專利名稱：一種單鏈微核糖核酸的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單鏈微核糖核酸(以下簡稱miRNA)是一類具有21_23個單核苷酸長度的核糖核 酸分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因信使核糖核酸堿基配對引導(dǎo)沉默 復(fù)合體(RISC)降解信使核糖核酸或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進化中相當保守，在植物、 動物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNA只在特定的組織和發(fā)育階段表達，miRNA組織特異性和時序性， 決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作 用。miRNA序列在不同的生物細胞中具有一定的保守性，miRNA的功能是參與生命的一些 基本過程，如發(fā)育過程中的細胞增殖、細胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等。最近的研究發(fā)現(xiàn)， miRNA表達與多種癌癥相關(guān)，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的 脆性位點。這說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用 類似于抑癌基因和癌基因的功能。這些研究結(jié)果都表明miRNA在細胞癌變中可能發(fā)揮著重 要的作用。因此，建立一種操作快速簡便、費用低廉的檢測方法對miRNA的功能研究具有重 要意義。由于miRNA分子較小，檢測技術(shù)的難點高于其余分子的檢測。成熟的miRNA—般 只有二十幾個堿基，同族的miRNA之間通常只有一兩個堿基的差別，而且絕大部分在細胞 中的表達水平都比較低，這些特性給傳統(tǒng)的檢測方法如核糖核酸雜交，芯片檢測等常規(guī)手 段帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，建立一種用于檢測miRNA 分子的簡便、實用的方法，以用于miRNA的表達分析、克隆研究以及臨床標本檢驗。
本發(fā)明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，包括以下步驟 (1)將包含單鏈微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在 37C反應(yīng)50-70分鐘，得到反應(yīng)液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，核 糖核酸加入的質(zhì)量體積比為2納克 200納克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成 為多聚腺苷酸聚合酶為2單位、核糖核酸為20納克 2微克、pH值為8. 0的三羥甲基氨 基甲烷鹽酸鹽100毫摩爾/升、氯化鈉200毫摩爾/升、乙二胺四乙酸80毫摩爾/升和三 磷酸腺苷為50毫摩爾/升； (2)從步驟(1)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)中，在37t:反應(yīng) 50-70分鐘，得到反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，步驟(1)的反應(yīng)液的加入體積 比為l : IO，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(1)的反應(yīng)液2微升、逆轉(zhuǎn)錄引物150納摩爾 /升、PH值為8. 8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽150毫摩爾/升、氯化鉀500毫摩爾/升、三 磷酸脫氧核糖核苷為100微摩爾/升、核糖核酸酶抑制劑為20單位和Quant逆轉(zhuǎn)錄酶為2 單位；
(3)從步驟(2)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)程序 為40個熱循環(huán)，每個熱循環(huán)的條件為94t:保溫20秒，6(TC保溫30秒，72。C保溫30秒，步驟 (2)反應(yīng)液的加入體積比為l : IO，聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(2)的反應(yīng)液2微 升、脫氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩爾濃度為200納摩爾/升和通用型下 游引物摩爾濃度為200納摩爾/升。 本發(fā)明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，其優(yōu)點是檢測簡便、快捷、節(jié)約。本發(fā) 明方法是基于SYBR Green I染料法的miRNA熒光定量檢測系統(tǒng)，可用于從一個合成反應(yīng)的 單鏈脫氧核糖核酸中檢測多種miRNA，不僅減少了檢測誤差、節(jié)約了檢測樣品，同時還實現(xiàn) 了檢測的高通量。而且本發(fā)明方法具有較好的檢測特異性，能分辨單堿基差異的miRNA ;檢 測靈敏度高，可在低至納克級的總核糖核酸中檢測到特異表達的miRNA。


圖1是單鏈微核糖核酸mir-24和mir-122熒光定量檢測的擴增曲線。
圖2是單鏈微核糖核酸mir-24和mir_122熒光定量檢測的溶解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明提出的單鏈微核糖核酸的檢測方法，包括以下步驟 (1)將包含單鏈微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在 37C反應(yīng)50-70分鐘，得到反應(yīng)液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，核 糖核酸加入的質(zhì)量體積比為2納克 200納克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成 為多聚腺苷酸聚合酶為2單位、核糖核酸為20納克 2微克、pH值為8. 0的三羥甲基氨 基甲烷鹽酸鹽100毫摩爾/升、氯化鈉200毫摩爾/升、乙二胺四乙酸80毫摩爾/升和三 磷酸腺苷為50毫摩爾/升； (2)從步驟(1)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)中，在37t:反應(yīng) 50-70分鐘，得到反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，步驟(1)的反應(yīng)液的加入體積 比為l : IO，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(1)的反應(yīng)液2微升、逆轉(zhuǎn)錄引物150納摩爾 /升、PH值為8. 8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽150毫摩爾/升、氯化鉀500毫摩爾/升、三 磷酸脫氧核糖核苷為100微摩爾/升、核糖核酸酶抑制劑為20單位和Quant逆轉(zhuǎn)錄酶為2 單位； (3)從步驟(2)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)程序 為40個熱循環(huán)，每個熱循環(huán)的條件為94t:保溫20秒，6(TC保溫30秒，72。C保溫30秒，步驟 (2)反應(yīng)液的加入體積比為l : IO，聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(2)的反應(yīng)液2微 升、脫氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩爾濃度為200納摩爾/升和通用型下 游引物摩爾濃度為200納摩爾/升。 本發(fā)明涉及一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。使用細胞 或組織核糖核酸(含有miRNA)，其中的miRNA經(jīng)過多聚腺苷酸聚合酶在其3'端加上多聚腺 苷酸尾巴，再由逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄獲得核糖核酸互補單鏈脫氧核糖核酸，最后以miRNA 相關(guān)序列和逆轉(zhuǎn)錄引物的部分互補序列分別作為miRNA檢測的上下游引物，使用特定的 測系統(tǒng)(含SYBR Green I熒光染料)來檢測miRNA。
本發(fā)明方法中，所用的Quant逆轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核酸聚合酶混合液由天根生化 科技(北京)有限公司生產(chǎn)。 上述方法中步驟(2)中使用的逆轉(zhuǎn)錄引物、步驟(3)中使用的上游引物、通用型下 游引物，由美國英俊invitrogen公司合成。 以下介紹本發(fā)明方法的實施例檢測小鼠肝臟組織中的單鏈微核糖核酸mir-24
和單鏈微核糖核酸mir-122。 1、多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng) (1)包含單鏈微核糖核酸的核糖核酸的制備 稱取50mg的小鼠肝臟組織，用天根生化科技(北京)有限公司的miRNA提取試劑 盒提取小鼠肝臟細胞中的總核糖核酸，得到的總核糖核酸經(jīng)過吸光值測定獲得其濃度。
(2)配制多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)混合液20微升，組成如下核糖核酸為2微克，多 聚腺苷酸聚合酶為2U，pH值為8. 0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽100毫摩爾/升、氯化鈉200 毫摩爾/升、乙二胺四乙酸80毫摩爾/升和三磷酸腺苷為50毫摩爾/升。輕輕混勻上述 配制的反應(yīng)液，在37t:反應(yīng)50-70分鐘，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中miRNA的3'端為多聚合腺苷 酸尾巴結(jié)構(gòu)。所得的反應(yīng)液可以直接進行下游實驗，也可以放置-2(TC短暫保存，如需長期 保存建議存放于-80°C 。
2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
(1)逆轉(zhuǎn)錄引物的序列 5' -GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGTGCATGACAGTG(T)22(A， G， C) -3，
(2)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液20微升，組成如下步驟1(2)的反應(yīng)生成液2微升、 逆轉(zhuǎn)錄引物150納摩爾/升、pH值為8. 8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽150毫摩爾/升、氯 化鉀500毫摩爾/升、三磷酸脫氧核糖核苷為100微摩爾/升、核糖核酸酶抑制劑為20單 位和Quant逆轉(zhuǎn)錄酶為2單位。輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，在37。C反應(yīng)50-70分鐘，反應(yīng) 結(jié)束后反應(yīng)液中含有相應(yīng)的單鏈脫氧核糖核酸，放置于-201:保存。
3、聚合酶鏈式反應(yīng)
(1)引物序列:通用型下游5' -GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGT-3'
mir-24上游引物序列5' -TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3'
mir-122上游引物序列5' -TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT-3， (2)配制聚合酶鏈式反應(yīng)混合液20微升，組成如下步驟2 (2)的反應(yīng)生成液2微 升，天根生化科技(北京)有限公司的脫氧核糖核酸聚合酶混合液10微升，上游引物摩爾 濃度為200納摩爾/升，通用型下游引物摩爾濃度為200納摩爾/升。反應(yīng)程序為40個熱 循環(huán)，每個熱循環(huán)的條件為94t:保溫20秒，6(TC保溫30秒，72。C保溫30秒，反應(yīng)結(jié)束后即 可通過熒光定量檢測儀檢測相應(yīng)的miRNA。說明書附圖中圖l是單鏈微核糖核酸mir-24和 mir-122熒光定量檢測的擴增曲線；圖2是單鏈微核糖核酸mir-24和mir-122熒光定量檢 測的溶解曲線。
權(quán)利要求
一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將包含單鏈微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在37℃反應(yīng)50-70分鐘，得到反應(yīng)液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，核糖核酸加入的質(zhì)量體積比為2納克～200納克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成為多聚腺苷酸聚合酶為2單位、核糖核酸為20納克～2微克、pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽100毫摩爾/升、氯化鈉200毫摩爾/升、乙二胺四乙酸80毫摩爾/升和三磷酸腺苷為50毫摩爾/升；(2)從步驟(1)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)中，在37℃反應(yīng)50-70分鐘，得到反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的體積為20微升，步驟(1)的反應(yīng)液的加入體積比為1∶10，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(1)的反應(yīng)液2微升、逆轉(zhuǎn)錄引物150納摩爾/升、pH值為8.8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽150毫摩爾/升、氯化鉀500毫摩爾/升、三磷酸脫氧核糖核苷為100微摩爾/升、核糖核酸酶抑制劑為20單位和Quant逆轉(zhuǎn)錄酶為2單位；(3)從步驟(2)的反應(yīng)液中取出2微升，加入到聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)程序為40個熱循環(huán)，每個熱循環(huán)的條件為94℃保溫20秒，60℃保溫30秒，72℃保溫30秒，步驟(2)反應(yīng)液的加入體積比為1∶10，聚合酶鏈式反應(yīng)系統(tǒng)的組成為步驟(2)的反應(yīng)液2微升、脫氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩爾濃度為200納摩爾/升和通用型下游引物摩爾濃度為200納摩爾/升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單鏈微核糖核酸的檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。使用細胞或組織核糖核酸(含有miRNA)，其中的miRNA經(jīng)過多聚腺苷酸聚合酶在其3’端加上多聚腺苷酸尾巴，再由逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄獲得核糖核酸互補單鏈脫氧核糖核酸，最后以miRNA相關(guān)序列和逆轉(zhuǎn)錄引物的部分互補序列分別作為miRNA檢測的上下游引物，使用特定的檢測系統(tǒng)(含SYBR Green I熒光染料)來檢測miRNA。本方法具有簡便、快速和適于大量樣本檢測的優(yōu)點。本方法可用于miRNA的表達分析、克隆研究以及臨床標本檢驗。
文檔編號G01N21/64GK101792806SQ20101012981
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者俞萍, 孫克非, 寇彤, 李曉晨 申請人:天根生化科技(北京)有限公司