與氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)比對報告。實施例3克倫特羅檢測試劑盒的制備1.微量測試孔的包被將上述經(jīng)硫酸銨法純化后的抗體用0.05moL/L、pH為9.6的碳酸緩沖液稀釋到濃度為0.1iig/mL-1.0iig/mL，每孔0.lmL加入96孔微孔板，37攝氏度孵育2小時后4攝氏度過夜。2.制備CLE-HRP采用重氮法將克倫特羅與辣根過氧化物酶按10:l摩爾比連接，4攝氏度過夜后對PBS充分透析。根據(jù)偶聯(lián)物的活性決定酶的工作濃度。實施例4克倫特羅檢測試劑盒的組建組建克倫特羅檢測試劑盒，使其包括以下組分(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔，每條8孔，每板12條；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL，每個濃度各1瓶；(3)20倍清洗緩沖液，含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS;(4)20倍濃縮酶標(biāo)記物，濃縮酶標(biāo)記物(酶標(biāo)抗原)的濃度為0.3iig/ml-l.0yg/ml;(5)底物溶液A，稱取NaAcH202.825g，檸檬酸1.725g，檸檬酸鈉？H202.95g，加蒸餾水溶解，用濃HAc調(diào)pH至4.50后加入0.1-1.OmL30%的H202，最后用250mL的容量11瓶定容即可；(6)底物溶液B，稱取TMB20-200mg，溶解于125mL的二甲亞砜中，再加入蒸餾水定容至250mL;(7)反應(yīng)終止液，用量筒量取濃硫酸150mL，在玻璃棒攪拌下緩慢加入850mL蒸餾水中；(8)酶標(biāo)稀釋液，為0.05mol/L的PBS溶液。實施例5檢測樣品的制備(樣品前處理)1.若待測物為尿液，直接將尿液取50L進行測試，如有混濁請先離心取上清液進行分析。2.若待測物為血清，則用以下方法進行處理(5倍稀釋)抽取待驗動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。取O.lmL血清，加入O.4mL稀釋液，渦旋l分鐘，混勻。離心10分鐘(3000rpm)，取上清液50iiL進行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，則可直接取lmL血清進行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。3.若待測物為肉類，則用以下方法進行處理(10倍稀釋)取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。靜置30分鐘，離心10分鐘(3000rpm)，上清液與稀釋液進行1:3(4倍)稀釋后，取50yL進行分析。*若需要0.05卯b的靈敏度，則可繼續(xù)取稀釋液3mL進行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。4.若待測物為心、肝等器官，則用以下方法進行處理(10倍稀釋、煮沸)取4g已均質(zhì)樣品置入離心管中，再加入6mL0.01NHC1，渦旋1分鐘。以80—10(TC水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(3000rpm)。上清液與稀釋液進行1:3(4倍)稀釋后，取50yL進行分析。*若需要0.05ppb的靈敏度，可繼續(xù)取稀釋液3mL進行管柱純化，詳細(xì)方法見下文管柱純化。5.若待測物為飼料，則用以下方法進行稀釋(50倍稀釋)取lg已磨碎的待測飼料加入5mL0.OlNHCl，震蕩混合1分鐘。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，取上清液100iiL，用稀釋液做10倍稀釋。取50iiL進行分析。管柱純化(C18，500mg3mL)若利用C-18管柱進行樣品純化，可提升敏感度至0.05卯b，方法如下1.以10mL甲醇洗滌管柱，流速3mL/分。2.再以10mL蒸餾水洗滌管柱，流速3mL/分。3.分析樣品進入管柱(血清加入lmL，肉類或內(nèi)臟均質(zhì)稀釋后的上清液加入3mL)。(注)4.以10mL蒸餾水洗管柱，流速3mL/分。5.利用減壓真空裝置干燥管柱10分鐘。6.以2mLCH3CN洗滌管柱，流速3mL/分。7.再利用減壓真空裝置干燥管柱10分鐘。8.以2mL甲醇流出樣品，流速3mL/分。9.以5(TC氮氣流吹干樣品后，加入稀釋液溶解樣品。(樣品若是血清，則加入lmL稀釋液，樣品若是肉類或是內(nèi)臟類，則加入300iiL稀釋液)。10.取100iiL進行分析。注:分析樣品進管柱之前必須先用1NNaOH調(diào)整到pH9.0~9.5間！實施例6使用本發(fā)明的試劑盒檢測克倫特羅的操作步驟檢測前使用本發(fā)明的試劑盒檢測克倫特羅的方法包括1、將標(biāo)準(zhǔn)品6瓶、待測樣品、20倍濃縮清洗緩沖液、酶標(biāo)記物、微孔測試板，置于室溫下，回溫5分鐘。2、清洗緩沖液的配制用蒸餾水將20倍清洗緩沖液以1:19的比例稀釋(即lmL濃縮液+19mL蒸餾水)，作為微孔板清洗液。3、酶標(biāo)記物配制利用酶標(biāo)稀釋液將20倍濃縮酶標(biāo)記物以1:19的比例稀釋(即0.lmL20倍濃縮酶標(biāo)記物+1.9mL酶標(biāo)稀釋液)，即完成原倍酶標(biāo)記物的配制。稀釋后的酶標(biāo)記物請盡快使用，若保存于-20°C，保存期可達1個月，若保存于4°C，請勿超過一個星期。5、將剩余的微孔條放回鋁箔袋中，以膠帶封好儲存于4°C。6、如要提高靈敏度可用酶標(biāo)稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋一倍后使用。檢領(lǐng)[J時1、于適當(dāng)微孔中分別加入50iiL標(biāo)準(zhǔn)溶液(O，O.l，O.3，0.9，2.7和8.l卯b)。2、在另外的微孔中加入50iiL已完成前處理的樣品溶液。3、再于每一微孔中另再加入100iiL已完全回溶的酶標(biāo)記物。4、輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育30分鐘。5、將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。7、將底物A和B液等比例稀釋，于每一微孔中加入混合好的底物溶液100iiL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。8、于室溫下避光靜置溫育15分鐘。9、于每一微孔中加入50iiL反應(yīng)終止液。10、用酶標(biāo)儀于波長450nm下判讀。實施例7判定1.計算B/B。值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B。)再乘以100%。2.以B/B。值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線。3.根據(jù)每個樣品的B/B。值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。4.有些樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。實驗實施例本試劑盒1至6號標(biāo)準(zhǔn)液為無色透明液體；酶標(biāo)記物為藍色帶有絮狀沉淀物液體；底物(A液)為粉紅色澄清透明液體，無沉淀和絮狀物；顯色劑(B)液為無色澄清透明液體，無沉淀和絮狀物，無藍色趨向性變化；反應(yīng)終止液為澄清透明液體，無沉淀和絮狀物。實驗實施例l靈敏度向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入0ng/mL克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競爭反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長讀數(shù)。上述制備的試劑盒的克倫特羅含量為Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液20次測定OD值為<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>平均值B。=EXi鰭(i=1n)標(biāo)準(zhǔn)差SD={[n□EX2-(EX)2]轔n□(n_l)]}1/2靈敏度LOD=B。-3SDB。=2.170SD=0.0106LOD=2.136代入曲線計算得靈敏度=0.Olng/mL本試劑盒靈敏度在0.05ng/mL以內(nèi)IC50=0.57ng/mL平行20孔測定零值標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收度值，計算測定結(jié)果的平均值(B)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。靈敏度LOD=(B0-3SD)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的濃度值。本試劑盒靈敏度為0.lppb以內(nèi)。實驗實施例2特異性上述制備的克倫特羅試劑盒的特異性通過對相應(yīng)的物質(zhì)進行交叉反應(yīng)性分析而得到。抗血清的抑制物分別用萊克多巴胺、沙丁胺醇等類似物，以類似物在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的實測濃度的回收率計算交叉反應(yīng)率。向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或者其他相關(guān)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，25t:競爭反應(yīng)20min后，用清洗緩沖液洗板3次后加入等體積混合的底物溶液A和B，25t:下溫育lOmin顯色，然后加入反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀選擇450nm波長讀數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)及交叉物五次平均OD值實測濃度ng/mL交叉反應(yīng)率02.23000.lng/mL1.7650.10.3ng/mL1.3840.314<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果顯示本試劑盒與克倫特羅類似物的交叉反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實驗實施例3精密度使用試劑盒批號為20080201，20080202，20080203分別用三個批次的試劑盒，進行相同的質(zhì)控樣品的檢測。其中質(zhì)控樣品1為lng/mL，質(zhì)控樣品2為2ng/mL，質(zhì)控樣品3為5ng/mL每份樣品做5次重復(fù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果顯示本試劑盒批內(nèi)CV<10%，批間CV<20%。體現(xiàn)了良好的精密度。實驗實施例4本發(fā)明的試劑盒與氣相色譜_質(zhì)譜法(GC核S)比對GC-MS法優(yōu)點是把色譜高效快速的分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。應(yīng)用氣相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS-MS)對牛、羊、豬組織中的CLE含量進行檢測，最低檢測限為O.5ng/g;用GC-MS法(El離子源)檢測豬尿中的CLE,檢測限為0.5ng/mL;本次使用GC-MS法檢測豬尿中的CLE含量與試劑盒經(jīng)行比對。進行30個豬尿盲樣進行領(lǐng)lj試。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從以上數(shù)據(jù)，可以看出克倫特羅含量在0.5ppb以上本試劑盒所測定的結(jié)果與GC-MS所測定的結(jié)果基本一致，0.5ppb以下時已經(jīng)超出了GC-MS的檢測下限，而本試劑盒仍然可以給出準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，本試劑盒完全可以取代GC-MS用于常規(guī)克倫特羅的檢測。實驗實施例5回收率在不同樣品中添加不同濃度的CLE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后采用本試劑盒提供的前處理方法和試劑進行檢測，回收率=實測濃度/添加濃度X100%<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實驗實施例6產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗1、使用有效期實驗使用本發(fā)明的試劑盒進行穩(wěn)定性試驗，28t:放置，分別于0、l、2、3月，及以后每3個月，測定6個標(biāo)準(zhǔn)點的OD值及計算陰性豬尿中添加lng、5ng克倫特羅的回收率，并計算IC5Q。(IO次重復(fù)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>B回收率尿樣品中大約90110%BIC50二0.54上述實驗結(jié)果說明，該試劑盒在一年內(nèi)不同月份檢測，標(biāo)準(zhǔn)點OD數(shù)值、標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)、樣品濃度、添加回收率均無顯著性變化。體現(xiàn)了該試劑盒在正確保存條件下，實驗數(shù)據(jù)良好的再現(xiàn)性。2、室溫放置實驗室溫放置本發(fā)明的試劑盒，室溫(25_28°C)放置，分別于15天、1個月、2個月后測定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次重復(fù)的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒在室溫(25-28°C)放置2個月內(nèi)實驗OD值及IC5。無顯著性變化。3、凍融實驗使用本發(fā)明的試劑盒進行凍融實驗，將試劑盒組份置-181:三天，解凍后測定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒組分經(jīng)凍融后0D值及IC50無顯著性變化。4、37攝氏度加速試驗使用本發(fā)明的試劑盒進行加速試驗，37t:放置，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天后測定各標(biāo)準(zhǔn)濃度的0D值(10次重復(fù)的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果顯示該試劑盒組分經(jīng)37攝氏度后0D值及IC50無顯著性變化。本發(fā)明的克倫特羅檢測試劑盒靈敏度已達到國外進口產(chǎn)品的水平，且交叉反應(yīng)低，反應(yīng)時間短，穩(wěn)定性好。權(quán)利要求一種克倫特羅檢測試劑盒，其包括(1)包被了克倫特羅抗體的微量測試孔；(2)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)清洗緩沖液；(4)濃縮酶標(biāo)記物；(5)底物溶液A；(6)底物溶液B；(7)反應(yīng)終止液；和(8)酶標(biāo)稀釋液，其中，將克倫特羅進行重氮化，再與牛血清白蛋白BSA進行偶氮連結(jié)，形成克倫特羅-BSA，作為制備多克隆抗體的免疫抗原，并且用該免疫抗原制備的多克隆抗體包被微量測試孔，以及在酶標(biāo)記物的制備中，將小分子克倫特羅先進行重氮化，再與辣根過氧化物酶HRP進行偶氮連接形成酶標(biāo)抗原克倫特羅-HRP。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分另U為0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述濃縮酶標(biāo)記物的濃度為0.3lig/mL_l.0lig/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述包被了克倫特羅抗體的微量測試孔的制備過程中，克倫特羅抗體包被濃度為0.1-1g/mL，包被體積為100L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述清洗緩沖液為含有千分之五的吐溫20的0.05moL/L的PBS。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述底物溶液A用一定濃度的檸檬酸緩沖液，調(diào)PH值至4.5-5.0，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得，而所述底物溶液B為8mg/mL-16mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，該溶液的溶劑為等體積混合的二甲亞砜和水。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的克倫特羅檢測試劑盒，其中，所述反應(yīng)終止液為10%-15%的硫酸溶液。8.—種檢測樣品中殘留的克倫特羅的方法，該方法包括以下步驟(1)檢測樣品的制備；(2)使用權(quán)利要求17中任一項所述的試劑盒檢測克倫特羅；禾口(3)分析檢測結(jié)果。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，向包被了克倫特羅抗體的微量測試孔中加入克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和酶標(biāo)克倫特羅溶液，競爭反應(yīng)后，用清洗緩沖液洗板后加入等體積混合的底物溶液A和B，顯色，然后加入反應(yīng)終止液終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，其中，所述酶標(biāo)克倫特羅溶液為用所述酶標(biāo)稀釋液稀釋濃縮酶標(biāo)記物得到的溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述樣品為尿液、血清、動物組織、器官或飼料。全文摘要本發(fā)明提供了一種克倫特羅檢測試劑盒，其包括包被了克倫特羅抗體的微量測試孔、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液、清洗緩沖液、濃縮酶標(biāo)記物、底物溶液A、底物溶液B、反應(yīng)終止液和酶標(biāo)稀釋液。本發(fā)明還公開了使用上述試劑盒檢測克倫特羅的方法，其包括以下步驟檢測樣品的制備；使用本發(fā)明的試劑盒檢測克倫特羅；和分析檢測結(jié)果。本發(fā)明的克倫特羅檢測試劑盒，除可用于尿液檢測以外，同時著重于對血清樣本的檢測，使檢驗結(jié)果更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定；也可以對飼料、肌肉、組織等樣品進行檢測。該試劑盒簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到40分鐘，回收率為80％～120％，靈敏度可達到0.05ppb。文檔編號G01N33/543GK101776684SQ20101011056公開日2010年7月14日申請日期2010年2月12日優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日發(fā)明者李康,肖理文,胡佳駿,董國秀,蔡曉帆,郭曉梅申請人:上海優(yōu)你生物科技股份有限公司