專利名稱：基于微間隙陣列電極的電化學免疫傳感器及其檢測動物源食品中萊克多巴胺的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于微間隙陣列電極的電化學免疫傳感 器及其利用該傳感器檢測動物源食品中萊克多巴胺的方法。
背景技術：
動物性產(chǎn)品中常見的殘留藥物大致分為抗生素類、驅腸蟲藥類、生長促進劑類、抗 原蟲藥類、滅錐蟲藥類、鎮(zhèn)靜劑類和肝腎上腺素能受體阻斷劑及其它化學物質等，其中違禁 藥物包括如抗生素(環(huán)丙沙星、恩諾沙星等)、二苯乙烯類及其衍生物(已烯雌酚、雙烯雌 酚等)、0 _興奮劑(來克多巴胺、克侖特羅等)、鎮(zhèn)靜劑(氯丙嗪、安定等)、皮質激素類(地 塞咪松等)、甲狀腺抑制劑(丙硫氧嘧啶等)和性激素與同化激素(睪酮、雌二醇、孕酮等) 等。近二十年來，我國動物藥品行業(yè)進人了全面發(fā)展的時期，隨著各種新型獸藥在畜、禽中 的應用顯著增加，由此導致的畜禽肉及其加工食品中獸藥殘留的問題日益突出，嚴重危害 了人類健康，因此，進行獸藥殘留檢測技術的研究，發(fā)展可靠、靈敏、快速和實用的殘留分析 技術已迫在眉睫?，F(xiàn)有獸藥殘留分析技術大多采用化學分析法、比色法、生物測定法、高效薄層色譜 法(HPTLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、超臨界液體色譜法(SFC)、毛細管 區(qū)域電泳法(CZE)及聯(lián)用技術等，檢測限一般為Pg/kg級，LC-MS能對ng級的抗生素殘留 進行檢測與結構確證。我國現(xiàn)有檢測方法標準有SN0208-1993、SN0498-1995、NY5029-2001 等，而上述方法都需要嚴格的樣本前處理步驟，精細的微量操作手段，高靈敏的痕量檢測技 術，難度大，儀器化程序分析成本高，分析時間長。近年來頗受關注的免疫分析技術在抗生 素的殘留分析方面已有初步的應用，其方法的建立包括待測物選擇半抗原及人工抗原的合 成，抗體制備和測定方法建立幾個方面。如采用免疫法(IA)分析青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、 氯霉素、磺胺類等抗生素；生物傳感器技術對牛奶中的抗生素進行檢測；免疫親合色譜與 高效液相色譜聯(lián)用(IAC-HPLC)方式或免疫親合色譜與氣相色譜聯(lián)用(IAC-GC)方式對氯霉 素、阿維菌素、依維菌素殘留進行分析。這些分析技術在靈敏性、選擇性和實用性方面基本 能滿足目前抗生素殘留的分析要求(Kd= 10-6 10-12M)，但檢測速度慢，不能滿足現(xiàn)場和 實驗室快速定量檢測要求。目前，國際上在獸藥殘留分析方面主要呈現(xiàn)兩大趨勢一是殘留 指標限量值的逐步降低；二是檢測技術趨向于高技術化、系列化、速測化、便攜化。為了與國 際接軌，我們必須不斷開發(fā)和完善檢測技術，發(fā)展簡單、快速、準確、靈敏和便攜化的獸藥篩 選性多殘留分析技術。免疫傳感器是利用抗原抗體特異免疫反應與高靈敏傳感器件相結合構成的一種 生物傳感器件，它具有制備簡便、特異性好、操作快速、靈敏的特點，一些具有半抗原性(多 數(shù)獸用化學藥物具有此性能)的小分子物質均可設計研制成免疫傳感器，因此將免疫傳感 技術用于農產(chǎn)品中獸藥殘留物的檢測是當前一個新的發(fā)展方向。目前，國內外有關獸藥殘 留物的免疫分析已有一些文獻報告，但大多采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測定，雖采用單克隆抗體免疫分析技術的特異性較好，但靈敏度仍受一定限制。而有關免疫傳感技術的報導甚少，Caldow M等和Gustavsson E等發(fā)展了一種SI3R免疫傳感器，分別用于蜂蜜中泰樂 菌素和內酰胺類抗生素的檢測；此外，Knecht等報導了一種自動微陣列免疫傳感系統(tǒng) 用于同時檢測牛奶中的抗生素等。國內湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室已 在半抗原設計、抗原的合成和抗體的制備、純化及免疫傳感器制備方面開展了相關工作并 積累了一定的經(jīng)驗，但這些工作離實際應用仍有相當距離，因此，開展農產(chǎn)品中獸藥殘留物 高通量快速分析檢測是一種十分有意義的工作。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術存在的不足，提出一種基于微間隙陣 列電極的電化學免疫傳感器及其利用該傳感器檢測動物源食品中萊克多巴胺的方法，可實 現(xiàn)對動物源中萊克多巴胺的快速、高效的檢測。本發(fā)明的技術方案之一是，所述基于微間隙陣列電極的電化學免疫傳感器包括a.由叉指式雙電極組成微間隙陣列電極，且正電極和負電極的梳形齒寬D1均為 1 μ m-100 μ m,電極間隙D2為1 μ m-100 μ m ；微間隙陣列電極表面固定有30 μ L的萊克多巴 胺-BSA偶聯(lián)物，該萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物濃度為100 μ g/mL ；b.堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體；它在檢測時加到微間隙陣列電 極上，同被檢測樣品中的萊克多巴胺及所述電極上的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物發(fā)生競爭免 疫反應。本發(fā)明的技術方案之二是，利用基于微間隙電極陣列的電化學免疫傳感器對動物 源性食品樣品中萊克多巴胺的檢測方法為取濃度分別為 0. 10ng/mL、l. 0ng/mL、10. 0ng/mL、20. 0ng/mL、100. Ong/mL、 200. Ong/mL的萊克多巴胺標準樣品溶液各100 μ L，將所述每一種濃度的萊克多巴胺標準 樣品溶液分別與ι μ L堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體溶液室溫下混合反應 2min 3min ；然后將各混合物分別滴加到對應的電化學免疫定量傳感器的電極表面，室溫 下靜置反應5min-8min，將傳感器工作電極的正極與CHI 760A型電化學工作站的工作電極 連接，工作站對電極與參比電極復合，再與傳感器工作電極的負極連接，采用線性掃描伏安 法在0 50mV電位范圍檢測，記錄傳感器電流隨電位變化的響應曲線，并計算其電導值；根 據(jù)不同濃度的萊克多巴胺標準樣品溶液的電導值獲得工作曲線；再根據(jù)樣品的電導值與工 作曲線求得對應的樣品的萊克多巴胺的濃度。以下對本發(fā)明做出進一步說明。本發(fā)明中，所述堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體溶液可采用以下方法 制備取2. 5mg/mL的萊克多巴胺單克隆抗體lmL，加入堿性磷酸酯酶5mg，再加入質量分 數(shù)為2. 5%的戊二醛20 μ L，室溫靜放置2小時；然后用0. Olmol/LPBS于4°C透析過夜，換 液3次；再移入0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液中，于4°C透析過夜，換液3次；取出，用含質量 分數(shù)為1. 0% BSA和質量分數(shù)為0. 02% NaN3的Tris-HCl緩沖液稀釋至4mL，即為酶標記抗 體溶液原液；最后加入lmL-2mL純甘油，4°C保存。本發(fā)明的工作電極為微間隙陣列電極，可由常規(guī)光刻印刷法制作，正負電極均為兩個梳形金電極，正負電極的梳形齒數(shù)5-20個，彼此交叉組成微間隙陣列金電極，梳齒寬 為1 ii m-100 u m,間隙為1 ii m-100 u m ；再對基片進行硅烷化處理，步驟包括1)將金電極基 片用無水乙醇清洗三次，每次lmin-2min ；2)將金電極浸入1M的NaOH溶液中25min_35min， 然后用超純水清洗該電極三次，每次lmin-2min，吹干；3)將經(jīng)步驟2)處理后的金電極浸入 含氨丙基三甲氧基硅烷5% (V/V)的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；再用超純 水清洗三次后吹干，即得工作電極。本發(fā)明所述基于微間隙電極陣列的萊克多巴胺電化學免疫定量傳感器的制備，可 采用以下步驟1)按照上述制得的工作電極浸入質量分數(shù)為2. 5%的戊二醛水溶液中，室溫下靜 置1小時；2)取出，用超純水清洗三次；在上述電極上滴加30 PL萊克多巴胺與牛血清白蛋 白或酪蛋白交聯(lián)物溶液，室溫下靜置反應1小時；所述交聯(lián)物濃度為100i! g/mL，是溶于 0. Olmol/L、pH7. 4磷酸緩沖溶液而得；3)用超純水清洗三次，吹干，所得的工作電極保存于4°C備用；4)將上述工作電極浸泡在銀沉積溶液中l(wèi)min-2min，再經(jīng)室溫干燥，即得所述電 化學傳感器，所述的銀沉積溶液為將ImM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH 緩沖溶液而得，溶液PH = 9. 0。本發(fā)明基于微間隙電極陣列的電化學免疫傳感器的萊克多巴胺的檢測方法中，分 別取一系列濃度 0. 10ng/mLU. 0ng/mL、，10. 0ng/mL、20. 0ng/mLU00. 0ng/mL、200. Ong/mL 的萊克多巴胺標準樣品溶液lOOy L與1 P L堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體溶 液室溫下混合反應2 3min，然后將各混合物分別滴加到對應的電化學免疫定量傳感器的 電極表面，室溫下靜置反應5min-8min ；未反應的堿性磷酸酯酶標記抗體則與工作電極表 面的已經(jīng)固定了的萊克多巴胺牛血清白蛋白或酪蛋白交聯(lián)物反應形成偶聯(lián)物-單抗復合 物；偶聯(lián)物_單抗復合物中的堿性磷酸酶催化工作電極表面的抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn)生抗 壞血酸，銀離子在抗壞血酸的作用下被還原成銀單質并沉積在工作電極上，從而增大了微 間隙陣列電極的電導；將傳感器工作電極的正極與CHI 760A型電化學工作站的工作電極 連接，工作站對電極與參比電極復合，再與傳感器工作電極的負極連接，采用線性掃描伏安 法在0 50mV電位范圍檢測，記錄傳感器電流隨電位變化的響應曲線，并計算其電導值；根 據(jù)不同濃度的萊克多巴胺標準樣品溶液的電導值，獲得工作曲線；再根據(jù)樣品的電導值與 工作曲線，求得對應樣品的萊克多巴胺的濃度。本發(fā)明的有益效果為(1)電化學免疫定量傳感器制備簡單，成本低廉，可大批量低成本生產(chǎn)；(2)操作步驟簡單，檢測時間在30分鐘內，檢測所需要的儀器可用自行研制的電 阻量測裝置；(3)本免疫傳感器靈敏度高，可實現(xiàn)濃度為Ing/mL的動物源中萊克多巴胺的檢 測，達到我國食品中萊克多巴胺的限量標準，且背景干擾小，可以對食品中萊克多巴胺進行 快速篩查和檢測；(4)解決了快速檢測卡只能定性或者半定量的問題，克服了光學定性檢測卡、薄 層層析檢測卡重現(xiàn)性差的難題，實現(xiàn)真正意義上的定量檢測，數(shù)據(jù)真實可靠，整個儀器可便
5攜，低成本；在國內外首次將該技術應用于食品、環(huán)境等領域的檢測，特別適用于食品安全 檢測機構和監(jiān)管部門的現(xiàn)場檢測；(5)檢測溫度適宜范圍寬，在4°C -40°C都可使用，結果正常。本發(fā)明適合于衛(wèi)生、質監(jiān)、海關、家畜養(yǎng)殖場、食品企業(yè)等單位或個人對動物源性 食品樣品中的萊克多巴胺進行快速檢測，可望成為食品樣品中的萊克多巴胺現(xiàn)場篩查提供 有效的技術手段。


圖1是微間隙陣列電極的一種實施例放大圖樣(黑色區(qū)域為金膜，白色區(qū)域為裸 露的基片)諷為正電極或負電極的梳形齒寬，D2為電極間隙；圖2為微型化后的反應裝置示意圖；圖中，圓柱形筒體為反應槽示意圖，該反應槽 以外的構件為置于反應槽底部的微間隙陣列電極(其中兩黒色色塊為正、負電極)。
具體實施例方式利用本傳感器對樣品中萊克多巴胺的檢測樣品的前處理(1)飼料樣品粉碎后過20目篩，得試樣。取2g試樣于50ml離心管中，加入10ml 水，混勻，置于超聲波水浴中超聲30min (其間每lOmin取出混勻1次)，超聲提取后冷卻至 室溫，于2500rpm離心5min，取上清液進行測試。(2)尿液用尿液直接進行測試，如有渾濁請先離心取上清。尿液標準必須收集在 潔凈、干燥不含有任何防腐劑的塑料尿杯或玻璃容器內。若不能及時檢測送檢，尿樣標準在 2-8°C冷藏可以保存48小時。長期保存需冷凍于-20°C，忌反復凍融。(3)肉裝入大約4克碎的豬肉樣本(肉泥)于離心管中，蓋緊管蓋。將裝樣品的 離心管在微沸的水浴鍋中水浴10分鐘；吸取3滴以上(約lOOul)煮出的溶液到1. 5ml的 離心管中。如有明顯黃色渾濁請離心，使用上清液作為待測樣品溶液。分別取上述提取樣品lOOy L與1 P L堿性磷酸酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體混 合，室溫下反應2 3min，滴到固定有30 y L 100 u g/mL萊克多巴胺-BSA抗原的電化學免 疫定量傳感器的電極表面，室溫下靜置反應8-12min，再從該電極獲取與萊克多巴胺抗原濃 度相關的電導信號，記錄變化值。根據(jù)工作曲線計算得到萊克多巴胺濃度。五次測定并根 據(jù)工作曲線計算得到對應的樣品中萊克多巴胺濃度平均值為24. 2士 1. 2ng/mL。與五次色譜 法結果22. 3士2. 0ng/mL吻合。結果表明，本傳感器可以對萊克多巴胺進行快速檢測。
權利要求
一種基于微間隙陣列電極的電化學免疫傳感器，其特征是，它包括a.由叉指式雙電極組成微間隙陣列電極，且正電極和負電極的梳形齒寬均為1μm-100μm，電極間隙1μm-100μm；微間隙陣列電極表面固定有30μL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物，該萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物濃度為100μg/mL；b.堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體；它在檢測時加到微間隙陣列電極上，同被檢測樣品中的萊克多巴胺及所述電極上的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物發(fā)生競爭免疫反應。
2.一種基于權利要求1所述微間隙電極陣列的電化學免疫傳感器的萊克多巴胺的檢 測方法，其特征是，該方法為取濃度分別為 0. 10ng/mLU. Ong/mLUO. 0ng/mL、20. 0ng/mLU00. 0ng/mL、200. Ong/mL 的萊克多巴胺標準樣品溶液各100 yL，將所述每一種濃度的萊克多巴胺標準樣品溶液分 別與1 P L堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體溶液室溫下混合反應2min 3min ； 然后將各混合物分別滴加到對應的電化學免疫定量傳感器的電極表面，室溫下靜置反應 5min-8min，將傳感器工作電極的正極與CHI 760A型電化學工作站的工作電極連接，工作 站對電極與參比電極復合，再與傳感器工作電極的負極連接，采用線性掃描伏安法在0 50mV電位范圍檢測，記錄傳感器電流隨電位變化的響應曲線，并計算其電導值；根據(jù)不同 濃度的萊克多巴胺標準樣品溶液的電導值獲得工作曲線；再根據(jù)樣品的電導值與工作曲線 求得對應的樣品的萊克多巴胺的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微間隙陣列電極的電化學免疫定量傳感器及用于檢測食品中萊克多巴胺的方法。傳感器有叉指式雙電極組成的微間隙陣列電極，其正電極和負電極的梳形齒寬均為1μm-100μm，電極間隙1μm-100μm，微間隙陣列電極表面固定有萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物；堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺單克隆抗體，它在檢測時加到微間隙陣列電極上，同被檢測樣品中的萊克多巴胺及所述電極上的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物發(fā)生競爭免疫反應。該傳感器特異性強，能夠實現(xiàn)定量檢測，4-40℃都可使用，10min以后便可觀察結果，適合于單位或個人對動物源性食品樣品中的萊克多巴胺進行快速檢測。
文檔編號G01N27/327GK101858918SQ20101019573
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權日2010年6月9日
發(fā)明者付冠艷, 俞汝勤, 彭新凱, 彭瑞乾, 沈國勵, 蔣健暉 申請人:長沙市食品質量安全監(jiān)督檢測中心