專利名稱：一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法，屬納米無機(jī)材料與生
物高分子化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組氨酸標(biāo)簽蛋白是蛋白質(zhì)提純中常用的蛋白，經(jīng)組氨酸標(biāo)簽的蛋白提純效率大大 增高，且蛋白特性基本不發(fā)生改變。而應(yīng)用納米二氧化硅包裹蛋白是目前納米技術(shù)與生物 技術(shù)結(jié)合的交叉研究方向。傳統(tǒng)方法包裹的納米二氧化硅在溶液中容易泄漏，包裹效率低 下，該法利用組氨酸標(biāo)簽蛋白的特性，選用合適的可以和咪唑基團(tuán)絡(luò)合的金屬離子和組氨 酸標(biāo)簽蛋白絡(luò)合，改變了蛋白的帶電性，制備了穩(wěn)定的、單分散的納米二氧化硅顆粒。包含 蛋白的納米二氧化硅顆粒是一種無毒、生物相容性好的無機(jī)納米材料，且其表面易于修飾 和改性，尺寸可控性好，被廣泛的應(yīng)用于生物標(biāo)記、納米探針、載藥體系等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
組氨酸標(biāo)簽蛋白是指一種蛋白質(zhì)的一端加入幾個組氨酸( 一般為六個)。組氨酸 也是一種氨基酸。組氨酸標(biāo)簽是在蛋白質(zhì)提純前，在蛋白質(zhì)對應(yīng)的DNA上加上幾個組氨酸 的基因，這樣表達(dá)出的蛋白質(zhì)的一端就含有組氨酸標(biāo)簽，這個標(biāo)簽是用來蛋白質(zhì)的提純用 的。這個六個組氨酸標(biāo)簽可以和金屬離子整合?？蒲腥藛T利用這種醫(yī)理和作用，開展了一 些新材料的開發(fā)工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法。 本發(fā)明一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法，其特征在于具有以下過程
和步驟 a.將環(huán)己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇三者按體積比4 : 1 : l的比例混合 均勻使呈微乳液混合液體系；然后加入上述混合液總體積的2. 7%的氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽 蛋白的混合物，該混合物中氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽蛋白兩者的摩爾比為3 : l;劇烈攪拌均勻 后，再加入一定量的正硅酸乙酯；正硅酸乙酯的加入量以上述微乳液混合液的總體積為計 量基準(zhǔn)，為微乳液混合液總體積的0. 9 1. 0% (體積％ );然后磁力攪拌均勻后加入一定 量的氨水引發(fā)聚合，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時；接著再加入一定量的丙酮使納米球沉淀出 來；丙酮的加入量為上述總反應(yīng)物體積的2倍；經(jīng)洗滌數(shù)次以除去表面活性劑等雜質(zhì)，最終 得到包含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的納米二氧化硅顆粒。 所述的氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽蛋白的混合物中，其中的氯化鈣可以用水溶性的氯化
鋅、或氯化鐵、或氯化銅、或氯化鎳中的任一種鹽所取代。
本發(fā)明方法的機(jī)理，可簡單地敘述如下 組氨酸標(biāo)簽蛋白通過和金屬離子的整合作用吸附在納米二氧化硅顆粒的內(nèi)部。
本發(fā)明方法可制得包含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的納米二氧化硅顆粒，同樣地可測得組 氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅。組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白是組氨酸標(biāo)簽蛋白的一種。 一般實驗過程中主要選取綠色熒光蛋白，因為綠色熒光蛋白具有熒光特性，易于檢 本發(fā)明方法制得的含有組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅，其熒光信號 較強(qiáng)；且具有較好的熱穩(wěn)定性，不易被酶解，以及熒光不得被淬滅等優(yōu)良性能。
另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可用作熒光納米二氧化硅探針，能很好的穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì) 胞，且在細(xì)胞中熒光信號強(qiáng)，穩(wěn)定性好，無毒性，可作生物標(biāo)記。


圖1為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的透射 電子顯微鏡(TEM)照片圖。 圖2為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的熒光
強(qiáng)度與同等濃度無Si02包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度的比較。 圖3為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無Si(^
包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白熱穩(wěn)定性對比曲線圖。 圖4為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無Si(^ 包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白酶K酶解對比曲線圖。 圖5為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無鈣
離子情況下直接包裹組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的泄漏研究。 圖6為本發(fā)明所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無Si(^
包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白鹽酸胍淬滅的熒光圖。
具體實施例方式
現(xiàn)將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
實施例 以組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白為例。將7. 5毫升環(huán)己烷、1. 77毫升聚乙二醇辛基 苯基醚、1. 8毫升正己醇的混合液混合，加入300微升氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白 的混合物，再加入100微升正硅酸乙酯，磁力攪拌均勻，最后用60微升氨水引發(fā)聚合，室溫 攪拌反應(yīng)24小時后，加入20毫升丙酮使納米球沉淀出來，洗滌數(shù)次除去表面活性劑等雜 質(zhì)，即可得到包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒。 本實施例所得的包含組氯酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的透射電子 顯微鏡(TEM)圖示于圖1。 從圖1中可看出，納米二氧化硅顆粒內(nèi)部包含了組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白。
納米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白與無二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽 綠色熒光蛋白的性能對比 本實施例中所得到的納米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白與無二氧化
硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白的性能對比，參見附圖中的圖2至圖6。 圖2為本實施例所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的熒
光強(qiáng)度與同等濃度無二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度比較圖。從圖
2中可看出前者具有更好的熒光強(qiáng)度。
圖3為本實施例所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無 氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白熱穩(wěn)定性對比曲線圖。從圖3中可看到前者具有較 好的熱穩(wěn)定性。 圖4為本實施例所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無 二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白酶K酶解對比曲線圖。從圖4中表明組氨酸標(biāo) 簽綠色熒光蛋白(無Si02包裹)在蛋白酶K的存在下，2小時后有80%發(fā)生了酶解，而納 米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白其大多數(shù)(70% )都沒有被酶解，從而說明被 納米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白具有更好的穩(wěn)定性。 圖5為本實施例所得包含組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無 鈣離子存在下直接包裹組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的泄漏研究。圖5表 明沒有金屬鈣離子存在下的納米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白在洗滌過程中 很快就發(fā)生了泄漏，相反地在有鈣離子存在的情況下，被納米二氧化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽 綠色熒光蛋白很穩(wěn)定地得泄漏。 圖6為本實施例所得包含組氨酸的綠色熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與無二氧 化硅包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白的鹽酸胍淬滅的熒光圖。從圖6中表明無Si(^包裹 的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白在鹽酸胍淬滅劑存在下10分鐘就基本變性，而納米二氧化硅 包裹的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白在同樣的鹽酸胍存在下，20分鐘后仍保存有大于60%的 熒光強(qiáng)度，因而可看出包裹納米Si02后的組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白具有更好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法，其特征在于具有以下的過程和步驟a.將環(huán)己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇三者按體積比4∶1∶1的比例混合均勻使呈微乳液混合液體系；然后加入上述混合液總體積的2.7％的氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽蛋白的混合物，該混合物中氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽蛋白兩者的摩爾比為3∶1；劇烈攪拌均勻后，再加入一定量的正硅酸乙酯；正硅酸乙酯的加入量以上述微乳液混合液的總體積為計量基準(zhǔn)，為微乳液混合液總體積的0.9～1.0％(體積％)；然后磁力攪拌均勻后加入一定量的氨水引發(fā)聚合，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時；接著再加入一定量的丙酮使納米球沉淀出來；丙酮的加入量為上述總反應(yīng)物體積的2倍；經(jīng)洗滌數(shù)次以除去表面活性劑等雜質(zhì)，最終得到包含有組氨酸標(biāo)簽蛋白的納米二氧化硅顆粒。
2. 如權(quán)利要求書l所述的一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法，其特征在于所述的氯化鈣與組氨酸標(biāo)簽蛋白的混合物中，其中的氯化鈣可以用水溶性的氯化鋅、或氯化鐵、或氯化銅、或氯化鎳中的任一種鹽所取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米二氧化硅包裹組氨酸標(biāo)簽蛋白的方法，屬納米無機(jī)材料與生物高分子化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法的要點是將環(huán)己烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇按一定比例混合均勻至呈微乳液混合液體系，加入金屬離子水溶性鹽與組氨酸標(biāo)簽蛋白的混合物，再加入一定量的正硅酸乙酯，磁力攪拌均勻，再用少量氨水引發(fā)聚合，室溫下攪拌反應(yīng)完全后，加入丙酮破乳值納米球沉淀出來，然后洗滌數(shù)次以去除表面活性劑等雜質(zhì)，即可得到包含組氨酸標(biāo)簽蛋白的納米二氧化硅顆粒。本發(fā)明方法制得的組氨酸標(biāo)簽的綠色熒光蛋白為例制得的納米二氧化硅顆粒具有極好的熱穩(wěn)定性，且具有不易被酶解和熒光不易被淬滅等優(yōu)良性能。
文檔編號G01N21/64GK101792480SQ20101012678
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉剛波, 葉張梅, 曹傲能, 王海芳, 董二亞, 蔡正偉 申請人:上海大學(xué)