專利名稱：利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測量方法，尤其是一種測定蛋白質(zhì)濃度的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)濃度測定是在生命科學(xué)研究中經(jīng)常使用的技術(shù)。目前有許多方法用于蛋白 質(zhì)濃度測定，但是又各有局限經(jīng)典的紫外分光光度法靈敏度有限；常規(guī)的BCA、L0Wry法等 又涉及相對復(fù)雜的試劑配制；有的方法，如公開號為CN168774的中國專利操作步驟復(fù)雜， 容易引入人為誤差，導(dǎo)致測量結(jié)果的準(zhǔn)確性下降；有的方法，如如歐洲專利G01N33/68A12， 美國專利US2010047913等，將液相層析和質(zhì)譜聯(lián)用，雖然提高了檢測的靈敏度及準(zhǔn)確性， 但是由于層析和質(zhì)譜設(shè)備的昂貴限制了其使用，而且該類方法耗時(shí)較長，不易于實(shí)現(xiàn)快速 的批處理操作。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)計(jì)數(shù)成本高昂、操作耗時(shí)長等不足，本發(fā)明提供了一種測定蛋 白質(zhì)濃度的方法，成本低廉，操作簡便快捷。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟1.將待測的未知濃度的實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液和1組至少4個(gè)已知濃度且濃度不同的 標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液各0. 5-2 μ L滴加在硝酸纖維素膜上；2.將硝酸纖維素膜自然晾干；3.將硝酸纖維素膜整個(gè)放入質(zhì)量百分比濃度為0. 10%的戊二醛溶液，將溶 液和硝酸纖維素膜加熱至40°C 80°C，并保溫5 60分鐘；4.用磷酸鹽緩沖液(PBS)或水或生理鹽水清洗硝酸纖維素膜兩次以上；5.使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇660nm-710nm之間任一波長激光激發(fā)，在大 于激發(fā)激光波長至少40nm處檢測硝酸纖維素膜上各蛋白質(zhì)溶液斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度；6.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液的已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光 強(qiáng)度!與蛋白質(zhì)溶液濃度Nia的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系 數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度It5s計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶
液濃度N實(shí)驗(yàn)，即N^= (I實(shí)驗(yàn)_b)/a。由于通常情況下待測的實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液雖然未知濃度，但是其濃度的數(shù)量級基 本是可以確定的，因此，所述標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液中應(yīng)至少有一個(gè)的蛋白質(zhì)濃度大于實(shí)驗(yàn)組 蛋白溶液濃度，并且至少有一個(gè)的蛋白質(zhì)濃度小于實(shí)驗(yàn)組蛋白溶液濃度。否則將導(dǎo)致無法 獲得所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就需要重新調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液濃度。所述硝酸纖維素膜應(yīng)當(dāng)足夠大，至少使各蛋白質(zhì)溶液滴加在其上后形成的斑點(diǎn)之 間不相互重疊干擾。所述的戊二醛溶液采用水或生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)作為溶劑配制。
本發(fā)明的有益效果是由于采用戊二醛溶液對點(diǎn)有蛋白質(zhì)樣品的硝酸纖維素膜進(jìn)行浸泡處理，在起到固定蛋白質(zhì)作用的同時(shí)，利用戊二醛與蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生紅外熒光 這一現(xiàn)象，結(jié)合紅外熒光檢測設(shè)備對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明體現(xiàn)了降低 成本，提高速度，減少操作時(shí)間，利于批量操作。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知濃度(實(shí)驗(yàn)組)及已知濃度(標(biāo)準(zhǔn)組)1250ng/ μ L>625ng/μ L>312. 5ng/μ L>156. 25ng/μ L>78. 125ng/μ L>39. 06ng/μ L>19. 5ng/μ L> 9. 75ng/ μ L、4. 88ng/ μ L溶液，每個(gè)樣品2 μ L滴加在硝酸纖維素膜上；2.將硝酸纖維素膜自然晾干；3.將硝酸纖維素膜整個(gè)放入戊二醛濃度為0. 的生理鹽水溶液中，將溶液加熱 到80°C，保溫30分鐘；4.用水清洗硝酸纖維素膜兩次以上；5.使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇680nm波長激光激發(fā)，在大于激發(fā)激光波長 720nm處檢測樣品的熒光強(qiáng)度；6.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度Iia與蛋 白質(zhì)濃度&^的關(guān)系公式I = aXN +b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)樣品的熒光強(qiáng)度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)濃度
(N實(shí)驗(yàn))，艮口 N實(shí)驗(yàn)=(I實(shí)驗(yàn)_b)/a。采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在線性范圍廣，數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性 程度高(R2 = 0. 998)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的720nm處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確 的計(jì)算出樣本中的蛋白濃度。實(shí)施例2 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知濃度(實(shí)驗(yàn)組)及已知濃度(標(biāo)準(zhǔn)組)625ng/ μ L>312.5ng/μ L>156.25ng/μ L>78.13ng/μ L>39.06ng/μ L>19. 5ng/μ L>9. 75ng/μ L> 4. 88ng/ μ L、2. 44ng/ μ L溶液，每個(gè)樣品1 μ L滴加在硝酸纖維素膜上；2.將硝酸纖維素膜自然晾干；3.將硝酸纖維素膜整個(gè)放入戊二醛濃度為的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，將 溶液置于微波爐加熱，反應(yīng)5分鐘；4.用磷酸鹽緩沖液清洗硝酸纖維素膜兩次以上；5.使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇710nm波長激光激發(fā)，在大于激發(fā)激光波長 780nm處檢測樣品的熒光強(qiáng)度；6.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度Iia與蛋 白質(zhì)濃度&^的關(guān)系公式I = aXN +b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)樣品的熒光強(qiáng)度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)濃度(N實(shí)驗(yàn))，艮口 N實(shí)驗(yàn)=(I實(shí)驗(yàn)_b)/a。采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在線性范圍廣，數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性 程度高(R2 = 0. 997)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的780nm處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確 的計(jì)算出樣本中的蛋白濃度。實(shí)施例3 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知濃度(實(shí)驗(yàn)組)及已知濃度(標(biāo)準(zhǔn)組)2500ng/ μ L>1250ng/μ L>625ng/μ L>312. 5ng/μ L>156. 25ng/μ L>78. 125ng/μ L>39. 06ng/μ L> 19. 5ng/ μ L、9. 75ng/ μ L、溶液，每個(gè)樣品0. 5 μ L滴加在硝酸纖維素膜上；2.將硝酸纖維素膜自然晾干；3.將硝酸纖維素膜整個(gè)放入戊二醛濃度為10%的水溶液中，將溶液加熱到40°C， 保溫60分鐘；4.用生理鹽水清洗硝酸纖維素膜兩次以上；5.使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇690nm波長激光激發(fā)，在大于激發(fā)激光波長 740nm處檢測樣品的熒光強(qiáng)度；6.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度Iia與蛋 白質(zhì)濃度&^的關(guān)系公式I = aXN +b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)樣品的熒光強(qiáng)度(I3^)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)濃度
(N實(shí)驗(yàn))，艮口 N實(shí)驗(yàn)=(I實(shí)驗(yàn)_b)/a。采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在線性范圍廣，數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，線性程度高(R2 = 0. 998)，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的740nm處熒光強(qiáng)度，可以快速、準(zhǔn)確 的計(jì)算出樣本中的蛋白濃度。
權(quán)利要求
利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法，其特征在于包括下述步驟1)將待測的未知濃度的實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液和1組至少4個(gè)已知濃度且濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液各0.5-2μL滴加在硝酸纖維素膜上；2)將硝酸纖維素膜自然晾干；3)將硝酸纖維素膜整個(gè)放入質(zhì)量百分比濃度為0.1％～10％的戊二醛溶液，將溶液和硝酸纖維素膜加熱至40℃～80℃，并保溫5～60分鐘；4)用磷酸鹽緩沖液或水或生理鹽水清洗硝酸纖維素膜兩次以上；5)使用紅外激光掃描成像系統(tǒng)，選擇660nm-710nm之間任一波長激光激發(fā)，在大于激發(fā)激光波長至少40nm處檢測硝酸纖維素膜上各蛋白質(zhì)溶液斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度；6)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熒光強(qiáng)度I校準(zhǔn)與蛋白質(zhì)溶液濃度N標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系公式I標(biāo)準(zhǔn)＝a×N標(biāo)準(zhǔn)+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；7)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度I實(shí)驗(yàn)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液濃度N實(shí)驗(yàn)，即N實(shí)驗(yàn)＝(I實(shí)驗(yàn)-b)/a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法，其 特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液中應(yīng)至少有一個(gè)的蛋白質(zhì)濃度大于實(shí)驗(yàn)組蛋白溶液濃 度，并且至少有一個(gè)的蛋白質(zhì)濃度小于實(shí)驗(yàn)組蛋白溶液濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法，其特 征在于所述的硝酸纖維素膜大小以使各蛋白質(zhì)溶液滴加在其上后形成的斑點(diǎn)之間不相互 重疊干擾為準(zhǔn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法，其特 征在于所述的戊二醛溶液采用水或生理鹽水或磷酸鹽緩沖液作為溶劑配制。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用戊二醛誘發(fā)紅外熒光測定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法，將待測的實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)溶液和若干已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)組蛋白質(zhì)溶液滴加在硝酸纖維素膜上；晾干后放入戊二醛溶液，加熱后清洗；檢測樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組已知蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)樣品的熒光強(qiáng)度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)濃度。本發(fā)明體現(xiàn)了降低成本，提高速度，減少操作時(shí)間，利于批量操作。
文檔編號G01N21/64GK101846625SQ201010171490
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者何剛, 商澎, 李京寶, 王亮, 騫愛榮 申請人:西北工業(yè)大學(xué)