專(zhuān)利名稱(chēng)：一種小軸海綿活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞的標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋動(dòng)物細(xì)胞的鑒定以及活性天然產(chǎn)物的代謝研究，具體地說(shuō)是小軸海綿(Anixella sp.)中活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞(所指的儲(chǔ)存細(xì)胞，其學(xué)名為“小球細(xì)胞”，英文為“Spherulous Cell”簡(jiǎn)稱(chēng)Sp細(xì)胞)的一種化學(xué)染色標(biāo)記方法； 本發(fā)明可簡(jiǎn)便準(zhǔn)確地鑒別該類(lèi)細(xì)胞，并為細(xì)胞培養(yǎng)和活性產(chǎn)物代謝提供分化和調(diào)控指標(biāo)。
背景技術(shù)：
海綿是海洋天然藥源活性產(chǎn)物的重要來(lái)源，在海綿各種類(lèi)型的細(xì)胞中，Sp細(xì)胞 (Sp細(xì)胞)是活性產(chǎn)物的重要貯存場(chǎng)所。我國(guó)南海小軸海綿(Axinellasp.)中發(fā)現(xiàn)的兩種具有治療骨關(guān)節(jié)炎和老年癡呆癥活性的生物堿，debromohymenialdisine (DBH)和 hymenialdisine(HD)，也存在于該海綿的Sp細(xì)胞中。鑒于Sp細(xì)胞具有儲(chǔ)藏次生代謝產(chǎn)物的特性，在目前的海綿細(xì)胞培養(yǎng)體系——細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的過(guò)程中，定向調(diào)控向Sp細(xì)胞分化，是具有應(yīng)用前景的活性化合物生產(chǎn)方式。而對(duì)Sp細(xì)胞的分化跟蹤和定性定量研究，需要找到一種其獨(dú)有而穩(wěn)定的標(biāo)記方法。目前對(duì)海綿細(xì)胞種類(lèi)的鑒定，主要以形態(tài)觀察為主。電鏡觀察比較清晰準(zhǔn)確，但制樣過(guò)程較繁瑣；光鏡觀察雖簡(jiǎn)便但有一定局限性。對(duì)于小軸海綿而言，雖然Sp細(xì)胞在光鏡下有顯著的深棕色特征，但細(xì)胞于玻片上干燥后再浸潤(rùn)，便會(huì)喪失其顏色特性而變透明 (由于溶脹導(dǎo)致內(nèi)部小顆粒泄露所致)，不利于后續(xù)的觀察鑒定。另外在小軸海綿中，除深棕色的Sp細(xì)胞外，還有部分內(nèi)含顆粒的灰色細(xì)胞，在光鏡觀察時(shí)容易與Sp細(xì)胞混淆(圖 Ι-a)。細(xì)胞化學(xué)染色方法能夠原位顯示細(xì)胞的內(nèi)含物質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)便和顯色穩(wěn)定的特點(diǎn)， 可彌補(bǔ)電鏡和光鏡鑒定方法的不足。以往的海綿細(xì)胞化學(xué)染色研究多集中于對(duì)常規(guī)細(xì)胞內(nèi)含物(如DNA、RNA、糖原、月旨肪等)的檢測(cè)，此外也有關(guān)于海綿細(xì)胞的酸性磷酸酶和脂酶的活性報(bào)道。然而相關(guān)資料表明，迄今為止尚未能對(duì)海綿中的某類(lèi)細(xì)胞建立特異性的染色標(biāo)記。使用細(xì)胞化學(xué)染色方法表征小軸海綿種活性產(chǎn)物儲(chǔ)藏細(xì)胞(Sp細(xì)胞)，具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小軸海綿中活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞(Sp細(xì)胞)的簡(jiǎn)便可靠的鑒別方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為小軸海綿活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞(Sp細(xì)胞)的標(biāo)記方法，使用3，3' _ 二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)染色液對(duì)固定后的海綿細(xì)胞染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，顆粒狀著染的細(xì)胞為小軸海綿活性產(chǎn)物的儲(chǔ)存細(xì)胞(Sp細(xì)胞)。具體操作步驟為取小軸海綿細(xì)胞，使用含2-4%甲醛或2-3%戊二醛的無(wú)鈣鎂海水(CMFASW) (CMFASW中可含10-30mMEDTA)固定0. 5-1. 5小時(shí)，離心收集細(xì)胞，加入CMFASW調(diào)整細(xì)胞 懸液密度約為IO7個(gè)/ml，涂于載玻片，細(xì)胞涂片干燥后用蒸餾水浸泡除去鹽分，向玻片上的細(xì)胞區(qū)域滴加3，3' _ 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液，室溫染色5-8分鐘，洗掉染色液，光學(xué)顯微鏡放大400倍以上觀察，細(xì)胞內(nèi)含有深棕色著染顆粒(直徑1-3 μ m)的，為小軸海綿活性產(chǎn)物的儲(chǔ)存細(xì)胞(Sp細(xì)胞)。所述的海綿細(xì)胞可以是海綿組織離散的細(xì)胞，也可以是細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞；無(wú)鈣鎂海水，可以是常規(guī)配方的不含鈣鎂離子的人工海水，其中NaCl含量30-35g/L ；3， 3' _ 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液的組成為3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)2.5-10g/L，過(guò)氧化氫(H2O2) 0. 1_1%，三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base) 3-10g/L，ρΗ7· 2-7. 4。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1.本方法簡(jiǎn)便易行，與電子顯微鏡觀察鑒定相比，避免了使用復(fù)雜的制樣流程和昂貴的試劑儀器，節(jié)約了操作成本和時(shí)間。2.光學(xué)顯微鏡下觀察，小軸海綿中除了深棕色的Sp細(xì)胞(圖Ι-a箭頭所指)以夕卜，還有部分深灰色細(xì)胞(圖Ι-a三角所指)，兩者易于混淆；本方法使用化學(xué)染色法顯示小球細(xì)胞內(nèi)部獨(dú)有的過(guò)氧化物酶體，與單純的外觀觀察相比，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。3.過(guò)氧化物酶是廣泛存在于動(dòng)植物中的一類(lèi)酶，但很多細(xì)胞的酶活水平不足以在化學(xué)染色中顯色(如圖5所示的繁茂膜海綿，就無(wú)明顯著染細(xì)胞)，本發(fā)明充分利用了小軸海綿Sp細(xì)胞與其它類(lèi)別細(xì)胞在酶活性質(zhì)上的巨大差異，以DAB染色方法，清晰地顯示了活性產(chǎn)物儲(chǔ)存 細(xì)胞，便于在細(xì)胞分化和代謝調(diào)控研究中的大規(guī)模計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)。4.細(xì)胞經(jīng)染色后可長(zhǎng)期保存和觀察。


圖1為小軸海綿組織固定后離散，細(xì)胞經(jīng)DAB染色的照片(圖中箭頭指示Sp細(xì)胞， 三角指示外觀易與Sp細(xì)胞混淆的灰色細(xì)胞)(a)組織固定后初離散，(b)細(xì)胞經(jīng)DAB染色后(比例尺=50 μ m)；圖2為小軸海綿不同類(lèi)型細(xì)胞的DAB染色照片(a)富集的Sp細(xì)胞，(b)富集Sp 細(xì)胞的DAB染色，(c) 29g離心的大細(xì)胞，摻雜個(gè)別Sp細(xì)胞(箭頭所指為Sp細(xì)胞)，(d) 29g 離心大細(xì)胞的DAB染色，摻雜的Sp細(xì)胞陽(yáng)性著染(箭頭所指為Sp細(xì)胞)，(e) IlOg離心的小細(xì)胞，不含Sp細(xì)胞，(f) IlOg離心的小細(xì)胞的DAB染色，不含Sp細(xì)胞，染色結(jié)果為陰性， 比例尺25 μ m ；圖3為小軸海綿不同類(lèi)型細(xì)胞蛋白提取物的非變性凝膠電泳(native-PAGE)富集的Sp細(xì)胞、29g和IlOg離心細(xì)胞的蛋白提取物考馬斯亮藍(lán)(CBB)和DAB染色，顯示了 Sp 細(xì)胞的特有DAB陽(yáng)性條帶(CB)；圖4小軸海綿細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)5天離散后DAB染色照片(a)離散的細(xì)胞，(b)離散細(xì)胞的DAB染色(箭頭所指為Sp細(xì)胞，三角所指為吞噬Sp細(xì)胞后的原細(xì)胞)，Sp細(xì)胞為顆粒狀著染，吞噬Sp細(xì)胞后的原細(xì)胞為彌散狀著染(不含陽(yáng)性染色顆粒)，兩者易于區(qū)分，比例尺 50 μ m ；圖5繁茂膜海綿細(xì)胞的DAB染色照片(a)離散的細(xì)胞，(b)離散細(xì)胞的DAB染色 (如圖所示，繁茂膜海綿中并無(wú)明顯的細(xì)胞著染，DAB顆粒狀著染是小軸海綿中Sp細(xì)胞的特異性標(biāo)志)，比例尺50 μ m。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)操作實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，小軸海綿采集自中國(guó)南海西沙海域，使用顯微照相技術(shù)進(jìn)行染色觀察。實(shí)施例1海綿組織離散后DAB染色顯示活性產(chǎn)物儲(chǔ)藏細(xì)胞(Sp細(xì)胞)取新鮮的小軸海綿組織，于含IOmM EDTA的CMFASW中浸泡10分鐘，棄去浸泡液， 加入含4%甲醛的CMFASW，1. 5小時(shí)后輕輕擠壓組織塊，得到的細(xì)胞液29g離心，棄上清，力口入CMFASW成為細(xì)胞懸液，取20 μ 1涂片，干片后浸入蒸餾水，取出后向細(xì)胞區(qū)域中滴加DAB 染色液(DAB 10g/L, H2O2O. 1%, Tris-Base 9. 68g/L，ρΗ7· 4)，染色 5min，自來(lái)水洗掉染液， 光鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)含有深棕色著染顆粒的為Sp細(xì)胞(圖1)。實(shí)施例2 小軸海綿不同細(xì)胞組分的DAB染色取細(xì)胞分離得到的不同組分富集的Sp細(xì)胞(圖2-a)、29g離心的大細(xì)胞(含個(gè)別Sp細(xì)胞，圖2-c)和IlOg離心的小細(xì)胞(不含Sp細(xì)胞，圖2-e)，加入含2. 5%戊二醛的 CMFASff,固定0. 5小時(shí)，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液涂片，干燥后用蒸餾水浸泡除去鹽分，向玻片上的細(xì)胞區(qū)域滴加DAB染色液(DAB 2. 5g/L，過(guò)氧化氫l%，Tris-Base 3. 63g/L，pH7. 2)， 染色8分鐘，洗掉染色液，光學(xué)顯微鏡放大400倍以上觀察，富集的Sp細(xì)胞內(nèi)含有深棕色著染顆粒(圖2-b)，500rpm大細(xì)胞中含個(gè)別顆粒狀著染的Sp細(xì)胞(圖2_d)，IOOOrpm小細(xì)胞中不含Sp細(xì)胞(無(wú)著染，圖2-f)；將這幾類(lèi)細(xì)胞的蛋白提取物進(jìn)行非變性電泳，發(fā)現(xiàn)參與 DAB反應(yīng)的酶只存在于Sp細(xì)胞中(圖3)。該實(shí)施例充分表明，在小軸海綿中只有Sp細(xì)胞具有DAB顆粒狀著染的特征，并且相關(guān)的過(guò)氧化物酶為Sp細(xì)胞的特征蛋白。實(shí)施例3小軸海綿細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞DAB染色取培養(yǎng)5天的小軸海綿細(xì)胞團(tuán)，于含30mM EDTA的CMFASW中離散，加入甲醛至終濃度2 %，固定1小時(shí)后細(xì)胞離心，棄上清，加入CMFASW成為細(xì)胞懸液，取20 μ 1涂片，干燥后浸入蒸餾水，取出后向細(xì)胞區(qū)域中滴加DAB染色液(DAB 5g/L，H2O2 0.4%, Tris-Base 6. 05g/L，pH7. 2)，染色5min，自來(lái)水洗掉染液，光鏡下觀察，部分吞噬了 Sp細(xì)胞的原細(xì)胞呈整體彌散狀著染，不符合Sp細(xì)胞的特征，易于與Sp細(xì)胞區(qū)分，而細(xì)胞內(nèi)含有深棕色著染顆粒的為Sp細(xì)胞(圖4)。該實(shí)施例表明，DAB顆粒狀著染鑒定Sp細(xì)胞的方法，不僅適用于組織剛離散得到的細(xì)胞，還適用于細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程，該方法能很好地將Sp細(xì)胞與吞噬Sp細(xì)胞后的原細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。對(duì)比例繁茂膜海綿細(xì)胞的DAB染色取新鮮的繁茂膜海綿組織，于含IOmM EDTA的CMFASW中浸泡10分鐘，輕輕擠壓組織塊使細(xì)胞離散，得到的細(xì)胞液IlOg離心，加入含2. 5%戊二醛的CMFASW固定1小時(shí)， 取20 μ 1涂片，干片后浸入蒸餾水，取出后向細(xì)胞區(qū)域中滴加DAB染色液(DAB 10g/L, H2O2 0. 1%, Tris-Base 9. 68g/L，pH7. 4)，染色5min，自來(lái)水洗掉染液，光鏡下觀察，無(wú)明顯著染細(xì)胞(圖5)。本對(duì)比例說(shuō)明，雖然過(guò)氧化物酶是一類(lèi)廣泛存在的酶，但并非能使各類(lèi)細(xì)胞染色和區(qū)分，小軸海 綿中Sp細(xì)胞的DAB染色具有特異性。
權(quán)利要求
1.一種小軸海綿活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞的標(biāo)記方法，其特征在于海綿細(xì)胞經(jīng)固定液固定后，使用3，3' -二氨基聯(lián)苯胺染色液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，顆粒狀著染的細(xì)胞為小軸海綿活性產(chǎn)物的儲(chǔ)存細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用的固定液為含體積濃度2-4%甲醛或2-3 %戊二醛的無(wú)鈣鎂海水，無(wú)鈣鎂海水中可含10-30mM乙二胺四乙酸二鈉，固定時(shí)間 0. 5-1. 5 小時(shí)。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于海綿細(xì)胞染色過(guò)程3，3'-二氨基聯(lián)苯胺染色液的組成為3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺2.5-10g/L，過(guò)氧化氫體積濃度0. 1-1%，三羥甲基氨基甲烷 3-10g/L, ρΗ7· 2-7. 4。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于光學(xué)顯微鏡下觀察時(shí)，放大>400倍，含有深棕色著染顆粒的細(xì)胞，為小軸海綿活性產(chǎn)物的儲(chǔ)存細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小軸海綿(Anixella sp.)活性產(chǎn)物儲(chǔ)存細(xì)胞的標(biāo)記方法，該方法是使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)海綿細(xì)胞染色，光學(xué)顯微鏡下觀察顆粒狀著染的細(xì)胞，即為小軸海綿中活性產(chǎn)物Debromohymenialdisine和Hymenialdisine的儲(chǔ)存細(xì)胞。該方法彌補(bǔ)了目前單純通過(guò)電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞鑒定的不足，具有簡(jiǎn)便清晰、穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102221494SQ20101014835
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者宋悅凡, 張衛(wèi), 張錦友, 曲翊, 曹旭鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所