專利名稱：：一種載脂蛋白e檢測試劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種測定血清成分試劑的制備方法及試劑盒，特別是測定血清中APOE的試劑，可廣泛應用在醫(yī)學及生物化學
技術領域：
。
背景技術：
：載脂蛋白E(APOE)是一個含有299個氨基酸結合有磷脂的糖蛋白.其分子量為34kD。ApoE可以在各種組織中合成，但以肝臟為主，首先合成的是含有317個氨基酸的前肽，這個前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過蛋白水解作用除去18個氨基酸的信號肽，再經(jīng)過糖基化作用和細胞外液的脫唾液酸作用形成成熟的ApoE；ApoE分泌入血后即轉移到脂蛋白中。APOE是脂蛋白所必須的結構蛋白，可通過與各組織細胞的受體結合，參于脂蛋白代謝，調(diào)節(jié)膽固醇水平，激活卵磷脂腿固醇脂舫蘸轉移酶(LCAT)，并具有某種免疫調(diào)節(jié)作用。測定ApoE對診斷和治療高脂血癥動脈粥樣硬化等疾病提供了重要理論依據(jù)。已知測定APOE的方法有層析法、電泳法、免疫分析法、其中層析法和電泳法操作繁瑣，不能進行批量樣本分析和直接上全自動生化分析儀等缺點，而免疫分析法中的免疫擴散法、放射免疫分析法、熒光標記免疫分析法、酶標記免疫分析法、化學發(fā)光免疫分析法也存在諸多不足之處；如需要特殊的設備，樣品需要預處理，不能上全自動生化分析儀進行批量檢測分析等。臨床上常用的免疫透射比濁法因其樣本用量少，可直接在全自動上進行批量樣本分析、操作簡單受其歡迎；但目前建立的方法及試劑都存在一些缺點和/或不足，主要表現(xiàn)在一是抗體效價不高，特異性、親合力、親和力不好；二是校準血清是以人血清為基質(zhì)，雖然乙肝表面抗原陰性、HIV檢測陰性、丙氨酸氨基轉移酶正常的人血清，但這也很難排除沒有其他傳染病的可能，給操作者帶來很大的危險性；而且校準血清為凍干品，每批的定值不一，使用前需用水復溶，操作極其不便；另外，不同的復溶者復溶后瓶間差異大，復溶后必須冰凍保存，特別是不能反復解凍使用，不但造成試劑浪費，而且質(zhì)量也得不到保證，測定結果差異大，其穩(wěn)定性也不好；三是對高脂、黃疸、溶血樣本抗干擾能力差；四是采用單點校準液定標，不符合曲線回歸方程計算，導致出現(xiàn)高值偏低，低值偏高的現(xiàn)象，所測結果不準確；五是抗血清在短時間內(nèi)出現(xiàn)沉淀，使上機操作困難，影響檢測效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種樣本無需稀釋、操作簡單、準確度高、重復性好、抗干擾能力強，采用優(yōu)質(zhì)新生牛血清代替人血清作為基質(zhì)制備的穩(wěn)定的以液體血清型恒定值校準液聯(lián)合檢測載脂蛋白E的試劑，來解決上述
背景技術：
的不足之處。本發(fā)明提供的技術方案是一種載脂蛋白E檢測試劑，包括a、試劑Rl—種使樣品中APOE抗原位點充分暴露，有利于與抗APOE抗體充分結合的反應劑，包括5-200mmol/L緩沖液、0.1_10%的表面活性劑、0.1_40%電解質(zhì)、20%-80%高分子加速劑、0.1%-0.5%反應促進劑、0.1%-1%的穩(wěn)定劑以及適量防腐劑，其余為純化水。b、試劑R2—種與人血清中的APOE抗原有高度特異反應性的抗APOE抗體溶液，在一定量的試劑Rl中加入體積比為20-50%的抗人APOE抗血清以及0.001%-5%的抗氧化劑；C、恒定值校準液一種用來與樣品比較，進行結果計算的液體血清型溶液，包括:20-100mmol/L的緩沖液、80_160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化劑、0.01-15mmol/L的增效劑、0.l-50mmol/L的穩(wěn)定劑、適量防腐劑，其余為純化水。恒定值校準液的濃度可以是高濃度單點參考校準品，在使用時用生理鹽水稀釋成多個不同濃度的參考校準品，也可以直接制備成多個不同濃度的參考校準品，這里沒有特別的限制，只要制得的APOE恒定值校準液能與樣本比較，能夠測定樣本中恒定值校準液的含量即可。進一步，試劑R2中還加入反應促進劑聚凝胺，以縮短整個反應時間。增效劑可選用檸檬酸、灑石酸、抗壞血酸中的一種或多種?？寡趸瘎┛梢韵热芙庠贗O-IOOml丙二醇或乙醇中，然后加入試劑R2中。本發(fā)明的檢測原理是利用抗原抗體反應，加入試劑Rl(反應劑)解除樣本中抗原周圍的電子層和水化層，使抗原位點充分暴露，然后加入試劑R2(抗APOE抗體溶液)使有高度特異反應性的抗APOE抗體與樣本中相應的抗原反應，形成不溶性的抗原_抗體復合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的APOE含量成正比；在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原-抗體復合物的吸光度值，與已知恒定的校準液(ΑΡ0Ε抗原濃度相同的校準液)比較，則可計算出樣本中APOE的含量。本發(fā)明的有益效果是由于首次采用抗氧化劑的再生技術(加入增效劑)來穩(wěn)定載脂蛋白E參考校準品，提高了抗干擾能力，使校準液的值在2-8°C—年幾乎保持不變，這就顯著提高了檢測數(shù)據(jù)的準確性(與放射免疫分析法的檢測數(shù)據(jù)基本一致)，并且重復性好；另外，檢測樣本無需稀釋、能夠直接采用全自動生化分析儀，操作方法和步驟得到了大幅度的簡化，檢測效率顯著提高。圖1是本發(fā)明實施例1進行檢測所得的APOE的測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值的相互關系示意圖。圖2是本發(fā)明實施例2進行檢測所得的APOE的測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值的相互關系示意圖。圖3是本發(fā)明實施例3進行檢測所得的APOE的測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值的相互關系示意圖。具體實施例方式本發(fā)明提供的檢測試劑盒，其中主要包括一種與APOE抗原有高度特異反應活性的抗體和使樣品中APOE抗原位點充分暴露的反應劑(或稱樣品稀釋液)以及液體血清型恒定值校準液。本發(fā)明的有關細節(jié)描述如下緩沖液可以是磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、PIPES、HEPES、TAPS、甘氨酸、硼酸，或者硼酸鹽中的一種或多種；本發(fā)明優(yōu)選磷酸鹽緩沖液，緩沖液的PH值為5-10，優(yōu)選7.4-8.1。表面活性劑可選用是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，這里優(yōu)選非離子表面活性劑，作為實例有Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，這些表面活性劑可以單獨使用，也可以兩種或兩種以上混合使用，這里不作限制。電解質(zhì)可選用陰離子電解質(zhì)或陽離子電解質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選陽離子中的氯化鈉(NaCl)。高分子加速劑可選用聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一種或多種，優(yōu)選聚乙二醇6000。防腐劑可選用疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、廣譜殺菌劑中的一種或多種混合；從環(huán)保角度考慮，本發(fā)明優(yōu)選廣譜殺菌劑。防霉劑可選用丙酸鈉、脫氧乙酸中的一種或多種。穩(wěn)定劑可選用乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一種或多種混合。抗人APOE抗血清可以是羊抗人APOE抗血清、兔抗人APOE抗血清、鼠抗人APOE抗血清、?？谷薃POE抗血清中的一種?？寡趸瘎┛蛇x用丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂中的一種或多種混合。反應促進劑可選用聚凝胺。恒定值校準液是決定試劑準確度的重要因素之一；載脂蛋白APOE在液體狀態(tài)下，能自發(fā)氧化，使校準液的值在短時間內(nèi)發(fā)生很大的下降，所以必須使用抗氧化劑來減緩或阻止載脂蛋白APOE的氧化速度；但是由于時間過長或某些客觀的因素，抗氧化劑本身也發(fā)生了還原，其抗氧化效果下降。為了提高校準液在液體狀態(tài)下的穩(wěn)定性，發(fā)明人進行了長期研究后發(fā)現(xiàn)抗氧化劑被還原的同時，產(chǎn)生了一定量的自由基，在其中加入適量的增效劑，使增效劑與抗氧化劑還原產(chǎn)生的自由基作用，使抗氧化劑得以再生.從而達到提高了校準液的穩(wěn)定性。本發(fā)明首次采用抗氧化劑的再生技術(加入增效劑)來穩(wěn)定載脂蛋白E參考校準品，使校準液的值在2-8°C—年幾乎保持不變。本發(fā)明所用生化原料可全部外購。以下通過具體實施例進一步說明。實施例1試劑Rl(反應劑)磷酸鹽(緩沖液)25mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%(0.1-10%)NaCL(電解質(zhì))4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速劑)40%(20%-80%)廣譜殺菌劑(防腐劑)3%(0.-5%)聚凝胺(反應促進劑)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%(0.1%-1%)APOE抗體試劑其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應劑稀釋液(或樣本稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清400ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準液(血清型溶液):CAPSO(緩沖液)20mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)6mmol/L檸檬酸(增效劑)lOmmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)3mmol/L丙酸鈉(防霉劑)2mmol/LAPOE抗原120mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準液濃度將相應量的APOE抗原加入上述溶液中，制備得APOE恒定值校準液。APOE恒定值校準液的濃度可以是高濃度單點參考校準品，在使用時用生理鹽水稀釋成多個不同濃度參考校準品，也可以直接制備成多個不同濃度的參考校準品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8°C保存。采用本實施例獲得的APOE測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值進行比較(如圖1所示；并進行回歸分析)，獲知相關性r=0.9795(y=0.9758X-0.5125)；顯示出本實施例與放射免疫分析法具有良好的相關性。實施例2試劑Rl(反應劑)磷酸鹽(緩沖液)30mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%NaCL(電解質(zhì))4.5%PEG-6000(高分子加速劑)40%廣譜殺菌劑(防腐劑)3%聚凝胺(反應促進劑)0.3%乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應劑稀釋液(樣本稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清250ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準液(血清型溶液)CAPSO(緩沖液)50mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)6mmol/L檸檬酸(增效劑)lOmmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)3mmol/L丙酸鈉(防霉劑)2mmol/LAPOE抗原150mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準液濃度將相應量的APOE抗原上述溶液中，制備得APOE恒定值校準液。APOE恒定值校準液的濃度可以是高濃度單點參考校準品，在使用時用生理鹽水稀釋成多個不同濃度參考校準品，也可以直接制備成多個不同濃度的參考校準品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8°C保存。采用本實施例獲得的APOE測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值進行比較(如圖2所示；并進行回歸分析)，獲知相關性r=0.9889(y=1.0076X-1.3128)；顯示出本實施例與放射免疫分析法具有良好的相關性。實施例3試劑Rl(反應劑)磷酸鹽(緩沖液)200mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%(0.1-10%)NaCL(電解質(zhì))4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速劑)40%(20%-80%)廣譜殺菌劑(防腐劑)3%(0.-5%)聚凝胺(反應促進劑)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%(0.1%-1%)其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應劑(樣品稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清300ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準液(血清型溶液)CAPSO緩沖液100mmol/L丁基羥基茴香醚抗氧化劑6mmol/L檸檬酸增效劑IOmmol/L廣譜殺菌劑防腐劑2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉穩(wěn)定劑2mmol/L牛血清白蛋白穩(wěn)定劑3mmol/L丙酸鈉防霉劑2mmol/LAPOE抗原100mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準液濃度將相應量的APOE抗原上述溶液中，制備得APOE恒定值校準液。APOE恒定值校準液的濃度可以是高濃度單點參考校準品，在使用時用生理鹽水稀釋成多個不同濃度參考校準品，也可以直接制備成多個不同濃度的參考校準品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8°C保存。采用本實施例獲得的APOE測定值與通過放射免疫分析法所得的APOE測得值進行比較(如圖3所示；并進行回歸分析)，獲知相關性r=0.9967(y=0.9994X-0.9826；顯示出本實施例與放射免疫分析法具有良好的相關性。本發(fā)明的測定步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果的計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中ΔΑΤ以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值AAS以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值CS校準液中ApoE的濃度尚需說明的是本文中未特別標明的比例均為重量比。權利要求一種載脂蛋白E檢測試劑，包括a、試劑R1一種使樣品中APOE抗原位點充分暴露，有利于與抗APOE抗體充分結合的反應劑，包括5-200mmol/L緩沖液、0.1-10％的表面活性劑、0.1-40％電解質(zhì)、20％-80％高分子加速劑、0.1％-0.5％反應促進劑、0.1％-1％的穩(wěn)定劑以及適量防腐劑，其余為純化水。b、試劑R2一種與人血清中的APOE抗原有高度特異反應性的抗APOE抗體溶液，在一定量的試劑R1中加入體積比為20-50％的抗人APOE抗血清以及0.001％-5％的抗氧化劑；c、恒定值校準液一種用來與樣品比較，進行結果計算的液體血清型溶液，包括20-100mmol/L的緩沖液、80-160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化劑、0.01-15mmol/L的增效劑、0.1-50mmol/L的穩(wěn)定劑、適量防腐劑，其余為純化水。2.根據(jù)權利要求1所述的一種載脂蛋白E檢測試劑，其特征在于試劑R2中還加入反應促進劑聚凝胺。3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種載脂蛋白E檢測試劑，其特征在于所述的增效劑可選用檸檬酸、灑石酸、抗壞血酸中的一種或多種。4.根據(jù)權利要求3所述的一種載脂蛋白E檢測試劑，其特征在于所述抗氧化劑先溶解在IO-IOOml丙二醇或乙醇中，然后加入試劑R2中。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定血清中APOE的試劑。目的是提供一種樣本無需稀釋、操作簡單、準確度高、重復性好、抗干擾能力強，采用優(yōu)質(zhì)新生牛血清代替人血清作為基質(zhì)制備的穩(wěn)定的以液體血清型恒定值校準液聯(lián)合檢測載脂蛋白E的試劑。技術方案是一種載脂蛋白E檢測試劑包括a、試劑R1緩沖液、表面活性劑、電解質(zhì)、高分子加速劑、反應促進劑、穩(wěn)定劑以及適量防腐劑，其余為純化水。b、試劑R2在一定量的試劑R1中加入體積比為20-50％的抗人APOE抗血清以及抗氧化劑；c、恒定值校準液包括緩沖液、APOE抗原、抗氧化劑、增效劑、穩(wěn)定劑、適量防腐劑，其余為純化水。文檔編號G01N33/96GK101799475SQ20101013941公開日2010年8月11日申請日期2010年3月31日優(yōu)先權日2010年3月31日發(fā)明者王賢理,蒙凱,蔡其浩申請人:浙江伊利康生物技術有限公司