專利名稱：一種用于糖蛋白檢測的磁性弛豫開關(guān)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明核磁共振技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于糖蛋白檢測的磁性弛豫開關(guān)。
背景技術(shù)：
糖蛋白是一種含有寡糖鏈的蛋白質(zhì)，兩者以共價鍵相連。其中，寡糖鏈由共轉(zhuǎn)譯 或后轉(zhuǎn)譯修飾過程中的糖基化(glycosylation)作用而連結(jié)到蛋白質(zhì)上。糖蛋白在細胞 內(nèi)部，細胞膜和細胞外均有發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)中幾乎所有關(guān)鍵分子都是糖蛋白。蛋白質(zhì)糖基 化的多樣性與細胞周期，分化和發(fā)展狀態(tài)有關(guān)。蛋白中某些位點的糖基化與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有密 切關(guān)系，而糖基化程度及糖鏈結(jié)構(gòu)的異常變化則往往是癌癥及其他疾病的標志。一些腫瘤 的標志物及治療的靶標如前列腺癌標志物PSA、乳腺癌中的Her2/neU、卵巢癌中的CA125等 都是糖蛋白。糖蛋白常用的分析方法有放射性標記法、分子熒光標記法、凝集素標記法、抗 體標記法、電泳法以及化學(xué)酵素法等。近年來，發(fā)展了包括高效液相色譜、毛細管電泳、生物 質(zhì)譜、表面等離子共振光譜、拉曼光譜、電化學(xué)檢測等在內(nèi)的多種新方法對糖蛋白進行了檢 測。另外，應(yīng)用具有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的金屬納米粒子(如金和銀的納米粒子)和具有磁性的 納米粒子(如氧化鐵納米粒子)在糖蛋白檢測方面具有較大的應(yīng)用前景。磁性弛豫開關(guān)(Magnetic Relaxation Switches)是一種基于磁性粒子的生 物傳感器，其工作原理基于磁性粒子在分散及團聚狀態(tài)下其橫向弛豫時間(Transverse Relaxation Time)T2的變化來進行檢測，通過對磁性粒子表面進行功能化修飾，可以對寡 核苷酸，脫氧核糖核酸，蛋白質(zhì)，酶，病毒，細菌，抗體等生物活性分子進行檢測。與傳統(tǒng)的光 學(xué)檢測方法如紫外可見光譜，熒光光譜相比，該檢測方法具有相當(dāng)高的靈敏度及特異性，其 優(yōu)點在于磁性粒子團聚后對周圍水質(zhì)子的弛豫率(1/T2)的改變，而不依賴于光學(xué)性質(zhì)的 檢測，因此特別適合于復(fù)雜的實際樣品的檢測。在磁性弛豫開關(guān)的檢測，經(jīng)常出現(xiàn)一種叫前 區(qū)效應(yīng)(Prozone Effect)的現(xiàn)象，其本質(zhì)是已經(jīng)形成的磁性粒子團聚物在過量目標物的存 在下重新分散，導(dǎo)致T2的重新上升。T2的反復(fù)變化會影響檢測的準確性。為了解決以上問 題，本發(fā)明設(shè)計一種基于磁性弛豫開關(guān)并適用于糖蛋白檢測的新方法，通過合理設(shè)計避免 前區(qū)效應(yīng)的出現(xiàn)從而提高檢測的準確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于糖蛋白檢測，且檢測準確性高的磁性弛豫開關(guān)，并 提供用該磁性弛豫開關(guān)進行糖蛋白檢測的方法。本發(fā)明提出的磁性弛豫開關(guān)，探針采用一種超順磁性納米粒子，該超順磁性納米 粒子以四氧化三鐵納米粒子為核，核尺寸小于10納米，外部以葡聚糖為殼，整個粒子的平 均粒徑不超過60納米。該超順磁性納米粒子是水溶性粒子。本發(fā)明中，所述超順磁性納米粒子中，四氧化三鐵重量含量為48—52%，飽和磁化 強度為32. 29emu/g，其縱向和橫向弛豫度分別為18. SlmM^S"1和269. ？福-、—1。本發(fā)明提供的功能化超順磁性納米粒子的制備方法，包括以下兩個步驟(1)超順磁性納米粒子的合成；(2)超順磁性納米粒子的純化。本發(fā)明的基于所述磁性弛豫開關(guān)進行糖蛋白檢測的方法，不需要任何標記手段， 操作簡單，僅包括兩個混合步驟及一個檢測步驟。所述的混合步驟，包括凝集素的混合以及目標物的混合。所述的凝集素為伴刀豆 球蛋白。本發(fā)明提供的檢測方法，其目標物為ai-酸性糖蛋白，其檢測線性濃度范圍為0 7. Onmol/L，檢測限為 0. 40nmol/L。發(fā)明利用超順磁性納米粒子在分散與團聚狀態(tài)下其橫向弛豫時間T2的改變，通 過對磁性納米粒子表面的葡聚糖與凝集素伴刀豆球蛋白之間特異性的互相作用，形成穩(wěn)定 團聚物，同時使其T2下降，然后加入目標物ai酸性糖蛋白，由于具有較高的糖含量和與伴 刀豆球蛋白間的作用力，^酸性糖蛋白與超順磁性納米粒子產(chǎn)生競爭機制，使已經(jīng)形成的 團聚物在一定程度上分散，使T2上升，從而對特定目標分子進行檢測。通過該設(shè)計，在對目 標物的檢測中，T2的變化趨于一致，不會發(fā)生反復(fù)變化從而避免了磁性弛豫開關(guān)檢測中前 區(qū)效應(yīng)的出現(xiàn)，提高檢測的準確性。結(jié)果顯示，該方法對酸性糖蛋白檢測的線性濃度范 圍為0 7. Onmol/L，檢測限達到0. 40nmol/L，遠低于血漿中AGP的正常濃度。


圖1為本發(fā)明檢測方法的示意圖。圖2為本發(fā)明超順磁性納米粒子的透射電鏡圖。圖3為本發(fā)明超順磁性納米粒子的X射線衍射圖。圖4為本發(fā)明超順磁性納米粒子的紅外光譜圖。圖5為本發(fā)明超順磁性納米粒子的熱重分析圖。圖6為本發(fā)明超順磁性納米粒子的弛豫率線性擬合圖。圖7為本發(fā)明超順磁性納米粒子的T2隨Con A濃度及檢測時間的變化圖。圖8為本發(fā)明超順磁性納米粒子的粒徑隨Con A濃度的變化圖。圖9為本發(fā)明超順磁性納米粒子的T2在0 10 ii g/mL Con A的線性擬合圖。圖10為本發(fā)明超順磁性納米粒子與Con A的團聚物在0 0. 3 y g/mL AGP的線 性擬合圖。
具體實施例方式1、超順磁性納米粒子的合成與純化采用共沉淀法合成超順磁性納米粒子，具體方法如下，324. 4mg六水三氯化鐵， 119. 3mg四水氯化亞鐵和4. 5g葡聚糖(Dextran)(分子量=10T)溶解在10mL去離子水中， 冷卻到2 4°C，在強烈機械攪拌和氮氣保護下加入450 ii L 2 4°C氨水(25 28% )，反 應(yīng)混合物在一個小時內(nèi)均勻加熱到75 85°C后在該溫度維持75分鐘。反應(yīng)液自然冷卻到 室溫后通過透析(截留分子量=300KD)除去雜質(zhì)與多余的葡聚糖，最后通過超濾(300KD) 濃縮溶液。2、橫向弛豫時間的檢測1000 iiL的超順磁性納米粒子溶液(25iiM Fe3+)與不同濃度的伴刀豆球蛋白(Concanavalin A, Con A)在管徑15mm的樣品管中混合并定容至2000 y L，并分別在25°C 和38 °C的水浴中恒溫，隨后在磁感應(yīng)強度為0. 47T的匪I20-Analyst(Niumag Corp.， Shanghai，P. R. China)磁共振成像分析儀上以CPMG序列進行T2檢測。在糖蛋白的檢測中， 以 a 丨-酸性糖蛋白(a「Acid Glycoprotein，AGP)，牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)和前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)分別作為目標物進行檢測。 1000 u L的超順磁性納米粒子溶液先與50 ii L的ConA(100 u g/mL)溶液混合均勻，靜置反 應(yīng)20分鐘，隨后分別加入不同濃度的AGP，BSA或PSA并以去離子水定容至2000 u L，分別 在25°C和38°C的水浴中恒溫30分鐘，隨后進行T2檢測。
權(quán)利要求
一種用于糖蛋白檢測的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于該磁性弛豫開關(guān)的探針采用一種超順磁性納米粒子，該超順磁性納米粒子以四氧化三鐵納米粒子為核，核尺寸小于10納米，外部以葡聚糖為殼，整個粒子的平均粒徑不超過60納米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于糖蛋白檢測的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于四氧化 三鐵重量含量為48-52%，飽和磁化強度為32. 29emu/g，其縱向和橫向弛豫度分別為 18. Slmr'S-1 和 269. 2mM_1S_10
3.一種基于權(quán)利要求1所述磁性弛豫開關(guān)進行糖蛋白的檢測方法，其特征在于包括 兩步的混合步驟和一步檢測步驟；所述的混合步驟為凝集素的混合步驟和目標物的混合步 馬聚o
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的凝集素為伴刀豆球蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的目標物為al_酸性糖蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的目標物，其檢測的線性濃度范 圍為 0 7. Onmol/L，檢測限為 0. 40nmol/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于核磁共振技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于糖蛋白檢測的磁性弛豫開關(guān)。該磁性弛豫開關(guān)的探針采用一種以四氧化三鐵納米粒子為核，以葡聚糖為殼，平均粒徑不超過60納米的超順磁性納米粒子。利用磁性弛豫開關(guān)進行糖蛋白的檢測方法，包括兩步混合步驟和一步檢測步驟；混合步驟為凝集素的混合和目標物的混合，凝集素為伴刀豆球蛋白，目標物為a1-酸性糖蛋白。其檢測的線性濃度范圍為0～7.0nmol/L，檢測限為0.40nmol/L，遠低于血漿中AGP的正常濃度。
文檔編號G01R33/465GK101858964SQ20101019162
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者孔繼烈, 蔡少瑜 申請人:復(fù)旦大學(xué)