專利名稱：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法、抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體，特別是一種豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法、抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
近年來新出現(xiàn)的斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)是一種以發(fā)燒、漸進性消瘦、呼吸和消化系統(tǒng)紊亂為特征的豬病，目前多個國家和地區(qū)存在該病的流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2)被認為是PMWS的主要病原，此外其還與多種其他豬病有關(guān)，如豬呼吸道病綜合癥、豬皮炎腎病綜合癥等。
目前，國內(nèi)外許多學者已經(jīng)建立了多種診斷方法來檢測豬圓環(huán)病毒2型及其抗體，例如檢測病原的多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)、原位雜交方法、免疫組化方法等和檢測抗體的間接免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法等，但這些診斷方法有診斷周期長、成本高等局限性，不太適用于臨床診斷的快速、普及應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種可用于建立一種特異、敏感和快速的間接免疫熒光診斷方法來檢測豬圓環(huán)病毒II型的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的還在于提供一種由上述制備方法生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個目的還在于提供一種由上述方法制備的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的應(yīng)用。
本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體的制備方法，其步驟如下 (1)將凍存的PCV2復蘇后擴大培養(yǎng)，超速離心，收集沉淀，超聲波裂解，蛋白含量測定儀測定其質(zhì)量濃度，-70℃～80℃凍存?zhèn)溆茫? (2)取健康7～8周齡BALB/c小鼠數(shù)只，頸背部皮下多點注射免疫，其中抗原PCV2全病毒劑量為首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫間隔14天，三免14天后尾靜脈采血測抗體效價，選效價高數(shù)量級在107以上的小鼠在細胞融合前3天脾臟注射50μg加強免疫， (3)無菌摘取小鼠脾臟，制成脾細胞，按1∶5的體積比比例取脾細胞和骨髓瘤細胞混合，離心后，棄上清液；緩慢加入體積分數(shù)50％PEG 4000進行融合；用體積分數(shù)1％HAT培養(yǎng)液重懸融合細胞，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔105個細胞/100μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄細胞生長情況； (4)待96孔板中有融合細胞生長，且液體稍微變黃時，吸取培養(yǎng)液，用包被Cap蛋白的間接ELISA方法進行篩選，選擇強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克隆；經(jīng)幾次亞克隆后，即獲得穩(wěn)定分泌豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體且效價高的雜交瘤細胞。
所述的制備方法還包括將取10周齡健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL/只，7～14d后腹腔注射雜交瘤細胞0.5mL(含5×105～1×106個雜交瘤細胞)/只，待小鼠腹腔明顯增大時抽取腹水，去除油脂和沉淀后即為單抗腹水，-70℃～80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 將所獲得的雜交瘤細胞注入小鼠腹腔，可從其腹水中獲得大量該單克隆抗體。
所述的制備方法步驟1中的超離離心的轉(zhuǎn)速為55,000r·min-1離心4h。
所述的制備方法步驟1中還包括在離心后采用適量的PBS溶解。
通過上述方法制備獲得雜交瘤細胞，進而獲得豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體，可利用如下方法進行鑒定(1)利用間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的效價，(2)用單克隆抗體分型試劑盒進行分型鑒定，經(jīng)亞型鑒定表明抗體的免疫球蛋白均為IgM，(3)雜交瘤細胞的染色體分析將傳代2～3天的雜交瘤細胞取出，向細胞瓶內(nèi)加入含1/15mol/L秋水仙堿的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5h，使染色體停止在分裂中期，1,000r/min離心10min，收集細胞，用10mL 5g/L KCl溶液重懸，置37℃水浴低滲處理25min，加入1mL細胞固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)＝3∶1)預固定2min，1,000r/min離心10min，棄上清液，用新鮮固定液將細胞重懸，在4℃固定過夜，根據(jù)細胞壓積的多少留一定量的固定液將細胞懸浮，滴管吸取細胞懸液少許滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即吹散，火焰固定，用體積分數(shù)10％姬姆薩(Giemsa)染色液染色10min，洗去染液自然干燥，于顯微鏡下觀察計數(shù)，每株細胞計數(shù)10個細胞染色體數(shù)，計算平均值(4)間接免疫熒光特性分析PCV2感染96孔板上生長的PK15細胞，待細胞長成單層后棄上清液，用無水乙醇固定，PBS洗滌3次，分別將制備獲得的兩株單克隆抗體腹水按不同濃度加入96孔板中，37℃反應(yīng)60min，PBS洗3次，加入FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃反應(yīng)30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，將PBS作為陰性對照，小鼠陽性血清作為陽性對照。有綠色熒光者判為陽性，無熒光者判為陰性，(5)單克隆抗體的鑒定還包括其結(jié)合位點分析，用間接ELSIA疊加實驗分析單克隆抗體的結(jié)合位點。根據(jù)腹水單克隆抗體的效價，將腹水單克隆抗體分別稀釋至飽和時的工作濃度，在此濃度下各取50％兩兩混勻。分別測定腹水單克隆抗體混和后的及飽和濃度下的效價。計算加成指數(shù)AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％。式中A1、A2分別為2株不同單克隆抗體所測的效價，A1+2為兩兩混和抗體所測的效價。每組重復實驗3次，計算其平均值，AI值大于50％即認為兩種單克隆抗體識別不同的抗原表位。。
本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體為采用上述制備方法制備獲得的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明由上述方法制備的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體可應(yīng)用于建立間接免疫熒光診斷方法，其具體步驟為(1)制作病料切片，采取疑似PCV2病料，切取黃豆大小肺臟和淋巴結(jié)組織塊，放置于組織固著器上并冷凍，待組織塊冷凍后將其裝到切片機上，調(diào)整好位置后，切取0.1～0.3mm的組織薄片，將經(jīng)過冷乙醇浸泡過的玻片貼片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存?zhèn)溆茫? (2)間接免疫熒光診斷方法建立，取出制備好的病料切片，分別滴加PCV2小鼠陽性血清、豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min，共3次，然后滴加的不同濃度的羊抗鼠熒光二抗，同時以小鼠陽性血清為陽性對照，以PCV2的PCR陰性病料為陰性對照，以偽狂犬病毒(PRV)陽性而PCV2陰性的PCV2病料為實驗對象，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min次，共3次，滴加體積分數(shù)50％甘油蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察。分別將8-60和10-48作為一抗，檢測臨床上的20份PCV2病料，并將間接免疫熒光診斷結(jié)果與PCR結(jié)果做符合率比較。
綜上所述，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點 本發(fā)明采用超離全病毒免疫小鼠，通過間接ELISA方法篩選陽性克隆，獲得了針對PCV2-ORF2蛋白的單克隆抗體。表明使用全病毒蛋白作為免疫原，能避免原核或真核表達的蛋白失真。在采用間接ELISA法篩選雜交瘤細胞的過程中，使用以Cap蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法檢測，快速準確地檢測到特異性針對PCV2 Cap蛋白的單克隆抗體，并經(jīng)3次亞克隆后最終獲得能穩(wěn)定分泌抗PCV2-Cap蛋白單克隆抗體的細胞株。從雜交瘤細胞染色體核型、經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存后的生物學特性、以及單克隆抗體的亞類、效價及針對的抗原表位等方面，對所獲得的單克隆抗體生物學特性進行了系統(tǒng)鑒定，結(jié)果表明，所獲得的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強而且穩(wěn)定，單克隆抗體效價高，對應(yīng)同一個抗原表位，具有一定的應(yīng)用價值。間接免疫熒光試驗結(jié)果表明，所獲得的單克隆抗體均具有針對PCV2病毒天然Cap蛋白的結(jié)合表位，具有很強的特異性。說明所篩選單抗均具有良好的熒光特性，適宜作為熒光一抗來建立間接免疫熒光診斷方法，為PCV1和PCV2的鑒別診斷方法的研究提供了材料。本研究通過獲得的PCV2單克隆抗體為一抗，羊抗鼠熒光抗體為二抗，經(jīng)過條件優(yōu)化，初步建立了能檢測豬病料中PCV2病原的間接免疫熒光診斷方法，并檢測了來自福建省各個豬場的20份臨床疑似PCV2的豬病料，與診斷PCV2的PCR診斷方法比較，結(jié)果表明，2種診斷方法的診斷結(jié)果基本一致，這為PCV2引發(fā)的一系列疾病的預防和治療提供了幫助。



圖1是本發(fā)明實施例的8-60(A)和10-48(B)2株單克隆抗體細胞的染色體(1000×)圖 圖2是本發(fā)明實施例2株單克隆杭體對PCV2感染的PK15細胞涂片的間接免疫熒光試驗結(jié)果(10×40) 圖3是2株單克隆杭體對PCV2感染的豬病料的間接免疫熒光試驗結(jié)果(10×20) 圖2中的A.陰性對照；B.陽性對照；C.8-60；D.10-48 圖3中的A.小鼠陽性血清；B.8-60；C.10-48；D.PCR陰性病料；E.PRV病料
具體實施例方式 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述。
實施例1 一種豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體的制備方法 1.材料與方法 1.1菌株、細胞及試驗動物 PCV2分離株、PK15細胞系、骨髓瘤細胞SP2/0均由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所畜病室保存，BALB/c小鼠購自福建省中醫(yī)學院。
1.2主要試劑 HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG、熒光素(FITC)標記羊抗鼠IgG均購自Sigma公司。
1.3抗原的制備 將凍存的PCV2復蘇后擴大培養(yǎng)，55,000r·min-1離心4h，適量PBS溶解、收集沉淀，超聲波裂解，經(jīng)蛋白定量儀測定其質(zhì)量濃度為1.1mg/ml，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.4動物免疫 取健康8周齡BALB/c小鼠3只，頸背部皮下多點注射免疫，抗原(PCV2全病毒)劑量為首免100μg，二免100μg，三免180μg。免疫間隔14d，三免14d后尾靜脈采血測抗體效價，血清中PCV2抗體效價為109，選效價高的小鼠在細胞融合前3d脾臟注射50μg加強免疫。
1.5細胞融合 無菌摘取小鼠脾臟，制成脾細胞，按1∶5的體積比比例取脾細胞和骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，1000r/min離心10min后，棄上清液；緩慢加入體積分數(shù)50％PEG 4000進行融合；用體積分數(shù)1％(HAT∶DMEM)HAT培養(yǎng)液重懸融合細胞，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔105個細胞/100μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄細胞生長情況；注意補充體積分數(shù)1％HAT(HAT∶DMEM)培養(yǎng)液。(試驗中發(fā)現(xiàn)，將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)融合后3d即可見雜交瘤細胞生長，細胞融合率達到85％以上。) 1.6雜交瘤細胞的篩選和克隆 待96孔板中有融合細胞生長，且液體稍微變黃時，吸取培養(yǎng)液，用包被Cap蛋白的間接ELISA方法進行篩選，將其分別命名為10-48和8-60，選擇強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克?。?次亞克隆后，獲得了2株穩(wěn)定分泌抗體且效價高的細胞擴大培養(yǎng)并凍存。將其連續(xù)傳代2個月和經(jīng)過凍存復蘇后仍能保持分泌抗體的能力。
1.7單抗腹水的制備 取10周齡健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL/只，7～14d后腹腔注射雜交瘤細胞0.5mL(含5×105～1×106個雜交瘤細胞)/只，待小鼠腹腔明顯增大時抽取腹水，去除油脂和沉淀后即為單抗腹水，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.8 PCV2 Cap蛋白單克隆抗體的鑒定 1.8.1單克隆抗體的效價 利用間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液及小鼠腹水效價。
1.8.2單克隆抗體亞型鑒定 用Sigma單克隆抗體分型試劑盒進行分型鑒定。結(jié)果見表1 表1 8-60、10-48這2株單克隆抗體的效價及亞類
由表一可見，利用包被Cap蛋白的間接ELISA對所得的2株單克隆抗體進行檢測，小鼠腹水效價明顯高于細胞培養(yǎng)上清液效價，亞類鑒定結(jié)果表明，2株單克隆抗體的免疫球蛋白亞型均為IgM。
1.8.3單克隆抗體結(jié)合位點分析 用間接ELSIA疊加實驗分析單克隆抗體的結(jié)合位點。根據(jù)腹水單克隆抗體的效價，將2株腹水單克隆抗體分別稀釋至飽和時的工作濃度，在此濃度下各取50％兩兩混勻。分別測定2株腹水單克隆抗體混和后的及飽和濃度下的效價。計算加成指數(shù)AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％。式中A1、A2分別為2株不同單克隆抗體所測的效價，A1+2為兩兩混和抗體所測的效價。每組重復實驗3次，計算其平均值，AI值大于50％即認為兩種單克隆抗體識別不同的抗原表位。
表2 8-60、10-48這2株單克隆抗體結(jié)合位點的ELISA疊加的AI值 Table2 Results of additivity ELISA for two monoclonal antibody％
表2顯示，8-60與10-48之間反應(yīng)的AI值均小于10％，因此可以初步判定獲得的2株單克隆抗體具有同一個結(jié)合位點。
1.8.4 雜交瘤細胞的染色體分析 將傳代2～3d的雜交瘤細胞取出，向細胞瓶內(nèi)加入含1/15mol/L秋水仙堿的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5h，使染色體停止在分裂中期。1000r/min離心10min，收集細胞，用10mL 5g/L KCl溶液重懸。置37℃浴低滲處理25min，加入1mL細胞固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)＝3∶1)預固定2min，1000r/min離心10min，棄上清液，用新鮮固定液將細胞重懸，在4℃固定過夜。根據(jù)細胞壓積的多少留一定量的固定液將細胞懸浮，滴管吸取細胞懸液少許滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即吹散，火焰固定，用體積分數(shù)10％姬姆薩(Giemsa)染色液染色10min，洗去染液自然干燥，于顯微鏡下觀察計數(shù)。每株細胞計數(shù)10個細胞染色體數(shù)，計算平均值。
2株單克隆抗體細胞的染色體數(shù)均為98～105對，多數(shù)核型為端著絲點染色體，少數(shù)為核型為中間著絲點染色體(圖1) 1.8.5熒光特性分析 PCV2感染96孔板上生長的PK15細胞，待細胞長成單層后棄上清液，用無水乙醇固定，PBS洗滌3次，加入小鼠腹水(稀釋10倍)，37℃反應(yīng)60min，PBS洗3次，加入FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃反應(yīng)30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。將PBS作為陰性對照，小鼠血清作為陽性對照。有綠色熒光者判為陽性，無熒光者判為陰性。觀察發(fā)現(xiàn)，PCV2感染的陽性孔PK細胞及8-60和10-48孔中的PK細胞均呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，且熒光多聚集在PK15細胞的細胞質(zhì)中，而陰性孔PK細胞無明顯綠色熒光(圖2)，表明8-60和10-48均具有良好的熒光特性。
本實施例未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同。
實施例2 本實施例為由實施例1制備獲的豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體。
實施例3 由實施例1制備所得的豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體的應(yīng)用，其為 1制作病料切片 采取疑似PCV2病料，切取黃豆大小肺臟和淋巴結(jié)組織塊，放置于組織固著器上并冷凍，待組織塊冷凍后將其裝到切片機上，調(diào)整好位置后，切取0.1～0.3mm的組織薄片，將經(jīng)過冷乙醇浸泡過的玻片貼片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2間接免疫熒光診斷方法建立 取出制備好的病料切片，分別加PCV2小鼠陽性血清、8-60和10-48培養(yǎng)上清液單抗，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min，共3次，然后滴加的不同濃度(1∶30000、1∶20000、1∶10000)的羊抗鼠熒光二抗，同時以小鼠陽性血清為陽性對照，以PCV2的PCR陰性病料為陰性對照，以偽狂犬病毒(PRV)陽性而PCV2陰性的PCV2病料為實驗對象，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min次，共3次，滴加體積分數(shù)50％甘油蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察。分別將8-60和10-48作為一抗，檢測臨床上的20份PCV2病料，并將間接免疫熒光診斷結(jié)果與PCR結(jié)果做符合率比較。
建立的間接免疫熒光診斷方法與PCR診斷方法的比較見圖3顯示，對PCV2的PCR陽性病料，小鼠陽性血清以及PCV2單抗8-60和10-48的培養(yǎng)上清液作為一抗的病料熒光染色也很強；而PCR陰性病料的熒光染色呈陰性；偽狂犬病毒陽性，PCV2陰性的病料，其熒光染色也呈陰性(圖3)。此外，用單克隆抗體8-60和10-48分別作為一抗，檢測了臨床上的20份PCV2病料，與PCR結(jié)果的陽性符合率為93.75％，與PCR結(jié)果的陰性符合率為100％(表3)。
表32株單克隆抗體對PCV2感染豬病料間接免疫熒光診斷與PCR診斷符合率的比較 Table3 Result of accordant rate between IFA and PCR
本實施例未述部分與現(xiàn)有技術(shù)相同。
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法，其步驟如下
(1)將凍存的PCV2復蘇后擴大培養(yǎng)，超速離心，收集沉淀，超聲波裂解，蛋白含量測定儀測定其質(zhì)量濃度，-70～80℃凍存?zhèn)溆茫?br> (2)取健康7～8周齡BALB/c小鼠數(shù)只，頸背部皮下多點注射免疫，其中抗原PCV2全病毒劑量為首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫間隔14天，三免14天后尾靜脈采血測抗體效價，選效價高數(shù)量級在107以上的小鼠在細胞融合前3天脾臟注射50μg加強免疫，
(3)無菌摘取小鼠脾臟，制成脾細胞，按1∶5的體積比比例取脾細胞和骨髓瘤細胞混合，離心后，棄上清液；緩慢加入體積分數(shù)50％PEG 4000進行融合；用體積分數(shù)1％HAT培養(yǎng)液重懸融合細胞，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔105個細胞/100μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄細胞生長情況；
(4)待96孔板中有融合細胞生長，且液體稍微變黃時，吸取培養(yǎng)液，用包被Cap蛋白的間接ELISA方法進行篩選，選擇強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克??；經(jīng)幾次亞克隆后，即獲得穩(wěn)定分泌豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體且效價高的雜交瘤細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征如下所述的制備方法還包括將取10周齡健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL/只，7～14d后腹腔注射雜交瘤細胞0.5mL含(5×105～1×106個雜交瘤細胞)/只，待小鼠腹腔明顯增大時抽取腹水，去除油脂和沉淀后即為單抗腹水，-70℃～80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征如下所述的制備方法步驟1中的超速離心的轉(zhuǎn)速為55,000r·min-1離心4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征如下所述的制備方法步驟1中還包括在離心后采用適量的PBS溶解。
5.一種由權(quán)利要求1的制備方法所獲得的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體，其特征在于所述的豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體由如下步驟制得，(1)將凍存的PCV2復蘇后擴大培養(yǎng)，超速離心，收集沉淀，超聲波裂解，蛋白含量測定儀測定其質(zhì)量濃度，-70℃～80℃凍存?zhèn)溆茫?br> (2)取健康7～8周齡BALB/c小鼠數(shù)只，頸背部皮下多點注射免疫，其中抗原PCV2全病毒劑量為首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫間隔14天，三免14天后尾靜脈采血測抗體效價，選效價高數(shù)量級在107以上的小鼠在細胞融合前3天脾臟注射50μg加強免疫，
(3)無菌摘取小鼠脾臟，制成脾細胞，按1∶5的體積比比例取脾細胞和骨髓瘤細胞混合，離心后，棄上清液；緩慢加入體積分數(shù)50％PEG 4000進行融合；用體積分數(shù)1％HAT培養(yǎng)液重懸融合細胞，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔105個細胞/100μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄細胞生長情況；
(4)待96孔板中有融合細胞生長，且液體稍微變黃時，吸取培養(yǎng)液，用包被Cap蛋白的間接ELISA方法進行篩選，選擇強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克??；經(jīng)幾次亞克隆后，即獲得穩(wěn)定分泌豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體且效價高的雜交瘤細胞。
6.一種由權(quán)利要求1方法制得的豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體在建立間接免疫熒光診斷方法中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬圓環(huán)病毒II型蛋白單克隆抗體在建立間接免疫熒光診斷方法中的應(yīng)用為(1)制作病料切片，采取疑似PCV2病料，切取黃豆大小肺臟和淋巴結(jié)組織塊，放置于組織固著器上并冷凍，待組織塊冷凍后將其裝到切片機上，調(diào)整好位置后，切取0.1～0.3mm的組織薄片，將經(jīng)過冷乙醇浸泡過的玻片貼片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)間接免疫熒光診斷方法建立，取出制備好的病料切片，分別滴加PCV2小鼠陽性血清、豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min，共3次，然后滴加的不同濃度的羊抗鼠熒光二抗，同時以小鼠陽性血清為陽性對照，以PCV2的PCR陰性病料為陰性對照，以偽狂犬病毒(PRV)陽性而PCV2陰性的PCV2病料為實驗對象，裝入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗滌5min次，共3次，滴加體積分數(shù)50％甘油蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察。分別將8-60和10-48作為一抗，檢測臨床上的20份PCV2病料，并將間接免疫熒光診斷結(jié)果與PCR結(jié)果做符合率比較。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬圓環(huán)病毒II型Cap蛋白單克隆抗體的制備方法、抗體及應(yīng)用。本發(fā)明以超離純化的豬圓環(huán)病毒II型作為免疫原，按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0細胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選獲得了2株分泌PCV2-Cap蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為8-60、10-48，對其生物學特性進行鑒定，并將其作為一抗，建立了間接免疫熒光診斷方法。該間接免疫熒光診斷方法，與PCR診斷方法的結(jié)果基本一致，陽性和陰性符合率分別為93.75％和100％，為預防和治療豬圓環(huán)病毒病提供了參考。
文檔編號G01N33/577GK101768218SQ20101012077
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者車勇良, 周倫江, 莊向生, 魏宏, 王隆柏, 陳少鶯, 陳如敬 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所, 車勇良, 周倫江, 莊向生, 魏宏, 王隆柏, 陳少鶯, 陳如敬