專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β₂-微球蛋白試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定血清成份的試劑盒，特別是測(cè)定血清中的02-微球蛋白(02-MG)的試劑盒，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：日2-微球蛋白(@2-MG)是一種低分子量(11800)的蛋白質(zhì)，最先在腎小管性腎炎的病人尿中分離邛2_MG存在于幾乎所有有核細(xì)胞表面，是人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)分子輕鏈的組成部分。作為HLA代謝和分解的產(chǎn)物，02-MG以低濃度的游離形式出現(xiàn)在血清、尿液和其他體液中。游離h-MG通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)腎小管重吸收排出和降解。因?yàn)?2-MG每天在體內(nèi)生成率較為恒定，且只被腎臟排泄，測(cè)定血02-MG可作為腎小球?yàn)V過(guò)率的指標(biāo)。已知測(cè)定-微球蛋白(02-MG)的方法有免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫法(ELISA法)。這些方法存在著操作繁瑣，需要特殊的設(shè)備，樣本需要預(yù)處理，不能進(jìn)行批量樣本分析和不能直接上全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述
背景技術(shù)：
的不足，提供一種02-微球蛋白檢測(cè)試劑的改進(jìn)，所提供的試劑應(yīng)具有樣本無(wú)需稀釋、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適用于各種類(lèi)型的全自動(dòng)生化分析儀的納米微球免疫比濁法檢測(cè)32-微球蛋白試劑盒。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)02-微球蛋白試劑盒，包括試劑禮、試劑R2以及參考校準(zhǔn)品；其中a、試劑禮一種使樣本中微球蛋白抗原位點(diǎn)充分暴露，有利于與抗日2-微球蛋白抗體試劑充分結(jié)合的微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L緩沖液、0.l-5mmol/L防腐劑、0.5-5mmol/L的穩(wěn)定劑、50-200mmol/L電解質(zhì)、0.l-4mmol/L表面活性劑，其余為純化水；b、試劑R2—種結(jié)合有抗人02-微球蛋白抗體的納米微球溶液，包括5-200mmol/L緩沖液、0.-5%重量比的結(jié)合有抗人02-微球蛋白抗體的納米微球、適量的防腐劑，納米微球直徑為50-150nm；c、參考校準(zhǔn)品一種用來(lái)與樣本比較，進(jìn)行結(jié)果計(jì)算的02-微球蛋白溶液，包括緩沖液100-200mmol/L，穩(wěn)定劑166-180mmol/，適量防腐劑以及根據(jù)濃度需要確定的一定量的重組人32-微球蛋白純品，其余為純化水。將重組人32-微球蛋白純品加入上述溶液中，獲得所需濃度的h-MG參考校準(zhǔn)品(該02-微球蛋白參考校準(zhǔn)品為添加重組人32-微球蛋白純品的人血清或其它類(lèi)似血清基質(zhì)的液體)。02-MG參考校準(zhǔn)品的濃度可以是高濃度單點(diǎn)參考校準(zhǔn)品，在使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品；也可以直接制備成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品。這里沒(méi)有特別的限制，只要制得的02-MG參考校準(zhǔn)品能夠與樣本比較，能夠測(cè)定樣本中02-MG的含量即可。所述微球蛋白試劑R1中還加入反應(yīng)加速劑，濃度為3-lOmmol/L。所述穩(wěn)定劑是乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白以及氯化鈉中的一種或多種的混口o所述緩沖液是三羥甲基氨基甲烷或CAPS0。所述防腐劑是廣譜殺菌劑。所述結(jié)合有抗人02-微球蛋白抗體的納米微球溶液的制備方法是用緩沖液在室溫下稀釋重量比例為11的抗人02-MG抗體多克隆抗體和納米微球，將兩者混勻后室溫振蕩吸附2小時(shí)(即常規(guī)的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的緩沖液封閉1小時(shí)，離心去上清，再用緩沖液稀釋至濃度為0.3%，并加入適量防腐劑?？谷?2-MG抗體多克隆抗體包括羊抗抗人02-MG抗體多克隆抗體或兔抗抗人32-MG抗體多克隆抗體或鼠抗抗人02-MG抗體多克隆抗體。本發(fā)明所需主要原料1、羊抗人02_微球蛋白多克隆抗體；可外購(gòu)或委托浙江伊利康生物技術(shù)研發(fā)中心按常規(guī)方法制備，該抗體僅與人02"微球蛋白反應(yīng)，與其它抗原無(wú)免疫交叉反應(yīng)，效價(jià)能夠滿(mǎn)足本試劑要求。2、納米微球；市場(chǎng)上有許多商品化的納米微球可供選擇，包括美國(guó)Sigma公司、德國(guó)默克公司、日本UNF公司；可選擇多種直徑的納米微球，本發(fā)明采用了直徑為80120nm的微球，相應(yīng)的試劑檢測(cè)主波長(zhǎng)為600nm。3、重組02-微球蛋白純品；可外購(gòu)，或由浙江伊利康生物技術(shù)研發(fā)中心制備，用于制備本試劑所需參考校準(zhǔn)品。其余生化原料均可外購(gòu)。本發(fā)明測(cè)定樣本的原理是利用抗原抗體反應(yīng)，先加入試劑R1(樣本稀釋液)，解除樣本中抗原周?chē)碾娮訉雍退瘜?，使抗原位點(diǎn)充分暴露；然后加入試劑&(抗人02-MG抗體的納米微球溶液)，使h-MG抗體的納米微球與樣本中相應(yīng)的h-MG抗原反應(yīng)，形成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的h-MG含量成正比；在規(guī)定波長(zhǎng)下測(cè)定該不溶性抗原_抗體復(fù)合物的吸光度值，與已知濃度的02-MG參考校準(zhǔn)品進(jìn)行比較，則可計(jì)算出樣本中02-MG的含量。試劑R2中納米微球與抗人02-微球蛋白抗體的結(jié)合可以采用物理吸附法或化學(xué)交聯(lián)法制備，優(yōu)選物理吸附法。本發(fā)明提供的試劑為液體雙試劑，具有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且測(cè)定時(shí)操作簡(jiǎn)單、樣本不用預(yù)稀釋?zhuān)捎糜跈z測(cè)體液中日2-微球蛋白的濃度，適用于臨床全自動(dòng)生化分析儀。圖1為采用本發(fā)明實(shí)施例1進(jìn)行測(cè)定所得02-MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的02-MG測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。圖2為采用本發(fā)明實(shí)施例2進(jìn)行測(cè)定所得02-MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的02-MG測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。圖3為采用本發(fā)明實(shí)施例3進(jìn)行測(cè)定所得02-MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的02_MG測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。具體實(shí)施例方式02-MG檢測(cè)試劑的制備實(shí)施例實(shí)施例一1、32_MG溶液(試劑隊(duì))三羥甲基氨基甲烷緩沖液吐溫-20(表面活性劑)NaCL(電解質(zhì))PEG-6000(反應(yīng)加速劑)廣譜殺菌劑(防腐劑)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)其余為純化水2、抗人02-MG抗體溶液(試劑R2)用lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.4)在室溫下稀釋羊抗人02_MG抗體多克隆抗體和80nm納米微球(抗體和微球的重量比例為11)，將兩者混勻后室溫振蕩吸附2小時(shí)(即本領(lǐng)域技術(shù)人員已公知的物理吸附法)，加入封閉液(含0.1%BSA三羥甲基氨基四烷緩沖液)封閉1小時(shí)，離心去上清，用lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至濃度為0.3%，并加入適量的防腐劑；即獲得日2-微球蛋白檢測(cè)試劑盒試劑(R2)。3、血清型32-MG溶液(參考校準(zhǔn)品)CAPS0(緩沖液)廣譜殺菌劑(防腐劑)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)氯化鈉(穩(wěn)定劑)其余為純化水按照所需要的02-MG參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的重組02-MG純品40mg/L加入上述溶液中，制備得40mg/L濃度的02-MG參考校準(zhǔn)品。采用本實(shí)施例對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，所得02-MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的h-MG測(cè)得值進(jìn)行比較(參見(jiàn)圖1，并進(jìn)行回歸分析)；獲知相關(guān)性r=0.9995(y=1.007x+0.0236)；顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。實(shí)施例二1、32_MG溶液(試劑隊(duì))三羥甲基氨基甲烷(緩沖液)吐溫-20(表面活性劑)NaCL(電解質(zhì))PEG-6000(反應(yīng)促進(jìn)劑)廣譜殺菌劑(防腐劑)50mmol/L0.5mmol/LlOOmmol/L4mmol/L3mmol/L5mmol/LlOOmmol/L2mmol/L2mmol/L3mmol/L166mmol/L150mmol/L4mmol/L60mmol/L8mmol/L0.lmmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5mmol/L其余為純化水2、抗人β2-MG抗體溶液(試劑R2)用150mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.4)在室溫下稀釋羊抗人β2_MG抗體多克隆抗體和IOOnm納米微球(抗體和微球的重量比例為11)，將兩者混勻后室溫振蕩吸附2小時(shí)(即本領(lǐng)域技術(shù)人員已公知的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的三羥甲基氨基四烷緩沖液封閉1小時(shí)，離心去上清，用lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至濃度為4%，并加入適量的防腐劑；即獲得β2-微球蛋白檢測(cè)試劑盒試劑(R2)。3、血清型β2-MG溶液(參考校準(zhǔn)品)CAPSO(緩沖液)150mmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)3mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)3mmol/L氯化鈉(穩(wěn)定劑)166mmol/L其余為純化水按照所需要的β2-MG參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的重組β2-MG純品60mg/L加入上述溶液中，制備得60mg/L濃度的β2-MG參考校準(zhǔn)品。采用本實(shí)施例對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，所得i32_MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的P2-MG測(cè)得值進(jìn)行比較(參見(jiàn)圖2，并進(jìn)行回歸分析)；獲知相關(guān)性r=0.9985(y=1.0264X+0.0149)；顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。實(shí)施例三1、^2-MG溶液(試劑R1)三羥甲基氨基甲烷緩沖液200mmol/L吐溫-20(表面活性劑)2mmol/LNaCL(電解質(zhì))200mmol/LPEG-6000(反應(yīng)促進(jìn)劑)5mmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)3mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2mmol/L其余為純化水2、抗人β2-MG抗體溶液(試劑R2)用200mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.4)在室溫下稀釋羊抗人β2_MG抗體多克隆抗體和120nm納米微球(抗體和微球的重量比例為11)，將兩者混勻后室溫振蕩吸附2小時(shí)(即本領(lǐng)域技術(shù)人員已公知的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的三羥甲基氨基四烷緩沖液封閉1小時(shí)，離心去上清，用lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至濃度為2%，并加入適量的防腐劑；即獲得β2-微球蛋白檢測(cè)試劑盒試劑(R2)。3、血清型β2-MG溶液(參考校準(zhǔn)品)CAPSO(緩沖液)200mmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)5mmol/L氯化鈉(穩(wěn)定劑)166mmol/L其余為純化水按照所需要的β2-MG參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的重組β2-MG純品80mg/L加入上述緩沖液中，制備得80mg/L濃度的β2-MG參考校準(zhǔn)品。采用本實(shí)施例對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，所得i32_MG的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的P2-MG測(cè)得值進(jìn)行比較(參見(jiàn)圖3，并進(jìn)行回歸分析)；獲知相關(guān)性r=0.9992(y=1.0062X+0.0285)；顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。本發(fā)明的測(cè)定條件及步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果的計(jì)算式中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>ΔAT待測(cè)樣品平均每分鐘吸光度變化值ΔAS校準(zhǔn)液平均每分鐘吸光度變化值CS校準(zhǔn)液中β2-MG的濃度尚需補(bǔ)充的是本文中凡未特別標(biāo)明的比例均為重量比。權(quán)利要求一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2-微球蛋白試劑盒，包括試劑R1、試劑R2以及參考校準(zhǔn)品；其中a、試劑R1一種使樣本中β2-微球蛋白抗原位點(diǎn)充分暴露，有利于與抗β2-微球蛋白抗體試劑充分結(jié)合的β2-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L緩沖液、0.1-5mmol/L防腐劑、0.5-5mmol/L的穩(wěn)定劑、50-200mmol/L電解質(zhì)、0.1-4mmol/L表面活性劑，其余為純化水；b、試劑R2一種結(jié)合有抗人β2-微球蛋白抗體的納米微球溶液，包括5-200mmol/L緩沖液、0.1％-5％重量比的結(jié)合有抗人β2-微球蛋白抗體的納米微球、適量的防腐劑，納米微球直徑為50-150nm；c、參考校準(zhǔn)品一種用來(lái)與樣本比較，進(jìn)行結(jié)果計(jì)算的β2-微球蛋白溶液，包括緩沖液100-200mmol/L，穩(wěn)定劑166-180mmol/，適量防腐劑2mmol/L以及根據(jù)濃度需要確定的一定量的重組人β2-微球蛋白純品，其余為純化水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2-微球蛋白試劑盒，其特征在于所述β2_微球蛋白試劑Rl中還加入反應(yīng)加速劑，濃度為3-lOmmol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2_微球蛋白試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑是乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白以及氯化鈉中的一種或多種的混I=IO4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2_微球蛋白試劑盒，其特征在于所述緩沖液是三羥甲基氨基甲烷或CAPSO。5.權(quán)利要求1所述的一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2-微球蛋白試劑盒，其特征在于所述結(jié)合有抗人β2-微球蛋白抗體的納米微球溶液的制備方法是用緩沖液在室溫下稀釋重量比例為11的抗人P2-MG抗體多克隆抗體和納米微球，將兩者混勻后室溫振蕩吸附2小時(shí)，加入含0.BSA的緩沖液封閉1小時(shí)，離心去上清，再用緩沖液稀釋至濃度為0.3%，并加入適量防腐劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清中的β2-微球蛋白的試劑盒。所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述
背景技術(shù)：
的不足，提供一種樣本無(wú)需稀釋、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適用于各種類(lèi)型的全自動(dòng)生化分析儀的納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2-微球蛋白試劑盒。技術(shù)方案是一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)β2-微球蛋白試劑盒，包括；a、試劑R1緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)、表面活性劑，其余為純化水；b、試劑R2緩沖液、結(jié)合有抗人β2-微球蛋白抗體的納米微球、防腐劑，納米微球直徑為50-150nm；c、參考校準(zhǔn)品緩沖液，穩(wěn)定劑，防腐劑以及根據(jù)濃度需要確定的一定量的重組人β2-微球蛋白純品，其余為純化水。文檔編號(hào)G01N21/31GK101813700SQ201010139410公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者王賢理,蒙凱,蔡其浩申請(qǐng)人:浙江伊利康生物技術(shù)有限公司