專利名稱：：測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒蘸康姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥品控制質(zhì)量領(lǐng)域，涉及一種測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。
背景技術(shù)：
：銀杏葉又名白果葉，來源于銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，在我國有悠久的藥用歷史，主要用于治療肺虛咳喘和心悸怔忡等癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，銀杏葉具有清除氧自由基、降血脂、增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平、改善血液流變狀態(tài)、抗炎、抗過敏等作用。因而用銀杏葉研制開發(fā)的制劑品種越來越多，臨床應用越來越廣泛。目前在臨床上應用的有斯泰隆、金納多、天保寧、銀可絡、舒血寧、絡欣通，冠心酮等多種品牌的片劑、顆粒劑、注射劑。主要用于治療各種心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等。銀杏葉及其制劑中主要有效成分為黃酮類和內(nèi)酯類兩類成分，到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于銀杏葉及其制劑的質(zhì)量控制方法普遍是測定這兩類成分的含量。關(guān)于銀杏葉及其制劑中黃酮類含量測定的方法，雖然已經(jīng)有高效液相色譜法和薄層掃描法，但其測定原理都是在水解的基礎上，以槲皮素、山柰素和異鼠李素三種黃酮苷元為對照，經(jīng)過折算而進行測定的，這兩種方法的主要缺點是(l)需要水解。在水解過程中，由于操作等多方面的原因，可能發(fā)生水解不夠或水解過度等現(xiàn)象，導致測定結(jié)果不準確；而且水解過程費時費力，嚴重影響工作效率。(2)測定的是黃酮苷元的含量。由于測定的是水解后的黃酮苷元的含量，不能準確反映銀杏葉及其制劑中黃酮苷類成分的真實含量，不能達到真正控制銀杏葉及其制劑質(zhì)量均一性的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種測定銀杏葉或相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒蘸康姆椒?。本發(fā)明提供的測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，包括如下步驟在無陰性干擾的情況下，以山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諡閷φ掌罚酶咝б合嗌V對作為供試品的所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中的山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒者M行測定，由外標法計算得到所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮?。該方法中，在所述測定步驟之前，先將所述對照品和所述供試品溶于溶劑中；溶解所述對照品的溶劑選自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流動相中的任意一種；溶解所述供試品的溶劑選自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流動相中的任意一種。所述測定步驟中，檢測波長為190nm400nm，優(yōu)選360nm。流動相為下述溶劑a溶劑c中的任意一種所述溶劑a為甲醇的水溶液，所述溶劑b為乙腈的水溶液，所述溶劑c為甲醇、乙腈和水組成的混合液。所述流動相還可為溶劑a-溶劑c中的任意一種與修飾劑、緩沖溶液、離子抑制劑和PH值調(diào)節(jié)劑中的至少一種組成的混合液；其中，所述溶劑a為甲醇的水溶液，所述溶劑b為乙腈的水溶液，所述溶劑c為甲醇、乙腈和水組成的混合液；所述修飾劑選自四氫呋喃、異丙醇和二氧六環(huán)中的任意一種；所述緩沖溶液選自磷酸鹽緩沖溶液、乙酸鹽緩沖溶液和檸檬酸鹽緩沖溶液中的任意一種；所述離子抑制劑選自十二烷基磺酸鈉、十一烷基磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉和壬烷磺酸鈉中的任意一種；所述PH值調(diào)節(jié)劑選自甲酸、乙酸、磷酸和檸檬酸中的任意一種。所述修飾劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.5%10.0%，優(yōu)選3.0%5.0%;所述緩沖溶液的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.5%10.0%，優(yōu)選3.0%5.0%;所述離子抑制劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.1%3.0%，優(yōu)選0.5%1.0X;所述pH值調(diào)節(jié)劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.05%5.0%，優(yōu)選0.2%1.0%。所述相關(guān)制劑為銀杏葉藥材、銀杏葉提取物、含有銀杏葉的固體制劑或含有銀杏葉的液體制劑，其中，所述固體制劑為丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、散劑或茶劑，所述液體制劑為注射劑、口服液、酊劑或煎膏劑。本發(fā)明提供的測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，可為下述方法a-方法c中的任一方法所述方法a為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌?，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉的溶液取銀杏葉，粉碎，稱取2g，加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml，稱定重量，置于水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分濃度為75X的乙醇水溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使其溶解，置于已處理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脫，棄去水液，再用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使其溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45ym的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法進行處理取聚酰胺顆粒用60目篩篩除細粉，加23倍重量的水浸泡使其潤濕，裝入色譜柱中，用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，接著用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性；(2)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(3)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮窟x用型號為AgilentZORBAXEclipsePlusC18、規(guī)格為50mmX4.6mm、填充劑粒8徑為1.8m的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液組成的混合液為流動相，分別精密吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各2iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表1所示進行梯度洗脫，每次所述梯度洗脫的平衡時間為10分鐘，所述流動相的流速為每分鐘0.6ml，所述檢測波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為40°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒辗逵嬎悴坏陀?000，所述表1中，A代表乙腈，B代表質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液，％代表體積百分比；表1、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣e及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣ex對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?-~~----對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛?；所述方法b為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌?，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉的溶液取銀杏葉，粉碎，稱取2g，加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml，稱定重量，置于水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分濃度為75X的乙醇水溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使溶解，置于已處理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脫，棄去水液，再用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使其溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法進行處理取聚酰胺顆粒用60目篩篩除細粉，加23倍重量的水浸泡使其潤濕，裝入色譜柱中，用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，接著用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性；(2)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45m的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(3)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為0.45Pm微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮窟x用型號為HP1100型Inertsil&0DS-3C18、規(guī)格為250mmX4.6mm、填充劑粒徑為5ym的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以流動相A和流動相B組成的混合液為流動相，分別吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各10iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表2所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.Oml，所述檢測的波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為30°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒辗逵嬎悴坏陀?000;所述流動相A為由水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比iooo:470:50:6.os混合而得的混合液，所述流動相B為水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比1400:200:30:6.88混合而得的混合液；所述表2中，A代表所述流動相A，B代表所述流動相B，％代表體積百分比；表2、梯度洗脫條件時間(分鐘)A(%)B(%)01010—1090—901030lo-+2590-■>753045ss-+2575-—75458025-+7075-—308010070—10030-—0100-—100—畫100.01根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣e及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣ex對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的濃度；所述方法C為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(2)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為0.45Pm微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮窟x用型號為Inertsil0DS-3C18、規(guī)格為250mmX4.6mm、填充劑粒徑為5ym的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液組成的混合液為流動相，分別吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各10iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表3所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.Oml，所述檢測的波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為3(TC，理論板數(shù)按山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰計算不低于8000;所述表3中，A代表乙腈，B代表質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液，％代表體積百分比；表3、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣e及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積x對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的濃度。上述測定方法中，所述無陰性干擾的情況是指處方中含銀杏葉的復方制劑中，取去除銀杏葉以后的其他所有藥味，按照原加工工藝和供試品溶液的制備方法制得的陰性樣品溶液，按照同樣的色譜條件，進樣后，在色譜圖中無與對照品色譜峰保留時間一致的色譜峰。所述外標法是指在規(guī)定的色譜條件下，分別取對照品溶液和供試品溶液進樣，根據(jù)對照品色譜峰的保留時間確定供試品色譜圖中被測成分的色譜峰，再以該色譜峰的面積或峰高與對照品色譜峰的面積或峰高及其濃度進行比較，計算得到供試品中被測成分的濃度，即為得到供試品中被測成分的含量。本發(fā)明提供的測定銀杏葉制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒蘸康姆椒ǎ谥苽涔┰嚻啡芤簳r，不需要水解，克服了現(xiàn)有測定方法中測定結(jié)果不準確、水解過程費時費力等缺點，能夠準確測定銀杏葉及其制劑中黃酮苷類成分的真實含量，有利于有效控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。圖1為實施例1中對照品的HPLC圖譜。圖2為實施例1中作為供試品的銀杏葉藥材的HPLC圖譜。圖3為實施例1中作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜。圖4為實施例1中作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜。圖5為實施例2中對照品的HPLC圖譜。圖6為實施例2中作為供試品的銀杏葉藥材的HPLC圖譜。圖7為實施例2中作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜。圖8為實施例2中作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜。圖9為實施例3中對照品的HPLC圖譜。圖10為實施例3中作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜。圖11為實施例3中作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。本發(fā)明中所述濃度如無特別說明，均為質(zhì)量百分濃度。山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏慕Y(jié)構(gòu)確認數(shù)據(jù)英文名kaempferol3_0_2〃_(6〃'_p_coumaroyl)glucosylrh咖noside結(jié)構(gòu)式取干燥銀杏葉10kg，用乙醇40升回流提取2次，提取液合并，減壓濃縮，與柱層析硅膠(100目200目)20kg拌樣后，置索氏提取器中，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇各4升回流提取，乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠(200目300目)柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇(95:550:50)梯度洗脫，收集相應餾分，經(jīng)硅膠柱反復色譜分離、純化，即得。該化合物的核磁檢測結(jié)果如下'HNMR(200MHz，DMS0_d6):SO.92(3H，d，J=6HzMerhamnose)，3.06-4.24(m，sugarsprotons)，4.35(1H，d，J=8Hz，H—lglc)，5.61(1H，d，J=2Hz，H—lrha)，6.11(1H，d，J=2.5Hz，H-6)，6.IO(IH，d，J=16Hz，H-8coum).6.25(1H，d，J=2.5Hz，H-8)，6.72(2H，d，J=9Hz，H-3co咖andH-5co咖)，6.91(2H，d，J=9Hz，H-3'，andH-6')，7.37(2H，d，J=9Hz，H-2coumandH-6coum)，7.45(1H，d，J=16Hz，H-7coum).7.72(2H，d，J=9Hz，H-2'andH-6')，8.49(s，OHphenolic).13CNMR(50MHz，DMSO-d6):S17.4(C-6rha)，63.1(C-6glc)，69.8(C-5rha)，1270.2(C-4glc)，70.4(C-3rha)，71.7(C-2rha)，73.6(C-2glc，C-5glc)，76.0(C-3glc)，81.6(C-4rha)，93.9(C—8)，99.2(C—6)，100.6(C—lrha)，103.3(C—lglc)，106.0(C.10)，113.7(C-8coum)，115.4(C-3'，C—5')，115.7(C—3coum，C—5coum)，120.3(C—1')，124.8(C-lco咖)，130.0(C-2'，C-6')，130.4(C-2co咖，C-6coum)，134.2(C-3)，144.2(C-7coum)，156.2(C—9)，156.5(C—2)，160.2(C—4coum)，161.2(C—5)165.9(C—7)，166.4(C-9coum)，177.4(C-4).由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確。實施例1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的型號為AgilentZ0RBAXEclipsePlusC18，規(guī)格為50mmX4.6mm，1.8ym，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和濃度為0.4%的磷酸水溶液的混合液為流動相，按照表1所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘0.6ml;檢測波長為360nm，柱溫為4(TC，理論板數(shù)按山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰峰計算應不低于8000。表1中，A代表乙腈，B代表濃度為0.4%的磷酸水溶液，所列A和B的百分比均為體積百分比。對于表1中所列時間段內(nèi)，流動相的體積百分比由小到大或由大到小進行變化的洗脫區(qū)間，可直接設定該洗脫區(qū)間內(nèi)體積百分比的兩端值，色譜儀中的既定程序會進行自動調(diào)整。表1、梯度洗脫條件時間(分鐘)A(%)B(%)01214—1486—86121714—1686—84172416—2084—80242620—2180—79264021—2179—794040.0121—1479—86對照品溶液的制備精密稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌愤m量，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，即得。供試品溶液的制備(1)銀杏葉取銀杏葉本品，粉碎，精密稱取2g，精密加入75%乙醇100ml，稱定重量，置水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使溶解，置于已處理好的聚酰胺柱(3060目，3g，內(nèi)徑lcm)，用水50ml洗脫，棄去水液，再用75%乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45iim)濾過，取續(xù)濾液，即得。其中，所用聚酰胺柱按照下述方法進行處理取新購置的聚酰胺顆粒，用60目篩篩除細粉，加23倍量(體積與重量比)的水浸泡使其潤濕，裝入色譜中，用25倍柱體積的2%5%的鹽酸溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，接著用25倍柱體積的2%5%的氫氧化鈉溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，即可。13(2)銀杏葉提取物精密稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，精密加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用微孔濾膜(0.45iim)濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)舒血寧注射液取注射液，用微孔濾膜(0.45m)濾過，取續(xù)濾液，即得。測定分別精密吸取對照品溶液與上述三種供試品溶液各21，注入高效液相色譜儀中進行測定，所得高效液相色譜結(jié)果如圖1-圖4所示。其中，圖1為對照品的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為27.020分鐘，圖2為作為供試品的銀杏葉藥材的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為26.917分鐘，圖3為中作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為26.986分鐘，圖4為作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為26.815分鐘。按照外標法計算山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮浚唧w計算過程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>得到所述供試品為銀杏葉時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?.033mg/g;按照與上相同的方法，計算得到所述供試品為銀杏葉提取物時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?2.31mg/g;所述供試品為舒血寧注射液時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?.020mg/ml。實施例2、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的型號為HP1100型Inertsil&0DS-3C18，規(guī)格為250mmX4.6mm，5iim，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以流動相A和流動相B組成的混合液為流動相，按照表2所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.0ml;檢測波長為360nm，柱溫為30°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒辗逵嬎銘坏陀?000。所述流動相A為由水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比1000:470:50:6.08混合而得的混合液，所述流動相B為水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比1400:200:30:6.88混合而得的混合液。表2中，A代表所述流動相A，B代表所述流動相B。對于表2中所列時間段內(nèi)，流動相的體積百分比由小到大或由大到小進行變化的洗脫區(qū)間，可直接設定該洗脫區(qū)間內(nèi)體積百分比的兩端值，色譜儀中的既定程序會進行自動調(diào)整。表2、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>01010—"090—103010—+2590—+75304525-+2575-+75458025-+7075-+308010070—10030-—0100100.01100-—100_>90對照品溶液的制備精密稱取山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，即得。供試品溶液的制備(1)銀杏葉取銀杏葉本品，粉碎，精密稱取2g，精密加入75%乙醇100ml，稱定重量，置水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使溶解，置已處理好(該處理方法同實施例1)的聚酰胺柱(3060目，3g，內(nèi)徑1cm)，用水50ml洗脫，棄去水液，再用75%乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45iim)濾過，取續(xù)濾液，即得。(2)銀杏葉提取物精密稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，精密加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用微孔濾膜(0.45iim)濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)舒血寧注射液取注射液，用微孔濾膜(0.45m)濾過，取續(xù)濾液，即得。測定分別精密吸取對照品溶液與上述三種供試品溶液各101，注入高效液相色譜儀中進行測定，所得高效液相色譜結(jié)果如圖5-圖8所示。其中，圖5為對照品的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為74.411分鐘，圖6為作為供試品的銀杏葉藥材的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為73.696分鐘，圖7為中作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為73.035分鐘，圖8為作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為72.926分鐘。按照外標法計算山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量，具體計算過程如下山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積x對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品為銀杏葉時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?.033mg/g;按照與上相同的方法，計算得到所述供試品為銀杏葉提取物時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?2.31mg/g;所述供試品為舒血寧注射液時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?.020mg/ml。實施例3、15色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的型號為Inertsil0DS-3C18，規(guī)格為250mmX4.6mm，5iim，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和濃度為0.4%的磷酸水溶液的混合液為流動相，按照表3所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.Oml;檢測波長為360nm，柱溫為30°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰計算應不低于8000。表3中，A代表乙腈，B代表濃度為0.4%的磷酸水溶液。對于表3中所列時間段內(nèi)，流動相的體積百分比由小到大或由大到小進行變化的洗脫區(qū)間，可直接設定該洗脫區(qū)間內(nèi)體積百分比的兩端值，色譜儀中的既定程序會進行自動調(diào)整。表3、梯度洗脫條件洗脫時間(分鐘)A(%)B(%)0815-今1585—8581715-—1785—83172517-■>1783—83253417-—2083—803440SO-—2080—804070SO-—3580—657070.0135-—1565—85對照品溶液的制備精密稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌愤m量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，即得。供試品溶液的制備(1)銀杏葉提取物精密稱取浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，精密加入甲醇10ml，超聲處理10分鐘，用微孔濾膜(0.45iim)濾過，取續(xù)濾液，即得。(2)舒血寧注射液取注射液，用微孔濾膜(0.45m)濾過，取續(xù)濾液，即得。測定分別精密吸取對照品溶液與上述三種供試品溶液各lOiU，注入高效液相色譜儀中進行測定，所得高效液相色譜結(jié)果如圖9-11所示。其中，圖9為對照品的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為57.493分鐘，圖10為作為供試品的銀杏葉提取物的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為57.453分鐘，圖11為作為供試品的舒血寧注射液的HPLC圖譜，山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏谋Ａ魰r間為57.454分鐘。按照外標法計算山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量，具體計算過程如下山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣ex對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品為銀杏葉提取物時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛葹?2.31mg/g;所述供試品為舒血寧注射液時，其中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒?6的濃度為O.020mg/ml<權(quán)利要求一種測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，包括如下步驟在無陰性干擾的情況下，以山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諡閷φ掌?，利用高效液相色譜對作為供試品的所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中的山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒者M行測定，由外標法計算得到所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于在所述測定之前，先將所述對照品和所述供試品分別溶于溶劑中，分別得到對照品溶液和供試品溶液；溶解所述對照品的溶劑選自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流動相中的任意一種；溶解所述供試品的溶劑選自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流動相中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述對照品溶液的濃度為每lml所述對照品溶液中含有O.001-0.10mg所述對照品，優(yōu)選每lml所述對照品溶液中含有O.07mg所述對照品。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述流動相為下述溶劑a-溶劑c中的任意一種所述溶劑a為甲醇的水溶液，所述溶劑b為乙腈的水溶液，所述溶劑c為甲醇、乙腈和水組成的混合液。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的方法，其特征在于所述流動相為溶劑a-溶劑c中的任意一種與修飾劑、緩沖溶液、離子抑制劑和PH值調(diào)節(jié)劑中的至少一種組成的混合液；所述溶劑a為甲醇的水溶液，所述溶劑b為乙腈的水溶液，所述溶劑c為甲醇、乙腈和水組成的混合液；所述修飾劑選自四氫呋喃、異丙醇和二氧六環(huán)中的任意一種；所述緩沖溶液選自磷酸鹽緩沖溶液、乙酸鹽緩沖溶液和檸檬酸鹽緩沖溶液中的任意一種；所述離子抑制劑選自十二烷基磺酸鈉、十一烷基磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉和壬烷磺酸鈉中的任意一種；所述PH值調(diào)節(jié)劑選自甲酸、乙酸、磷酸和檸檬酸中的任意一種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述修飾劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的O.5%10.0%，優(yōu)選3.0%5.0%;所述緩沖溶液的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.5%10.0%，優(yōu)選3.0%5.0%;所述離子抑制劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.1%3.0%，優(yōu)選0.5%1.0%;所述pH值調(diào)節(jié)劑的加入量為所述溶劑a或溶劑b或溶劑c體積的0.05%5.0%，優(yōu)選O.2%1.0%。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述測定步驟中，檢測波長為190nm400nm，優(yōu)選360nm。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7任一所述的方法，其特征在于所述相關(guān)制劑為銀杏葉藥材、銀杏葉提取物、含有銀杏葉的固體制劑或含有銀杏葉的液體制劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述固體制劑為丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、散劑或茶劑，所述液體制劑為注射劑、口服液、酊劑或煎膏劑。10.根據(jù)權(quán)利要求l-9任一所述的方法，其特征在于所述測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒蘸康姆椒?，是按照下述方法a-方法c中的任一方法進行測定的所述方法a為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌?，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉的溶液取銀杏葉，粉碎，稱取2g，加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml，稱定重量，置于水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使其溶解，置于已處理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脫，棄去水液，再用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使其溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法進行處理取聚酰胺顆粒用60目篩篩除細粉，加23倍重量的水浸泡使其潤濕，裝入色譜柱中，用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，接著用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性；(2)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(3)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為O.45ym的微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮窟x用型號為AgilentZORBAXEclipsePlusC18、規(guī)格為50mmX4.6mm、填充劑粒徑為1.8iim的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液組成的混合液為流動相，分別精密吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各2iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表1所示進行梯度洗脫，每次所述梯度洗脫的平衡時間為10分鐘，所述流動相的流速為每分鐘0.6ml，所述檢測波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為40°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒辗逵嬎悴坏陀?000，所述表1中，A代表乙腈，B代表質(zhì)量百分濃度為0.4X的磷酸水溶液，％代表體積百分比；表1、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積x對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的濃度；所述方法b為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌罚蛹状贾瞥擅縧ml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉的溶液取銀杏葉，粉碎，稱取2g，加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液lOOml，稱定重量，置于水浴中加熱回流提取40分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液25ml，蒸干，殘渣加水2ml使溶解，置于已處理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脫，棄去水液，再用質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇水溶液100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使其溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法進行處理取聚酰胺顆粒用60目篩篩除細粉，加23倍重量的水浸泡使其潤濕，裝入色譜柱中，用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性，接著用25倍柱體積的質(zhì)量百分濃度為2%5%的鹽酸水溶液洗脫，再用去離子水洗脫至中性；(2)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(3)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為0.45Pm微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮窟x用型號為HP1100型InertsilR0DS-3C18、規(guī)格為250mmX4.6mm、填充劑粒徑為[5Pm的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以流動相A和流動相B組成的混合液為流動相，分別吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各10iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表2所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.Oml，所述檢測的波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為3(TC，理論板數(shù)按山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰計算不低于8000;所述流動相a為由水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比iooo:470:50:6.os混合而得的混合液，所述流動相b為水、乙腈、異丙醇和檸檬酸以體積比i400:200:30:6.88混合而得的混合液；所述表2中，a代表所述流動相a，b代表所述流動相b，％代表體積百分比；表2、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面積x對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛?；所述方法c為1)制備對照品的溶液稱取山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諏φ掌愤m量，加甲醇制成每lml含0.07mg的溶液，得到所述對照品的溶液；2)制備供試品溶液(1)制備銀杏葉提取物的溶液稱取購自浙江康恩貝植物提取物有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品批號為070301的銀杏葉提取物O.035g，加入甲醇10ml，超聲處理IO分鐘，用孔徑為0.45iim的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得到所述銀杏葉提取物的溶液；(2)制備舒血寧注射液的溶液用孔徑為0.45Pm微孔濾膜濾過舒血寧注射液，取續(xù)濾液，得到所述舒血寧注射液的溶液；3)測定所述供試品溶液中山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量選用型號為Inertsil0DS-3C18、規(guī)格為250mmX4.6mm、填充劑粒徑為5iim的高效液相色譜柱，所述色譜柱中的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以乙腈和質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液組成的混合液為流動相，分別吸取所述對照品溶液與所述供試品溶液各10iU，分別注入所述高效液相色譜儀中，按照表3所示進行梯度洗脫，每次洗脫的平衡時間為10分鐘，流動相的流速為每分鐘1.Oml，所述檢測的波長為360nm，所述色譜柱的柱溫為30°C，理論板數(shù)按山柰酚對香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰計算不低于8000;所述表3中，a代表乙腈，b代表質(zhì)量百分濃度為0.4%的磷酸水溶液，％代表體積百分比；表3、梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)所得所述供試品和對照品的高效液相色譜圖計算得到所述山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣e及所述對照品的峰面積，按照下式所示的外標法進行計算山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏姆迕娣ex對照品溶液的濃度供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諠舛?對照品的峰面積得到所述供試品溶液中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏臐舛?。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于測定銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒蘸康姆椒?。該方法是在無陰性干擾的情況下，以山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒諡閷φ掌罚酶咝б合嗌V對作為供試品的所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中的山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒者M行測定，由外標法計算得到所述銀杏葉或其相關(guān)制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏暮俊Ｔ摲椒ㄔ谥苽涔┰嚻啡芤簳r，不需要水解，克服了現(xiàn)有測定方法中測定結(jié)果不準確、水解過程費時費力等缺點，能夠準確測定銀杏葉或其制劑中山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏恼鎸嵑浚欣谟行Э刂葡嚓P(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。文檔編號G01N30/02GK101788540SQ20101012266公開日2010年7月28日申請日期2010年3月11日優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日發(fā)明者付欣彤,王京輝,王志斌,郭洪祝,陳有根申請人:北京市藥品檢驗所