專利名稱：白花蛇舌草有效部位及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種白花蛇舌草有效部位及其制備方法、 檢測(cè)方法，以及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白花蛇舌草是民間常用的一種中藥，其味苦、甘、性寒，歸心、肺、肝、大腸經(jīng)。主要功效為清熱解毒，利濕，抗癌，主治肺熱喘咳、咽喉腫痛、腸癰瘡瘍、毒蛇咬傷、熱淋澀痛、水腫、痢疾、腸炎、濕熱黃疽、癌腫等。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)白花蛇舌草的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究，其抗腫瘤的有效成分多而且較為復(fù)雜。但是迄今未見涉及白花蛇舌草有效部位及其制備方法和用途的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白花蛇舌草有效部位及其制備方法，還提供一種白花蛇舌草有效部位的檢測(cè)方法，還提供一種白花蛇舌草在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明白花蛇舌草有效部位的制備方法為提取取藥材白花蛇舌草加8-16重量倍的45-80%乙醇，提取1_3次，每次1_3小時(shí)，合并提取液，濃縮；純化以石油醚萃取濃縮物的水溶液2-5次，去除石油醚層，上D-101型大孔樹脂柱，上樣濃度為2. 6-5. 2mg/mL，按照2-6mL/min的吸附流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，其中徑高比為 1 4 1 13，分別用水、10-30%、20-45%、25-60%乙醇溶液以2-5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集25-60%洗脫部分并蒸干，溫度不高于60°C，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量為50-85%。本發(fā)明白花蛇舌草有效部位的檢測(cè)方法為如下含量測(cè)定中的一種或幾種本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量測(cè)定精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品0. 0015-0. 0038重量份，置IOmL量瓶中，加水6-10體積份，以功率250W，頻率40kHz超聲處理3_8分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，其中每ImL含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 267mg ；取本發(fā)明白花蛇舌草有效部位0. 02-0. 04重量份，精密稱定，置IOmL量瓶中，加水 6-12體積份，以功率250W，頻率40kHz超聲處理15-30分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻， 即得。取0. 2-0. 8體積份待測(cè)溶液，置IOmL量瓶中，50-85 %乙醇加至2-8體積份，加入 30-70%鹽酸1-3體積份，搖勻，80°C水解15-40分鐘，取出，立即冷卻，加入1_3體積份對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，用50-85%乙醇定容，搖勻，室溫放置20-45分鐘，在640nm處用分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量為 85% -96%。本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量測(cè)定
色譜條件色譜柱采用YMC-C18柱250mmX4. 6mm，5 μ m ；檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm ；進(jìn)樣量為10 μ L，流速為l.OmL/min;柱溫為30°C ；以乙腈為流動(dòng)相A，以0. 05%甲酸水溶液為 流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為時(shí)間O 15 20 30 60分鐘，流動(dòng)相A乙腈由 15% 20% 20% 25% 25% ；對(duì)照品溶液的制備精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品適量，力口 40-60%甲醇制成每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 105mg的溶液；精密量取上述 6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯溶液0. 5-1. 5體積份，置IOmL量瓶中，加40-60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯20. 9 μ g的溶液；供試品溶液的制備取本發(fā)明白花蛇舌草有效部位0. 0025-0. 0048重量份，精密稱定，置IOOmL量瓶中，加40-60%甲醇60-85體積份，以功率250W，頻率40KHz超聲處理 8-12分鐘，取出，放冷，加40-60 %甲醇至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液， 即得；測(cè)定法分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、及供試品溶液各0. 008-0. 012體積份，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯計(jì)為 60-85%。本發(fā)明所述的重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。本發(fā)明白花蛇舌草有效部位可以單獨(dú)、組合或與其它任何中西藥物按任意比例配伍，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成膠囊齊 、片齊 、丸齊 、顆粒齊 、口服液體制齊 、注射劑等藥學(xué)上可接受的各種劑型。其中注射液原料純度大于80%。本發(fā)明通過(guò)對(duì)白花蛇舌草的有效部位進(jìn)行純化，并進(jìn)行了白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷和6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯的含量測(cè)定，進(jìn)而明確了該有效部位中抗腫瘤的有效成分，有利于提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。同時(shí)，通過(guò)小鼠的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)以及與臨床常用抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺的對(duì)照，顯示本發(fā)明白花蛇舌草有效部位的抗腫瘤作用明顯。


圖1 圖A為樣品紫外吸收?qǐng)D，圖B為樣品液相圖，圖C為對(duì)照品液相圖，圖D，E為樣品質(zhì)譜2 總環(huán)烯醚萜苷光譜掃描3 6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4 6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5 6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線下面實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1白花蛇舌草純化后有效部位的鑒定實(shí)驗(yàn)條件儀器=Waters-Micromass(HPLC-MS)色譜條件如(表1);色譜柱YMC-C18柱(250mm X 4. 6mm, 5 μ m)；
流動(dòng)相流動(dòng)相A為水(0. 05%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度條件見下表1 ；流速1· OmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)3IOnm；柱溫35°C；進(jìn)樣體積10 μ L。表1液相分析梯度洗脫條件考察
權(quán)利要求
1.一種白花蛇舌草有效部位，其特征在于該有效部位由如下方法制成取藥材白花蛇舌草加8-16重量倍的45-80%乙醇，提取1-3次，每次1_3小時(shí)，合并提取液，濃縮；以石油醚萃取濃縮物的水溶液2-5次，去除石油醚層，上D-101型大孔樹脂柱，上樣濃度為2. 6-5. 2mg/mL,按照2-6mL/min的吸附流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，其中徑高比為 1 4 1 13，分別用水、10-30%、20-45%、25-60%乙醇溶液以2-5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集25-60%洗脫部分并蒸干，溫度不高于60°C，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量為50-85%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種白花蛇舌草有效部位，其特征在于該有效部位由如下方法制成取藥材白花蛇舌草加12重量倍60 %乙醇，提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，濃縮； 以石油醚萃取濃縮物的水溶液3次，去除石油醚層，上D-101型大孔樹脂柱，上樣濃度為 3.733mg/mL，按照4mL/min的吸附流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，其中徑高比為1 10，分別用水、 20%、30%、40%乙醇溶液以3mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集40 %洗脫部分并蒸干，溫度不高于60°C，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量為70%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種白花蛇舌草有效部位的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取藥材白花蛇舌草加8-16重量倍的45-80%乙醇，提取1-3次，每次1_3小時(shí)，合并提取液，濃縮；以石油醚萃取濃縮物的水溶液2-5次，去除石油醚層，上D-101型大孔樹脂柱，上樣濃度為2. 6-5. 2mg/mL，按照2-6mL/min的吸附流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，其中徑高比為 1 4 1 13，分別用水、10-30%、20-45%、25-60%乙醇溶液以2-5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集25-60%洗脫部分并蒸干，溫度不高于60°C，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量為50-85%。
4.如權(quán)利要求3所述的一種白花蛇舌草有效部位的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取藥材白花蛇舌草加12重量倍60 %乙醇，提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，濃縮； 以石油醚萃取濃縮物的水溶液3次，去除石油醚層，上D-101型大孔樹脂柱，上樣濃度為 3.733mg/mL，按照4mL/min的吸附流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，其中徑高比為1 10，分別用水、 20%、30%、40%乙醇溶液以3mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集40%洗脫部分并蒸干，溫度不高于60°C，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量為70%。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種白花蛇舌草有效部位的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下含量測(cè)定中的一種或幾種本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量測(cè)定精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品0. 0015-0. 0038重量份，置IOmL量瓶中，加水6-10體積份，以功率250W， 頻率40kHz超聲處理3-8分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，其中每ImL 含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 267mg ；取本發(fā)明白花蛇舌草有效部位0. 02-0. 04重量份，精密稱定，置IOmL量瓶中，加水6-12體積份，以功率250W，頻率40kHz超聲處理15-30 分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得；取0. 2-0. 8體積份待測(cè)溶液，置IOmL量瓶中，50-85%乙醇加至2-8體積份，加入30-70%鹽酸1_3體積份，搖勻，80°C水解15-40分鐘，取出，立即冷卻，加入1-3體積份對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，用50-85 %乙醇定容，搖勻，室溫放置20-45分鐘，在640nm處用分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量為85% -96% ；本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量測(cè)定色譜條件色譜柱采用YMC-C18柱250mmX4. 6mm，5 μ m ；檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm ；進(jìn)樣量為10 μ L，流速為 1. OmL/min ；柱溫為30°C ；以乙腈為流動(dòng)相A，以0. 05%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為時(shí)間O 15 20 30 60分鐘，流動(dòng)相A乙腈由15% 20% 20% 25% 25% ；對(duì)照品溶液的制備精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品適量，加40-60%甲醇制成每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 105mg的溶液；精密量取上述6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯溶液0. 5-1. 5體積份，置IOmL量瓶中，加40-60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯20. 9 μ g的溶液；供試品溶液的制備取本發(fā)明白花蛇舌草有效部位0. 0025-0. 0048重量份，精密稱定，置IOOmL量瓶中， 加40-60%甲醇60-85體積份，以功率250W，頻率40KHz超聲處理8_12分鐘，取出，放冷，加 40-60%甲醇至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得；測(cè)定法分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、及供試品溶液各0. 008-0. 012體積份，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得；本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯計(jì)為60-85%。
6.如權(quán)利要求5所述的一種白花蛇舌草有效部位的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下含量測(cè)定中的一種或幾種本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量測(cè)定精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品2. 67mg,置IOmL量瓶中，加水8mL，以功率250W，頻率40kHz超聲處理5 分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，其中每ImL含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 267mg ；取本發(fā)明白花蛇舌草有效部位28mg，精密稱定，置IOmL量瓶中，加水8mL，以功率250W，頻率40kHz超聲處理20分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得；取0. 5mL待測(cè)溶液，置IOmL量瓶中，75%乙醇加至4mL，加入50%鹽酸2. OmL，搖勻，80°C水解20min，取出，立即冷卻，加入2mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，用75 %乙醇定容，搖勻，室溫放置30min，在 640nm處用分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中總環(huán)烯醚萜苷的含量95. 51% ；本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯含量測(cè)定色譜條件色譜柱采用YMC-C18柱250mmX4. 6mm，5 μ m ；檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm;進(jìn)樣量為10 μ L，流速為 1. OmL/min ；柱溫為30°C ；以乙腈為流動(dòng)相A，以0. 05%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為時(shí)間O 15 20 30 60分鐘，流動(dòng)相A乙腈由15% 20% 20% 25% 25% ；對(duì)照品溶液的制備精密稱取6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯0. 105mg的溶液；精密量取上述 6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯溶液lmL，置IOmL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每Iml含6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯20. 9 μ g的溶液；供試品溶液的制備取實(shí)施例1制備的本發(fā)明白花蛇舌草有效部位3. 62mg，精密稱定，置IOOmL量瓶中，加50%甲醇80mL，以功率250W，頻率40KHz超聲處理10分鐘，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，用0. 45 μ m 的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得；測(cè)定法分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、及供試品溶液各(10 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得；本發(fā)明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯計(jì)為69. 76%。
7.如權(quán)利要求1或2所述的一種白花蛇舌草有效部位在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白花蛇舌草有效部位及其制備方法，本發(fā)明通過(guò)對(duì)白花蛇舌草的有效部位進(jìn)行純化，并對(duì)其中總環(huán)烯醚萜苷和6-O-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯進(jìn)行了含量測(cè)定，進(jìn)一步明確了該有效部位中抗腫瘤的有效成分，有利于提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性；同時(shí)，通過(guò)小鼠的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)以及與臨床常用抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺的對(duì)照，顯示本發(fā)明白花蛇舌草有效部位的抗腫瘤作用明顯。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102218097SQ20101014506
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者王英鋒, 鄭宜 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)