專利名稱：食品和飲料中胡蘿卜成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用核酸擴增技術進行植物源性成分快速檢測的方法，具體是一 種胡蘿卜成分實時熒光PCR檢測用的引物和探針序列。
背景技術：
全球經濟一體化和貿易國際化的的不斷擴大，對于發(fā)展中的中國，是機遇也是挑 戰(zhàn)。目前，我國已成為世界上第五大農產品出口國，農產品進出口貿易持續(xù)增長。美國、歐 盟、日本等發(fā)達國家和地區(qū)為了維護本國的經濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的 檢驗項目和嚴格甚至苛刻的技術標準，對進口農產品設置貿易障礙，導致我國農產品出口 增長遭受較大壓力。就進出口的農產品而言，合格的產品，不僅要無毒無害，滿足安全衛(wèi)生 要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質要求。其中品質合格，又主要包含兩方面的含義1.原 料來源與標簽一致。2.組分含量與標簽一致。歐盟自2006年1月1日起開始實施新的食 品衛(wèi)生法規(guī)，新法規(guī)突出了食品生產過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調食品的 身份鑒定標識與健康標識。我國國家標準GB 7718-94《食品標簽通用標準》和國家出入境 檢驗檢疫局發(fā)布的《進出口食品標簽管理辦法》，也明確提出食品標簽標注內容應與食品相 符。為此，國家質檢總局專門發(fā)文，要求嚴厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產品要 依法沒收并監(jiān)督銷毀，追查生產源頭和去向，嚴防流入消費環(huán)節(jié)。在食品和飲料的生產與銷售中，產品無標簽或標簽不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充 好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內、國外均屢屢發(fā)生。各種原料被加工成食品和飲 料成品后，已無法從外觀對其組成進行鑒定。生產者受利益驅動，擅自改變產品組成，或摻 入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導致產品的真實屬性與標簽不符。這種造假行為不 僅僅涉及經濟、營養(yǎng)價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發(fā)食源性過敏反應。胡蘿卜是一種質脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發(fā) 油、胡蘿卜素、維生素A、維生素Bi、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營養(yǎng)成分，常作為食品 配料用于制作各種糕點、面食和飲料。胡蘿卜雖營養(yǎng)豐富，但同時也是一種常見的食物過敏 原。有文獻報道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥是柏林人最常見的食物過敏原。瑞 士專家報道，大約25%的食物過敏者會對胡蘿卜產生過敏反應?！秮嗊\食品安全食品過敏原 標識標注》地方技術規(guī)范已于2009年頒布實施，規(guī)范列出可導致過敏反應的食品名單，要求 含有名單上過敏原的亞運食品必須如實標注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效 的胡蘿卜成分檢測方法，確保食物標簽真實準確，對于減少食源性過敏反應發(fā)生，加強食品 過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。食品中植物源性成分檢測，常采用DNA檢測的方法。以DNA為測試對象的方法與 以蛋白為測試對象的方法相比，在食物成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受食物 基質的影響較?。淮送?，DNA比較穩(wěn)定，不象蛋白質組成那樣受地理條件、季節(jié)變化和加工 工藝的影響。當前，基于DNA的檢測方法中，實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應等優(yōu)點，得到研究者的普遍認可，成為檢測的重要工 具。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種胡蘿卜成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法，克服基 于蛋白的檢測方法在某些食品檢測中的局限性，為胡蘿卜成分檢測提供有效工具，從而確 保食品標簽的一致性和消費者的飲食安全。本發(fā)明的主要原理為針對保守序列設計一組引物(上游引物 5' -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3‘和下游引物5' -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘)和一 條 Taqman 探針(序列為5' -FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA-3 ‘)。進行核 酸檢測時，模板DNA經加熱至94-95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模 板特異性結合。探針的5端標記有報告熒光集團，3端有淬滅熒光集團。當探針完整的時 候，報告集團所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq 酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3' -5'外切核酸酶活性就會將探針切 斷，報告集團遠離淬滅集團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環(huán)的增加，目 的片段成指數(shù)增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數(shù)量。本發(fā)明涉及的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(I)PCR擴增反應液A包括10XPCR 反應緩沖液、0. 1-0. 4mmol/L dNTP(含 dUTP)、2_4mmol/L 硫酸鎂、 0. 2-0. 6 μ mol/L 上游引物、0. 2-0. 6 μ mol/L 下游引物、0. 2-0. 6 μ mol/L TaqMan 探針；其中10XPCR反應緩沖液含有l(wèi)OOmmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲燒一鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ；其中上游引物序列為5 ‘ -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3 ‘、下游引物序列為 5 ‘ -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3‘；其中TaqMan 探針序列為5 ‘ -TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-3 ‘，其 5 ‘端標記 FAM報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光集團；其中上游引物、下游引物、TaqMan探針的體積比為1 1 1 ；其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為 dUTP dATP dGTP dCTP = 2:1:1:1。(2)UNG 酶 υ/μ L ；(3)Taq_:5U/yL。上面所述PCR擴增反應液A，每管23. 5μ L的最佳組成為2.5μ L 10XPCR反應 緩沖液、2 μ L2. 5mmol/LdNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、2 μ L 25mmol/L硫酸鎂、1 μ L lOymol/L 上游弓丨物、IyL 10 μ mol/L T 游弓丨物、IyL 10 μ mol/L Taqman-MGB 探針、14 μ L ddH20(滅菌雙蒸水)。使用上述試劑盒檢測食品中胡蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1)_(3)(1)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。(2)胡蘿卜成分的實時熒光PCR擴增
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A.在裝有23. 5 μ L PCR擴增反應液A的反應管中加入1 μ L待檢樣品DNA、0. 2 μ L UNG酶和0. 3 μ L Taq酶，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；94-95"C 4min, 1個循環(huán)，滅活UNG酶，預變性；94-95"C 10_20sec ;60°C 20_40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。擴增時，應設立三個對照陽性對照(取新鮮胡蘿卜提取的基因組DNA)、陰性對照 (非胡蘿卜基因組DNA)、空白對照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。如待測樣品出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值小于或等于41，陰性對照、陽性對照和空白對 照結果都成立(即陽性樣品出現(xiàn)典型陽性擴增曲線，陰性樣品和空白對照無擴增)，則可判 定該樣品檢出胡蘿卜成分。如待測樣品Ct值大于或等于45，陰性對照、陽性對照和空白對照都成立，則可判 定該樣品未檢出胡蘿卜成分。如待測樣品Ct值在41-45之間，應重作實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結果Ct 值仍小于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立，則可判定該樣品檢出胡蘿卜成 分；再次擴增后的結果Ct值大于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立，則可判 定該樣品未檢出胡蘿卜成分。抗凍蛋白是具有熱滯效應和冰晶重結晶抑制效應的蛋白質，在生物受到凍害脅迫 時產生，具有防止細胞受冰凍傷害的功能。1998-1999年，Dawn Worral和Knut Meyer等 先后獨立在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)了具有冷誘導特性的抗凍蛋白。隨后，國內外學者對胡蘿卜抗凍 蛋白進行了一系列研究，對不同品系胡蘿卜的抗凍蛋白基因進行了克隆和轉化。研究發(fā)現(xiàn)， 胡蘿卜抗凍蛋白同其他植物的抗凍蛋白沒有相似的氨基酸序列，但處于不同生存環(huán)境的胡 蘿卜其抗凍蛋白基因保持了很高的種內同源性(98.5%)。本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜抗凍蛋白基 因的保守序列，設計了 一組特異性引物和一條特異性Taqman探針。該保守基因序列通過對 Genebank登錄的各物種的抗凍蛋白的核酸序列的比對獲得，可保證胡蘿卜的檢出。本發(fā)明 采用實時熒光PCR技術，該技術特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復雜 的加工食品和飲料中胡蘿卜的檢測。


圖1用實時熒光PCR技術檢測某待測胡蘿卜面條樣品DNA，樣品的擴增曲線。圖2用實時熒光PCR技術檢測某待測番茄米粉樣品DNA，樣品的擴增曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1按下列配方制作胡蘿卜才成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如 下(I)PCR擴增反應液A
包括10XPCR 反應緩沖液、0. 2mmol/L dNTP(含 dUTP)、2mmol/L 硫酸鎂、 0. 4ymol/L 上游引物 5 ‘ -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3 ‘、0. 4ymol/L 下游弓| 物 5 ‘ -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3 ‘、0· 4 μ mol/L Taqman-MGB 探針 5 ‘ -FAM-TCAAAACAGCCT TGAAAAACCCCACCA-TRAMA-3‘；其中10XPCR反應緩沖液含有l(wèi)OOmmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲燒一鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ；其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為 dUTP dATP dGTP dCTP = 2:1:1:1。(2) UNG 酶IU/ μ L ；(3)Taq_:5U/yL。按照以下程序進行檢測(1)待測胡蘿卜面條樣品DNA的提取A.稱取0. Ig胡蘿卜面條，剪碎，轉至1. 5mL離心管中。加入600 μ L預熱的裂解緩 沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液， 混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L緩沖液，上下顛倒混勻10次；Ε.取出離心柱，將離心柱放置在1個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置 2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加 入200 μ L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200yL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一 次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 μ L洗脫 緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2)待測胡蘿卜面條DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應管中加入23. 5 μ L PCR反應液Α、0· 2 μ L UNG酶、0· 3 μ L Taq酶和 1 μ L樣品DNA，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；940C 4min，l個循環(huán)，滅活UNG酶，預變性；94"C 30sec ；60°C 30sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。樣品出現(xiàn)陽性擴增曲線，Ct值為29. 5，見圖1。陰性對照(芹菜DNA)和空白對照 (水)無擴增，陽性對照(胡蘿卜汁DNA)產生典型陽性擴增曲線，據(jù)此可判定該樣品檢出胡 蘿卜成分。
實施例2按下列配方制作胡蘿卜才成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如 下(I)PCR擴增反應液A包括10XPCR 反應緩沖液、0. 2mmol/L dNTP(含 dUTP)、2mmol/L 硫酸鎂、 0. 4ymol/L 上游引物 5 ‘ -CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3 ‘、0. 4ymol/L 下游弓| 物 5 ‘ -CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3 ‘、0· 4 μ mol/L Taqman-MGB 探針 5 ‘ -FAM-TCAAAACAGCCT TGAAAAACCCCACCA-TRAMA-3‘；其中10XPCR反應緩沖液含有l(wèi)OOmmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲燒一鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ；其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為 dUTP dATP dGTP dCTP = 2:1:1:1。(2) UNG 酶IU/ μ L ；(3)Taq_:5U/yL。按照以下程序進行檢測(1)待測番茄米粉樣品DNA的提取A.稱取0. Ig番茄米粉，轉至1.5mL離心管中。加入600 μ L預熱的裂解緩沖液，輕 輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液， 混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L緩沖液，上下顛倒混勻10次；Ε.取出離心柱，將離心柱放置在1個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置 2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加 入200 μ L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200 μ L 70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一 次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的1. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 μ L洗脫 緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2)待測番茄米粉DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應管中加入23. 5 μ L PCR反應液Α、0. 2 μ L UNG酶、0. 3 μ L Taq酶和 1 μ L樣品DNA，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增50"C 2min, 1 個循環(huán)，激活 UNG 酶；940C 4min，l個循環(huán)，滅活UNG酶，預變性；94"C 30sec ；60°C 30sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增。
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(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。樣品未出現(xiàn)陽性擴增曲線，見圖2。陰性對照(豬肉DNA)和空白對照(水)無擴 增，陽性對照(胡蘿卜汁DNA)產生典型陽性擴增曲線，據(jù)此可判定該樣品未檢出胡蘿卜成 分。
權利要求
一種胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其特征在于其中的試劑包括(1) (3)(1)PCR擴增反應液A包括10×PCR反應緩沖液、0.1 0.4mmol/L dNTP(含dUTP)、2 4mmol/L硫酸鎂、1 2U Taq酶、0.2 0.5U UNG酶、0.2 0.6μmol/L上游引物、0.2 0.6μmol/L下游引物′、0.2 0.6μmol/L TaqMan探針；其中10×PCR反應緩沖液含有100mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通X 100；其中上游引物序列為5′ CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA 3′、下游引物序列為5′ CGTCTGACACCCATGAGTCTGT 3′；其中TaqMan探針序列為5′ TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA 3′，其5′端標記FAM報告熒光集團，3′端標記TAMRA淬滅熒光集團；(2)UNG酶1U/μL；(3)Taq酶5U/μL。
2.根據(jù)權利要求1中所述的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其特征是上述的上游引物、 下游引物、TaqMan探針的體積比為1 1 1。
3.根據(jù)權利要求1中所述的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其特征是上述的dNTP內的四 種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP dATP dGTP dCTP = 2 1 1 1。
4.一種使用如權利要求1所述的試劑盒快速檢測胡蘿卜成分的方法，其特征是依次包 括下列步驟(1)待檢樣品DNA的提取；(2)胡蘿卜成分的實時熒光PCR擴增A.在裝有如權利要求1所述的PCR擴增反應液A的反應管中加入0.2μL UNG酶、 0. 3 μ L Taq酶和1 μ L待檢樣品DNA，混勻；B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增500C 2min, 1個循環(huán)，激活UNG酶；94-950C 4min, 1個循環(huán)，滅活UNG酶，預變性；94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴增；(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品和飲料中植物源性成分的定性檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的試劑盒及方法。試劑盒包括PCR擴增反應液A、UNG酶B、Taq酶C；PCR擴增反應液A含有10×PCR反應緩沖液、硫酸鎂、dNTP(含dUTP)、上游引物5′-CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3′、下游引物5′-CGTCTGACACCCATGAGTCTGT -3′、TaqMan探針5′-FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TRAMA-3′；胡蘿卜成分的快速檢測方法包括食品和飲料DNA的提取、胡蘿卜成分的實時熒光PCR擴增和結果判定。其優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復性好。
文檔編號G01N21/64GK101921836SQ20101019509
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權日2010年5月27日
發(fā)明者孫敏, 梁君妮, 肖西志, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心