專利名稱：一種蘇丹紅Ⅰ的酶聯(lián)免疫吸附分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蘇丹紅I的半抗原合成及其免疫分析方法。屬于免疫分析化學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蘇丹紅(Sudan dyes)是一類人工合成的親脂性偶氮化合物，主要分為四類(I、 II、III、IV)，其中蘇丹紅II、III、IV都是蘇丹紅I的衍生物。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅 歸為三類致癌物，即動物致癌物，目前尚不確定對人類有致癌作用。2003年英國、法國等許 多歐盟國家相繼發(fā)現(xiàn)了進(jìn)口辣椒和食品中含有蘇丹紅，引發(fā)了全球的“蘇丹紅”風(fēng)暴。我國 自2005年3月開始，也相繼在辣椒調(diào)味品、成鴨蛋及唇膏等產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)蘇丹紅，最常見的是 蘇丹紅I和蘇丹紅IV。蘇丹紅殘留常規(guī)的分析主要是應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)或者高效液相色譜_質(zhì) 譜(HPLC-MS)等儀器方法在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。應(yīng)用這些理化分析技術(shù)對食品、生物和環(huán)境等樣 品中痕量蘇丹紅殘留進(jìn)行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過繁復(fù)的分離、提 取、凈化等前處理過程，分析速度慢、成本高，前處理過程需要使用大量的有機(jī)溶劑，容易造 成環(huán)境污染。許多理化分析技術(shù)本身就具有局限性，如蘇丹紅I的熱穩(wěn)定性差，難于用氣相 色譜法分析，而液相色譜尚缺乏選擇性好的高靈敏度檢測器等。隨著待檢樣品、特別是要求 現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的儀器分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開發(fā) 和應(yīng)用高效率的蘇丹紅快速分析技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述不足，公開了一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、 操作方法簡單的ELISA方法，用于食品中蘇丹紅I的批量、快速檢測。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種蘇丹紅I的酶聯(lián)免疫吸附 分析方法，其是以人工合成的半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)作為免疫原制備蘇丹紅 I多克隆抗體；以所述半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)的復(fù)合物作為包被抗原，進(jìn)行競爭性 ELISA，其中所述半抗原為4-(2_羥基-1-萘偶氮基)苯甲酸(Sl)、4-(2-羥基-1-萘偶氮 基)苯丁酸(S2)、4’ -(2-羥基-1-萘偶氮基)聯(lián)苯-4-甲酸(S3)、6-羥基-5-(苯偶氮 基)-2_萘甲酸(S4)、2-(l-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸(S5)和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧 基)戊酸(S6)中的任意一種。本發(fā)明主要根據(jù)蘇丹紅I的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)及合成蘇丹紅I的6種半抗原；再 將半抗原與BSA偶聯(lián)后制備人工免疫原，分別免疫新西蘭大耳白兔制備出蘇丹紅I多克隆 抗體。然后以6種半抗原與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物作為包被抗原，分別吸附于酶標(biāo)板孔壁上，用 定量蘇丹紅I做抑制試驗(yàn)，對每種抗體進(jìn)行篩選，選出抑制效果最好的抗體和包被抗原組 合，建立蘇丹紅I的競爭性ELISA方法。在番茄醬和辣椒粉樣品中添加定量的蘇丹紅I，樣 品經(jīng)簡單前處理后用建立的ELISA檢測，計(jì)算準(zhǔn)確度和精確度，對ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證。
本發(fā)明的方法，其中所述半抗原通過活性酯法與BSA和OVA偶聯(lián)。其中，本發(fā)明的6種蘇丹紅I的半抗原(S1-S6)合成的技術(shù)路線如下 其中，蘇丹紅I抗體的制備過程中所用的免疫原優(yōu)選是半抗原S2、S4、S6與BSA的 偶聯(lián)復(fù)合物(BSA-S2、BSA-S4和BSA-S6)。包被抗原是所有6種半抗原分別與OVA的偶聯(lián) 復(fù)合物(OVA-SI、0VA-S2、0VA-S3、0VA-S4、0VA-S5 和 0VA-S6)。最后篩選出抑制效果最好的抗體和包被抗原組合是抗BSA-S2抗體和包被抗原 OVA-Sl0即蘇丹紅I多克隆抗體以4-(2_羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸與BSA偶聯(lián)的復(fù)合物 為免疫原；以4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯甲酸與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物作為包被抗原。其中，蘇丹紅I的競爭性ELISA方法原理是酶標(biāo)板上的每個孔均包被有相同量的包被抗原，依次加入待測蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、多克隆抗體，固相包被抗原和待測蘇丹紅 I相互競爭與抗體反應(yīng)，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測的 蘇丹紅I濃度高時，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標(biāo)二抗與被固定抗體結(jié)合 量少，用洗滌液洗滌后加入底物液和顯色液，顯色反應(yīng)淺，用酶標(biāo)儀檢測的OD值低，表明抑 制率高；反之，當(dāng)待測蘇丹紅I濃度低 時，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知的蘇丹 紅I濃度檢測所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測蘇丹紅I的濃度。根據(jù)本發(fā)明提供的ELISA 方法和現(xiàn)有的技術(shù)，可以制備出直接使用的ELISA試劑盒，其可以含有上述抗蘇丹紅I多克 隆抗體、吸附在酶標(biāo)板上的上述包被抗原、蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 抗體(酶標(biāo)二抗)、濃縮緩沖液(PBST，含0. 05% (v/v)Tween20的磷酸鹽緩沖液，ρΗ7· 4)、 樣品稀釋液(含10%甲醇的PBST)、顯色液(Α液和B液)、終止液(2Μ的硫酸液)等等，方 便直接使用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測食品中的蘇丹紅I殘留，樣品的前處理過程簡 單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。本發(fā)明對 解決大批量樣品的蘇丹紅I殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，抗體來源于免疫原BSA-S2，包被抗原為0VA-S1。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1蘇丹紅I半抗原的合成及結(jié)構(gòu)鑒定(1)半抗原4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯甲酸(Si)的合成及鑒定將1. 37g 4-氨基苯甲酸溶于50ml水中，冰浴冷卻至0_5°C，在攪拌狀態(tài)下逐滴加 入12ml濃鹽酸，然后加入5ml亞硝酸鈉溶液(0. 7g)，混合液繼續(xù)攪拌lOmin，溫度控制為 0-5°C。將1. 44g 2-萘酚溶于30ml氫氧化鈉溶液(10%，w/v)中，用冰浴預(yù)冷后再加入到 上述混合液中，攪拌30min后，反應(yīng)液用真空抽濾，產(chǎn)物用去離子水洗滌，最后用甲醇重結(jié) 晶后得到純化半抗原Si，產(chǎn)率約為60%。結(jié)構(gòu)鑒定屯NMR(DMSO) δ (ppm) :15·89(1Η，s, ArOH), 13. 03 (1Η, s, COOH), 8. 47 (1Η, d, J = 7. 7Hz, Ar), 8. 06 (2Η, d, J = 6. 9Ηζ, Ar), 7. 96 (1Η, d, J = 9. 6Ηζ, Ar)，
7.88 (2Η, d，J = 6. 9Hz, Ar)，7. 75 (1Η, d，J = 7. 7Hz, Ar)，7. 61 (1Η, t，J = 4. 4Hz, Ar) ,7. 50 (1H, t, J = 4. 4Hz, Ar) ,6. 80 (1H, d, J = 9. 6Hz，Ar). 13C NMR(DMSO) δ (ppm) 175. 99 (COOH)，166. 87，146. 81,142. 41，132. 87，131. 24，131. 24，130. 34，129. 72，129. 37， 128. 31，128. 25，127. 00，125. 66，121. 92，117. 55，117. 55 (Ar). (2)半抗原4- (2-羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸(S2)的合成及鑒定半抗原S2的合成方法與半抗原Sl合成方法類似，用4-氨基苯丁酸替代4-氨基 苯甲酸，半抗原S2的產(chǎn)率約為55% .結(jié)構(gòu)鑒定^H NMR(DMSO) δ (ppm) :15·65(1Η，s, ArOH), 12. 10 (1Η, s, C00H),
8.61 (1Η, d, J = 8. 2Hz, Ar)，7. 98 (1Η, d, J = 9. 3Hz, Ar)，7. 86-7. 74 (3Η, m, Ar)，7. 47 (1H, t, J = 7. 3Hz, Ar)，7. 39 (1H, d, J = 8. 4Hz, Ar)，7. 27 (2H, d, J = 7. 5Hz, Ar)，
7.Ol (1H, d, J = 9. 3Hz, Ar)，2. 68 (2H, t, J = 7. 6Hz CH2CH2COOH)，2. 26 (2H, t, J = 7. 3Hz CHaCH2CH2), 1. 85 (2H, m, J = 7. 4Hz CH2CH2CH2). 13C NMR (DMSO) δ (ppm) 174. 34 (COOH)， 165. 43，144. 44，142. 94，138. 97，132. 81，129. 86，129. 86，129. 13，129. 02，128. 91，127. 96， 126. 22，122. 75，121. 37, 119. 80，118. 74，108. 78，108. 78 (Ar)，34. 26 (CH2CHiCH2COOH)， 33. 18 (CH2CH2CH2COOH)，26. 28 (CH2CH2CH2C00H).(3)半抗原4’ -(2-羥基-1-萘偶氮基)聯(lián)苯-4-甲酸(S3)的合成及鑒定半抗原S3的合成方法與半抗原Sl合成方法類似，用4’ -氨基-4-羧基聯(lián)苯替代 4-氨基苯甲酸，半抗原S3的產(chǎn)率約為40% .結(jié)構(gòu)鑒定屯NMR(DMSO) δ (ppm) :15·83(1Η，s, ArOH), 13. 05 (1Η, s, C00H),
8.57 (1Η, d, J = 8. IHz, Ar)，8. 05 (1Η, d, J = 8. 4Hz, Ar)，8. 00-7. 87 (9Η, m, Ar)，7. 80 (1Η, d, J = 8. 0Hz, Ar) ,7. 46 (1Η, t, J = 8. OHz, Ar) ,6. 93 (1Η, d, J = 9. 4Hz, Ar). 13C NMR(DMSO) δ (ppm) :168. 62 (C00H)，144. 89，140. 96，140. 04，139. 35，132. 84，130. 13，130. 13，129. 60，
129.26，129. 07，128. 81，128. 25，128. 25，128. 03，126. 08，126. 08，126. 03，126. 03，123. 96， 121. 51，119. 77，119. 77 (Ar).(4)半抗原6-羥基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸(S4)的合成及鑒定半抗原S4的合成方法與半抗原Sl合成方法類似，用6-羥基-2-萘甲酸和苯胺分 別替代2-萘酚和4-氨基苯甲酸，半抗原S4的產(chǎn)率約為58% .結(jié)構(gòu)鑒定=1HNMR(DMSO) δ (ppm) :15·84(1Η，s, ArOH), 13. 06 (1Η, s, C00H), 8. 64 (1Η, d, J = 8. 6Hz，Ar) ,8. 44 (1Η, s, Ar), 8. 11 (2Η, t, J = 9. IHz, Ar), 7. 90 (2Η, d, J = 7. OHz, Ar), 7. 58 (2Η, t, J = 7. 8Ηζ, Ar), 7. 44 (1Η, t, J = 7. 3Ηζ, Ar), 7. 03 (1Η, d, J = 9. 4Hz, Ar). 13C NMR(DMSO) δ (ppm) : 168. 60 (C00H)，167. 23，145. 33，140. 04，135. 81，
130.97，129. 97，129. 97，129. 02，128. 85，128. 85，127. 86，127. 38，124. 67，121. 63，119. 57， 119. 57(Ar).(5)半抗原2- (1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸(S5)的合成及鑒定將100ml丙酮加入到250ml圓底燒瓶中，再加入1. 05g蘇丹紅I和IOg碳酸鉀，攪 拌使其成懸濁液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將1.48g溴乙酸乙酯逐滴加入到反應(yīng)液中，加熱回流反應(yīng) 大約24h，冷卻至室溫。真空抽濾去除濾渣，蒸干濾液中的丙酮，殘留物加入到50ml含4% 氫氧化鈉(w/v)的甲醇中，混合液加熱回流反應(yīng)2h，冷卻至室溫，蒸干甲醇，將殘留物溶于 50ml水中，用6M的HCl調(diào)整溶液的pH值至6. 0，析出紅色沉淀，該沉淀經(jīng)晾干后再以重結(jié) 晶方法純化，最終產(chǎn)物半抗原S5的產(chǎn)率約為42% .結(jié)構(gòu)鑒定=1HNMR(DMSO) δ (ppm) 13. 11 (1H，s，COOfl)，8. 25 (1H，d，J = 8. 4Hz，Ar)， 8. 03 (1H, d, J = 9. 3Hz, Ar)，7. 96 (3H, d, J = 9. 6Hz, Ar)，7. 68-7. 48 (6H, m, Ar)，4. 93 (2H, s, OCHa). 13C NMR(DMSO) δ (ppm) 170. 36 (C00H), 153. 07,147. 74,135. 82,131. 60,131. 17, 129. 66，129. 66，129. 13，128. 24，128. 23，127. 22，124. 87，122. 76，122. 51，122. 51,116. 29， 66. 53 (OCH2).(6)半抗原5- (1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸(S6)的合成及鑒定半抗原S6的合成方法與半抗原S5合成方法類似，用5-溴戊酸乙酯替代溴乙酸乙 酯，半抗原S6的產(chǎn)率約為44% .
結(jié)構(gòu)鑒定^H NMR(DMSO) δ (ppm) :12·03(1Η，s, C00H) ,8. 30 (1H, d, J = 8. 5Hz, Ar)，8. 04 (1H, d, J = 9. IHz, Ar)，7. 97-7. 92 (3Η, m, Ar)，7. 66-7. 46 (5H, m, Ar)，7. 45 (1H, t, J = 5. 8Hz, Ar) ,4. 21 (2H, t, J = 5. 7Hz, OCH2CH2)，2. 27 (2H, t, J = 7. OHz, CH2CH2COOH)， 1. 70 (4H, m, J = 5. IHz, OCH2CH2Ce^CH2) . 13C NMR(DMSO) δ (ppm) :174· 50 (COOH)，153. 18， 148. 02，135. 58，131. 42，131. 32，131. 32，129. 59，128. 76，128. 20，128. 00，127. 94，124. 58， 122. 62，122. 30，122. 30，116. 61 (Ar)，69. 59 (0CH2)，33. 43 (CH2COOH)，28. 50 (OCH2CH2CH2)， 21. 33 (OCH2CH2CH2).實(shí)施例2蘇丹紅I多克隆抗體制備 利用半抗原中的羧基，以活性酯法分別將半抗原S2，S4和S6與BSA偶聯(lián)制備免疫 原，凍干保存。將2mg免疫原溶于Iml生理鹽水中，再與Iml完全弗氏佐劑混合，充分乳化 后注射新西蘭大耳白兔大腿，每一種免疫原免疫2只兔子。以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，換 用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開始，每次免疫后 一周從兔耳靜脈采血檢測血清效價(jià)?？偣布訌?qiáng)免疫7次，最后一次免疫后一周從兔頸動脈 采全血，用35%的飽和硫酸銨鹽析法純化兔抗血清，獲得較純的蘇丹紅I多克隆抗體。實(shí)施例3蘇丹紅I的競爭性ELISA方法用活性酯法將所有半抗原(S1-S6)分別與OVA偶聯(lián)制備包被抗原，以蘇丹紅I作 抑制物，用競爭性ELISA法對每一種抗體進(jìn)行篩選，其步驟如下(1)包被用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100μ 1，4°C包被過夜。(2)洗板每孔加入200 μ 1的PBST (含0. 05% (v/v) Tween20的磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4)，放置lmin，再甩掉洗滌液，重復(fù)3次，將板內(nèi)殘留PBST在吸水紙上拍干。(3)封閉加入封閉液150 μ 1/孔，在室溫條件下靜置1. 5h，棄封閉液，洗板同上。 封閉液配制100ml碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)中加入Ig明膠。(4)競爭反應(yīng)每孔加入50μ 1的蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)液或待測的樣品，標(biāo)準(zhǔn)液和樣品稀 釋液均用含10%甲醇的PBST ；再加入50 μ 1的抗體，抗體稀釋液為PBST，在室溫下反應(yīng)lh， 洗板。(5)加酶標(biāo)二抗將羊抗兔酶標(biāo)二抗用PBST按1 10，000稀釋，每孔加入100 μ 1，
在室溫下反應(yīng)lh，洗板。(6)顯色=A 液配制過氧化脲 Ig, 10. 3g 檸檬酸，35. 8g Na2HPO4 · 12H20, Tween-20 100 μ 1，蒸餾水 1000ml，ρΗ5 ；B 液配制四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 700mg (40ml DMSO 溶解)，10. 3g 檸檬酸，蒸餾水1000ml，pH2. 4-2. 6。將A液和B液按1 1混合，然后每孔加入100 μ 1，室 溫條件下避光顯色10-15min。(7)終止及測定每孔加入50 μ 1濃度為2Μ的硫酸液終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀于 450nm波長測定各孔的OD值。根據(jù)表1的結(jié)果，蘇丹紅I抑制效果最好的組合是抗BSA-S2的抗體和包被抗原 0VA-S1，因此該組合被用于建立蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用于樣品分析。表1不同抗體與包被抗原組合蘇丹紅I的IC5tl值 NA表示未檢測 實(shí)施例4蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線應(yīng)用實(shí)施例3的ELISA方法，建立蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，抗體(來源于BSA-S2 ) 和包被抗原(OVA-Sl)的最佳工作濃度用方陣法篩選獲得，抗體和包被抗原的濃度均為 1 10，000。蘇丹紅I的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度設(shè)置范圍為O lOOng/ml。以 四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn) 曲線(見圖1)，靈敏度用抑制最高OD值一半時所需的蘇丹紅I的濃度表示，即抑制中濃度 IC5tl值，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC5tl值為1. 6ng/ml。最低檢測限(LOD)以ICltl表示，該值為0. 02ng/ ml。曲線的線性范圍IC2ci-IC8tl值為0. l-15ng/ml。實(shí)施例5抗體的特異性實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)構(gòu)類似物蘇丹紅(I，II，III，IV)、蘇丹紅G、對位紅、1-氨基-2-萘酚、晚 霞黃、2-萘酚和苯胺作為待測物，測得各物質(zhì)的IC5tl值，再用下列方程式計(jì)算抗體對這些物 質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對蘇丹紅I的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。交叉反應(yīng)(CR%) = IC50 (蘇丹紅 I)/IC5tl (供試物)X 100%實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表2，采用間接ELISA法，多克隆抗體與對位紅存在一定的交叉反 應(yīng)(12.8% )，原因是蘇丹紅I與對位紅的結(jié)構(gòu)非常接近，唯一的不同是對位紅結(jié)構(gòu)中苯環(huán) 對位有一個硝基?？贵w對其它結(jié)構(gòu)相近或相似物質(zhì)均無明顯的交叉反應(yīng)(< 0. 3% )。說 明該抗體的特異性好，可確保對樣品中蘇丹紅I殘留測定結(jié)果的可靠性。表2抗體與蘇丹紅I結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)

實(shí)施例6蘇丹紅I酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒本例中，試劑盒包含如下部分(1)吸附了包被抗原(OVA-Sl)的96孔酶標(biāo)板。(2)以BSA-S2為免疫原制備的抗蘇丹紅I多克隆抗體。
(3)蘇丹紅I的標(biāo)準(zhǔn)液。(4)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(酶標(biāo)二抗)。(5)濃縮緩沖液(PBST)的配方為氯化鈉Sg、磷酸二氫鉀0. 2g、磷酸氫二鈉3g、氯 化鉀 5g、Tween-20 2ml、蒸餾水 20ml。(6)樣品稀釋液含10%甲醇的PBST。(7)顯色 A 液過氧化脲 Ig, 10. 3g 檸檬酸，35. 8g Na2HP04 · 12H20, Tween-20 100 μ 1，蒸餾水 1000ml，pH5 ；顯色B 液四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 700mg(40ml DMSO溶解)，10. 3g 檸檬酸，蒸餾水lOOOmL，pH2. 4-2. 6。(8) 2M的硫酸液。本試劑盒組裝完成后，在4°C下至少可保存6個月。實(shí)施例7樣品檢測從超市中購買番茄醬和辣椒粉樣品，經(jīng)HPLC-GC鑒定樣品中不含蘇丹紅等添加 齊U。分別稱取2. Og番茄醬和辣椒粉在50ml燒杯中，往樣品中添加蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品，使番 茄醬中蘇丹紅I的終濃度為0. 5μ g/g，ly g/g和5μ g/g，辣椒粉中蘇丹紅I的終濃度為 1.0μβ/^，5μβ/^*20μβ/^。樣品前處理往燒杯中加入20ml的甲醇，超聲萃取lOmin， 過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘留物用5ml的甲醇/PBST混合液(v/v，l/9)溶解，溶液經(jīng) 0.45 μ m醋酸纖維素膜過濾后，用建立的蘇丹紅I的ELISA方法進(jìn)行測定。因?yàn)樘崛∫褐?的各種基質(zhì)對ELISA有干擾，所以采用PBST (含10%甲醇)稀釋樣品的方法消除基質(zhì)的影 響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，番茄醬和辣椒粉的提取液所需的最小稀釋倍數(shù)是20倍和50倍。添加回 收的檢測結(jié)果見表3，批內(nèi)分析的平均回收率是60. 8-96. 8%，變異系數(shù)6. 4-16. 2% ；批間 分析的平均回收率是58. 5-92. 4%，變異系數(shù)1. 8-17. 5%。該方法的準(zhǔn)確度和精確度均符 合實(shí)際檢測要求，可用于蘇丹紅I在食品中的快速篩查。表3樣品中蘇丹紅I的ELISA檢測結(jié)果 通過以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供了一種蘇丹紅I的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，涉 及6種蘇丹紅I半抗原的合成及結(jié)構(gòu)鑒定、蘇丹紅I多克隆抗體的制備、最佳的抗體和包被 抗原組合篩選、蘇丹紅I免疫分析方法的建立。本發(fā)明的特點(diǎn)是合成多種不同的半抗原，從 而增加了抗體和包被抗原的多樣性，通過篩選不同的抗體和包被抗原組合，建立了一種異 源性的蘇丹紅I的ELISA方法，該方法靈敏度達(dá)0. 02ng/ml，能準(zhǔn)確地檢測食品中的蘇丹紅I殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能作為一種儀器檢測方法的補(bǔ)充，對樣品進(jìn)行篩查。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種蘇丹紅I的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于，其是以人工合成的半抗原與BSA偶聯(lián)作為免疫原制備蘇丹紅I多克隆抗體；以所述半抗原與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物作為包被抗原，進(jìn)行競爭性酶聯(lián)免疫吸附分析，其中所述半抗原為4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯甲酸、4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸、4’-(2-羥基-1-萘偶氮基)聯(lián)苯-4-甲酸、6-羥基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸、2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸中的任意一種。
2.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于，所述半抗原通過活性酯 法與BSA和OVA偶聯(lián)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于，所述蘇丹紅I多克隆 抗體以4-(2_羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸與BSA偶聯(lián)的復(fù)合物為免疫原。
4.如權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于，所述包被抗原為4-(2-羥 基-1-萘偶氮基)苯甲酸與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的酶聯(lián)免疫吸附分析方法用于檢測番茄醬和辣椒粉樣品 中的蘇丹紅I殘留量。
6.一種檢測蘇丹紅I殘留量的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于，其含有的抗 體為以人工合成的半抗原與BSA偶聯(lián)作為免疫原制備的蘇丹紅I多克隆抗體；包被抗原 為所述半抗原與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物；其中所述半抗原為4-(2_羥基-1-萘偶氮基)苯甲 酸、4-(2_羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸、4’ -(2-羥基-1-萘偶氮基)聯(lián)苯-4-甲酸、6-羥 基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸、2- (1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸和5- (1-苯偶氮基-2-萘 氧基)戊酸中的任意一種。
7.如權(quán)利要求6所述的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于，所述半抗原通過活性 酯法與BSA和OVA偶聯(lián)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于，所述蘇丹紅I多克 隆抗體以4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯丁酸與BSA偶聯(lián)的復(fù)合物為免疫原。
9.如權(quán)利要求8所述的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于，所述包被抗原為 4-(2-羥基-1-萘偶氮基)苯甲酸與OVA偶聯(lián)的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘇丹紅I的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其是以人工合成的半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)作為免疫原制備蘇丹紅I多克隆抗體；以所述半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)的復(fù)合物作為包被抗原，進(jìn)行競爭性酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。本發(fā)明的方法能準(zhǔn)確靈敏地檢測食品中的蘇丹紅I殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。本發(fā)明對解決大批量樣品的蘇丹紅I殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號G01N33/535GK101839907SQ20101014525
公開日2010年9月22日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者李季, 王佳, 許艇, 韋克毅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)