專利名稱：Npm1基因突變的聯(lián)合檢測方法及診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外診斷檢測技術領域，具體涉及NPMl基因突變的液相芯片聯(lián)合檢 測方法及其診斷試劑盒。
背景技術：
核磷蛋白(nucleophosmiiNPM)基因定位于人類染色體5q35，含有12個外顯子， 編碼由294個氨基酸組成的NPM蛋白。NPMl參與核糖體的合成和中心體復制以調(diào)控細胞增 殖和周期進程。NPMl突變僅累及第12號外顯子，目前有超過40種不同的突變亞型，其中 絕大多數(shù)包含了 12號外顯子4個堿基的插入。其中最常見的是NPMl-mutA，占所有突變的 75% -80%，它是在野生型NPMl核苷酸序列上第956-959位上插入1個TCTG4個核苷酸而 形成串聯(lián)重復序列。NPMl-mutB和NPMl-mutD各占10%和5%，分別插入的是CATG和CCTG ； 其余突變較少見。NPMl基因突變是目前急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中最常見 的突變形式，約占所有AML的35 %，而在正常核型的AML中可占46 % -62 %。AML是一組高 度異質(zhì)性疾病，正常核型AML約占成人原發(fā)AML患者的40% -50%,是中危組細胞遺傳學 分類中人數(shù)最多的一個亞型，也是目前研究的熱點之一。最近國外幾個大規(guī)模的多中心研 究相繼顯示，在具有分子異質(zhì)性的正常核型AML患者中，46% -62%可檢測到核磷蛋白成員 NPMl基因突變及(或)表達的改變，它在AML的診斷、分型及判斷預后與監(jiān)測微小殘留病灶 等方面有重要價值。另外，近來有報道顯示在骨髓增生異常綜合癥(MDS)患者中，也存在著NPMl突變。目前，白血病和骨髓增生異常綜合癥主要是依靠細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳 學、分子生物學等檢測方法來進行診斷和檢測分型。細胞形態(tài)學受主觀因素影響，臨床診斷 的一致率僅為70%左右。核型分析和顯帶技術等細胞遺傳學方法是在全基因組水平篩查 染色體易位，容易漏檢許多染色體的微小異常。免疫學方法具有較高的假陽性率和假陰性 率，并且無法做到早期診斷。當前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學檢測白血病基因突變的方 法中，熒光原位雜交技術(FISH)只能進行定性檢測、操作復雜；熒光定量PCR存在著檢測通 量的局限性，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip) 技術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。因此臨床上需要有一種 檢測方法，能夠迅速、穩(wěn)定、準確地對白血病的多種基因突變進行聯(lián)合并行檢測，液相芯片 (xMAP)技術正是這樣一種新型檢測技術。液相芯片能夠?qū)ι倭繕颖具M行定性、定量檢測，具有高通量、操作簡便、重復性好、 靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點。該系統(tǒng)是由許多微球為主要基質(zhì)構成的，在微球的制造 過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質(zhì)分為 100種，可以標記上100種不同的探針分子，能同時對一個樣品中多達100種不同的目標分 子進行檢測。根據(jù)檢測物的不同，微球表面可以共價結(jié)合各種各樣的核酸檢測探針，在雜交 反應進行時再加上熒光標記。在同一反應體系中可以同時加入不同的檢測微球，這樣就可
4以利用少量的樣本進行快速、高通量的檢測。反應結(jié)束后，通過微流體技術將微球排成單列 快速流經(jīng)液相芯片檢測儀，每個微球可同時被兩束激光檢測到，紅色激光激發(fā)微球上的紅 色分類熒光，將各個不同的反應區(qū)分開來而定性；綠色激光則激發(fā)結(jié)合在待測樣本上的熒 光標記進行定量。當標記好的待測樣本與特定微球上的探針結(jié)合在一起時，兩束激光所激 發(fā)的光均可被檢測到。最后，通過計算機的高速數(shù)字信號處理器，可以自動統(tǒng)計分析得出特 定微球上的平均熒光強度，從而確定檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術的高通量、操作簡便、重復性好、靈敏度高、線性范圍寬 等突出優(yōu)點，對NPMl的多種基因突變進行聯(lián)合并行檢測，能夠在臨床檢測上得到更好的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測方法及診斷 試劑盒。該方法及試劑盒包含對多種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測，可以對急性髓系白血病 (AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷提供重要的參考依據(jù)，同時對患者進行療 效觀察、預后及微小殘留疾病進行動態(tài)監(jiān)測。本檢測方法及診斷試劑盒具有高靈敏度、高特 異性、高準確度、檢測迅速等優(yōu)點。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下在本發(fā)明的一方面，提供一種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測方法，包括以下步驟(1)包含多種不同熒光編碼的羧基微球beads ；每種微球上分別共價結(jié)合針對 NPMl的多種突變基因的mRNA所設計的特異性核酸探針；所述NPMl的多種突變基因包含以 下任意一種基因或任意組合的多種基因NPMl-mutA(SPNPMl mutation ·Α)、NPMl_mutB (即 NPMl mutation B)、NPMl-mutD (艮口 NPMl mutation D)，即所述 NPMl 的多種突變基因可以 是NPMl-mutA、NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意一種或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意兩種基因組合或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB和NPMl-mutD三種基因組合或加上其它基因；(2)針對多種不同的NPMl突變基因的mRNA，分別設計上下游引物，對不同的突變 基因的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出相應的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與NPMl突變基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物雜交后， 加入鏈霉親和素_藻紅蛋白(Str印tavidin-PE)，通過液相芯片xMAP法檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中 是否含有NPMl突變基因，和/或樣品中突變基因的表達狀況。以上檢測方法的步驟(1)中，所述的微球是平均直徑為5.6μπι，結(jié)合了不同熒光 染料的聚苯烯微球，即色彩編碼微球(color-coded beads)。步驟(1)中，所述的共價結(jié)合于微球上的針對NPMl的多種突變基因的特異性核酸 探針，包括如下序列(其中5’端含氨基修飾)NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID N0. 2 所 示；
NPMl-mutD 5' -AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所 示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。步驟(2)中，所述的針對NPMl不同突變基因的mRNA所設計的上下游引物，包括如 下序列(其中上游引物5’端含生物素標簽)NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 6 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 8 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 9 所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。步驟⑷中，所述的內(nèi)參基因Abelson基因的引物和探針序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示；探針5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID N0. 12 所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測多種NPMl基因突變的診斷試劑盒，包含共價 結(jié)合了 NPMl突變基因mRNA特異性探針的微球混合物、結(jié)合了 Abelson基因探針的微球、 NPMl突變基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、鏈霉親和素-藻紅蛋白 Str印tavidin-PE、質(zhì)控品(陰性對照和陽性對照)。以上試劑盒中所述的質(zhì)控品包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種 突變基因質(zhì)粒的混合液(包括含Abelson基因的質(zhì)粒)，陰性對照品為不含有突變基因及 Abelson基因的質(zhì)粒溶液；所述的微球混合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測多種NPMl基因突變的診斷試劑盒在檢測體 外樣品，對急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷、復發(fā)、治療方 案的確定以及預后判斷中的應用。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術，使檢測方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩(wěn)定性好、檢測迅速、準確等突出優(yōu)點，能夠?qū)PMl突變基因進行定性和定量檢 測，能在臨床檢測上得到更好的應用。此外，本發(fā)明可以對急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷提供重要的參考依據(jù)，同時對患者進行療效觀察，預后與 微小殘留疾病的動態(tài)監(jiān)測提供重要的依據(jù)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例詳細說明本發(fā)明，但并不能理解為對本發(fā)明的限制。所述的 實施例只提供闡明核酸探針、試劑盒及其制作和應用方法而不為其所限制。期間各種變化 形式在本發(fā)明和所述的權項的范圍內(nèi)是可預期的。實驗材料引物和探針均由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司；多重PCR試劑盒、不同編號的微球(表面羧基修飾)、 鏈霉親和素_藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)購置于Pierce公司；2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N_月桂酰基氨酸鈉 (Sarkosyl)、四甲基氯化銨(TMAC)均購置于sigma公司。緩沖液和雜交液的配置偶聯(lián)緩沖液，PH4.5250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ΡΗ8. O18.75ml0. 5Μ EDTA, ΡΗ8. 03. OmldH201. 37ml ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, PH8. 012.5ml0. 5M EDTA, PH8. 02. OmldH2084.25ml;TE 緩沖液，PH8. 0500mlIM Tris-HCl, PH8. 05ml0. 5M EDTA, PH8. 0ImldH20444ml實施例1 1種NPMl基因突變的液相芯片檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟一 .檢測NPMl-mutA突變基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；Abelson 基因:5，_AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12所示；2.將以上含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號為11、21號的2種羧基微球偶 聯(lián)2. 1取出一小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2用dH20分別溶解NPMl-mutA和Abelson的寡核苷酸探針，濃度為lmM(lnmol/ μ 1)；2. 3分別全速渦旋編號為11、21號的2種羧基微球儲存懸液至少3min，產(chǎn)生均一 的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲存懸液到2個離心管中；2. 5 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20 秒；2. 7將2種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃度 為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配置10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)； 2. 10加入2. 5μ 1 10mg/ml EDC的新鮮EDC溶液分別到2種微球中(25 μ g終濃度 約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2. 11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配置第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 13 2種微球中各加入2. 5 μ 1 10mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 15 2 種偶聯(lián)微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 16 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸2種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 18 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ΡΗ8. 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細胞計數(shù)器計數(shù)2種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細胞計數(shù)器上；d.數(shù)細胞計數(shù)器上4個角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配置將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列NPMl-mutA探針微球11和Abelson 探針微球21，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個/μ 1，2-8°C避光保存。二 .樣本的制備
取1-5號AML或MDS患者的臨床樣本，分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細胞；2.取1個離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 40C 12，OOOg 離心 15min ；6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 離心 IOmin,棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 40C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-lOmin ；12.用 50ul RNase-free dH20 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin ；13.測OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對上述的1-5號樣本的mRNA進行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增l.cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1RNase-free water forward to 12 μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離 心收集管壁上的反應液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應液；5 X react ion buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1)1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID N0. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 5 所示；
Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID NO. 11 所示。2. 2 多重 PCR 反應采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR試劑盒，體系如下終體積為50 μ 1(2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 中含熱啟動 TaqDNA 酶、MgCl2 和 dNTPMix。)PCR 擴增程序:95 V 15min ；94°C 30s，55°C 90s, 72°C 90s, 35 個循環(huán)；72°C IOmin ； 4°C保溫。四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配置的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個微球/ μ 1。(注每個反應需要33μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對照孔、陰性對照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個樣品孔內(nèi)分別加入1-5號患者樣本的PCR擴增產(chǎn)物和TE溶液(PH為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應液；8.蓋上反應蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級結(jié)構；9.在雜交溫度下孵育反應板15min ；10.制備新鮮的檢測混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液 至10 μ g/ml (每個反應需要25 μ 1的檢測混合液)；11.向每孔加入25μ 1的檢測混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C, l-3min ；雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持雜交溫度， 對各反應孔進行檢測分析，測定熒光MFI值。五.檢測結(jié)果及分析檢測結(jié)果(熒光MFI值)如表1所示表 1
0138]Template cDNA
0139]2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
0140]IOXPrimer mix
0141]RNase-free water
10 μ 1 25 μ 1 5 μ 1 10 μ 權利要求
一種NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)包含多種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價結(jié)合針對NPM1的多種突變基因的mRNA所設計的特異性核酸探針；所述的NPM1的多種突變基因包含以下任意一種基因或任意組合的多種基因NPM1 mutA、NPM1 mutB和NPM1 mutD；(2)針對NPM1的多種突變基因的mRNA，分別設計上下游引物，對不同的突變基因的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出相應的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與NPM1突變基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物混合雜交，加入鏈霉親和素 藻紅蛋白Streptavidin PE后，通過液相芯片xMAP方法檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中是否存在NPM1突變基因，和/或樣品中突變基因的表達狀況。
2.如權利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，步驟(1)中， 所述的微球是平均直徑為5. 6 y m，結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯微球，即色彩編碼微球 Color-coded beads0
3.如權利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述 的共價結(jié)合于微球上的針對NPM1的多種突變基因的特異性核酸探針，包括如下序列，其中 5’端含氨基修飾NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示； NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； NPMl-mutD :5，-AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； 或者包含有上述序列或其互補序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列或其互補序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4.如權利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，所 述的針對不同NPM1突變基因的mRNA所設計的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’ 端含生物素標簽NPMl-mutA 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 9 所示；或者包含有上述序列或其互補序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列或其互補序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
5.如權利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，步驟(4)中，所述 的內(nèi)參基因為Abelson基因，其引物和探針序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；2下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示； 探針 5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示； 或者包含有上述序列或其互補序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列或其互補序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
6.一種檢測NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，包含了權利要求1中所述的共 價結(jié)合了 NPM1突變基因特異性探針的微球混合物及結(jié)合了 Abelson基因探針的微球、權利 要求1中所述的NPM1突變基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、鏈霉親 和素-藻紅蛋白和質(zhì)控品。
7.如權利要求6所述的檢測NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，所述的微球混 合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。
8.如權利要求6所述的檢測NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品 包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種NPM1突變基因質(zhì)粒的混合液，包括含 Abelson基因的質(zhì)粒；陰性對照為不含有NPM1突變基因及Abelson基因的質(zhì)粒溶液。
9.一種如權利要求6所述的檢測NPM1基因突變的診斷試劑盒在檢測體外樣品，對急性 髓系白血病和骨髓增生異常綜合癥的早期診斷、復發(fā)、治療方案的確定以及預后判斷中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核磷蛋白NPM1基因突變的聯(lián)合檢測方法及診斷試劑盒，通過對NPM1突變基因NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD設計引物和探針，將探針與微球共價結(jié)合形成的探針微球混合物，與逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物雜交，加入鏈霉親和素藻紅蛋白后，可檢測出不同微球的熒光信號，從而確定待檢測樣品中是否含有NPM1基因突變及突變基因的表達狀況。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測快速、準確等優(yōu)點，能夠?qū)PM1基因突變進行定性和定量檢測，為急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷、復發(fā)、治療方案的確定以及預后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
文檔編號G01N21/64GK101955994SQ20101020265
公開日2011年1月26日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權日2010年6月17日
發(fā)明者邵棠, 陳鳴 申請人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司