專利名稱：奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，用于檢測奶牛乳汁孕酮水平。
背景技術(shù)：
目前我國奶牛的飼養(yǎng)規(guī)模不斷的擴(kuò)大，現(xiàn)在已經(jīng)成為畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，為了縮 短奶牛的產(chǎn)犢間隔提高奶牛的利用率，能使奶牛多產(chǎn)奶和多繁殖犢牛，要經(jīng)常對(duì)產(chǎn)犢后空 懷泌乳母牛進(jìn)行卵巢孕酮檢查，目前在養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行卵巢孕酮檢查常用的有直腸檢查與采 血檢查這兩種方法，直腸檢查法對(duì)牛的直腸粘膜卵巢等易造成機(jī)械性刺激易引起粘膜損傷 和造成出血對(duì)奶牛卵巢造成損傷，需要檢查人員直檢水平較高，但檢查結(jié)果也不很準(zhǔn)確；采 血檢查法須將奶牛保定易造成應(yīng)激有礙奶牛健康，奶牛乳汁孕酮的變化與血漿孕酮的含量 同步。所以，根據(jù)乳汁中孕酮含量可以描述出母牛生殖過程所發(fā)生的生理變化，包括黃體 的形成及其分泌活動(dòng)的連續(xù)或結(jié)束等生理狀態(tài)。因此，根據(jù)乳汁中孕酮含量的變化可檢查 母牛的發(fā)情、妊娠診斷、產(chǎn)后卵巢機(jī)能活動(dòng)、以及一些繁殖疾病的診斷及其治療效果的監(jiān)測 等。乳汁中孕酮含量的測定，取樣方便，不損害家畜健康，不影響生產(chǎn)，比血漿孕酮的測定更 具有實(shí)用性。因此，采取奶牛乳汁孕酮檢查法是奶牛機(jī)體孕酮含量測定的有效途徑，尋求一 種奶牛乳汁孕酮生物傳感器成為廣大奶牛場、養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)的祈盼。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有的技術(shù)不足，提供一種取樣方便，不損害家畜健康， 不影響生產(chǎn)，比血漿孕酮的測定更具有實(shí)用性的奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器。( 二 )技術(shù)方案以上為本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明在于提供一種應(yīng)用一次性絲網(wǎng)印刷電極研制的生物傳感器，并將建立的 間接競爭ELISA法應(yīng)用到生物傳感器上。本發(fā)明通過抗原-抗體反應(yīng)，將孕酮完全抗原修飾于絲網(wǎng)印刷電極上，在絲網(wǎng)印 刷電極上建間接競爭ELISA法。本發(fā)明所述修飾電極的孕酮完全抗原與待測抗原競爭結(jié)合孕酮單克隆抗體，辣根 過氧化物酶標(biāo)記第二抗體與孕酮單克隆抗體結(jié)合。本發(fā)明建立在絲網(wǎng)印刷電極上的間接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮。本發(fā)明的制備方法是，采用絲網(wǎng)印刷工藝制備三電極結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器。首先 在PET薄膜上印刷銀導(dǎo)電軌道，然后用碳漿印制碳電極，其中直徑3mm的圓盤為工作電極， 而半環(huán)為對(duì)電極。最后，印刷綠色油墨作為絕緣層，僅露出電極和連接處。在用絲網(wǎng)印刷電 極制作的工作電極上滴加5 μ L P4-OVA, 37°C孵育45min ；洗滌液洗滌兩次；用0. 5%牛血清 白蛋白封閉，在工作電極上滴加50μ L，37°C孵育60min ；洗滌液洗滌兩次；制備好的生物傳感器置于4°C密閉的環(huán)境中備用。本發(fā)明是在工作電極上滴加2. 5μ L孕酮單克隆抗體和競爭孕酮抗原5 μ L，37 °C 作用45min ；洗滌液沖洗兩次；滴加酶標(biāo)二抗，37°C孵育40min，洗滌液沖洗兩次；在電極上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用計(jì)時(shí)電流法測定電化學(xué)信號(hào)。將所得電流值代入建立的 曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以酶免疫技術(shù)為基礎(chǔ)，建立間接競爭 ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮，通過抗原_抗體特異性反應(yīng)，將孕酮完全抗原修飾在絲網(wǎng) 印刷電極上制備生物傳感器?？晒┠膛Ｔ缙谌焉镌\斷、發(fā)情鑒定以及相關(guān)疾病的診斷的確 診使用，可以通過連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測孕酮判斷奶牛機(jī)體的生殖狀態(tài)。本發(fā)明中，孕酮完全抗原修飾在絲網(wǎng)印刷電極上，置于37°C 45min，后用0. 5% BSA 封閉，再經(jīng)過37°C恒溫箱處理2h，置于4°C保存。應(yīng)用該方法制備的生物傳感器具有穩(wěn)定性 好、操作及處理簡便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)抗孕酮單克隆抗體的特異性強(qiáng)，降低陰性成本底，提高了 生物傳感器的靈敏度，應(yīng)用于孕酮的檢測，能夠達(dá)到檢測乳汁中孕酮含量的要求。(三)有益效果本發(fā)明優(yōu)越性在于生物傳感器的特異性、靈敏性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率的性能 參數(shù)的測定，結(jié)果表明發(fā)明方法的最低檢測限可達(dá)0. 16ng/mL，批內(nèi)平均差異8.2%，批間 平均差異7. 72%，回收率95. 8% 115. 7%，制備成功的生物傳感器可在4°C環(huán)境中保存4 天仍能保持原有活性。經(jīng)對(duì)奶樣測定結(jié)果顯示，均符合臨床情況，說明本方法對(duì)檢測奶牛 乳汁孕酮來改善奶牛繁殖具有重要的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。


圖1是本發(fā)明的操作流程示意圖。圖2是本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，進(jìn)一步詳細(xì)說明發(fā)明所述奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器的具體實(shí) 施方式，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一通過抗原-抗體反應(yīng)，將孕酮完全抗原修飾于絲網(wǎng)印刷電極上，制備生物傳感器。孕酮完全抗原的制備采用碳化二亞胺法，應(yīng)用OVA與11 α -羥基孕酮半琥珀酸偶 聯(lián)制備孕酮完全抗原，具體操作步驟如下稱取Imgll α-羥基孕酮半琥珀酸(11 α-0H-P4-HS)，溶于0. 02mL 二甲基甲酰 胺(DMF)中；分別稱取0. 0298mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0. 534mg 二環(huán)己基碳化二亞 胺(DCC)，各自溶于0. 004mLDMF中；將上述三種溶液混合，在室溫下振蕩90min ；將振蕩均 勻的混合液逐滴緩慢地加入溶解于含有2. Img卵清白蛋白(OVA)的0.2mol/L磷酸鹽緩 沖液(PBS)中，pH7.0，然后4°C攪拌過夜；將偶聯(lián)的液體裝入預(yù)先處理好的透析袋中，放 入大燒杯中透析；在透析過程中用0. lMNaHC032. 2L，透析4小時(shí)；去離子水2. 2LX3次， 透析1. 5hX3次；最后用ILPBS(pH 7. 4)透析15小時(shí)。取出偶聯(lián)物11 α -0H-P4-HS-0VA, 4000rpm,離心30min，取上清分裝，在_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> 4
分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11 α -0H-P4-HS-0VA)，卵清白蛋白 (OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 α -0H-P4-HS)包被酶標(biāo)板，按照間接競爭ELISA法操 作，鑒定完全抗原免疫活性。實(shí)施例二應(yīng)用生物傳感器定量檢測奶牛乳汁孕酮方法。如圖1，采用絲網(wǎng)印刷工藝制備三電極結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器。首先在PET薄膜上 印刷銀導(dǎo)電軌道，然后用碳漿印制碳電極，其中直徑3mm的圓盤為工作電極，而半環(huán)為對(duì)電 極。最后，印刷綠色油墨作為絕緣層，僅露出電極和連接處。在用絲網(wǎng)印刷電極制作的工作 電極上滴加5μ L P4-0VA，37°C孵育45min ；洗滌液洗滌兩次；用0. 5%牛血清白蛋白封閉， 在工作電極上滴加5(^1^，371孵育601^11;洗滌液洗滌兩次；制備好的生物傳感器置于4°C 密閉的環(huán)境中備用。在工作電極上滴加2.5yL孕酮單克隆抗體和競爭孕酮抗原5yL，37°C作用 45min ；洗滌液沖洗兩次；滴加酶標(biāo)二抗，濕盒37°C孵育40min，洗滌液沖洗兩次；在電極上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用計(jì)時(shí)電流法測定電化學(xué)信號(hào)。不同濃度孕酮測定結(jié)果顯示孕酮濃度與電流值呈負(fù)相關(guān)，即孕酮濃度越大，電流 值越小。如圖2為了建立更好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以孕酮濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，電流對(duì)數(shù) 為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得電流值代入曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。在本 試驗(yàn)中，檢測限0. 16ng/ml。比較廣泛的線性范圍為0. 16-50ng/ml，線性回歸相關(guān)系數(shù)為 0. 9957，符合相關(guān)系數(shù)大于0. 99的要求。最低檢測量根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)用生物傳感器測定了 10個(gè)經(jīng)過去激素處 理的空白奶樣，求出它的平均數(shù)(Xtl)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)計(jì)算出X(I-2S，再將此值代入方程，計(jì)算 出檢測的靈敏度。生物傳感器的最低檢測量為0. 16ng/mL。精密度在精確度的研究中，對(duì)批間變異系數(shù)和批內(nèi)變異系數(shù)的競爭分析進(jìn)行了 比較?；跇?biāo)準(zhǔn)曲線中，選取三種不同濃度的孕酮，0. 5ng/ml、10ng/ml和40ng/ml，表示低， 中，高濃度，進(jìn)行了研究。選取在4°C保存的生物傳感器，定在不同的時(shí)間即連續(xù)4天，每 天檢測一次三個(gè)水平的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)間接ELISA操作程序，比較產(chǎn)生電流，確定變異系數(shù)。選取保存于4°C的4個(gè)批次的孕酮檢測生物傳感器，同時(shí)檢測三個(gè)水平濃度的孕 酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品，并設(shè)定3個(gè)重復(fù)。根據(jù)反應(yīng)操作程序，比較產(chǎn)生電流，確定變異系數(shù)。結(jié)果 平均批內(nèi)變異系數(shù)為8. 2%，平均批間變異系數(shù)為7. 72%。以上為本發(fā)明的最佳實(shí)施方式，依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 能夠顯而易見地想到的一些雷同、代替方案，均應(yīng)落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，其特征在于通過抗原 抗體反應(yīng)，將孕酮完全抗原修飾于絲網(wǎng)印刷電極上，在絲網(wǎng)印刷電極上建間接競爭ELISA法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，其特征在于所述修飾電極 的孕酮完全抗原與待測抗原競爭結(jié)合孕酮單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記第二抗體與孕 酮單克隆抗體結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，其特征在于用建立在 絲網(wǎng)印刷電極上的間接競爭ELISA法定量檢測奶牛乳汁孕酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，其特征在于制備方法 采用絲網(wǎng)印刷工藝制備三電極結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器，首先在PET薄膜上印刷銀導(dǎo)電軌道， 然后用碳漿印制碳電極，其中直徑3mm的圓盤為工作電極，而半環(huán)為對(duì)電極，最后，印刷綠 色油墨作為絕緣層，僅露出電極和連接處，在用絲網(wǎng)印刷電極制作的工作電極上滴加5μ L P4-OVA, 37°C孵育45min ；洗滌液洗滌兩次；用0. 5%牛血清白蛋白封閉，在工作電極上滴加 5(^1^，371孵育601^11;洗滌液洗滌兩次；制備好的生物傳感器置于4°C密閉的環(huán)境中備 用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳汁孕酮檢測生物傳感器，其特征在于生物傳感器 的使用方法在工作電極上滴加2.54 1^孕酮單克隆抗體和競爭孕酮抗原54 1^，371作用 45min ；洗滌液沖洗兩次；滴加酶標(biāo)二抗，濕盒37°C孵育40min，洗滌液沖洗兩次；在電極上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用計(jì)時(shí)電流法測定電化學(xué)信號(hào)，將所得電流值代入建立的 曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。
全文摘要
本發(fā)明研究了一種間接競爭抗原抗體免疫反應(yīng)方法，應(yīng)用修飾的孕酮完全抗原(P4-OVA)和待測抗原競爭孕酮單克隆抗體，最后酶標(biāo)記第二抗體與單克隆抗體結(jié)合，在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極端修飾P4-OVA制成對(duì)奶牛孕酮有特異敏感性的生物傳感器，然后將此方法轉(zhuǎn)移至生物傳感器，用電化學(xué)技術(shù)檢測辣根過物氧化酶作催化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和過氧化氫(H2O2)藉此確定孕酮含量。
文檔編號(hào)G01N33/64GK101915847SQ20101019974
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者劉騫, 吳凌, 夏成, 張洪友, 徐闖, 高維明, 黃海波 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)