專利名稱：檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法及其酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種血吸蟲病的快速診斷方法，特別是一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法及其酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
1、免疫診斷在日本血吸蟲病防治中的重要性血吸蟲病是一種廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的人獸共患寄生蟲病，全球76個 國家和地區(qū)的約2億人口受感染，有6億人口受感染威脅。我國是日本血吸蟲病流行區(qū)，建 國初期曾嚴(yán)重影響了人們的正常生產(chǎn)和生活。經(jīng)過50多年的防治，已經(jīng)取得了舉世矚目的 成就，到2003年全國共有血吸蟲病病人數(shù)843007人，較建國初期(1161. 2萬人)減少了 92.74%。已有廣東、上海、福建、廣西、浙江等5省(區(qū)、市)阻斷了血吸蟲病的傳播；僅剩 湖南、湖北、江西、安徽、江蘇等5省湖區(qū)及川、滇山區(qū)未得到控制。我們在欣喜的同時，也面 臨著進(jìn)一步防治工作的巨大挑戰(zhàn)。隨著防治工作的深入，人群感染度不斷下降，低度流行區(qū) 擴(kuò)大，血吸蟲病的病原學(xué)診斷在現(xiàn)場大范圍的應(yīng)用越來越困難，不但敏感性差、費(fèi)時費(fèi)力， 且不易被群眾和工作人員接受。另一方面，現(xiàn)在控制血吸蟲病的主要手段是吡喹酮化療，但 大規(guī)模、反復(fù)單一藥物化療，可能產(chǎn)生藥物抗性，據(jù)國外報(bào)道，已經(jīng)出現(xiàn)具吡喹酮抗性的曼 氏血吸蟲株，因此研制用于血吸蟲病低度流行區(qū)的敏感性和特異性更高的診斷手段已經(jīng)被 列為第三大世界血吸蟲病防治規(guī)劃優(yōu)先研究項(xiàng)目。2、循環(huán)抗原在日本血吸蟲病免疫診斷中的作用經(jīng)過幾十年的發(fā)展，血吸蟲病免疫診斷技術(shù)已具有較高的敏感性、特異性和可行 性。檢測血吸蟲循環(huán)抗體是一種成本低、操作簡單的檢測，也是目前現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查時應(yīng) 用最廣的途徑，但循環(huán)抗體在治療后相當(dāng)長一段時間內(nèi)仍保持較高水平，不易區(qū)分既往感 染和現(xiàn)癥感染，無法在現(xiàn)場應(yīng)用時確定目標(biāo)化療人群；而且難以反映藥物療效，不宜用作療 效考核的評價指標(biāo)。另一種途徑是檢測循環(huán)抗原，循環(huán)抗原(circulating antigen, CAg) 是存在于患者血液、唾液、尿液等體液中的血吸蟲蟲體的代謝產(chǎn)物及分泌物，檢測患者血清 或尿液中的循環(huán)抗原，可評估蟲負(fù)荷數(shù)和活動性感染，可以作為診斷的依據(jù)。而且，在治療 后，CAg轉(zhuǎn)陰較快，檢測循環(huán)抗原可以作為療效考核的依據(jù)，基于循環(huán)抗原檢測的各種方法 層出不窮，但都困擾在敏感性低、特異性不強(qiáng)的問題上，因此尋找敏感性高、特異性強(qiáng)的循 環(huán)抗原檢測方法和技術(shù)是血吸蟲病免疫診斷的新方向。3、IgY用作免疫診斷抗體的可行性卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY)是鳥類、兩棲和爬行類動物主 要的免疫球蛋白。IgY是一種系統(tǒng)型抗體，可根據(jù)抗原分子的大小結(jié)合1 2個抗原，顯示 為單價或二價。IgY相對分子質(zhì)量(Mr)為180000，沉降系數(shù)約為7. 8，包含2個重鏈(H)和 2個輕鏈(L)，重鏈相對分子質(zhì)量(Mr)為68000，比IgG(H) (Mr50000)稍重。IgY的免疫學(xué)特 性(1)由于種系發(fā)生距離相差很大，禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發(fā)生交叉血 清學(xué)反應(yīng)。(2)不與類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factors,RF)結(jié)合。(3)不會激活補(bǔ)體系統(tǒng)。(4)不結(jié)合細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞表面Fc受體，使得IgY在雙重免疫組化方面比IgG更具優(yōu) 勢。(5)與IgG幾無交叉反應(yīng)，常用于循環(huán)復(fù)合物的測定.基于以上優(yōu)點(diǎn)，IgY技術(shù)在醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，特別是一些免疫診斷技術(shù)如沉淀反應(yīng)、免疫電泳、ELISA、免疫電鏡 和免疫印跡，表明IgY完全可以取代傳統(tǒng)的IgG。免疫十天后，在雞體內(nèi)即可獲得高滴度的 抗體，而且效價穩(wěn)定，可以持續(xù)6-28周。另外，免疫雞的飼養(yǎng)簡單，花費(fèi)少，符合3個RS[替 代(r印lacing)、減少(reducing)、改善(refining)]的動物保護(hù)原則，減少了對動物的傷 害。鑒于IgY的產(chǎn)量大、穩(wěn)定性好、獨(dú)特的免疫學(xué)特性以及動物種系發(fā)生學(xué)距離遠(yuǎn)等優(yōu)點(diǎn)， 被稱為最有潛力的哺乳動物抗體替代品4.單克隆抗體技術(shù)在血吸蟲病免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用自Kohler和Milstein(1975)發(fā)明單克隆抗體制備技術(shù)以來，單抗技術(shù)廣泛運(yùn)用 于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的各個領(lǐng)域，為疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療提供了重要的手段。單克隆 抗體是由一個細(xì)胞產(chǎn)生的，其成分(類，亞類，型和結(jié)合P位等)是同源的，只針對復(fù)雜抗 原的一個抗原決定簇，并有相同的親和性，抗體滴度也很高，檢測循環(huán)抗原具有高度的特異 性，抗原和單抗可規(guī)?；a(chǎn)，方法簡便實(shí)用，且具有較好的療效考核價值，可區(qū)分現(xiàn)癥感 染與既往感染，可用于血吸蟲病的免疫診斷和流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法及其酶聯(lián)免疫試劑盒，所 述的這種血吸蟲循環(huán)抗原的檢測方法及其酶聯(lián)免疫試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)檢測血吸蟲循 環(huán)抗原的方法敏感性低、特異性不強(qiáng)的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法，包括一個制備抗血吸蟲可溶性蟲 卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗體的步驟，包括一個采用雜交瘤技術(shù)制備抗血吸蟲可溶 性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體[產(chǎn)生于小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細(xì)胞 株A1E3)，保藏號CGMCC NO 3642]的步驟，包括一個選取抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的 特異IgY多克隆抗體的步驟，所述的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗 體用于包被固相載體，包括一個選取抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體用于制 備酶結(jié)合物的步驟，所述的單克隆抗體用于制備酶結(jié)合物，在上述步驟均實(shí)行之后，將待測 血清樣品滴于包被好的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗體的固相載體 中，保溫反應(yīng)并洗滌后，加入酶標(biāo)記抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體，保溫反 應(yīng)并洗滌后，形成抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗體-循環(huán)抗原-酶 標(biāo)抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物，加入底物顯色，終止顯色后通過酶標(biāo)議讀數(shù)，確定 樣品陰陽性結(jié)果，陽性標(biāo)本形成有色產(chǎn)物，而陰性則無。進(jìn)一步的，在制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗體的步驟 中，又包括如下步驟1)制備日本血吸蟲的可溶性抗原；2)抗原免疫及雞蛋的收集；3)抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的特異IgY多克隆抗體的提取與純化。進(jìn)一步的，在采用雜交瘤技術(shù)制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體 [產(chǎn)生于小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細(xì)胞株A1E3)，保藏號CGMCC NO 3642]的步驟中，所述的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原SEA單克隆抗體的制備方法如下(一 )包括一個動物免疫的步驟，在一個動物免疫的步驟中，先制備日本血吸蟲的 可溶性抗原，然后通過日本血吸蟲的可溶性抗原免疫動物；( 二)包括一個細(xì)胞融合的步驟；(三)包括一個雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化的步驟；
(四)包括一個將單克隆細(xì)胞株注入動物內(nèi)產(chǎn)生抗體的步驟；(五)包括一個純化血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆抗體的步驟；(六)還包括一個標(biāo)記血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆抗體的步驟。本發(fā)明還提供了一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括了包被有包被 原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、血吸蟲病陰性血清、 顯色液、終止液。進(jìn)一步的，所述的濃縮洗滌液為0. 01 0. 05mol/L pH值7. 0-7. 4，含有吐溫 20的0. 3%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。進(jìn)一步的，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的 18-22倍稀釋的工作液，優(yōu)選的為上述濃縮洗滌液的20倍稀釋工作液。進(jìn)一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶時，顯色液為過氧化氫(A液)和 四甲基聯(lián)苯胺(B液)，終止液為2mol/L的硫酸。進(jìn)一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖 液，終止液為lmol/L氫氧化鈉緩沖液。進(jìn)一步的，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒?yàn)感染血吸蟲家兔血 清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。進(jìn)一步的，所述的酶標(biāo)板為96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板；進(jìn)一步的，所述的包被緩沖液為pH值9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。本發(fā)明還提供了一種抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆細(xì)胞株，其分類命名為 小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸蟲病單克隆抗體細(xì)胞株A1E3)，該細(xì)胞株保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2010 年3月3號，保藏號為3642。該細(xì)胞株是由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞融合得到 的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明還提供了一種抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體，由所述的小鼠雜交瘤細(xì) 胞單克隆細(xì)胞株CGMCC NO 3642產(chǎn)生。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(一 )本發(fā)明的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的雙抗體夾心法為兩步法，敏感性高、特異性 強(qiáng)、重復(fù)性好，分別適合批量標(biāo)本的檢測和療效考核；( 二)本發(fā)明的一種血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，此試劑盒操作簡便、快 速，檢測急、慢性血吸蟲病病人血清，檢出率高，適合醫(yī)院檢驗(yàn)科、疾病防控中心、社康中心 等部門用于血吸蟲病的臨床診斷、療效考核和流行病學(xué)調(diào)查，具有很高的實(shí)用價值。


圖1是本發(fā)明的一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法的原理圖，其中，1代表包被抗日 本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體IgY(Anti-SEA-IgY)的固相載體；2代表血清(循環(huán) 抗原)；3代表酶標(biāo)記抗血吸蟲可溶性抗原單克隆抗體；4代表抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗 原多克隆抗體IgY-循環(huán)抗原_酶標(biāo)記抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體IgY的制備方法如下1.日本血吸蟲可溶性抗原的制備將每只感染1500條日本血吸蟲尾蚴(來自中 國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所)的7只新西蘭兔在42天后按常規(guī)方法解剖，從 肝臟中分離收集蟲卵并凍干。取干卵稱重，按的比例溶于0.9%的生理鹽水中，研磨后， 置4°C冷浸，期間每天振搖2次，每次2分鐘。4天后冰浴超聲粉碎，每次3分鐘，間歇3分 鐘，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4°C離心30分鐘，取上清，收集分裝，用Braford法 測定抗原蛋白濃度，-20°C保存?zhèn)溆谩?.抗原免疫及雞蛋的收集將日本血吸蟲SEA抗原50 μ g與等量弗氏完全佐劑混 合、充分乳化后，經(jīng)海藍(lán)蛋雞雙翅翅根靜脈注射。4周后，用SEA抗原與等體積弗氏不完全佐 劑加強(qiáng)免疫一次，劑量同上。以后4周直接用抗原加強(qiáng)免疫一次，劑量同首次。收集免疫后 4-20周的雞蛋，并做好標(biāo)記，4°C冰箱儲存。3.特異抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原多克隆抗體IgY的提取與純化用卵黃分離 器取卵黃，雙蒸水清洗后量筒計(jì)量，與PH為5. 2的雙蒸水按1 8稀釋，置常溫?cái)嚢?. 5小 時，后在_20°C冷凍3小時，再放4°C緩慢融化，40C 5000rpm離心25分鐘，取上清即獲得IgY 粗提液。加入等體積的飽和硫酸銨溶液，放置3小時，在4°C IOOOOrpm, 25分鐘離心，將離心 后的沉淀稀釋到原卵黃液體積，再加入1/2的飽和硫酸銨溶液，4°C放置3小時。此過程反 復(fù)2-3次。所得沉淀經(jīng)透析、濃縮至原蛋黃液的1/10 (或用聚乙二醇6000濃縮)，分裝到冷 凍管中-20°C保存。實(shí)施例2抗血吸蟲SEA單克隆抗體的制備方法如下(一 )動物免疫①抗原制備將每只感染1500條日本血吸蟲尾蚴(來自中國疾病預(yù)防控制中心寄 生蟲病預(yù)防控制所)的7只新西蘭兔在42天后按常規(guī)方法解剖，從肝臟中分離收集蟲卵并 凍干。取干卵稱重，按1 %的比例溶于0. 9 %的生理鹽水中，研磨后，置4°C冷浸，期間每天振 搖2次，每次2分鐘。4天后冰浴超聲粉碎，每次3分鐘，間歇3分鐘，共3次。再如上冷浸 2天，10000rpm4°C離心30分鐘，取上清，收集分裝，用Braford法測定抗原蛋白濃度，_20°C 保存?zhèn)溆谩＂诿庖邉游锏倪x擇選用6 8w的雌性BALB/c小鼠。初次免疫將血吸蟲可溶性 抗原(SEA)與弗氏完全佐劑混合并乳化完全，按25 IOOyg/只劑量腹腔注射小鼠。4周 后用相同劑量的SEA與弗氏不完全佐劑混合乳化進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周，再用SEA單 獨(dú)加強(qiáng)免疫2次，用ELISA法檢測免疫效價，達(dá)到1/10000以上時，進(jìn)行最后一次尾靜脈加 強(qiáng)免疫，三天后取脾臟融合。(二)細(xì)胞融合取骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫脾細(xì)胞按1 5 1 10比例在PEG4000作用下進(jìn)行融合，融合好后雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，Α)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，Τ)的培養(yǎng)基(HAT)中進(jìn)行選擇生 長，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。(三)雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即用SEA進(jìn)行篩選， 挑選出針對SEA的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行克隆化，直到獲得分泌穩(wěn)定的針對SEA的單克隆細(xì)胞株。 一種抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆細(xì)胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞(日本血吸 蟲病單克隆抗體細(xì)胞株Α1Ε3)，該細(xì)胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2010年3月3號，保藏號為3642。(四)將此抗小鼠雜交瘤細(xì)胞(CGMCC3642)注入BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，1 2周后 小鼠腹腔產(chǎn)出大量的抗體，小心抽取腹水，離心得到大量針對SEA的單克隆抗體腹水上清。(五)所述的血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的單克隆抗體的純化方法如下①飽和硫酸銨溶液的配制500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室 溫過夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.8。②鹽析吸取IOml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶 液5. Oml ；繼續(xù)緩慢攪拌30min ； 10000r/min離心15min ；棄去上清液，沉淀物用1/3飽 和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重復(fù)前一步1 2次；沉淀物溶于1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 緩沖液中。③脫鹽常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過S印hadex G_50層析柱， 以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速lml/min。第一個蛋白峰即為脫鹽的 抗體溶液。透析法是將透析袋于2% NaHCO3, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸餾水清洗 透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋lOmin，冷至室溫即可使用(并可于0.2mol/L EDTA 溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50 100倍體積的PBS或Tris-HCl 緩沖液透析(4°C) 12 24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11.5g，碘化鉀 8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml)檢測，直至透析外液無黃色物形成為 止。④蛋白質(zhì)含量的測定(Pr)(mg/ml) = (1. 45 X OD280-O. 74XD260) X 稀釋倍數(shù)；或 (Pr) =OD28tlX 稀釋倍數(shù)/3⑤分裝凍存?zhèn)溆谩?六)標(biāo)記抗血吸蟲可溶性抗原(SEA)的單克隆抗體所述的標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)或堿 性磷酸酶(alkaline phosohatase，AP)，其標(biāo)記過程如下(一 )辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的常用方法 是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG 氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用 過碘酸鈉氧化先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定SchifT氏堿。其 操作步驟如下①將5mg HRP 溶于 0.5ml 0. lmol/L NaHCO3 溶液中；加 0. 5mll0mmol/L NaIO4 溶 液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時；
②加0. 75ml 10. lmol/L Na2CO3 混勻；③加入0. 75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等(15mg/ml)，混勻；④稱取S印hadex G25干粉0. 3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨 后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用(避光)3小時或4°C過夜；⑤用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30min ；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(或4°C 過夜)；⑥將交聯(lián)物過S印hadex G200或S印harose 6B (2. 5 X 50cm)層析純化，分管收集 第一峰；
⑦酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定酶活性和抗體活性的測定，可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、 DAB-H2O2顯色反應(yīng)測定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性；⑧HRP抗體結(jié)合物的保存加入等量甘油后，小量分裝_20°C存放，防止反復(fù)凍融； 或加入等量60%甘油4°C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性，必要時還可以凍 干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。(二)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記堿性磷酸酶(AP)用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法， 將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結(jié)合，制備成 結(jié)合物。其程序如下①將5mg AP加入Iml抗體溶液(2mg/ml)中溶解，裝入透析袋，于4°C對0. Olmol/ L pH 7. 2PBS透析18小時，換液三次。②加入2. 5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時，4°C對PBS透析過夜，其間換液三次。③換用0. 05mol/L PH8. OTris-HCl緩沖液透析，4°C過夜，換液三次。④取出標(biāo)記抗體，用含1 % BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標(biāo)記物原液。⑤每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?shí)施例3 —種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法如圖1所示，本發(fā)明的一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法包括如下步驟(一)選擇抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的多克隆抗體IgY用于包被固相載體(1)，抗 血吸蟲蟲卵可溶性抗原單克隆抗體用于制備酶結(jié)合物；( 二)將人或鼠、兔類血清等待測樣品(2)滴于包被好抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原 的多克隆抗體IgY的固相載體(1)中，保溫反應(yīng)并洗滌后，加入酶標(biāo)記抗血吸蟲蟲卵可溶 性抗原的單克隆抗體(3)，保溫反應(yīng)并洗滌后，形成抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的多克隆抗體 IgY-循環(huán)抗原_酶標(biāo)抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物(4)，加底物顯色后陽性標(biāo)本形 成有色產(chǎn)物，而陰性則無，終止顯色后通過酶標(biāo)議讀數(shù)，確定樣品陰陽性結(jié)果。實(shí)施例4 一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒(一 )本發(fā)明還提供了一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有 包被原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽性血清、陰性血清、顯色 液、終止液。進(jìn)一步的，所述的濃縮洗滌液為0. 01 0. 05mol/L pH值7. 0-7. 4，含有吐溫20,0. 3%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。進(jìn)一步的，所述的樣品稀釋液為洗滌緩沖液，洗滌緩沖液為上述濃縮洗滌液的20倍稀釋工作液。進(jìn)一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶時，顯色液為過氧化氫(A液)和 四甲基聯(lián)苯胺(B液)，終止液為2mol/L的硫酸。進(jìn)一步的，當(dāng)所述的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖 液，終止液為lmol/L氫氧化鈉緩沖液。進(jìn)一步的，所述的血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒?yàn)感染血吸蟲家兔血 清，所述的血吸蟲病陰性血清為健康人血清或正常兔血清。進(jìn)一步的，所述的酶標(biāo)板為96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板；進(jìn)一步的，所述的包被緩沖液為pH值9. 6，0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。具體的所述的一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法如下①包被有包被原的酶標(biāo)板用包被緩沖液(pH值9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖 液)抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的多克隆抗體IgY稀釋成200 μ g/ml，在96孔可拆卸聚苯乙 烯酶標(biāo)板每孔加入100μ 1，37°C孵育2h，倒去包被液，用19倍稀釋的濃縮洗滌液洗2 3 次，每次30s，拍干，然后加入100 μ 1封閉液(10%脫脂奶粉)，37°C孵育lh，倒去孔內(nèi)液體， 干燥后真空密封保存。②酶標(biāo)記物如例一所述，為HRP標(biāo)記；③濃縮洗滌液0. 01 0. 05mol/L pH值7. 0-7. 4，含有吐溫20,0. 3%疊氮化
鈉的磷酸鹽緩沖液；④樣品稀釋液洗滌緩沖液；⑤血吸蟲病人陽性血清、陰性血清陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒?yàn)感染血吸 蟲尾蚴家兔血清；陰性血清為健康人血清或正常兔血清。⑥顯色液所述當(dāng)酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶時，顯色液為過氧化氫(A液)51. 4ml0. 2mol/ L的Na2HPO4與48. 6ml0. lmol/L的檸檬酸混合并用HCl調(diào)pH至5. 1 5. 4，最后加入 67 μ 130%的H2O2 ；四甲基聯(lián)苯胺(B液)將四甲基聯(lián)苯胺50mg，無水乙醇5ml，0. lmol/L的 檸檬酸，0. lmol/L的EDTA 0. 5ml，加蒸餾水至IOOrnl ；⑦終止液將純硫酸與蒸餾水按體積比1 17的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。實(shí)施例5 —種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法將人或家兔陽性、陰性血清100 μ 1滴于包被有包被原的酶標(biāo)板中，370C孵育25 30min后，倒出孔內(nèi)液體，用19倍稀釋的濃縮洗滌液液洗3 5次，每次30s，拍干，加入HRP 標(biāo)記抗血吸蟲SEA單克隆抗體，37°C孵育25 30min，倒出孔內(nèi)液體，用19倍稀釋的濃縮洗 滌液洗3 5次，每次30s，拍干，加底物顯色液100 μ 1后37°C避光顯色5 lOmin，每孔加 入終止液(2mol/L硫酸溶液)50μ 1，混勻，用酶標(biāo)議測定每孔吸光值(0D值)，樣品OD值大 于規(guī)定的陰性對照OD值的2. 1倍，即判為陽性。實(shí)施例6試劑盒特異性、靈敏度檢測①特異性檢測20份急性血吸蟲病人血清、23份慢性血吸蟲病人血清、20份正常 人血清、10份蛔蟲病人血清、10份肝吸蟲病人血清、20份肺吸蟲病病人血清、10份囊蟲病病人血清、10份鞭蟲病人血清、10份裂頭蚴病人血清、10份鉤蟲病人血清、10份旋毛蟲病人血 清、10份弓形蟲病人血清，采用實(shí)施例4制備的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn) 行檢測，結(jié)果檢測急性、慢性血吸蟲病人血清陽性率分別為100%和91.3%，20份正常人血 清特異性為90%，除與蛔蟲、肺吸蟲、囊蟲病人血清存在少量交叉反應(yīng)外，與其他寄生蟲無 交叉反應(yīng)。②靈敏度檢測用實(shí)施例4制備的樣品稀釋液對SEA進(jìn)行梯度稀釋，用實(shí)施例4制 備的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測，以樣品稀釋液為空白對照，以實(shí)施 例4制備的陽性、陰性血清為陽性、陰性對照，結(jié)果如表1所示，表明該酶聯(lián)免疫試劑盒檢測 血吸蟲循環(huán)抗原的最低檢測值(檢測限)為3 μ g/ml。表1.血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏度檢測
權(quán)利要求
一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法，其特征在于所述的方法中包括一個制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的步驟，包括一個采用雜交瘤技術(shù)制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟，包括一個選取用于包被固相載體的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的步驟，包括一個選取用于制備酶結(jié)合物的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟，在上述步驟均實(shí)行之后，將待測血清樣品滴于包被好的抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的固相載體中，保溫反應(yīng)并洗滌后，加入酶標(biāo)記抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體，保溫反應(yīng)并洗滌后，形成抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體 循環(huán)抗原 酶標(biāo)抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體夾心復(fù)合物，加入底物顯色，終止顯色后通過酶標(biāo)儀讀數(shù)，確定樣品陰陽性結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法，其特征在于所述的制備抗血吸 蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的步驟中又包括如下步驟，1)制備日本血吸蟲的可溶性抗原；2)抗原免疫及雞蛋的收集；3)抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的提取與純化。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法，其特征在于所述的采用雜交瘤 技術(shù)制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟中又包括如下步驟，1)一個動物免疫的步驟，在所述的動物免疫的步驟中，先制備日本血吸蟲的可溶性抗 原，然后通過日本血吸蟲的可溶性抗原免疫動物；2)一個細(xì)胞融合的步驟；3)一個雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆化的步驟；4)將單克隆細(xì)胞株注入動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的步驟；5)一個純化抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體的步驟；6)一個標(biāo)記抗血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體的步驟。
4.一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括了包 被有包被捕獲抗體的酶標(biāo)板、包被緩沖液、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、血吸蟲病陽 性血清、血吸蟲病陰性血清、顯色液、終止液。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 濃縮洗滌液為0.01 0. 05mol/L, pH值為7.0 7. 4，含有吐溫20的0. 3%疊氮化鈉 的磷酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 樣品稀釋液為洗滌緩沖液，所述的洗滌緩沖液為濃縮洗滌液的18-22倍稀釋的工作液。
7.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶，顯色液為過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺，終止液為2mol/L的硫 酸。
9.如權(quán)利要求7所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，終止液為lmol/L氫氧化鈉緩沖 液。
10.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 血吸蟲病陽性血清為血吸蟲病人血清或?qū)嶒?yàn)感染血吸蟲家兔血清，所述的血吸蟲病陰性血 清為健康人血清或正常兔血清。
11.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 酶標(biāo)板為96孔可拆卸聚苯乙烯酶標(biāo)板。
12.如權(quán)利要求4所述的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的 包被緩沖液為PH值為9. 6的0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
13.一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC N0:3642。
14.一種血吸蟲可溶性抗原的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求13所述的小鼠雜 交瘤細(xì)胞CGMCC NO 3642產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法，包括一個制備抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體的步驟，一個采用雜交瘤技術(shù)制備酶標(biāo)抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體的步驟，包括一個選取多克隆抗體用于包被固相載體的步驟，包括一個選取抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的單克隆抗體用于制備酶結(jié)合物的步驟，包括一個形成抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原的特異IgY多克隆抗體-循環(huán)抗原-酶標(biāo)抗血吸蟲SEA單克隆抗體夾心復(fù)合物的步驟，加入底物顯色讀數(shù)的步驟。本發(fā)明還提供了一種檢測血吸蟲循環(huán)抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，分別適合批量標(biāo)本的檢測和療效考核。
文檔編號G01N33/543GK101968485SQ201010144849
公開日2011年2月9日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者田利光, 蔡玉春, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所